Universidade Federal de Goiás. Instituto de Ciências Biológicas. Departamento de Ciências Fisiológicas. Programa de Pós-graduação em Biologia

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1 Universidade Federal de Goiás Instituto de Ciências Biológicas Departamento de Ciências Fisiológicas Programa de Pós-graduação em Biologia MARINA CONCEIÇÃO DOS SANTOS MOREIRA AUMENTO NA INGESTÃO DE SÓDIO DURANTE AS FASES PÓS-NATAIS INDUZ AUMENTO DE PRESSÃO ARTERIAL NA FASE ADULTA Goiânia - GO 2014

2 MARINA CONCEIÇÃO DOS SANTOS MOREIRA AUMENTO NA INGESTÃO DE SÓDIO DURANTE AS FASES PÓS-NATAIS INDUZ AUMENTO DE PRESSÃO ARTERIAL NA FASE ADULTA Dissertação apresentada ao Programa de Pós graduação em Biologia da Universidade Federal de Goiás como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Biologia. Orientador: Prof. Dr. Gustavo Rodrigues Pedrino Co-orientador: Prof. Dr. André Henrique Freiria-Oliveira Goiânia - GO 2014

3 A meu pai, Benedito Moreira Filho (in memoriam), pelo exemplo de honestidade e dignidade.

4 RESUMO Variações na concentração plasmática de sódio desencadeiam ajustes comportamentais e vegetativos que visam restabelecer as condições fisiológicas. Dentre estes ajustes, destacamos alterações do apetite ao sódio, da atividade simpática renal, da pressão arterial (PA), do fluxo sanguíneo renal (FSR) e da condutância vascular renal (CVR). Diversos estudos sugerem que doenças desenvolvidas na fase adulta estão relacionadas a certas condições às quais os indivíduos foram expostos durante os estágios iniciais da vida. Evidências experimentais têm demonstrado maior PA na prole adulta de mães alimentadas com dieta rica em sódio durante a gestação e a lactação. Apesar de demonstrarem a importância das fases pré-natais no desenvolvimento de hipertensão arterial, não existem evidências no que diz respeito aos efeitos de alterações do equilíbrio hidroeletrolítico durante as fases pós-natais em relação à hipertensão arterial. Assim, o presente trabalho avaliou os efeitos do aumento do consumo de sódio durante o período pós-natal sobre parâmetros cardiovasculares e comportamentais na fase adulta. Ratos Wistar com 21 dias de vida foram mantidos com solução salina hipertônica (NaCl 0,3 M) e ração ad libitum durante 60 dias (grupo experimental). Os animais do grupo controle foram mantidos com água e ração ad libitum. Após estes 60 dias, os animais de ambos os grupos foram mantidos com água e ração por um período de 15 dias (período de recuperação). Posteriormente, foi realizada canulação crônica da artéria e da veia femorais direitas para registro de pressão arterial média basal (PAM) e frequência cardíaca (FC) nos animais não anestesiados. No grupo experimental, observou-se aumentos na PAM (118,3 ± 2,7 mmhg) e na FC (398,2 ± 7,5 bpm) basais, quando comparado com o grupo controle (98,6 ± 2,6 mmhg; 365,4 ± 12,2 bpm). Além do mais, observamos uma diminuição no índice de barorreflexo nos animais experimentais quando comparados com o grupo controle, tanto para as infusões de fenilefrina (-1,24 ± 0,2 bpm mmhg -1 vs. -1,83 ± 0,04 bpm mmhg -1, respectivamente), quanto para as infusões de nitroprussiato de sódio (0,85 ± 0,22 bpm mmhg -1 vs. 2,12 ± 0,2 bpm mmhg -1, respectivamente). Os valores basais de PAM, FC, FSR, CVR e atividade nervosa simpática renal (ASR) nos animais anestesiados foram avaliados. A PAM e a FC do grupo experimental (124,4 ± 3,0 mmhg; 437,9 ± 10,5 bpm) foram significativamente maiores que do grupo controle (102,4 ± 2,4 mmhg; 375,2 ± 15,4 bpm). Os valores basais de FSR (controle: 3,4 ± 0,4 ml min -1 ; experimental: 3,9 ± 0,2 ml min -1 ), de CVR (controle: 28,8 ± 4,4 μl (min mmhg) -1 ; experimental: 33,6 ± 1,2 μl (min mmhg) -1 ) e ASR (controle: 0,0300 ±

5 0,0095 V e 89,5 ± 3,67 spikes s -1 ; experimental: 0,0351 ± 0,0109 V e 78,1 ± 4,89 spikes s - 1 ) foram semelhantes entre os grupos. A função cardiovascular ex vivo na fase adulta também foi avaliada. Observou-se que os animais submetidos à sobrecarga de sódio durante o período pós-natal apresentaram comprometimento do relaxamento vascular independente de endotélio e ainda, aumento da pressão intraventricular diastólica durante o período de reperfusão cardíaca. Além disso, após o período de recuperação, os ajustes cardiovasculares induzidos por hipernatremia aguda foram avaliados. Observou-se que, nos animais controle, a infusão de salina hipertônica provocou aumento transitório de PAM (Δ9,2 ± 2,2 mmhg), bradicardia transitória (Δ -18,9 ± 7,9 bpm), além de aumentos sustentados do fluxo sanguíneo renal (Δ 37,7 ± 6,9% em relação ao basal, após 60 min) e da condutância vascular renal (Δ 50,0 ± 4,4% em relação ao basal; após 60 min). Já nos animais do grupo experimental, a infusão de salina hipertônica provocou aumento transitório de PAM, maior que o observado nos animais controle (Δ 18,7 ± 1,7 mmhg, aos 10 min), e bradicardia sustentada (Δ -25,0 ± 10,2 bpm, após 60 min), além de aumentos de FSR (Δ 30,8 ± 11,0% em relação ao basal, após 60 min) e CVR (Δ 27,9 ± 12,3% em relação ao basal, após 60 min) menores que os observados no grupo controle. Após o período de recuperação, foram realizados testes de ingestão de água e sódio induzida por furosemida (10 mg kg -1 peso corporal, s.c.). No teste de ingestão induzida, a ingestão de salina hipertônica 0,3 M se mostrou reduzida nos animais experimentais, quando comparados ao grupo controle (7,8 ± 1,1 ml vs. 12,1 ± 0,6 ml, respectivamente). Em conjunto, os resultados obtidos no presente trabalho demonstram que alterações na homeostase hidromineral na vida pós-uterina alteram os ajustes comportamentais e cardiovasculares induzidos por depleção de sódio e por infusão de salina hipertônica (NaCl 3 M). Além disso, demonstram que uma dieta rica em sódio durante o período pósnatal altera a sensibilidade barorreflexa e a PA na fase adulta, além de comprometer o relaxamento cardíaco após isquemia e o vasorelaxamento independente de endotélio.

6 ABSTRACT Changes in plasma sodium concentration have led to adjustment mechanisms in order to restore their physiological conditions. The behavioral adjustments consist in the regulation of water and sodium intake. Among the vegetative adjustments, we highlight changes in renal sympathetic activity, blood pressure, renal blood flow (RBF) and renal vascular conductance (RVC). Experimental evidence has demonstrated increase of blood pressure of the adult offspring from mothers with high sodium diets during pregnancy. Although these studies had demonstrated the importance of prenatal phases in hypertension development, there has been no evidence of the effects of high sodium diets during postnatal phases in relation to hypertension. Thus, in the present study, we evaluated the effects of sodium overload during childhood on cardiovascular and behavioral parameters in adulthood. That way, 21 days after birth, we have offered to the experimental group, hypertonic solution (NaCl 0.3 M) and food ad libitum for 60 days. The control rats were maintained with tap water and food ad libitum. Afterwards, both groups were maintained with tap water and food during 15 days (recovery). Later, we performed chronic cannulation of right femoral artery to record baseline mean arterial pressure (MAP) and heart rate (HR) in unanesthetized animals. In the experimental group, we observed increases in basal MAP (118.3 ± 2.7 mmhg) and HR (398.2 ± 7.5 bpm), compared with the control group (98.6 ± 2.6 mmhg; ± 12.2 bpm). Baroreflex index was diminished in experimental group in relation to control group by phenylephrine infusions (-1.24 ± 0.2 bpm mmhg -1 vs ± 0.04 bpm mmhg -1, respectively) as by sodium nitroprusside infusions (0.85 ± 0.22 bpm mmhg -1 vs ± 0.2 bpm mmhg -1, respectively). The baseline values of MAP, HR, RBF, RVC and renal sympathetic nerve activity (RSNA) in anesthetized animals were evaluated. MAP and HR of experimental group (124.4 ± 3.0 mmhg; ± 10.5 bpm) were significantly higher than control group (102.4 ± 2.4 mmhg; ± 15.4 bpm). The baseline values of RBF (control: 3.4 ± 0.4 ml min -1 ; experimental: 3.9 ± 0.2 ml min -1 ), RVC (control: ± ml (min mmhg) -1 ; experimental: ± ml (min mmhg) -1 ) and RSNA (control: ± V and 89.5 ± 3.67 spikes s -1 ; experimental: ± V and 78.1 ± 4.89 spikes s -1 ) were similar between the groups. Ex vivo cardiovascular function in adulthood was also evaluated. It has been observed that animals treated with sodium overload during the postnatal period showed reduction of vascular endothelium-independent relaxation and also an increase in

7 intraventricular diastolic pressure during the cardiac reperfusion. Furthermore, after the recovery period, the animals were submitted to osmotic challenge. The cardiovascular adjustments induced by acute hypernatremia were evaluated. It was observed that in the control animals, the infusion of hypertonic saline evoked a transient increase in MAP (Δ 9.2 ± 2.2 mmhg ), transient bradycardia (Δ ± 7.9 bpm) and sustained increases in RBF (Δ 37.7 ± 6.9 % of baseline ) and RVC (Δ 50.0 ± 4.4 % of baseline, 60 min after infusion). However, in the experimental rats, hypertonic saline infusion caused a transient increase in MAP, higher than observed in control animals (Δ ± 1.7 mmhg, after 10 min) and sustained bradycardia (Δ ± 10.2 bpm, after 60 min). The increases in RBF (Δ 30.8 ± 11.0% of baseline, after 60 min) and RVC (Δ 27.9 ± 12.3 % of baseline, after 60 min) were lower than the observed in the control group. Later, we performed tests of water and sodium intake induced by furosemide (10 mg kg -1 bw, sc). In test-induced drinking, the hypertonic 0.3 M sodium intake was reduced in experimental animals compared to the control group (7.8 ± 1.1 ml vs ± 0.6 ml, respectively). Altogether, the results of the present study show that changes in hidromineral homeostasis, in postuterine phases, affect the behavioral and cardiovascular adjustments induced by sodium depletion and hypernatremia. Furthermore, they show that a high-sodium diet during the postnatal period alters baroreflex sensitivity and BP, in adulthood, compromising the cardiac relaxation after ischemia and endothelium-independent vasorelaxation.

8 SUMÁRIO Introdução Materiais e métodos 1. Modelo animal utilizado Protocolo de ingestão de dieta hipersódica Dosagem da osmolaridade plasmática e concentrações urinária e plasmática de sódio (Na+) Registro da pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC) nos animais não anestesiados Teste de barorreflexo Registro do fluxo sanguíneo renal e da condutância vascular e atividade simpática renal em animais anestesiados Análise da função cardiovascular Sobrecarga de Sódio Ingestão induzida de água e sódio Análise Estatística Resultados 1. Ingestão diária de ração e água ou salina (NaCl 0,3 M), peso corporal, concentrações urinária e plasmática de sódio e osmolaridade plasmática dos animais controle e experimentais durante os períodos de tratamento e recuperação Efeitos da dieta hipersódica (NaCl 0,3M) durante as fases pós-natais sobre a PAM e a FC nos animais não anestesiados Efeitos da dieta hipersódica (NaCl 0,3 M) durante as fases pós-natais sobre a sensibilidade barorreflexa Efeitos da dieta hipersódica (NaCl 0,3M) durante as fases pós-natais sobre os os valores basais de PAM, FC, FSR CVR e ASR em animais anestesiados Efeitos do aumento do consumo de sódio durante o período pós-natal sobre a função cardiovascular ex vivo dos animais adultos

9 6. Efeitos da dieta hipersódica (NaCl 0,3M) durante as fases pós-natais sobre os ajustes cardiovasculares induzidos pela infusão de salina hipertônica Efeitos da dieta hipersódica (NaCl 0,3M) durante as fases pós-natais sobre a ingestão de água e sódio induzida pela depleção de sódio Discussão Considerações finais Referências bibliográficas

10 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1: Média ± EPM da pressão arterial média (PAM; A) e da frequência cardíaca (FC; B) nos animais experimentais e controles não anestesiados. * diferente do grupo controle; p<0,05. Figura 2: Média ± EPM do índice de barorreflexo (IB; bpm mmhg -1 ) mediante infusões de fenilefrina e nitroprussiato de sódio dos animais controle e submetidos ao aumento da ingestão de sódio durante as fases pós-natais (experimental). * diferente do grupo controle; p< 0,05. Figura 3: Traçados representativos dos animais controle (A) e experimental (B) nos períodos basal e após infusão intravenosa de hexametônio. (PAP: pressão arterial pulsátil; ASR: atividade nervosa simpática renal; InstASR: integral da atividade nervosa simpática renal e FC: frequência cardíaca). Figura 4: Reatividade vascular em anéis de aorta abdominal na presença (A) e na ausência de endotélio (B) de animais controle e submetidos ao aumento da ingestão de sódio durante o período pós-natal. * diferente do grupo controle. p<0,05. Figura 5: Média ± EPM das pressões intraventriculares sistólica e diastólica (A e B), dp/dt+ (C), dp/dt- (D), pressão de perfusão (E), pressão desenvolvida no ventrículo esquerdo (F) e frequência cardíaca (G) nos períodos basal e de reperfusão nos corações isolados de animais controle e submetidos à sobrecarga de sódio. * diferente do grupo controle; diferente do basal; p< 0,05. Figura 6: Efeitos cardiovasculares induzidos por infusão de salina hipertônica nos animais controle e submetidos ao aumento da ingestão de sódio durante as fases pósnatais (experimental). A) pressão arterial média (PAM); B) frequência cardíaca (FC); C) variação percentual do fluxo sanguíneo renal (FSR); D) variação percentual da condutância vascular renal (CVR).* diferente do tempo 0; diferente do grupo controle. p < 0,05.

11 Figura 7: Média ± EPM da ingestão cumulativa de água (A; ml) e da ingestão cumulativa de sódio 0,3M (B; ml), em resposta a administração subcutânea de furosemida, em ratos controle e submetidos ao aumento da ingestão de sódio durante as fases pós-natais (experimental). * diferente do tempo 0; diferente do grupo controle. p < 0,05.

12 LISTA DE ABREVIATURAS ACH ANP CVR dp/dt EPM FC FSR FURO IB i.m. i.p. i.v. MnPO NPBL NPS NTS OVLT PA PAM PAP PVN s.c. SFO SNC VE Acetilcolina Peptídio natriurético atrial Condutância vascular renal Derivada de pressão/ derivada de tempo Erro padrão da média Frequência cardíaca Fluxo sanguíneo renal Furosemide Índice de barorreflexo Intra muscular Intra peritoneal Intra venoso Núcleo pré-óptico mediano Núcleo parabraquial lateral Nitroprussiato de sódio Núcleo do trato solitário Órgão vasculoso da lâmina terminal Pressão arterial Pressão arterial média Pressão arterial pulsátil Núcleo paraventricular do hipotálamo Subcutâneo Órgão subfornicial Sistema Nervoso Central Ventrículo esquerdo

13 INTRODUÇÃO A manutenção do meio interno estável é o principal objetivo de todos os processos fisiológicos (Cannon, 1929), e está diretamente relacionada com a manutenção das concentrações iônicas dos compartimentos intra e extracelulares. Assim, alterações da osmolaridade do compartimento extracelular são percebidas por todos os tecidos perfundidos e podem alterar o volume, o metabolismo e a função celular (Strange, 1993). Desta forma, a regulação precisa do volume e da osmolaridade do compartimento extracelular é fundamental para sobrevivência. Dentre os diferentes tipos de sais inorgânicos presentes nos líquidos corporais, o cloreto de sódio (NaCl) é o mais consumido e a concentração do íon sódio (Na + ) está diretamente relacionada à manutenção da homeostase dos fluidos corporais. Estes líquidos são separados em dois compartimentos: o extra e o intracelular. As composições destes compartimentos não são idênticas devido à permeabilidade seletiva da membrana celular, que permite que a água se movimente entre os compartimentos enquanto que os íons sódio permanecem em maior concentração no fluido extracelular. Quando o NaCl obtido na dieta é absorvido pelo intestino, o íon sódio passa a integrar o plasma sanguíneo e sua distribuição se torna uniforme ao longo do fluido extracelular, o que resulta em um aumento global da osmolaridade deste compartimento. A água, então, se desloca do compartimento intracelular para o extracelular até que a osmolaridade dos dois compartimentos atinja um equilíbrio (Toney, 2003). Assim, variações da concentração do íon sódio podem provocar fluxo osmótico entre os compartimentos intra e extracelular modificando a concentração de todos os demais componentes destes compartimentos, o que pode afetar a integridade da célula. Tais alterações no organismo podem resultar em convulsões, paralisia, coma e, em condições extremas, morte (Bourque et al., 1994). Desta forma, não é surpreendente observarmos a existência de diversos mecanismos homeostáticos que visam à manutenção da concentração plasmática de sódio dentro de uma faixa de variação restrita. A detecção das variações de osmolaridade é realizada pelos osmorreceptores centrais e periféricos, que enviam essas informações para diversas regiões do sistema nervoso central (SNC), modulando, assim, as respostas comportamentais e vegetativas (Bourque, 2008). Os osmorreceptores centrais estão localizados em regiões próximas aos ventrículos cerebrais, e que, por isso, recebem a denominação de órgãos circunventriculares. Dentre estes, destacam-se os neurônios localizados no órgão sub-fornicial (SFO) e no órgão vasculoso da 1

14 lâmina terminal (OVLT; Bie, 1980; Bourque et al., 1994). Os osmorreceptores periféricos estão localizados nos vasos renais, intestinais e principalmente hepáticos (veia porta) (Bourque, 2008). Estudos têm demonstrado que, quando expostos à hiperosmolaridade, os osmorreceptores reduzem seu o volume intracelular devido à perda osmótica de água (Sharif Naeini et al., 2006; Ciura & Bourque, 2006). Ademais, evidências experimentais têm relacionado à diminuição do volume celular com o aumento da excitabilidade e deflagração de potenciais de ação por essas células (Law, 1991; Ciura & Bourque, 2006). Uma vez detectadas as alterações da osmolaridade do fluido extracelular, desencadeiam-se mecanismos de ajustes comportamentais e vegetativos que visam reestabelecer o volume e/ou a composição do compartimento extracelular (Fitzsimons, 1998; Antunes-Rodrigues et al., 2004). Os ajustes comportamentais consistem na organização de comportamentos de ingestão de água e sódio motivados pelas sensações de sede e de apetite ao sódio (comportamento de busca e ingestão de alimentos que contenham cloreto de sódio, estimulado, essencialmente, pela diminuição da concentração plasmática de sódio e/ou por hipovolemia) (Beauchamp et al.,1990 e Johnson & Thunhorst, 1997). Estudos têm demonstrado que elevações mínimas da osmolaridade plasmática ou reduções do volume circulante são potentes estímulos para emissão do comportamento de sede (para revisão, ver: Johnson & Thunhorst, 1997). Em mamíferos, mesmo um aumento de apenas 1 a 2% da osmolaridade plasmática ou uma redução de 8 a 10% no volume do compartimento extracelular são suficientes para induzirem ingestão de água (Fitzsimons, 1998; Antunes-Rodrigues et al., 2004). Além da sede, o apetite ao sódio é um importante componente comportamental para a manutenção da osmolaridade plasmática. Em mamíferos, diminuições na concentração plasmática de sódio são potentes estímulos para que se desenvolva o apetite ao sódio (Beauchamp et al., 1990; Thunhorst, & Johnson, 1994). Várias evidências experimentais têm demonstrado que aumentos agudos da concentração plasmática de sódio desencadeiam uma série de respostas autonômicas, cardiovasculares e hormonais. Dentre essas respostas destacamos: a redução da atividade simpática renal (Morita et al., 1991; Weiss et al., 1996; Nishida et al., 1998; May et al., 2000), a secreção do peptídeo natriurético atrial (ANP), ocitocina e vasopressina (Pettersson et al., 1986; Morris & Alexander, 1988; Morris & Alexander, 1989; Rauch et al., 1990; Antunes- Rodrigues et al., 1992; Antunes-Rodrigues et al., 1993; Blanch et al., 2013), o aumento da 2

15 pressão arterial (PA; Colombari et al., 2000; Pedrino et al., 2005; Pedrino et al., 2008; Pedrino et al., 2009; Blanch et al., 2013) e a vasodilatação renal (Fujita et al., 1991; Colombari & Cravo, 1999; Colombari et al., 2000; Pedrino et al., 2005; Pedrino et al., 2008; Pedrino et al., 2009). Admite-se que estes ajustes, desencadeados pela hipernatremia, fazem parte de um conjunto de respostas integradas que visam promover a natriurese, restabelecendo, assim as condições volêmicas normais. Diversos estudos (Brooks et al., 2001; Brooks et al., 2004) demonstram que o aumento agudo da osmolaridade plasmática está associado com o aumento regional de atividade nervosa simpática (esplâncnica e lombar) enquanto que promove supressão da atividade nervosa simpática renal. Além disso, Scrogin et al. (1999) demonstraram que o aumento crônico da osmolaridade plasmática é capaz de promover alterações do tônus simpático, sugerindo que a osmolaridade possa ser um importante regulador a longo prazo do drive simpático e, consequentemente, da pressão arterial. Evidências experimentais e epidemiológicas demonstram que uma dieta rica em sódio é um importante fator de risco para o desenvolvimento da hipertensão arterial (Keys, 1970; Law et al., 1991; Simons-Morton & Obarzanek, 1997). Aumentos da PA têm sido descritos em populações em dieta rica em sódio (para revisão ver Horan et al., 1985). Estudos em modelos experimentais e ensaios clínicos fornecem provas convincentes a respeito do efeito nocivo da ingestão de sódio na PA, tanto entre hipertensos quanto entre normotensos (Sacks, 2001; Brown, 2009). Além de seus efeitos sobre a PA, o excesso de consumo de sódio na dieta tem sido associado diretamente com doença cardíaca coronariana, acidente vascular cerebral e doenças não cardiovasculares (Brown, 2009). Alguns estudos sugerem que doenças desenvolvidas na fase adulta estão relacionadas com determinadas condições a que o indivíduo foi exposto nos estágios iniciais de vida, incluindo a fase pré-natal (Barker et al., 1998). Bao et al. (1995) demonstram que o risco de se desenvolver hipertensão arterial na fase adulta está relacionado com os níveis de PA nas fases iniciais da vida. Consistente com estes resultados, Li et al. (1995) mostraram que valores altos de PA durante a infância estiveram correlacionados positivamente com os altos valores da PA sistólica e diastólica anos mais tarde. Neste sentido, Vidonho Jr et al. (2004) observaram maior PA na prole adulta de mães que foram alimentadas com dieta hipersódica (0,65M ou 1,3 M de NaCl) durante a gestação e a lactação. Apesar de evidenciarem as influências do período pré-natal no desenvolvimento de patologias na fase adulta, os diversos 3

16 estudos não avaliaram uma possível participação específica do período pós-natal no desenvolvimento destas patologias. Assim não existem evidências experimentais acerca dos efeitos do aumento da ingestão de sódio durante as fases pós-natais na fase adulta. Considerando estas informações o presente trabalho objetivou identificar se o aumento da ingestão de sódio em ratos jovens seria capaz de alterar a sensibilidade ao sódio e a PA na fase adulta. Mais especificamente, avaliamos os efeitos do aumento do consumo de sódio durante o período pós-natal sobre a pressão arterial média (PAM), frequência cardíaca (FC), sensibilidade barorreflexa e atividade simpática renal (ASR). Além disso, avaliamos os efeitos do aumento do consumo de sódio durante o período pós-natal sobre a reatividade vascular e a função cardíaca e, ainda, sobre as respostas cardiovasculares induzidas por hipernatremia e a ingestão de água e sódio induzida por depleção de sódio. MATERIAIS E MÉTODOS 1. Modelo animal utilizado Os experimentos foram realizados com ratos da linhagem Wistar - fornecidos pelo biotério central da Universidade Federal de Goiás (UFG) - com 21 dias de vida. Os animais foram mantidos em salas climatizadas (temperatura 22-24ºC) com acesso ad libitum à ração (0,4% NaCl; AIN-93M; Reeves et al., 1993). Todos os protocolos utilizados foram aprovados pelo comitê de ética em pesquisa da UFG (processo n o 051/2010). 2. Protocolo de ingestão de dieta hipersódica O incremento na quantidade sódio (dieta hipersódica) ingerida pelos animais do grupo experimental foi obtido pela adição de cloreto de sódio (0,3 M; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) na água ofertada a estes animais (grupo experimental). Ao grupo controle foi ofertada água (dieta normossódica). A administração da dieta hipersódica iniciou-se no vigésimo primeiro dia de vida e finalizou-se após 60 dias de tratamento. Após este período, foi estabelecido um período de recuperação de 15 dias, em que foi ofertada dieta normossódica para os animais de ambos os grupos. Tanto o grupo controle quanto o experimental tiveram acesso ad libitum à ração durante os períodos de tratamento e recuperação. Durante os períodos de tratamento e de recuperação, as quantidades ingeridas de água ou salina hipertônica, de ração e o peso dos animais foram medidos diariamente. 4

17 3. Dosagem da osmolaridade plasmática e concentrações urinária e plasmática de sódio (Na + ) Ao final dos períodos de tratamento e recuperação, amostras de plasma e de urina dos animais controle e experimentais foram coletadas. As amostras de sangue foram centrifugadas a 3500 rpm durante 5 minutos para separação do plasma. Para a determinação da concentração de sódio, as amostras de plasma e urina foram diluídas em água destilada, na proporção de 1:100 v/v. A concentração de sódio foi determinada por um fotômetro de chama (modelo 910M, Analyser, São Paulo, SP, Brasil), e a osmolaridade através de um osmômetro (Osmette II, modelo nº 5005; Precision Systems Inc., Natick, MA, EUA). 4. Registro da pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC) nos animais não anestesiados Para o registro da PAM os animais foram anestesiados com ketamina (116 mg kg -1 de massa corpórea, i.p.; Sespo, Paulínia, SP, Brasil) e xilazina (20 mg kg -1 de massa corpórea, i.p.; Rhobifarma, Hortolândia, SP, Brasil) e submetidos ao procedimento cirúrgico para a implantação de cânulas na artéria aorta abdominal através da artéria femoral direita e na veia cava inferior através da veia femoral direita. As cânulas então foram exteriorizadas pelo dorso do animal e estes foram suturados. Uma dose profilática de antibiótico foi administrada (penicilina, IU kg 1 de massa corpórea, i.m.; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) e os animais, então, foram individualizados em gaiolas. Após a recuperação foi realizado o registro da PAM e da FC nos animais não anestesiados. A pressão arterial pulsátil (PAP) foi registrada continuamente acoplando-se a cânula arterial a um transdutor de PA acoplado a um amplificador (ETH-200; CB Sciences, Dover, NH, USA) conectado a um sistema de aquisição de dados (PowerLab System; ADInstruments, Colorado Springs, CO, EUA). A PAM e a FC foram determinadas a partir do sinal pulsátil utilizando o programa LabChart (versão 5.5.6; ADInstruments, Colorado Springs, CO, EUA). 5. Teste de barorreflexo Para testar a integridade dos barorreceptores, foram analisadas as alterações da PAM e FC mediante a infusão intravenosa de substâncias de efeito conhecido sobre a PA. Foram realizadas infusões em bólus (0,1 ml) de fenilefrina (agonista adrenérgico; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA), nas concentrações de 10 μg ml -1, 15 μg ml -1 e 20 μg ml -1, e de 5

18 nitroprussiato de sódio (doador de NO; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) nas concentrações de 100 μg ml -1, 150 μg ml -1 e 200 μg ml -1. Para comparar a sensibilidade barorreflexa dos grupos, foi calculado o índice de barorreflexo (IB), dado como a razão entre a variação da frequência cardíaca e a variação da pressão arterial média (ΔFC ΔPAM -1 ) mediante a infusão dos fármacos acima citados. 6. Registro do fluxo sanguíneo renal, da condutância vascular renal e da atividade nervosa simpática renal em animais anestesiados Após o período de recuperação, em que ambos os grupos receberam dieta normossódica, os animais foram anestesiados com uretana (1,2 g kg -1 de massa corpórea, i.v.; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), após indução anestésica com halotana 2% em O 2 a 100%. A artéria e a veia femorais foram canuladas, como descrito anteriormente, para o registro da PAP e a infusão do anestésico, respectivamente. Após a canulação vascular, foi realizada traqueostomia, a fim de reduzir a resistência das vias aéreas. O fluxo sanguíneo renal (FSR) foi registrado por fluxometria de tempo de trânsito. Uma sonda em miniatura (probe 1RB, Transonic Systems, Inc., Ithaca, NY, EUA) foi implantada ao redor da artéria renal esquerda e conectada a um fluxômetro T206 (Transonic Systems, Inc., Ithaca, NY, EUA), que permite determinar o fluxo em valores absolutos (ml min -1 ). Os sinais obtidos foram enviados ao sistema de aquisição e análise de dados (PowerLab System; ADInstruments, Colorado Springs, CO, EUA). Os dados foram digitalizados em uma frequência de 1000 amostras s -1. As variações do FSR foram calculadas como a razão percentual em relação ao valor basal (%FSR), de acordo com a fórmula: %FSR = FSR final - FSR basal 100 FSR basal A condutância vascular renal (CVR) foi obtida pela razão do FSR e da PAM. As variações da CVR foram calculadas como variação percentual em relação ao basal (%CVR), utilizando-se a seguinte fórmula: %CVR = CVR final - CVR basal 100 CVR basal 6