UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ CARLA ROZILENE GUIMARÃES SILVA OLIVEIRA

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ CARLA ROZILENE GUIMARÃES SILVA OLIVEIRA AVALIAÇÃO FETO-PLACENTÁRIA DE CAPRINOS TRANSGÊNICOS PARA O FATOR ESTIMULANTE DE COLÔNIAS DE GRANULÓCITOS HUMANO (hg-csf) FORTALEZA-CEARÁ 2011

2 2 CARLA ROZILENE GUIMARÃES SILVA OLIVEIRA AVALIAÇÃO FETO-PLACENTÁRIA DE CAPRINOS TRANSGÊNICOS PARA O FATOR ESTIMULANTE DE COLÔNIAS DE GRANULÓCITOS HUMANO (hg-csf) Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de pequenos ruminantes. Orientador: Prof. Dr. Dárcio Ítalo Alves Teixeira. FORTALEZA-CEARÁ 2011

3 3 CARLA ROZILENE GUIMARÃES SILVA OLIVEIRA AVALIAÇÃO FETO-PLACENTÁRIA DE CAPRINOS TRANSGÊNICOS PARA O FATOR ESTIMULANTE DE COLÔNIAS DE GRANULÓCITOS HUMANO (hg-csf) Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Aprovada em: 08/12/2011 Conceito: satisfatório Nota obtida: 9,0 BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Dárcio Ítalo Alves Teixeira Universidade Estadual do Ceará Orientador Profa. Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva Universidade Estadual do Ceará Examinadora Dr. Jorge André Matias Martins Universidade Federal do Ceará Examinador

4 4 Dedico À minha filha Flávia Oliveira, por ser minha musa inspiradora para continuar firme nos meus objetivos.

5 5 A amizade desenvolve a felicidade e reduz o sofrimento, duplicando a nossa alegria e dividindo a nossa dor. Joseph Addison.

6 6 AGRADECIMENTOS À Universidade Estadual do Ceará, por ter disponibilizado o seu espaço para a realização do meu trabalho. Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV), pelo apoio e oportunidade para a realização do Mestrado, pela dedicação e organização tanto da coordenadoria, quanto da secretaria. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela concessão de bolsa de estudos. A Deus, por ter me dado a oportunidade de desfrutar as belezas desta vida, pelos momentos de aprendizado, paciência e saúde, pelo conforto nos momentos de tristeza e pela força e motivação para seguir lutando e enfrentando todas dificuldades para a conclusão deste trabalho. Ao meu pai, Raimundo Carlos e à minha mãe, Thanya Rozilene, pelo apoio, carinho e educação, pela coragem de largar tudo em busca dos meus objetivos e por todo amor e encorajamento para que eu conseguisse chegar até aqui. Ao meu esposo Rodrigo Oliveira, por ser um ótimo marido, um verdadeiro amigo e um maravilhoso pai, por sempre me dar forças para continuar, apoiando e incentivando as minhas decisões e pela sua dedicação e seu esforço durante esse período. À minha filha Flávia Oliveira por ser a minha motivação sempre, por me dar ânimo a cada dia para continuar com a cabeça erguida e sempre com o sorriso no rosto, mesmo interrompendo o período de aleitamento materno para frequentar as disciplinas, pela nossa separação aos nove meses de idade e pela distância, o nosso vínculo não foi afetado e se mantém forte. Ao meu Orientador Prof. Dr. Dárcio Ítalo Alves Teixeira pela amizade, confiança e compreensão, por sua orientação e colaboração para a realização e conclusão deste trabalho e pelos ensinamentos compartilhados. Ao prof. Dr. Vicente José de Figueirêdo Freitas por ter dado toda a assistência, por ter concedido a estrutura do Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução (LFCR) para a realização do meu projeto e pelos ensinamentos. À Profa. Dra. Luciana Magalhães Melo pelo incentivo, conselho e apoio, além das importantes sugestões para a melhoria deste trabalho. À Profa. Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva pelas sugestões e colaboração durante a minha qualificação.

7 7 À Dra. Alexsandra Fernandes Pereira pela ajuda durante a seleção do mestrado, pelas palavras de força, pelos conselhos, por sempre estar disposta a ajudar quando precisamos, pela amizade e pelas sugestões na minha dissertação. À M.Sc Joanna Maria Gonçalves de Souza por sua importante contribuição durante os preparativos do meu experimento, além de sua fundamental ajuda na realização do mesmo, obrigada pela grande amizade que construímos, pelo companheirismo e pelas importantes sugestões. À M.Sc. Raylene Ramos Moura por sempre estar disponível a ajudar e sempre com boa vontade, por compartilhar os seus conhecimentos com seus colegas de laboratório e por incentivar a sermos mais responsáveis e firmes em nossas decisões, obrigada por sua amizade, conselhos e compreensão, isso foi muito importante durante todo o período de mestrado e deu forças para continuar. Ao M.Sc. Ribrio Ivan Tavares Pereira Batista pela ajuda durante a execução do experimento, por sua contribuição durante a minha qualificação, pelos momentos de descontração, pela confiança em ter deixado eu morar em sua residência durante os últimos meses e por amizade. À Iana Sales Campelo pela companhia, amizade, por ser prestativa aos que pedem ajuda, pelas inúmeras sugestões nos meus slides (antes das apresentações) e por ser essa pessoa maravilhosa, é um exemplo para muita gente. Aos alunos de iniciação científica Carlos Henrique de Sousa Melo e Antônio Carlos de Albuquerque Teles Filho (Cacá) pela colaboração no meu experimento. Ao Henrique por sua amizade, confiança e paciência, por toda ajuda oferecida antes, durante e depois da realização do meu experimento e pelo seu bom humor, que é contagiante, faz muito bem quem está por perto. Ao Cacá por também ter tido importante participação para a realização do meu projeto, pela companhia e pelos momentos de alegria que tornaram esse período mais agradáveis. À toda equipe do Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução (LFCR), Agostinho Soares de Alcântara Neto, Deisy Johana Diaz Sanchez, Maiara Pinheiro Vieira, Maria Claudia dos Santos Luciano, Talles Monte de Almeida. Aos novatos Thaíse Cristine Ferreira de Carvalho, Flávio Carolino de Souza Filho, Tatiana Oliveira Pessoa, Murilo Torres de Melo Pedrosa e Otávio Bezerra Ferreira Neto, pelos momentos de descontração que tornam os dias mais agradáveis. A todos aqueles que passaram pelo laboratório: Francisco Carlos de Sousa, Victor Hugo Vieira Rodrigues, Érica Souza Albuquerque, Jefferson da Silva Ferreira e Rebeca Frota Freire, obrigada pela ajuda no meu experimento, pelos momentos de descontração, por todo tempo que passamos juntos, pelo aprendizado e pela amizade e

8 8 companheirismo. Não poderia deixar de agradecer aos funcionários do LFCR, Antônio César Camelo, Selmar Alves da Silva e Cícero Maximo do Nascimento, pela colaboração e apoio durante o meu experimento. Aos professores do PPGCV pela importante ajuda e pelas orientações durante esse período e a todos aqueles que de forma direta e indireta colaboraram para que esse trabalho desse certo. Muito obrigada!

9 9 RESUMO O objetivo deste trabalho foi avaliar o desenvolvimento morfológico e morfométrico de embriões e fetos caprinos transgênicos para o Fator Estimulante de Colônias de Granulócitos humano (hg-csf), através do uso da ultrassonografia em tempo real. Foram utilizadas quatro cabras não transgênicas (NT) gestantes após fertilização usando um macho transgênico (T) para o hg-csf da raça Canindé. Os exames ultrassonográficos foram realizados nos 30, 40 dias (via transretal, transdutor linear, 6,0/8,0 MHz) e nos 50, 60, 90 e 120 dias de gestação (via transabdominal, transdutor convexo, 3,5/5,0 MHz). As imagens foram gravadas para posterior mensuração dos parâmetros do diâmetro da vesícula embrionária (DVE), o comprimento crânio caudal (CCC), os diâmetros do tronco (DT), do abdômen (DA), do cordão umbilical (DCU) e dos placentomas (DPL) usando um programa computacional Image J, com prévia calibração para cada frequência utilizada. Foram ainda avaliadas a organogênese e formação esquelética, além da viabilidade embrionária/fetal com a presença da atividade cardíaca (Frequência Cardíaca Fetal - FCF) e dos movimentos do concepto. Após o parto, foi realizado o teste de DNA em todas as crias. Os dados estão apresentados de forma descritiva e expressos como média ± erro padrão para os conceptos transgênicos e não transgênicos. Após análise de PCR foram identificados quatro caprinos transgênicos (dois machos e duas fêmeas) e dois machos não transgênicos. Os primeiros parâmetros mensurados foram o DVE e o CCC nos dias 30, 40, 50 e 60. Com o crescimento dos conceptos, a partir dos 50 dias foi possível avaliar também o DT, DA, DCU, DPL. Os valores médios de todos os parâmetros apresentaram um aumento gradativo com o avançar da gestação. Os conceptos iniciaram sua diferenciação a partir de 40 dias. O coração foi detectado em todos os exames e diferenciação das câmaras cardíacas a partir dos 50 dias, os compartimentos gástricos, fígado e rins foram visualizados a partir aos 60 dias. A visualização de várias estruturas ósseas ocorreu aos 60 dias, com visualização de áreas hiperecóicas formando o crânio, caixa torácica, coluna vertebral e ossos longos. Em todos os conceptos a FCF diminuiu à medida que a avançou a gestação, da primeira observação aos 40 dias (T: 215,50 bpm; NT: 239,50 bpm) até a última aos 120 dias (T: 196,25 bpm; NT: 170 bpm). Todos os fetos apresentaram movimentos em todos os exames ultrassonográficos, mais intenso aos 50 dias de gestação. Ambos os conceptos caprinos transgênicos e não transgênicos tiveram um crescimento e morfologia semelhantes e permaneceram viáveis durante todo o período experimental. Portanto, presença do gene exógeno no genoma desses animais não interferiu no desenvolvimento embrionário/fetal e placentário.

10 Palavras-chave: Caprinos. Fetometria. hg-csf. Transgênese. Ultrassonografia. 10

11 11 ABSTRACT The objective of this study was to evaluate the morphometric and morphological development of transgenic goat embryos and fetuses for human Granulocyte Colony Stimulating Factor (hg-csf), through the use of ultrasound in real time. Four pregnancies in non-transgenic goats (NT) were obtained after fertilization using one transgenic (T) male for the hg-csf. Ultrasound examinations were performed at 30, 40 days (transrectal via, linear array transducer 6.0/8.0 MHz) and 50, 60, 90 and 120 days of pregnancy (transabdominal via, convex transducer, 3.5/5.0 MHz). The images were recorded for later measurement of the parameters of the diameter of embryonic vesicle (DEV), crown-rump length (CRL), diameter of the trunk (DT), abdomen (DA), the umbilical cord (DUC) and the placentomes (DPL) using a computer software Image J with prior calibration for each frequency used. Were also evaluated as organogenesis and formation of skeletal, and the viability embryo/fetus with presence of cardiac activity (Fetal Heart Rate - FHR) and the movements of the fetus. After parturition DNA testing was conducted in all offspring. The data are presented descriptively and expressed as means ± SEM for transgenic and non-transgenic conceptus. After PCR analysis four transgenic goats (two males and two females) and two non-transgenic males were identified. The initial parameters were measured in the DEV and CRL days 30, 40, 50 and 60. With the growth of fetuses, from 50 days could also evaluate the DT, DA, DUC, DPL. The average values of all parameters showed a gradual increase with advancing gestation. The conceptus started their differentiation at 40 days. The heart was detected in all examinations and the heart chambers were assessed at 50 days. Gastric compartments, liver and kidneys were observed at 60 days. The visualization of various bone structures occurred at 60 days, with visualization of hyperechoic areas forming the skull, rib cage, spine and long bones. In all fetuses the FHR decreased as the pregnancy progressed, the first observation at 40 days (T: bpm; NT: bpm) to the last at 120 days (T: bpm; NT: 170 bpm). All fetuses presented movements in all ultrasound examinations, more intense at 50 days of gestation. Both transgenic and non-transgenic goat embryos and fetuses had a growth and morphology similar and remained viable throughout the experimental period. Therefore, presence of exogenous gene in the genome of these animals did not affect the embryonic/fetal and placental develop. Keywords: Fetometry. Goats. hg-csf. Transgenesis. Ultrasound.

12 12 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Casal de fundadores transgênicos para o hg-csf. (A) Fêmea. (B) Macho Figura 2. Imagem ultrassonográfica de uma gestação dupla (setas) aos 40 dias de gestação obtidos utilizando um transdutor transabdominal de 5 MHz Figura 3. Imagens típicas observadas por ultrassonografia transretal em tempo real com um transdutor linear 7,5 MHz. (A) Vesícula embrionária cheia de líquido no lúmen do útero de uma fêmea caprina aos 22 dias de gestação. (B) Concepto (cabeça a esquerda) e o cordão umbilical aos 34 dias de gestação Figura 4. Visualização do rúmen (abaixo à esquerda) e do rim (acima à direita) de ovino aos 104 dias de gestação. KIL: Kidney lenght (comprimento renal) Figura 5. Aferição da freqüência cardíaca fetal (FCF) utilizando o Modo-M em um feto caprino aos 90 dias de gestação Capítulo 1 Figure 1. Fetometry results. (A) Diameter of embryonic vesicle, and (B) Crown-rump length of embryos and fetuses of transgenic (T) and non-transgenic (NT) goats on days 30, 40, 50 and 60 of gestation Figure 2. Fetometry results. (A) Diameter of the thorax, (B) Diameter of the abdomen, (C) Diameter of umbilical cord, and (D) Diameter of placentome of embryos and fetuses of transgenic (T) and non-transgenic (NT) goats on days 50, 60, 90 and 12 gestation Figure 3. Fetal heart rate of embryos and fetuses of transgenic (T) and non-transgenic (NT) goats on days 40, 50, 60, 90 and 120 of gestation... 42

13 13 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CEUA - Comissão de Ética para o Uso de Animais CCC - Comprimento crânio caudal cm - Centímetro CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CQB - Certificado de Qualidade de Biossegurança CRL - Crown-rump length CTNbio - Comissão Técnica Nacional de Biossegurança DA - Diameter of the abdomen (Diâmetro do abdômen) DBP - Diâmetro biparietal DCU - Diâmetro do cordão umbilical DEV - Diameter of embryonic vesicle DNA - Desoxyribose Nucleic Acid (Ácido Desoxirribonucléico) DO - Diâmetro orbital DPL - Diameter of the placentomes (Diâmetro dos placentomas ) DT - Diameter of the trunk (Diâmetro do tronco) DUC - Diameter of the umbilical cord (Diâmetro do cordão umbilical) DVE - Diâmetro da vesísula embrionária FCF - Frequência cardíaca fetal FHR - Fetal heart rate (Frequência cardíaca fetal) FUNCAP - Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento g - Grama (s) GnRH - Gonadotropin Releasing Hormone (Hormônio liberador de gonadotrofina) h - Hora hg-csf - Human Granulocyte Colony Stimulating Factor (Fator Estimulante de Colônias de Granulócitos humano IATF - Inseminação Artificaial em Tempo Fixo i.m. - Intramuscular LFCR - Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução MAP - Acetato de Medroxiprogesterona mg - Miligrama (s) MHz - Megahertz

14 14 ml - Mililítro mm - Milímetro NT - Non-transgenic (Não transgênico) PB - Proteína bruta PCR - Polymerase chain reaction (Reação em cadeia da polimerase) T - Transgenic (Transgênico) TNCS - Transferência Nuclear de Células Somáticas UECE - Universidade Estadual do Ceará UI - Unidades internacionais µg - Micrograma

15 15 SUMÁRIO PÁG. 1. INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Transgênese animal Transgênese caprina Importância da ultrassonografia em caprinos Diagnóstico de gestação por ultrassonografia Fetometria Morfologia embrionária/fetal Viabilidade embrionária/fetal JUSTIFICATIVA HIPÓTESE CIENTÍFICA OBJETIVOS Objetivo Geral Objetivos Específicos CAPÍTULO CONCLUSÕES PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS APÊNDICES... 56

16 16 1. INTRODUÇÃO A produção de animais transgênicos nesta década possui um interesse científico, estes podem ser utilizados para o estudo dos genes e sua regulação, para o melhoramento genético, pela introdução de novos genes ou modificação da expressão genética endógena que regulam as características de importância econômica (WHEELER et al., 2003) e para produção de proteínas recombinantes de interesse farmacêutico (FREITAS et al., 2007). Definimos animais transgênicos como os que possuem a inserção do gene exógeno em seu genoma e transmitem de forma estável (WHEELER, 2003; KEEFER, 2004). As proteínas recombinantes podem ser produzidas na glândula mamária ou no sangue de animais transgênicos e esta tecnologia tem avançado para a fase de aplicação comercial (DYCK et al., 2003). A espécie caprina é a mais adequada para produção destas proteínas por apresentar uma maturidade sexual precoce, menor custo de manutenção entre outras vantagens comparada a outros biorreatores (BALDASSARRE e KARATZAS, 2004). O Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução (LFCR) em 2008 obteve o nascimento de dois caprinos fundadores transgênicos para o Fator Estimulante de Colônias de Granulócitos humano (hg-csf) (FREITAS et al., 2010). A utilização de animais transgênicos como biorreatores tem sido questionada quanto à saúde dos mesmos. Diante disso, muitos estudos têm avaliado a normalidade dos parâmetros fisiológicos relativos à sanidade e reprodução destes animais (JACKSON et al., 2010). A obtenção desses caprinos transgênicos fundadores foi realizada pela técnica da microinjeção de DNA em pró-núcleos de zigotos produzidos in vivo (FREITAS et al., 2010). Essa técnica está caracterizada pela inserção aleatória no genoma hospedeiro (CLARK et al., 2000), diante disso vem a importância de acompanhar todas as fases de desenvolvimento dos animais transgênicos inclusive a sua linhagem (JACKSON et al., 2010), uma das formas seria o acompanhamento durante o período gestacional por meio da ultrassonografia (LEE et al., 2005). A ultrassonografia em modo B em caprinos pode ser utilizada para o diagnóstico de gestação (GONZÁLEZ et al., 2004), sexagem fetal (SANTOS et al., 2007), observação de patologias uterinas (LOPES JÚNIOR et al., 2004), além de ser utilizada para mensurar alguns parâmetros feto-placentários (fetometria), para a estimativa da idade gestacional (LÉGA et al., 2007), acompanhar o desenvolvimento e a morfologia do concepto juntamente com seus órgãos (LÉGA et al., 2003) e determinar a viabilidade do concepto durante o período gestacional (AMER, 2010). Alguns parâmetros utilizados para mensuração são: o diâmetro da

17 17 vesícula embrionária (DVE) ou saco gestacional, o comprimento crânio caudal (CCC) (KAREN et al., 2009), o diâmetro biparietal (DBP) (GONZÁLEZ-BULNES et al., 1998; ABDELGHAFAR et al., 2007), o diâmetro abdominal (DA), o diâmetro do tronco (DT) (LÉGA et al., 2007), o diâmetro do cordão umbilical (DCU) (LEE et al., 2005) e o diâmetro dos placentomas (DPL) (DOIZÉ et al., 1997). Na literatura não foram encontrados trabalhos com acompanhamento ultrassonográfico de conceptos transgênicos. Além disso, há poucos estudos em pequenos ruminantes referentes à caracterização morfológica ao longo do período gestacional. Desta forma, é importante o acompanhamento de caprinos transgênicos durante as diferentes fases de seu desenvolvimento, iniciando durante o período gestacional, observando aspectos morfológicos e morfométricos.

18 18 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Transgênese animal Os animais transgênicos contêm moléculas de DNA recombinante que foram introduzidas por meio da intervenção humana intencional (WALL, 1996), estes animais possuem a inserção do gene exógeno em seu genoma (KEEFER, 2004). Tanto a inserção dos genes quanto a sua transmissão ocorrem de forma estável (WHEELER, 2003) e todo o patrimônio genético pode ser transferido aos seus descendentes (FUKAMIZU, 1993). Na década de 80, foi realizada a primeira tentativa de geração de animais transgênicos, quando foi realizada a transferência de genes pela microinjeção de uma construção de DNA (exógeno) em pró-núcleos de zigotos de camundongos (GORDON et al., 1980). Esse método é mais eficiente em células animais do que os utilizados por bactérias, com células animais são realizadas modificações pós-traducionais adequadas, gerando atividade biológica plena (DYCK et al., 2003). Esse método é mais eficiente em células e vem sendo utilizado em várias espécies até os dias atuais (COLLARES et al., 2007). Por esta técnica foi gerado o primeiro camundongo transgênico no Brasil (PESQUERO et al., 2002). Mesmo sendo menos eficiente, a microinjeção tem gerado muitos animais de grande porte para aplicações na pecuária e na biomedicina (KUES e NIEMANN, 2011). Outra alternativa para gerar animais transgênicos seria, a transferência de DNA por vetores de lentivirais (EWERLING et al., 2006) e transferência via espermatozóides (COLLARES et al., 2005), entre outras. A produção desses animais é de interesse científico, pois podem ser utilizados para o estudo dos genes e sua regulação, para o melhoramento genético, pela introdução de novos genes ou modificação da expressão genética endógena que regulam as características de importância econômica (WHEELER et al., 2003) e para produção de proteínas recombinantes de interesse farmacêutico (FREITAS et al., 2007). É possível que animais transgênicos expressem proteínas nas células de determinados órgãos, utilizando promotores tecido-específicos, o isolamento de proteínas expressas nos fluidos corporais apresenta vantagens sobre os tecidos, pois estes podem ser constantemente produzidos e as proteínas são facilmente purificadas, quando comparado aos tecidos (WHEELER et al., 2003). As proteínas recombinantes podem ser produzidas por exemplo: no sangue, na urina, no plasma seminal e no leite (COLLARES et al., 2007). Esta tecnologia tem avançado para a fase de aplicação comercial (DYCK et al., 2003) e tem atraído significativo interesse por apresentar, como principais vantagens, o baixo custo de produção e proteínas de

19 19 alta qualidade (PAVLOU e REICHERT, 2004; HOUDEBINE, 2009). Um dos mais promissores avanços para a produção em larga escala de proteínas recombinantes tem sido a secreção dessas proteínas no leite de mamíferos transgênicos (COLLARES et al., 2007) Transgênese caprina A espécie caprina é uma ótima opção comparada a outros biorreatores por ser capaz de produzir vários quilogramas de proteínas recombinantes por ano (BALDASSARRE et al., 2004), além de apresentar menor custo de manutenção, maturidade sexual mais precoce e com menor período de gestação comparado com outras espécies. Além disso, uma pequena quantidade de caprinos transgênicos pode suprir a demanda para a maioria das proteínas recombinantes requeridas no mercado (BALDASSARRE e KARATZAS, 2004). O método tradicional para a produção de caprinos transgênicos fundadores envolve a microinjeção de uma construção de DNA em pró-núcleos de zigotos produzidos in vivo (EBERT et al., 1991; FREITAS et al., 2007) ou in vitro, a partir da colheita de oócitos guiada por laparoscopia (COL) (BALDASSARRE et al., 2003). Outro método para obtenção e propagação de animais transgênicos é a transferência nuclear de células somáticas (TNCS) (BAGUISI et al., 1999). Apenas uma proteína recombinante produzida por caprinos transgênicos foi liberada para uso clínico. A antitrombina III humana (ATryn ), produzida a partir da glândula mamária de cabras transgênicas, foi o primeiro medicamento aceito para os testes clínicos e comercialização na Europa em 2006 European Medicines Agency (EMA) e nos EUA em 2009, pela Food and Drug Administration (FDA), este medicamento pode ser utilizado no tratamento de pacientes com resistência a heparina que foram submetidos a procedimentos cardiopulmonares (KUES e NIEMANN, 2011), previne a formação de coágulos sanguíneos em pacientes com deficiência da proteína anticoagulante natural (SCHMIDT, 2006). Nosso laboratório juntamente com a Universidade Federal do Rio de Janeiro e a Academia de Ciências da Rússia iniciaram um projeto para obtenção de caprinos transgênicos produzindo o hg-csf no leite. Essa parceria resultou no nascimento do primeiro caprino transgênico da América Latina, um macho da raça Saanen (FREITAS et al., 2007). No ano de 2008, nasceram dois caprinos fundadores transgênicos para o hg-csf (Figura 1), sendo uma fêmea e um macho da Raça Canindé, esses animais foram obtidos pela técnica da microinjeção de DNA em pró-núcleos de zigotos produzidos in vivo (FREITAS et

20 20 al.,., 2010). Estes animais possuem em seu genoma o gene que codifica a proteína do hg-csf. O hg-csf CSF é importante para a defesa imunitária baseada em neutrófilos, devido ao seu papel regulatório no crescimento, diferenciação, sobrevivência e ativação de tais células c e seus precursores (BARREDA et al., 2004). Este tem sido utilizado no tratamento de muitas patologias, assim como no tratamento de pacientes com câncer que requerem altas doses de quimioterapia, pode ser usada no tratamento de tumores, pela radioterapia radioterapia e na utilização de drogas que diminuem a produção de células mielóides (WITTMAN et al., 2006). Figura 1. Casal asal de fundadores transgênicos para o hg hg-csf. (A) Fêmea. (B) Macho. Fonte: LFCR. Uma grande variedade de proteínas recombinantes tem sido produzida por caprinos transgênicos expressas na glândula mamária e secretadas no leite de cabras transgênicas, dentre elas: a lisozima (MAGA et al., 2006) e a lactoferrina humana (ZHANG et al., ) Nos últimos anos, o uso de fármacos obtidos a partir de animais transgênicos para terapia em humanos tem sido questionado. Diante disso, muitos estudos têm considerado ser relevante avaliar a normalidade dos parâmetros fisiológicos relativos à sanidade e reprodução destes animais, visando à aplicação bem-sucedida bem sucedida da transgênese para uso co comercial (JACKSON et al., 2010). A questão da biossegurança e da bioética devem sempre ser consideradas na pesquisa, na produção e nos estudos dos mecanismos que dirigem a expressão gênica aos tecidos candidatos a biorreatores. O controle total da expressão gênica e a produção de proteínas recombinantes em animais transgênicos continuarão avançando, e os produtos gerados serão constantemente avaliados quanto à sua segurança seguran e eficiência iência (COLLARES et al., 2007).

21 21 Após a obtenção desse casal e a confirmação do transgene no sêmen do macho fundador, a próxima etapa visou à multiplicação dessa linhagem. Previamente a isso, há a necessidade da avaliação durante todas as etapas da vida, incluindo a sua linhagem (JACKSON et al., 2010). Uma das formas seria o acompanhamento durante o período gestacional, por avaliar o desenvolvimento embrionário/fetal e placentário por meio da ultrassonografia (LEE et al., 2005) Importância da ultrassonografia em caprinos Nos últimos anos, muitas pesquisas relacionadas com a utilização da ultrassonografia em modo B em caprinos tem demonstrado interesse, principalmente para o diagnóstico de gestação (GONZÁLEZ et al., 2004), sexagem fetal (SANTOS et al., 2007), observação de patologias uterinas, como a hidrometra (LOPES JÚNIOR et al., 2004), além de ser utilizada para avaliar e mensurar alguns parâmetros embrionários/fetais e placentários, para a estimativa da idade gestacional (LÉGA et al., 2007). É possível acompanhar o desenvolvimento e a morfologia do concepto e de seus órgãos (LÉGA et al., 2003) em caprinos. A viabilidade embrionária/fetal pode ser determinada pela atividade cardíaca e os movimentos do concepto (AMER, 2010) Diagnóstico de gestação por ultrassonografia O diagnóstico de gestação preciso em cabras proporciona informações essenciais para as práticas eficazes de manejo do rebanho, como por exemplo, seleção de fêmeas não prenhes, determinação do número de fetos permitindo que os produtores separarem as fêmeas com gestação simples, dupla (Figura 2) ou tripla para um manejo nutricional diferenciado (MEDAN et al., 2004). A ultrassonografia em modo-b em tempo real é uma ferramenta eficiente de diagnóstico precoce de gestação em cabras. Essa é uma alternativa não invasiva, precisa e rápida para o diagnóstico da gestação e o estudo do desenvolvimento do concepto (HAIBEL, 1990). Com a utilização de um transdutor transretal de 7,0 MHz, é possível realizar o diagnóstico de gestação em cabras egípcias nativas a partir de 16,9 dias após a monta, pela detecção da vesícula embrionária ou saco gestacional (KAREN et al., 2009). O mesmo

22 22 exame, realizado com um transdutor na frequência de 5,0 MHz, permite visu visualizar essas estruturas 18 dias após a monta em cabras Anglo-Nubianas Anglo Nubianas (MARTINEZ et al., 1998). Figura 2. Imagem ultrassonográfica de uma gestação dupla (setas) aos 40 dias de gestação obtidos utilizando um transdutor transabdominal de 5,0 MHz. Fonte: Medan et al. (2004). De acordo com Padilla-Rivas Padilla Rivas et al. (2005), o diagnóstico de gestação deve estar baseado na presença do concepto, utilizando um transdutor transretal de 7,5 MHz, foi possível visualizar a vesícula embrionária aos 22 dias em cabras Boer (Figura 3). Por sua vez, González et al. (2004), trabalhando com cabras leiteiras da raça Canária utilizando transdutores com a mesma frequência, afirmaram que a detecção do embrião é possível a partir dos 26 dias depois da monta, com precisão máxima, máxima mas foram oram obtidos muitos falsos negativos durante a fase inicial de gestação. A determinação ecográfica do embrião, utilizando um transdutor transretal de 7,0 MHz, pode ser realizada a partir de 22,3 dias de gestação (KAREN et al., 2009), ou com uma frequência frequência de 6,0 MHz no dia 28 (SUGUNA et al., 2008). Essas discrepâncias de dados podem ser atribuídas às diferenças entre as raças caprinas utilizadas (PADILLA-RIVAS (PADILLA et al., 2005; KAREN et al., 2009). Quando as ecografias são realizadas com transdutores transabdominais transabdominais de 5,0 MHz, as vesículas embrionárias são visíveis a partir do dia 28 aproximadamente após a monta (SUGUNA et al., 2008; KAREN et al., 2009). O embrião pode ser visto entre os dias 30,3 e 35 de acordo com Karen et al. (2009) e Suguna et al. (2008), respectivamente. Para a confirmação da gestação é necessária a detecção do concepto (SUGUNA et al., 2008). Durante a avaliação em estágios iniciais da gestação, são importantes a observação do embrião e os batimentos cardíacos díacos embrionários dentro do saco gestacional (MEDAN et al., 2004).