Caracterização da proteinúria de pacientes com pré-eclâmpsia utilizando Pepstatina A. Joyce Pereira Takatsuka

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE Joyce Pereira Takatsuka Caracterização da proteinúria de pacientes com pré-eclâmpsia utilizando Pepstatina A UBERABA-MG 01

2 Joyce Pereira Takatsuka CARACTERIZAÇÃO DA PROTEINÚRIA DE PACIENTES COM PRÉ-ECLÂMPSIA UTILIZANDO PEPSTATINA A Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Ciências da Saúde Área de Concentração Patologia Básica e Experimental, da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor. Orientadora: Prof a. Dr a. Roseli Aparecida da Silva Gomes UBERABA-MG 01

3 Dedico esta tese... À minha família, principal responsável por esta conquista. Em especial, aos meus pais, Ricardo e Maria Helena, que nunca mediram esforços para que a minha educação fosse primordial. E que, por muitas vezes me acalmaram e enviaram energias positivas à distância quando o cansaço parecia me vencer e as dificuldades pareciam infindáveis... Ao meu noivo, Carlos Eduardo, por estar ao meu lado durante todos os momentos... Por compreender minhas tensões e ser sempre incentivador dos meus projetos... Enfim, a todos os colegas que colaboraram para a realização deste trabalho e amigos torceram para que meu sonho se concretizasse...

4 Agradecimentos A Deus Por me dar a dádiva da vida e saúde para seguir e buscar os meus sonhos... À Professora Roseli... Por ter aberto as portas do Laboratório de pesquisa em Bioquímica da UFTM para mim há 8 anos e muito ter colaborado para minha formação acadêmico-cientifica... Pela colaboração inestimável na execução deste trabalho e pela amizade construída... Às gestantes que participaram deste estudo... Sem sua colaboração nada disto seria possível... Pela compreensão da importância de sua participação e pela gentileza em coletar as amostras como solicitado... Aos professores e funcionários da Disciplina de Bioquímica da UFTM... Por todo auxílio técnico e científico, cada ensinamento prático transmitido, cada palavra de apoio e amizade construída... Por tornar esta jornada mais alegre e cheia de boas lembranças... À equipe de Medicina Fetal da UFTM... Pelo auxílio na obtenção das amostras de gestantes com pré-eclâmpsia... À amiga Enfermeira Ms. Bibiane Dias Miranda Parreira... Pelo auxílio na obtenção das amostras de gestantes normotensas... À banca examinadora desta tese... Pela gentileza em avaliar este trabalho e contribuir com seus valiosos conhecimentos em sua melhoria...

5 Aos colegas e professores da pós-graduação... Que compartilharam ensinamentos e aprendizados durante o curso de doutorado que serão levados comigo para sempre...

6 Apoio Financeiro O presente trabalho foi desenvolvido com recursos financeiros da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), da Fundação de Ensino e Pesquisa de Uberaba (FUNEPU) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

7 Ah! Se o mundo inteiro me pudesse ouvir... Tenho tanto pra contar, dizer que aprendi! Tim Maia

8 Resumo A pré-eclâmpsia é uma doença específica da gestação humana, caracterizada por hipertensão e proteinúria após a 0ª semana da gravidez. Além de uma ferramenta diagnóstica, a proteinúria tem sido proposta como indicativa da gravidade da doença e preditora dos sintomas. Entretanto, seu conteúdo e mecanismos ainda não inteiramente conhecidos. Soma-se a isto, o fato da urina ser um fluido biológico bastante rico e conter moléculas capazes de interferir em ensaios que poderiam esclarecer estas questões. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi caracterizar a proteinúria de pacientes com pré-eclâmpsia utilizando pepstatina A, na tentativa de inibir a principal protease ácida descrita na urina. Nove (09) gestantes com pré-eclâmpsia e quatro (0) gestantes normotensas coletaram amostras de urina de horas sem conservante, de 6 horas com HCl como conservante e de 6 horas com HCl e pepstatina como conservantes. Em ensaios de atividade proteolítica sobre hemoglobina bovina nas amostras de urina coletadas verificou-se que a adição de pepstatina A diminuiu significativamente (p=0,0006) a hidrólise de hemoglobina. Entretanto, atividade proteolítica residual foi detectada e atribuída a possíveis outras classes enzimáticas. O perfil proteico urinário das gestantes com préeclâmpsia foi avaliado por meio de eletroforeses em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) nas amostras sem conservante e nas amostras com adição de pepstatina A. Notou-se que há grande heterogeneidade nos perfis de proteínas excretadas na pré-eclâmpsia e grande variabilidade entre as pacientes, mesmo quando o inibidor de protease foi utilizado na coleta. Análises de SDS-PAGE, para comparar os perfis proteicos urinários da mesma gestante nas três condições de coleta, mostraram que a acidificação das amostras favoreceu a ação de aspartil proteases, levando a intensa modificação do perfil proteico com formação de bandas de baixa massa molecular na maioria das amostras proteinúricas e nãoproteinúricas. As amostras colhidas com HCl e pepstatina A apresentaram um perfil proteico semelhante ao observado nas amostras sem conservante, porém com algumas diferenças que podem sugerir que enzimas da classe de aspartil proteases tenham ação até mesmo nas amostras de horas sem ajuste de ph. As amostras coletadas com pepstatina A foram submetidas à análise proteômica por espectrometria de massa sequencial, precedida de cromatografia líquida (LC-MS/MS) para identificação das proteínas nas amostras de urina, e o número de espectro normalizado de cada proteína foi usado para comparações entre os grupos de gestantes. Um total de 6 proteínas foi identificado, sendo 8 exclusivamente encontradas nas amostras de gestantes com pré-eclâmpsia e 1, exclusivas de gestantes normotensas. A

9 albumina foi a única proteína encontrada significativamente aumentada (p=0,01) nas amostras de urina de gestantes com pré-eclâmpsia. Enquanto, a proteína AMBP (p=0,001), regiões específicas da cadeia kappa da imunoglobulina (p=0,06 e p=0,0) foram encontradas significativamente diminuídas nas amostras de gestantes com pré-eclâmpsia. Ressaltamos que uma proteína identificada como ribonuclease pancreática, em cuja família está incluída a angiogenina, também foi encontrada significativamente diminuída nas amostras de gestantes com pré-eclâmpsia (p=0,01), e esta diminuição pode estar relacionada com seu envolvimento na fisiopatologia da pré-eclâmpsia. Palavras-chave: Pré-eclâmpsia. Proteinúria. Pepstatina A.

10 Abstract Preeclampsia is a human pregnancy-specific disease, characterized by hypertension and proteinuria after 0 weeks of pregnancy. In addition to a diagnostic tool, proteinuria has been proposed as a disease severity indicator and symptoms predictor. However, its contents and mechanisms are still not entirely known. Moreover, urine is a very rich biological fluid and contains molecules able of interfering in tests that could clarify these issues. Thus, the aim of this study was to characterize the proteinuria of patients with preeclampsia using pepstatin A, in an attempt to inhibit the major acid protease described in urine. Nine (09) preeclamptic pregnant women and four (0) normotensive pregnant women collected a -hour urine sample without preservative, a 6-hour sample with HCl as preservative and a 6-hour sample with HCl and pepstatin as preservatives. In proteolytic activity assay on bovine hemoglobin with urine samples collected, it was found that the addition of pepstatin A in collection procedure significantly decreased (p=0.0006) hydrolysis of hemoglobin. However, residual proteolytic activity was detected and attributed to possible other enzyme classes. Urinary protein profile of preeclamptic pregnant women was evaluated by polyacrylamide gel electrophoresis containing sodium dodecyl sulfate (SDS- PAGE) using as unpreserved samples (-h) as those with addition of pepstatin A. It was noted that there is a great heterogeneity in profiles of excreted proteins in preeclampsia and large variability among patients, even when the protease inhibitor was used for sample collection. Electrophoresis analysis were also useful comparing urinary protein profiles of the same pregnant women in the three collection conditions, which showed that sample acidification favored aspartyl proteases action, leading to intense changes in protein profile with formation of lower molecular weight bands in most proteinuric and nonproteinuric samples. Samples collected with HCl and pepstatin A showed a protein profile similar to that observed in the sample without preservative, but with some differences that may suggest that enzymes from aspartyl protease class may have activity even in -hour samples without ph adjustment. The samples collected with pepstatin A were submitted to proteomics analysis by sequential mass spectrometry preceded by liquid chromatography (LC-MS/MS) for identification of proteins in urine samples, and the normalized spectrum number of each protein was used for comparisons between pregnant women groups. A total of 6 proteins were identified in urine samples. Among of them, 8 were exclusively found in samples from women with preeclampsia and 1, only found in normotensive pregnant women. Serum albumin was the

11 unique protein found significantly increased (p=0.01) in urine samples of preeclamptic women. Meanwhile, AMBP protein (p=0.001) and specific regions of the immunoglobulin kappa chain (p=0.06 and p=0.0) were found significantly decreased in samples from women with preeclampsia. We note that a protein identified as pancreatic ribonuclease, whose family included angiogenin, was also found significantly decreased (p=0.01) in samples of preeclamptic pregnant women, and this decrease may be related to its involvement in the pathophysiology of preeclampsia. Keywords: Preeclampsia. Proteinuria. Pepstatin A.

12 Lista de Figuras Figura 1. SDS-PAGE das amostras de horas das gestantes com préeclâmpsia... 6 Figura. SDS-PAGE das amostras das gestantes com pré-eclâmpsia 1 e... 8 Figura. SDS-PAGE das amostras das gestantes com pré-eclâmpsia, e Figura. SDS-PAGE das amostras da gestante com pré-eclâmpsia Figura 5. SDS-PAGE das amostras das gestantes com pré-eclâmpsia 7, 8 e Figura 6. SDS-PAGE das amostras das gestantes normotensas 1 e Figura 7. SDS-PAGE das amostras das gestantes normotensas e Figura 8. SDS-PAGE das amostras com pepstatina A das gestantes com préeclâmpsia... 56

13 Lista de Tabelas Tabela 1. Dados clínicos e demográficos de gestantes normotensas e préeclâmpticas... Tabela. Atividade proteolítica das amostras de urina de gestantes com préeclâmpsia... 5 Tabela. Atividade proteolítica das amostras de urina de gestantes normotensas... 5 Tabela. Porcentagem de inibição da atividade proteolítica das amostras de urina de gestantes com pré-eclâmpsia com uso de inibidores de proteases... 5 Tabela 5. Porcentagem de inibição da atividade proteolítica das amostras de urina de gestantes normotensas com uso de inibidores de proteases Tabela 6. Identificação e quantificação de proteínas nas amostras de urina das gestantes por LC-MS/MS Tabela 7. Características físico-químicas das proteínas identificadas por LC- MS/MS... 6

14 Lista de Símbolos e Abreviaturas %... porcentagem.. maior ou igual que mmhg. milímetro de mercúrio et al. e colaboradores mg... miligrama OMS... Organização Mundial de Saúde PAS. pressão arterial sistólica PAD... pressão arterial diastólica h.. hora HELLP hemólise, alteração de enzimas hepáticas e trombocitopenia UTI... unidade de terapia intensiva sflt-1... receptor solúvel de tirosina quinase 1 seng... endoglina solúvel PIGF... fator de crescimento placentário VEGF... fator de crescimento vascular endotelial L... litro α... alfa β... beta BPM... baixo peso molecular PMI... peso molecular intermediário APM... alto peso molecular <... menor que Ig... imunoglobulina SELDI... surface-enhanced laser desorption/ionization TOF time of flight ph... potencial hidrogeniônico Leu.. leucina Val.. valina HCl. ácido clorídrico UFTM. Universidade Federal do Triângulo Mineiro ABNT... Associação Brasileira de Normas Técnicas HC... Hospital de Clínicas UMS... Unidade municipal de saúde MG... Minas Gerais ml... mililitro µg... micrograma g... força g (gravidade)

15 o C... SDS-PAGE... graus Celsius Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio mm... milímetro... marca registrada V... volt cm... centímetro rpm... rotações por minuto NaOH... hidróxido de sódio N... normal nm... nanômetro LNBio... Laboratório Nacional de Biociências CNPEM... Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais SP... São Paulo M... molar mm... milimolar DTT... ditiotreitol TFA... ácido trifluoracético ACN... acetonitrila LC-MS/MS... Espectrometria de massa sequencial acoplada à cromatografia líquida de alta eficiência Q-TOF... Quadrupolo-Time of flight µl... microlitro µm... micrômetro min... minuto Da... dalton MS... espectrometria de massa PE... pré-eclâmpsia ±... mais ou menos kda... kilodalton PMM... padrão de massa molecular C... controle P... pepstatina A AMBP... alpha-1-microglobulin-bikunin precursor pi... ponto isoelétrico -DE... bidimensional >... maior que RNA... ácido ribonucleico

16 Sumário 1. Introdução Síndromes hipertensivas da gestação Pré-eclâmpsia Proteinúria Proteinúria na pré-eclâmpsia Aspartil proteases Justificativa Objetivos Objetivo geral Objetivos específicos Material e métodos Gestantes..... Obtenção e processamento das amostras..... Determinação da proteinúria das gestantes normotensas Avaliação do perfil proteico urinário Determinação da atividade proteolítica urinária Identificação das proteínas Extração das proteínas Digestão das proteínas Dessalinização dos peptídeos Espectrometria de massa Análise estatística Resultados Caracterização do grupo de estudo Avaliação do perfil eletroforético proteico urinário de gestantes com pré-eclâmpsia Influência de aspartil proteases no perfil eletroforético proteico urinário Determinação da atividade proteolítica urinária Avaliação do perfil eletroforético proteico urinário de gestantes com pré-eclâmpsia utilizando pepstatina A Identificação das proteínas Discussão Conclusões... 8 Referências Apêndices Anexos

17 Introdução

18 Introdução INTRODUÇÃO 1.1. Síndromes hipertensivas da gestação 1 5 A hipertensão arterial é a desordem mais comum em gestações complicadas, com implicações significativas em morbidade e mortalidade materna. É também uma das áreas da prática clínica mais extensivamente estudadas, apesar de pouco compreendida. Ela chega a atingir até 10% das gestantes e afeta cerca de mulheres nos Estados Unidos todo ano (HUTCHEON; LISONKOVA; JOSEPH, 011) No Brasil, a hipertensão é a principal causa de mortalidade materna, e correspondeu em 010 a 19,7% do total de óbitos maternos no país, sendo que no estado do Maranhão, chegou a ser causa da morte de 1,7% das gestantes. Em Minas Gerais, esta prevalência é de 19,% (Ministério da Saúde, 01) As síndromes hipertensivas da gestação são classificadas em (1) Hipertensão crônica, () Pré-eclâmpsia/eclâmpsia, () Pré-eclâmpsia sobreposta à hipertensão pré-existente e () Hipertensão gestacional (Report of the National High Blood Pressure Education Program Working Group on High Blood Pressure in Pregnancy, 000), diferenciadas abaixo A hipertensão crônica é definida clinicamente com níveis pressóricos aumentados ( 10 x 90 mmhg) antes da gestação ou antes da vigésima semana dela. A maioria das pacientes nesta categoria terá uma evolução benigna da gestação, podendo haver inclusive normalização da pressão arterial A pré-eclâmpsia é uma doença multisistêmica, específica da gestação, caracterizada por aparecimento de hipertensão e proteinúria (excreção proteica urinária maior que 00 mg

19 Introdução 18 1 em horas) após a 0ª semana de gestação. A eclâmpsia é a forma da doença que evolui com crises convulsivas. 5 Até 0% das mulheres hipertensas crônicas desenvolvem pré-eclâmpsia (pré- eclâmpsia sobreposta à hipertensão prévia), anunciada pela ocorrência de proteinúria no terceiro trimestre, o que não ocorre na hipertensão crônica pura. 6 A hipertensão gestacional ocorre quando há aparecimento de hipertensão arterial na 7 8 segunda metade da gestação em uma gestante previamente normotensa, na ausência de proteinúria Gaio et al. (001), demonstraram em um estudo com.89 gestantes, uma frequência de 7,5% de síndromes hipertensivas da gestação no Brasil, sendo,0% a frequência de hipertensão crônica,,% de pré-eclâmpsia/eclâmpsia, 0,7% de hipertensão gestacional e 0,5% de pré-eclâmpsia sobreposta à hipertensão prévia. 1.. Pré-eclâmpsia A pré-eclâmpsia se destaca dentre as síndromes hipertensivas da gestação devido ao seu impacto sobre a saúde materna e neonatal. Trata-se de uma síndrome específica de gestação humana, cuja incidência global tem sido estimada entre e 8% de todas as gestações, sendo a principal causa materna de morbidade e mortalidade, resultando em cerca de a mortes anualmente em todo o mundo (OMS, 00) Clinicamente, a pré-eclâmpsia é caracterizada pelo aparecimento de hipertensão arterial (PAS 10 mmhg ou PAD 90 mmhg), proteinúria ( 00 mg/ h) e edema após 0 semanas de gestação (MILNE et al., 005). Entretanto, o fenótipo da doença pode variar desde formas brandas até formas mais graves, como a síndrome HELLP e a eclâmpsia.

20 Introdução A eclâmpsia, que complica cerca de 1-% dos casos de pré-eclâmpsia grave, é definida como a ocorrência de convulsões tônico-clônicas em uma gestante ou no início do pós-parto que não podem ser atribuídas a outras causas (SIBAI, 006). Cerca de 10 a 0% dos casos de pré-eclâmpsia grave pode evoluir para a síndrome HELLP, definida por três sinais cujas iniciais dos termos em língua inglesa significam Hemolytic anemia, Elevated Liver enzymes e Low Platelet count, ou seja, hemólise, alterações de enzimas hepáticas e trombocitopenia (HARAM; SVENDSEN; ABILDGAARD, 009) A pré-eclâmpsia pode trazer complicações tanto para mãe quanto para o feto. Estas complicações foram revistas por Steegers et al. (010) e Mustafa et al. (01). A hipertensão durante a gestação pode ocasionar parto prematuro, restrição do crescimento fetal, dificuldade respiratória neonatal e uma frequência aumentada de admissão na UTI neonatal. Entretanto, mesmo nas formas mais graves a hipertensão durante a gestação não parece estar relacionada a um risco aumentado de morte fetal ou perinatal. As principais complicações maternas incluem danos ao sistema nervoso central, tais como convulsões, o que caracteriza a eclâmpsia, acidente vascular cerebral isquêmico ou hemorrágico, lesão hepática, ocasionando elevação das aminopeptidases e caracterizando a síndrome HELLP, falência hepática, disfunção renal, assim como uma frequência aumentada de partos por cesariana, partos prematuros e descolamento prematuro de placenta Apesar da dificuldade de se prever o desenvolvimento da pré-eclâmpsia, alguns fatores de risco têm sido identificados, como: nuliparidade, gestação multifetal, história prévia de pré-eclâmpsia, obesidade, diabetes mellitus, hipertensão crônica, doenças autoimunes, doenças de tecido conjuntivo e vascular, idade materna maior que 5 anos na primeira gestação, tabagismo e a raça negra (SIBAI et al., 1997; SIBAI et al., 000; WALKER, 000; AMERICAN COLLEGE OF OBSTETRICS & GYNECOLOGY, 00; DUCKITT; HARRINGTON, 005; LYKKE; PAIDAS; LANGHOFF-ROOS, 009). É interessante citar

21 Introdução que a prevalência da pré-eclâmpsia tem aumentado no mundo todo (HUTCHEON; LISONKOVA; JOSEPH, 011) e que isto pode estar, ao menos em parte, relacionado com o aumento também da prevalência dos fatores de risco, tais como obesidade e doenças crônicas, além das gestações múltiplas, com o advento da tecnologia de reprodução assistida (DUCKITT; HARRINGTON, 005) A etiologia exata da pré-eclâmpsia ainda é desconhecida e muitas teorias têm sido consideradas, tais como (1) invasão trofoblástica anormal e implantação inadequada, () desequilíbrio de fatores angiogênicos, () anormalidades na coagulação, () lesão vascular endotelial, (5) predisposição genética, (6) problemas cardiovasculares prévios, (7) resposta inflamatória exagerada e (8) estresse oxidativo aumentado (SIBAI, 01; STEEGERS et al., 010; MYATT; WEBSTER, 009; HUPPERTZ, 008; REDMAN; SARGENT, 009; REDMAN; SARGENT, 010). Parece não haver um mecanismo patogênico unificador para a pré-eclâmpsia, mas diversos autores concordam que a doença parece ser uma cascata desencadeada por resposta inflamatória materna anormal, lesão/ativação de células endoteliais com ambiente hemodinâmico alterado e imunidade prejudicada (STEINBERG; KHANKIN; KARUMANCHI, 009; AGGARWAL et al., 011; RAMMA; AHMED, 011; CLIFTON et al., 01) Existem evidências que fatores maternos, paternos e/ou fetais/placentários contribuem para uma disfunção endotelial localizada ou sistêmica (MEEKINS et al., 199; ROBERTS; REDMAN, 199) É comumente aceito que o mecanismo central da patogênese da préeclâmpsia envolva uma placentação anormal e um desenvolvimento placentário inadequado, o que resulta em redução na perfusão da placenta levando à sua isquemia (GOLDMAN-WOHL; YAGEL, 00; MOHAUPT, 007) e liberação de fatores solúveis na corrente sanguínea materna que levam a uma disfunção endotelial localizada ou generalizada, que é a característica mais proeminente da doença (HUPPERTZ, 008; MYATT; WEBSTER, 009).

22 Introdução Estudos sugerem que a disfunção endotelial na pré-eclâmpsia resulta de um estado antiangiogênico, mediado por altos níveis circulantes do receptor solúvel de tirosina quinase 1 (sflt-1) e endoglina solúvel (seng), juntamente com baixos níveis de fatores proangiogênicos, como o fator de crescimento placentário (PIGF) e o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) (VENKATESHA et al., 006; MAYNARD et al., 00; AHMAD; AHMED, 00). As concentrações mais altas de fatores antiangiogênicos parecem desencadear lesão da célula endotelial vascular no fígado, rins, cérebro, e também na própria placenta, o que resulta em hipertensão, proteinúria e outras manifestações sistêmicas da doença (STEINBERG; KHANKIN; KARUMANCHI, 009). 1.. Proteinúria Em condições normais, proteínas plasmáticas de alto peso molecular, como a albumina e as globulinas, praticamente não passam através da membrana de filtração capilar glomerular devido à restrição por tamanho e por carga da membrana. Proteínas de baixo peso molecular, como a β -microglobulina, a α 1 -microglobulina e a lisozima, entretanto, atravessam livremente a membrana de filtração, mas são 95% reabsorvidas ao chegarem ao túbulo contorcido proximal. Portanto, o conteúdo proteico na urina é baixo (0-10 mg/ h) e consiste principalmente de albumina plasmática (0%), fragmentos de imunoglobulinas (15%), outras proteínas plasmáticas (5%) e proteínas tissulares originadas do sistema urinário (0%). Em uma amostra de urina aleatória, a concentração de proteínas varia de 0 a 80 mg/l e o resultado de um teste qualitativo é tipicamente negativo. Quando a proteína urinária excede 150 mg/ h ou a concentração está acima de 100 mg/l, o resultado para um teste qualitativo se torna positivo. Isto é conhecido como proteinúria (RIELLA; PACHALY; ZUNINO, 008; McINTYRE; TAAL, 008; MILLER et al., 009).

23 Introdução 1 A proteinúria é a manifestação mais comum de doenças renais e diversos estudos (WANG; LaPAGE; HIRSCHBERG, 000; PETROVIC; STOJIMIROVIC, 008; BURTON; HARRIS, 1996) demonstraram que além de um sinal da lesão renal, a proteinúria participa da progressão da doença como um fator patológico independente Dois mecanismos parecem ser os responsáveis pelo aparecimento da proteinúria e caracterizam os padrões de proteínas encontrados em cada tipo de lesão renal. O aumento da permeabilidade da parede dos capilares glomerulares ocasiona passagem não seletiva de proteínas para o espaço de Bowman. Estudos experimentais (BLOUCH et al., 1997; COMPER; GLASGOW, 1995; OHLSON; SÖRENSSON; HARALDSSON, 000; REMUZZI; REMUZZI, 199) demonstraram que as alterações de permeabilidade são decorrentes de uma combinação de perda de restrição por tamanho e por carga. Ao atingir as células tubulares, as proteínas de baixo peso molecular (BPM) e peso molecular intermediário (PMI) são reabsorvidas, mas não as de alto peso (APM), que basicamente compõem a proteinúria glomerular em seu estado inicial, caracterizando uma proteinúria seletiva. A progressão do dano glomerular leva a uma saturação no processo de reabsorção de proteínas pelas células tubulares, gerando uma proteinúria não seletiva, com excreção de proteínas de APM, PMI e BPM. O outro mecanismo está relacionado a danos às células tubulares e subsequente reabsorção prejudicada. Em consequência, tem-se a chamada proteinúria tubular, caracterizada por proteínas de BPM, que são livremente filtradas e agora não podem ser reabsorvidas, e uma pequena quantidade de proteínas de PMI, em particular a albumina (D`AMICO; BAZZI, 00; MAACHI et al., 00).

24 Introdução 1.. Proteinúria da pré-eclâmpsia Apesar de alguns pesquisadores defenderem a exclusão da proteinúria como um dos critérios para o diagnóstico da pré-eclâmpsia (PETTIT; BROWN, 01) e algumas diretrizes internacionais não a considerarem como um aspecto patognomônico da doença, como a Australasian Society for the Study of Hypertension in Pregnancy (BROWN et al., 000) ou considerarem-na simplesmente uma hipertensão gestacional com proteinúria (HELEWA et al., 1997), as diretrizes da International Society for the Study of Hypertension in Pregnancy (BROWN et al., 001) e National High Blood Pressure Education Program Working Party (Report of the National High Blood Pressure Education Program Working Group on High Blood Pressure in Pregnancy, 000) persistem com a ideia da existência da proteinúria para a realização do diagnóstico da pré-eclâmpsia. Além disso, alguns autores (CHAN et al., 005; CHUA; REDMAN, 199) já demonstraram aumento no risco de intercorrências maternas e fetais na pré-eclâmpsia relacionadas com a proteinúria, evidenciando desta maneira a importância deste parâmetro na doença Estudos demonstraram que a análise qualitativa de proteínas urinárias por meio de fita reagente não se relaciona bem com o nível de proteínas em amostras de horas na préeclâmpsia (KUO; KOUMANTAKIS; GALLERY, 199; MEYER et al., 199). Além disso, apesar de alguns pesquisadores demonstrarem que a taxa proteína/creatinina urinária em uma única amostra possui forte correlação com nível de proteína total em amostras de horas de pacientes com diagnóstico confirmado de pré-eclâmpsia (JASCHEVATZKY et al., 1990; ROBERT et al., 1997; NEITHARDT; DOOLEY; BORENSZTAJN, 00), uma pesquisa realizada com 0 gestantes com suspeita de pré-eclâmpsia para comparar estes dois testes concluiu que a taxa proteína/creatinina não deve ser usada como uma alternativa à avaliação de urina de horas (DURNWALD; MERCER, 00). E em vista destes resultados

25 Introdução 1 contraditórios, o padrão ouro para a avaliação da proteinúria na pré-eclâmpsia continua a ser a coleta de urina durante um período de horas Enquanto o limiar máximo de referência para não gestantes é de 150 mg/ horas, sabe-se que na gestação saudável ocorre aumento no fluxo sanguíneo renal e na taxa de filtração glomerular (DAVISON, 1987), o que é acompanhado por aumento na excreção urinária de proteínas, sendo então considerado dentro da faixa de normalidade valores < 00 mg/dia para gestantes (KUO; KOUMANTAKIS; GALLERY, 199). Em gestações normais, a função tubular também sofre alterações que colaboram para o pequeno incremento na excreção de proteínas (CONRAD et al., 005) O mecanismo preciso da proteinúria na pré-eclâmpsia ainda não está elucidado. Sabese que ocorre queda na taxa de filtração glomerular e no fluxo sanguíneo renal (MORAN; LINDHEIMER; DAVISON, 00); portanto o aumento na excreção de proteínas deve ocorrer por aumento na permeabilidade glomerular, alterações na pressão nos glomérulos ou função tubular prejudicada. A pressão glomerular na pré-eclâmpsia parece ser mantida, mas existem relatos de mudanças no tamanho e a carga dos poros dos glomérulos (MORAN; LINDHEIMER; DAVISON, 00; MORAN et al., 00; NAICKER et al., 1997), o que parece contribuir para a proteinúria Além disto, algumas mudanças na morfologia renal parecem estar relacionadas ao mecanismo de proteinúria na pré-eclâmpsia. A endoteliose glomerular é uma lesão considerada por muito tempo característica da pré-eclâmpsia, entretanto um estudo demonstrou que ela é uma adaptação renal à gestação, encontrada exacerbada na préeclâmpsia (STREVENS et al., 00). Esta lesão é caracterizada por inchaço das células endoteliais, obliteração das fenestrações e invasão do espaço capilar e Moran, Lindheimer e Davison (00) a relacionam diretamente com o extravasamento de proteínas para o espaço

26 Introdução de Bowman. Um importante mediador destas alterações parece ser um desequilíbrio de fatores angiogênicos ocasionado pelos altos níveis circulantes de sflt-1 encontrados na pré-eclâmpsia (MAYNARD et al., 00). sflt-1 antagoniza as funções biológicas do VEGF, que é um fator crucial para a manutenção da integridade e fisiologia dos podócitos (LINDHEIMER; KANTER, 010) e a lesão podocitária está diretamente relacionada ao acometimento renal da pré-eclâmpsia (GAROVIC et al., 007) A pré-eclâmpsia é frequentemente relacionada como uma doença glomerular, sendo as lesões tubulares menos reportadas. KRONBORG et al (011) realizaram uma análise do padrão de excreção de proteínas de BPM e APM ao longo da gestação acometida por préeclâmpsia e encontraram uma lesão glomerular inicial, evidenciada pela excreção de proteínas de APM, seguida por uma reabsorção tubular prejudicada com o progresso da gestação, evidenciada pela excreção de proteínas de BPM. O dano tubular na pré-eclâmpsia foi também evidenciado pela maior excreção de N-acetil-ß-D-glucosaminidase, proteína livremente filtrada e normalmente reabsorvida, por gestantes acometidas pela doença em relação a gestantes normotensas (HAYASHI et al., 00; PATERNOSTER et al., 1999). Uma análise por imunoblot das proteínas excretadas na pré-eclâmpsia revelou que era possível atribuir origem tubular para a excreção de ao menos 1% das proteínas, comparado a cerca de 15% de proteínas a que foram atribuídas origem glomerular (YAMAMOTO et al., 199). Neste mesmo estudo, foi identificado grande quantidade de β -microglobulina, marcador de lesão tubular, na urina das gestantes com pré-eclâmpsia, entretanto não foi realizada comparação com um grupo controle. Uma análise eletroforética de urina de gestantes com pré-eclâmpsia mostrou desaparecimento da proteína de Tamm-Horsfall, produzida exclusivamente por células renais tubulares e que normalmente representa a principal proteína urinária, o que pode ser um reflexo da disfunção tubular da doença (NESSELHUT et al. 1989).

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