Universidade Estadual do Rio Grande do Sul Bacharelado em Gestão Ambiental Componente curricular: Microbiologia Ambiental Aula 5

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1 Universidade Estadual do Rio Grande do Sul Bacharelado em Gestão Ambiental Componente curricular: Microbiologia Ambiental Aula 5 Culturas, isolamento e controle dos microorganismos. Princípios gerais. O controle de microrganismos por agentes químicos, desinfetantes e antibióticos. Imunizações e vacinas. Trabalho em grupo: 1. Escolher um antibiótico e descrever: grupo de antibiótico a que pertence; período de descoberta ou síntese; ação geral e espectro de controle; existência de resistência; princípio da resistência se exisitir.

2 I. Culturas, isolamento e controle dos microorganismos. 1. Princípios gerais. Quais os tipos de de microorganismos estão presentes num dado ambiente? Por exemplo: há presença de Escherichia coli na água potável? Ou ainda: como separar bactérias patogênicas daquelas saprófitas que vivem no hospedeiro humano? Para isto há necessidade de métodos de isolamento e caracterização especiais.

3 I. Culturas, isolamento e controle dos microorganismos. 1. Culturas puras. O primeiro passo é reduzir as populações de microorganismos em meio de cultura, buscando uma cultura pura. Para isto, há um grande número de receitas, ou fórmulas de preparo de meios de cultura que visam o isolamento. Um grande avanço no isolamento de bactérias e fungos principalmente, foi a disponibilização comercial de uma gelatina especial chamada de ágar (ou ágar-ágar). É esta gelatina que, geralmente enriquecida com outros ingredientes, permite o crescimento bacteriano na superfície de placas de Petry, tubos ou garrafas (inclinados). Mas o que é o ágar? É uma substância gelatinosa derivada de algas marinhas macroscópicas, por exemplo da espécie Gelidium amansii.

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5 I. Culturas, isolamento e controle dos microorganismos. 1. Culturas puras. A gelatina em questão é um polissacarídio de galactose. Usado de forma isolada, é de fato um meio pobre. A incorporação de vários nutrientes ao ágar é rotineira portanto nas várias receitas de meios de isolamento. Por exemplo o ágar nutriente (comercial), conterá ágar, peptona, cloreto de sódio e extrato de cerveja. Entre as variações de meios de cultura com ágar, estão as adições de bile, sangue, maltose, etc., para a bacteriologia básica. Ainda é muito importante o ágar Saboraud, onde adiciona-se dextrose, para a micologia básica, usado por exemplo para o isolamento de Candida albicans e a maioria dos fungos cutâneos causadores das tinhas (ou dermatofitoses).

6 1. Culturas puras. Placas com ágar para isolamento de microorganismos.

7 I. Culturas, isolamento e controle dos microorganismos. 1. Culturas puras. Uma aspecto fundamental na preparação de meios de cultura em microbiologia é que estejam estéreis no momento de semeadura do material. Para isto é usado o princípio do aquecimento da água sob pressão. Isto é atingido com o autoclave. Um autoclave é um recipiente pressurizado destinado a aquecer a água acima do ponto de ebulição, 100 C sob pressão normal. Foi inventado por Charles Chamberland em O aparelho permite a saída do ar seco, pobre no aspecto esterilizante e o preenchimento da câmara onde está o meio de cultura com vapor super-aquecido.

8 I. Culturas, isolamento e controle dos microorganismos. 1. Culturas puras. Dois esquemas são normalmente utilizados. Após a saída do ar, sob pressão de 10 libras por polegada quadrada, são atingidos 115 C, a serem mantidos por 15 minutos, geralmente. Uma pressão de 15 lpq atingirá 121 C. É muito importante que o autoclave somente seja aberto com pressão zero, ou os meios entrarão em fervura e podem danificar, ou quebrar a vidraria.

9 I. Culturas, isolamento e controle dos microorganismos.

10 I. Culturas, isolamento e controle dos microorganismos.

11 2. Semeadura no meio de cultura.

12 2. Semeadura no meio de cultura.

13 2. Semeadura no meio de cultura. Três técnicas são comuns para a semeadura, ou inoculação O mais comum em placas é o uso de alça de platina que leva o inóculo à superfície do meio com ágar. O objetivo é esgotar o inóculo na superfície, de forma que células isoladas produzirão colônias separadas que podem ser observadas e trabalhadas. A vantagem da alça de platina é que pode ser esterilizada sem dificuldade na chama, com o uso do bico de Busen. As outras técnicas são a semeadura em superfície com alça de vidro e a pour-plate, onde o inóculo é misturado ao meio, quando este esfria a 45 C. A partir de colônias isoladas as amostras podem ser transferidas para meios identificadores. As placas iniciais podem ser armazenadas a 4 C por algum tempo.

14 2. Semeadura no meio de cultura.

15 2. Semeadura no meio de cultura. Culturas isoladas são geralmente conservadas por congelamento profundo, a -196 C no nitrogênio líquido, ou liofilizadas. Ver esquema da liofilização a seguir.

16 2. Semeadura no meio de cultura.

17 3. Controle de microorganismos por agentes biológicos e químicos. 3.1 Antibióticos, desinfetantes, antissépticos. Denomina-se de antibióticos os agentes destinados a controlar ou eliminar os microorganismos (ou germicidas) que estão presentes em situação de infecção no hospedeiro. Desinfetantes são agentes germicidas destinados a atuar no ambiente externo. Antissépticos são agentes germicidas que devem atuar na pele do hospedeiro.

18 3. Controle de microorganismos por agentes biológicos e químicos. 3.2 Antibióticos: história e classes. O termo antibiótico, de origem grega (anti-condições de vida) foi cunhado por Selman Waksman em 1942 para descrever as substâncias produzidas pelos microorganismos que fossem antagonistas de outros microrganismos, especialmente os patógenos. É sinônimo de antimicrobiano. O termo originalmente excluía os quimioterápicos (químicos sintéticos), como as sulfonamidas. Atualmente o termo tem uma compreensão mais ampla e envolve qualquer agente controlador que age sobre microorganismos, principalmente bactérias. Neste sentido é quase um sinônimo de bactericida. É usado também para indicar agentes contra fungos e protozoários, embora para estes últimos se utilizem termos como antimicóticos e protozoocidas. Por convenção, no caso dos vírus prefere-se a denominação antivirais.

19 3. Controle de microorganismos por agentes biológicos e químicos. 3.2 Antibióticos: história e classes. A maioria dos antibióticos é derivada de compostos produzidos por fungos como o Penicilium (penicilinas) ou bactérias como Streptomyces. (estreptomicinas). As chamadas novas gerações de antibióicos são modificações sintéticas sucessivas das fórmulas naturais. Isto é necessário em função da resistência aos antibióticos. Porque as bactérias ficam resistentes? Os antibióticos destinados a controlar bactérias são geralmente categorizados em restritos e de amplo espectro. Os primeiros têm a sua função restrita a determinados grupos de bactérias, frequentemente das categorias Gram-negativas e Gram-positivas, que é uma classificação advinda da resposta a corantes. Os antibióticos de amplo espectro agem sobre vários grupos.

20 3. Controle de microorganismos por agentes biológicos e químicos. 3.2 Antibióticos: história e classes. Os antibióticos podem ainda ser separados em bactericidas (a maioria) e bacteriostáticos, conforme eliminem ou estabilizem o crescimento bacteriano, sendo que neste caso a função eliminadora é do sistema imune do hospedeiro. Quanto ao efeito terapêutico ambos têm a mesma função. As vias de administração dos antibióticos podem ser: oral, intravenosa ou tópica, neste caso cutânea, em colírios, etc. Quais os efeitos colaterais dos antibióticos?

21 3.2 Antibióticos: história e classes. Primeiros quimioterápicos e antibióticos. A quinina é conhecida desde o século XVII para tratamento da malária. Era extraída da casca da cinchona no Peru antigo (ver figura).

22 3.2 Antibióticos: história e classes. O mercúrio era usado desde 1495 para o tratamento da sífilis. O problema deste e outros quimioterápicos era a toxicidade para o hospedeiro da infecção. Somente no início do século XX a quimioterapia avançou junto a tradição microbiana da época. Paul Ehrlich descobriu o tratamento da sífilis com pouco risco para o paciente, com a substituição do arsênico puro até então usado, por uma mistura com compostos orgânicos. A toxicidade ficava muito reduzida. Denominou o composto de Ehrlich 606 e depois de salvarsan, para a sífilis e outros espiroquetas (Nobel de 1908).

23 3.2 Antibióticos: história e classes. Nos 30 e início dos anos 40 Domagk e depois Trefouel descobriram primeiro que um derivado de corante, o Prontosil controlava estreptococcias de camundongos. Depois ficou estabelecido que era um derivado, a sulfonamida que agia contra as bactérias. As sulfonamidas passaram a ser os primeiros antibióticos usados em larga escala. A ação das sulfonamidas consiste em esgotar as enzimas bacterianas envolvidas na síntese de THFA, co-enzima essencial na síntese de aminoácidos e timidina, componente do DNA. Este esgotamento decorre na composição das sulfonamidas em que há um similar do PABA, precursor da THFA.

24 3.2 Antibióticos: história e classes. Por outro lado o conhecimento de alguns microorganismos inibiam outros era antigo. Somente em 1929 no entanto, Alexander Fleming comprovou a ação de um composto produzido por um fungo do gênero Penicillium, (P. notatum). Vsobre culturas de Staphylococcus aureus, a penicilina.

25 3.2 Antibióticos: história e classes. Na década de 30, no Reino Unido, os antibióticos começaram a ser produzidos, seguindo a descoberta de Fleming. Chain e Florey purificaram a penicilina que passou a ser usada em larga escala especialmente durante a 2ª Guerra. No período ainda, Dubos isolou a gramicidina, usada em feridas e úlceras (para Gram-positivos) e Waksman descobriu a estreptomicina, produzida pela bactéria Streptomyces griseus.

26 3.2 Antibióticos: história e classes. 3.1 Tipos de antibióticos baseados na estrutura química Beta-lactâmicos. Incluem as penicilinas, monobactâmicos, cefalosporinas e carapenens. Contém um núcleo básico, o anel B-lactâmico, composto de 3 átomos de carbono e 1 de nitrogênio (ver na referência). As penicilinas e os derivados serão comentados. As penicilinas próximas das naturais são a penicilina G e V. A penicilina G é a benzilpenicilina. É administrada por via parenteral. Seus usos incluíam endocardite, gonorréia, pneumonia, sífilis, etc. A penicilina V é a fenoximetilpenicilina, a ser administrada por via oral, originalmente para afecções da boca, garganta e dentes.

27 3.2 Antibióticos: história e classes Beta-lactâmicos. As amoxilina e ampicilina foram desenvolvidas depois como penicilinas orais e são ainda muito usadas. O advento de resistência às penicilinas deriva da produção de penicilinase pelas bactérias. Inibidores da penicilinase como o ácido clavulânico são geralmente componentes das atuais penicilinas. As penicilinas semi-sintéticas como a feneticilina e meticilina são usadas também em caso de resistência.

28 3.2 Antibióticos: história e classes Beta-lactâmicos. Mais recentemente um outro grupo de beta-lactâmicos, as cefalosporinas, em várias gerações, foram desenvolvidas. Estas têm largo espectro e derivam de compostos produzidos pelo fungo marinho Acremonium.

29 3.2 Antibióticos: história e classes Macrolídeos Categoria da eritromicina, derivada do Streptomyces erythreus. São semelhantes às penicilinas mas com largo espectro. A eritromicina é a 1 opção da terapêutica específica da coqueluche, difteria, legioneloses e infecções por micoplasma. Excelente eficácia nas infecções genitais e pélvicas (uretrites, colpites, anexites, prostatites) por clamidias e ureaplasma. A eritromicina é indicada nas infecções em que se utiliza a penicilina. É o ATB de escolha em pacientes com hipersensibilidade à penicilina. Empregada com bons resultados nas infecções estreptocócicas da faringe, pele e PN pneumocócicas e estreptocócicas.

30 3.2 Antibióticos: história e classes Macrolídeos Têm sido indicada na sífilis sem envolvimento neurológico; porém, na sífilis da gestante, não oferece segurança no tratamento da infecção fetal. Utilizada como droga alternativa (alérgicos e penicilina) para profilaxia da MR febre reumática e endocardite em pacientes que vão se submeter a procedimentos dentais. Outros macrolídeos recentes são a azitromicina e claritromicina Aminoglicosídeos Categoria da estreptomicina, usada para Gram-negativos e para tuberculose. Atualmente a TB é tratada com isoniazida, um quimioterápico, combinada com rifampicina, antibiótico também produzido por Streptomyces. Outro aminoglicosídeo é a neomicina, usada em preparações tópicas.

31 3.2 Antibióticos: história e classes Tetraciclinas Divididas em tetraciclina, clortetraciclina, oxitetraciclina, doxiciclina e minociclina, que as divide em tetraciclinas de curta e longa duração. São produzidas também por bactérias do gênero Streptomyces. São antibióticos de amplo-espectro, usados para brucelose, infecções urinárias, micoplasmas riquétsias, clamídias e complementares na malária.

32 3.2 Antibióticos: história e classes Outros: cloranfenicol, quinolonas. O cloranfenicol é produzido por Streptomyces venezuelae ou é sintetizado, por ser simples. Tem largo espectro, mas causa reações adversas como a anemia aplástica. É usado por exemplo contra a febre tifóide Quinolonas. São quimioterápicos inibidores do DNA em bactérias Gramnegativas (primeira geração), ou têm amplo espectro (segunda e terceira geração). A inibição do DNA bacteriano resulta da inibição da DNA girase, uma enzima necessária para a conformação ou enrolamento correto do filamento. Um derivado das quinolonas muito conhecido é a ciprofloxacina.

33 3.2 Antibióticos: história e classes. 3.2 Mecanismos de ação. O mecanismo de ação dos quimioterápicos e antibióticos naturais, embora complexo, geralmente situa-se nas categorias: Inibição da síntese da parede celular bacteriana; Lesão da membrana celular bacteriana ou fúngica; Inibição da síntese dos ácidos nucléicos, formação do DNA ou outras síntese protéicas. 3.3 Exercício: Escolher um grupo de antibióticos e descrever os produtos e modo de ação.

34 3.2 Antibióticos: história e classes. + +

35 3.2 Antibióticos: história e classes. Cloranfenicol Polipeptídeos Colistina (Polimixina E) Bacitracina Vancomicina Viomicina Rifamicina Antimicóticos Polienos Nistatina Anfotericina B Griseofulvina

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