UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA PIBIC : CNPq, CNPq/AF, UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PARD, PIAD, PIBIT, PADRC E FAPESPA RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO Período: 08 /2014 a 07 /2015 ( ) PARCIAL (X) FINAL IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO Título do Projeto de Pesquisa (ao qual está vinculado o Plano de Trabalho): PRODUÇÃO SUSTENTÁVEL DE MUÇUÃS NO MARAJÓ-PA: estratégias e avanços na domesticação Nome do Orientador: Diva Anelie de Araújo Guimarães Titulação do Orientador: Doutorado Instituto/Núcleo: Instituto de Ciências Biológicas Laboratório: Laboratório de Reprodução Animal Título do Plano de Trabalho: Determinação de micro-organismos presentes em muçuãs (Kinosternon scorpioides) mantidos em cativeiro Nome do Bolsista: Mateus Sousa de Almeida Tipo de Bolsa: ( ) PIBIC/ CNPq ( ) PIBIC/CNPq AF ( ) PIBIC /CNPq- Cota do pesquisador ( X) PIBIC/UFPA ( ) PIBIC/UFPA AF ( ) PIBIC/ INTERIOR ( ) PIBIC/PARD ( ) PIBIC/PADRC ( ) PIBIC/FAPESPA ( ) PIBIC/ PIAD ( ) PIBIC/PIBIT ( ) JTC/CAPES

2 Resumo do Projeto de Pesquisa: A criação de animais silvestres em cativeiro de forma conservacionista é fundamental, uma vez que proporciona o desenvolvimento da educação ambiental e constitui uma importante reserva genética de fauna que poderá ser manejada em conjunto com as comunidades tradicionais. Também oferecem condições para o desenvolvimento de pesquisas, muitas vezes, impossíveis de serem conduzidas em animais de vida. Na ilha do Marajó-PA, o muçuã (Kinosternon scorpioides) é criado para fins científicos pela Embrapa Amazônia Oriental, que conta com um plantel legalizado pelo órgão competente. Esse animal é um dos mais ameaçados da Amazônia, por ser muito apreciado na culinária e ser um dos mais utilizados na alimentação das comunidades tradicionais, dos vaqueiros dos campos do Marajó e ribeirinhos. Os maiores entraves para criação em cativeiro dessa espécie é a sustentabilidade na produção de filhotes e o manejo alimentar. Desta forma, a compreensão das condições necessárias para a incubação dos ovos e a determinação das exigências nutricionais desses quelônios é fundamental, tanto para o entendimento da sua biologia e ecologia como para a realização de trabalhos de conservação in-situ e ex-situ. Assim, objetiva-se nesse projeto avaliar à exigência nutricional na fase de postura, submetendo os ovos a diferentes temperaturas, para posterior seleção e melhoramento genético da espécie. Para tal, serão utilizadas 500 fêmeas e 50 machos na fase de reprodução, que deverão ser divididos em cinco tratamentos de níveis de cálcio (5,0; 5,7; 6,4; 7,1 e 7,7% Ca), com 10 repetições. Os ovos serão e levados às incubadoras artificiais sendo incubados em 10 chocadeiras com diferentes temperaturas (Testemunha, 26º a 34ºC), com 200 repetições, onde cada ovo será uma repetição. Após a eclosão, os animais serão pesados e submetidos à biometria, sendo realizada a determinação do sexo. Para todos os experimentos serão utilizados delineamentos inteiramente casualizados. Para todos os dados, serão efetuadas as análises estatísticas a partir da técnica de regressão e variância (ANOVA). Quando o teste F for significativo, as médias serão comparadas pelo Teste de Tukey a 5%.

3 Título do Plano de Trabalho: Determinação de micro-organismos presentes em muçuãs (Kinosternon scorpioides) mantidos em cativeiro 1- INTRODUÇÃO Apesar de concentrar a maior biodiversidade do planeta, a Amazônia sofre graves ameaças nos seus vários ecossistemas, onde espécies animais e vegetais nativos desaparecem antes mesmo de serem conhecidas e catalogadas. Ações antrópicas nas últimas décadas como a destruição dos habitats naturais, alteração nos ecossistemas e o manejo inadequado das espécies têm gerado riscos de extinção aos grupos genéticos animais pertencentes à fauna silvestre (MARQUES; COSTA, 2001; MARQUES et al., 2003). A criação de animais silvestres em cativeiro de forma conservacionista é fundamental, uma vez que proporciona o desenvolvimento da educação ambiental e constitui uma importante reserva genética de fauna que poderá ser manejada em conjunto com as comunidades tradicionais. Também oferecem condições para o desenvolvimento de pesquisas, muitas vezes, impossíveis de ser conduzido em animais de vida selvagem, como no caso do muçuã (Kinosternon scorpioides) um réptil da ordem dos quelônios, que são uma das tartarugas brasileiras menos conhecidas pela ciência. Segundo Huchzereyer (1993), as bactérias da espécie de Clostridium perfringens, Salmonella spp, Escherichia coli, Klebsiella, Campylobacter e Pseudomonas aeruginosa são os principais agentes etiológicos responsáveis por quadros de enterite em animais silvestres (MARINHO et al., 2004). No entanto, até o momento são escassas as informações a respeito dos micro-organismos que fazem parte do trato gastrintestinal de muçuãs. De acordo com Matsubara (2005) aves, repteis e suínos, são as principais fontes de Salmonella, sendo considerados portadores sadios, quando não demonstram sintomas ou alterações orgânicas em virtude da presença do agente. Segundo Bessa (2004), a qualidade microbiológica de produtos ingeridos pela população é um aspecto crucial para saúde pública, estando Salmonella entre os micro-organismos mais importantes para segurança alimentar se destacado como causadora de toxico infecções alimentares. Em virtude do citado anteriormente espera-se determinar os micro-organismos presentes no conteúdo gastrintestinal de muçuãs, para conhecer a microbiota que constitui o sistema digestivo desses animais e verificar a ocorrência de contaminação causada por bactérias patogênicas. Para assim ter possibilidade futura de controlar possíveis infecções por micro-organismos patogênicos comuns aos seres humanos e aos animais.

4 O muçuã é uma das tartarugas brasileiras das menos conhecidas pela ciência e, provavelmente, uma das mais ameaçadas. Na ilha do Marajó vivem nos campos alagados, servindo como alimento e como opção de renda à pequena produção ou familiar comunitária. Esse animal vem despertando o interesse, inclusive para a criação em cativeiro. No entanto, para a criação do muçuã há necessidade do melhor entendimento do processo reprodutivo da espécie, tendo em vista a carência de informações e estudos relacionados ao assunto. Para isso, é importante avaliar os eventos relacionados ao manejo da postura e a compreensão das condições necessárias para a incubação e eclosão dos ovos desses quelônios. Assim como o objetivo desse plano de trabalho é identificar patógenos nos animais e nos ovos, bem como, instituir um manejo sanitário dos quelônios em cativeiro. 2- OBJETIVOS Objetivo geral Identificar os micro-organismos presentes nas etapas do manejo de muçuãs mantidos em cativeiro, utilizando o isolamento microbiológico. Objetivos específicos 1. Verificar a ocorrência de bactérias presentes nos ovos e cloaca dos animais; 2. Identificar os micro-organismos presentes na água e areia dos recintos nos animais mantidos em cativeiro, durante o período seco e chuvoso. 3- METODOLOGIA 1- Coleta e transporte das amostras O experimento foi realizado no Campus Experimental Ermerson Salimos - CEMES/BAGAM/ Embrapa (Banco de Germoplasma da Amazônia Oriental), localizado, de acordo com as coordenadas e 54 de longitude W e e 21 de latitude S, na mesorregião

5 geográfica Marajó, à margem direita do rio Paracauari, distando por via terrestre cerca de 17 km da cidade de Salvaterra - Pará. As coletas de amostras cloacais de muçuãs foram realizadas em dois períodos, sendo a primeira coleta feita durante o inicio do verão de 2014, num total de 36 animais, cinco ovos e amostras de areia que serviam de substrato para a incubação dos ovos e, a outra coleta foi realizada no final do verão de 2015, colhendo-se 30 amostras cloacais. Todos os animais foram identificados individualmente com o uso de microchip da marca Partners, este é um micro-circuito eletrônico, estéril, antimicratório do tamanho de um grão de arroz (12x2mm), em conformidade com as normas ISO, CE, NBR e padrões internacionais. As amostras foram colhidas em duplicata com auxílio de swabs estéreis, introduzidos diretamente na cloaca dos animais, sendo que um swab foi armazenado em tubo contendo meio de transporte Stuart e o outro em água peptonada a 1%, devidamente acondicionados em uma caixa isotérmica com gelo e encaminhados ao Laboratório de Tecnologia Biomolecular - LTB/UFPA. As amostras de areia e ovos foram obtidas e armazenadas em frascos estéreis, em temperatura ambiente. 2- Análise microbiológica As amostras cloacais e amostras obtidas dos ovos e areia ao chegarem ao laboratório foram semeadas em placas de Petri contendo Agar MacConkey e submetidas a temperaturas de 37 ºC em estufa bacteriológica por horas. Simultaneamente, os tubos com água peptonada contendo os swabs foram incubados a 37 ºC durante 24 horas. Após este período as amostras foram imersas em caldo Rappaport a 37 ºC durante 24 horas e, semeadas em placas de Petri contendo Agar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD), meio seletivo para crescimento da bactéria Salmonella sp. e foram colocadas para incubar em estufas bacteriológicas a temperatura de 37 C durante horas. Após o crescimento as bactérias foram submetidas à coloração pelo Gram e posteriormente foram realizadas 14 provas bioquímicas para a caracterização metabólica bacteriana: TSI (triple sugar iron), fermentação de glicose, maltose, sacarose, manitol, vermelho de metila, voges prokauer, produção de indol, LIA (agar ferro lisina), uréase, fenilalanina desaminase, motilidade, produção de gás e utilização de citrato. 4- RESULTADOS Do total de 66 amostras cloacais colhidas nos dois períodos, foram isoladas 89 cepas bacterianas, sendo obtidos 51bactérias na primeira colheita e 38 na segunda colheita, sendo que

6 foram identificados 10 gêneros bacterianos, com destaque para Escherichia, Proteus, Edwardsiella, Klebsiella, Enterobacter, Salmonella, Citrobacter, Alcaligenes, Shigella, Providencia e Serratia. Os gêneros Proteus e Klebsiella foram isolados somente na primeira colheita e a bactéria Serratia foi isolado apenas na segunda colheita, conforme demonstrado na Tabela 1. Tabela 1. Resultado das análises microbiológicas realizadas em 66 amostras cloacais de muçuãs criadas na Ilha de Marajó, Micro-organismos 1ª colheita/2014 2ª colheita/2015 n % n % Escherichia coli 10 19, Proteus sp 10 19,6 0 0 Edwarsiella sp. 6 11, Klebsiella sp. 6 11,7 0 0 Enterobacter sp. 5 9,8 6 15,7 Salmonella sp. 5 9,8 6 15,7 Citrobacter sp. 4 7,8 3 7,8 Alcaligenes sp. 2 7,8 3 7,8 Shigella sp. 2 3,9 1 2,6 Providencia sp. 2 3,9 1 2,6 Serratia sp ,6 Total As amostras do ovo e areia não puderam ser processadas em virtude de chegarem deteriorados no laboratório, prejudicando as análises microbiológicas. 5- DISCUSSÃO Dentre as bactérias da família Enterobacteriaceae encontradas presentes na cloaca de muçuãs, criadas em cativeiro, merecem destaque Escherichia coli, Edwarsiella sp. e Proteus sp. que foram as bactérias mais frequentes, além da bactérias Salmonella sp e Shigella sp que são comumente implicados em causar doenças em seres humanos e animais, apresentando riscos de saúde pública.

7 O percentual de 20,2% de isolados de E. coli foi inferior ao encontrado por Benites, et al. (2013), o qual apresentou uma frequência de 67% de swabs cloacais de jabutis domiciliados e de Meyer-Junior et al (2006), que isolaram E. coli a partir de swabs cloacais de tartarugas da Amazônia (Podocnemis expansa), encontrando um percentual de 66%, entretanto, os mesmos autores relataram um índice de 26% obtidos de muçuãs, resultados próximos ao presente estudo. A presença de Salmonella, no presente estudo apresentou um percentual de 12,3%, inferior ao encontrado por Strohl et al. (2004) que ao avaliarem 52 quelônios encontraram 23% da bactéria. Entretanto, foi superior ao isolado por Benites, et al. (2013), em que ao analisarem 100 quelônios, conseguiram isolar 7% de positivos para Samonella sp. No entanto, Saelinger et al. (2006) analisaram 94 quelônios, e não isolaram nenhuma amostra Salmonella. Como Salmonella está frequentemente sendo incriminada como causadora de doenças nos seres humanos, são necessárias precauções no consumo de carne mal cozida, para evitar uma posterior contaminação. 6- CONCLUSÃO Conclui-se que o percentual de isolamento de enterobacterias obtidas da cloaca de muçuãs foi baixo, contudo foram isoladas espécies com potencial patogênico como o gênero Salmonella sp. e Shigella sp. que são comumente implicados em causar doenças em seres humanos e animais, apresentando riscos de saúde pública. 7- PUBLICAÇÕES Foi aceito o resumo intitulado Enterobacterial Presence in Cloacae of Scorpion mud Turtles (Kinosternon scorpioides) Bred in Captivity para apresentação no 28º Congresso Brasileiro de Microbiologia, na área de microbiologia veterinária, subárea Métodos de Diagnóstico microbiológico e sensibilidade aos antimicrobianos, que será realizado de 18 a 22 de outubro de 2015, no Centro de Convenções de Florianópolis, Santa Catarina, Brasil.

8 8- BIBLIOGRAFIA CORREA, I. M.O. et al. Detecção de fatores de virulência de Escherichia coli e análise de Salmonella spp. em psitacídeos. Pesq. Vet. Bras., Rio de Janeiro, v. 33, n. 2, p , Feb Available from < access on 07 Aug < BENITES N.R, et al. Microbiota bacteriana e fúngica presentes na cloaca de Jabutis-Piranga (Geochelone carbonaria) criados em domicílio. Vet. e Zootec mar.; 20(1): CASTRO, A. B. Biologia reprodutiva e crescimento do muçuã Kinosternon scorpioides (Linnaeus,1776 ) em cativeiro. 2006, 76p, UFPA, Belém, 17/09/2006. MEYER-JUNIOR J.C., et al. Determinação qualitativa das enterobactérias presentes no trato digestivo da tartaruga da Amazônia (Podocnemis expansa) mantidas em cativeiro. In: Anais do 7º Congresso Internacional sobre Manejo de Fauna Silvestre na Amazônia e América Latina; 2006, Ilhéus. Ilhéus-BA: UESC; 2006 SAELINGER C. et al. Prevalence of Salmonella spp. in cloacal, fecal, and gastrointestinal mucosal samples from wild North American turtle. J Am Vet Med Ass. 2006; 229: STROHL P. et al. Prevalence of Salmonella shedding in faeces by captive chelonians. Vet Rec. 2004; 154: PARECER DO ORIENTADOR: O aluno cumpriu as metas do plano de trabalho proposto, mostrando participação nas tarefas. DATA: 10 de agosto de 2015 ASSINATURA DO ORIENTADOR