PRODUÇÃO DE POLI-BETA-HIDROXIBUTIRATO ATRAVÉS DE GLUCONACETOBACTER DIAZOTROPHICUS.

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1 CIÊNCIAS BIOLÓGICAS MODALIDADE DE PRODUÇÃO QUÍMICO-BIOLÓGICA. PRODUÇÃO DE POLI-BETA-HIDROXIBUTIRATO ATRAVÉS DE GLUCONACETOBACTER DIAZOTROPHICUS. Rômulo dos Santos Aguiar. Rio de Janeiro 2012

2 RÔMULO DOS SANTOS AGUIAR. Aluno do curso de Ciências biológicas. Matrícula: PRODUÇÃO DE POLI-BETA-HIDROXIBUTIRATO ATRAVÉS DE GLUCONACETOBACTER DIAZOTROPHICUS. Trabalho de conclusão de curso apresentado ao curso de graduação em Ciências Biológicas Modalidade de produção químico-biológica, da Universidade Estadual da Zona Oeste, como requisito parcial para obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas sob orientação da professora Vânia Lúcia Muniz de Pádua. Orientadora: Dr. Vânia Lúcia Muniz de Pádua. Laboratório de Biologia - UEZO Co-orientadora: Dr. Cristiane Pimentel Victório Laboratório de Biologia UEZO Rio de Janeiro Dezembro de 2012

3 A282 Aguiar, Rômulo dos Santos. Produção de poli-beta-hidroxibutirato através de Gluconacetobacter diazotrophicus / Rômulo dos Santos Aguiar f.; 30 cm. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Ciências Biológicas) Centro Universitário Estadual da Zona oeste, Rio de Janeiro, Bibliografia: f Cana-de-açúcar. 2. Polihidroxibutirato. 3. Plástico biodegradável. I. Título. CDD

4 ii PRODUÇÃO DE POLI-BETA-HIDROXIBUTIRATO ATRAVÉS DE GLUCONACETOBACTER DIAZOTROPHICUS. Elaborado por Rômulo dos Santos Aguiar. Aluno do curso de Ciências Biológicas da UEZO Este trabalho de graduação foi analisado e aprovado com grau: Rio de Janeiro, de dezembro de Doutor: Ronaldo Figueiró Portella Pereira (Examinador 1) UEZO. Mestre: Adriano Arnóbio José da Silva e Silva (Examinador 2) UEZO. Dra. Vânia Lúcia Muniz de Pádua (presidente) UEZO. RIO DE JANEIRO, RJ-BRASIL DEZEMBRO/2012

5 iii AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus por ter me proporcionado esta oportunidade única de poder cursar uma instituição de nível superior, sem Ele provavelmente não chegaria nem no início dessa caminhada, pois é dele que provém minha força, minha ousadia e inspiração. Agradeço a minha orientadora, professora Vânia, por sua orientação, por me transmitir seus conhecimentos, por sua paciência no decorrer desse trabalho, principalmente por me ensinar que os valores éticos para execução de um trabalho acadêmico se estendem além de uma sala de aula e a todos os meus professores que colaboraram com a construção do meu aprendizado ao longo de toda minha trajetória acadêmica. Agradeço também a minha mãe Rosângela, minha heroína, por todo apoio e compreensão oferecido durante esses quatro anos, mesmo quando discordávamos de algo, ela sempre soube o que é o melhor para mim. Aos meus colegas da turma , foram quatro anos de parceria, companheirismo, aprendizado e crescimento mútuo. Vou sentir saudades das festinhas surpresas que já nem eram tão surpresas, das caminhadas até o centro de Campo Grande com a Célula coesa (Rafael O arrogante, Marcelle A que se acha feia, Yasmim A Benhê, Alessandra A eterna folhinha, Pedro Pai de todos, Agatha A pequenininha, Felipe O distraído e sem contar que ninguém esquecerá do famoso bate aqui... coração. Além da célula, agradeço as amizades que construi ao longo do tempo, Juliana Chal, Cristiane Farinelle, Cristiane Porto, Nataly, Ezaine, Valéria, Ranúzia, Bárbara, Josílio, Vanessa, Tamires, Amanda e Luana. Agradeço também a ajuda e companheirismo de todos os meus queridos amigos, Diogo Wosny, Ramon, Zé, Sônia, David, Rodrigo, Tony e Gisele, que tornaram meus dias os mais divertidos e mais felizes, amo vocês e não abro mão. Ao Nathan Regis que tem estado sempre ao meu lado, não deixando com que eu desanime ou olhe pra trás, acreditando em mim, mesmo quando eu não tinha motivos para acreditar... Adoro-te garoto! A toda equipe de colaboradores, técnicos e laboratoristas que estão sempre nos auxiliando com experimentos, preparo de soluções e até mesmo, dicas para elaboração do trabalho de conclusão de curso. E que a paz de Deus que excede todo entendimento abençoe a todos que de alguma forma contribuíram para a conclusão desse trabalho.

6 iv Resumo Os produtos plásticos derivados do petróleo são amplamente utilizados na medicina, na indústria alimentícia, brinquedos, utensílios domésticos etc. Entretanto, a exigência das leis ambientais e a conscientização da sociedade mundial em preservar o meio ambiente têm levado a pesquisas de novos produtos que utilizem recursos renováveis. A obtenção de plásticos biodegradáveis, dentre eles o polihidroxibutirato (PHB) adquirido a partir de sistemas bacterianos, constitui-se em uma importante e inovadora proposta para a substituição dos plásticos convencionais. A Gluconacetobacter diazotrophicus é uma bactéria que interage naturalmente com a cana-de-açúcar, promovendo a fixação de nitrogênio atmosférico, além, de produzir fitorreguladores, promovendo o desenvolvimento da vegetal. Após análise do genoma, completamente sequenciado, foram identificadas proteínas envolvidas na biossíntese do polímero biodegradável, demonstrando assim que G. diazotrophicus, possui potencial para produção de polihidroxibutirato. O objetivo principal desse trabalho é avaliar o potencial de produção do biopolímero pela bactéria, através de análise in silico das proteínas envolvidas na via do metabolismo do butanoato, tornando uma investigação útil para os demais, no sentido de que seja inovador e relevante, podendo assim, futuramente empregar G. diazotrophicus a indústria do plástico biodegradável. Palavras-chave: Cana-de-açúcar, polihidroxibutirato, plástico biodegradável.

7 v Abstract The plastic products derived from petroleum are widely used in medicine, food, toys, household items etc. However, the requirement of environmental laws and awareness of society in preserving the global environment have led to research new products that use renewable resources. Obtaining biodegradable plastics, among them polyhydroxybutyrate (PHB) purchased from bacterial systems, constitutes an important and innovator proposal for substitution of conventional plastics. The Gluconacetobacter diazotrophicus is a bacterium that interacts naturally with cane sugar, promoting the fixation of atmospheric nitrogen, in addition, to produce plant hormones, promoting the development of the plant. After analysis of the genome completely sequenced were identified proteins involved in the biosynthesis of the biodegradable polymer, thus demonstrating that G. diazotrophicus, has potential for production of polyhydroxybutyrate. The main objective of this study is to evaluate the potential for biopolymer production by the bacterium through in silico analysis of proteins involved in metabolism via butanoate, making research useful for others, in the sense that is innovative and relevant, and thus can in future employ G. diazotrophicus industry of biodegradable plastic. Keywords: Sugarcane, polyhydroxybutyrate, plastic biodegradable.

8 vi SUMÁRIO Página Resumo...iv Abstract...v 1. Introdução Gluconacetobacter diazotrophicus O que é plástico? Os diferentes tipos de plásticos Polipropileno Polietileno Poliestireno Polibutileno PVC (Policloreto de vinila) Processos de reaproveitamento e destino dos resíduos plásticos Incineração Reciclagem Plásticos Biodegradáveis Justificativa Objetivos Objetivos gerais Objetivos específicos Materiais e métodos Análise in silico Quantificação de PHB Resultados e discussão Conclusão...21 Referências Bibliográficas...22

9 1 1 INTRODUÇÃO: 1.1 Gluconacetobacter diazotrophicus: A Gluconacetobacter diazotrophicus (figura 1) é uma bactéria encontrada nos espaços intercelulares de diversas plantas de famílias como Poaceae, Convolvulaceae, Rubiaceae e Bromeliaceae, além de interagir naturalmente com a cana-de-açucar, onde é bastante abundante e considerada modelo de estudo de interação planta-bactéria (Muñoz- Rojas e Caballero-Mellado, 2003). Uma vez presente no tecido vegetal, a G. diazotrophicus, estabelece uma relação benéfica com a planta, produzindo fitorreguladores, dentre eles vitaminas, hormônios e outras substâncias de interesse vegetal, possuindo ainda ação antagonista a agentes patogênicos, além de fixar nitrogênio atmosférico, sendo responsável por até 70% do nitrogênio incorporado a biomassa vegetal (Muñoz-Rojas e Caballero-Mellado, 2001). Figura 1: Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5 O aumento da contribuição ao desenvolvimento vegetal pode levar à redução do uso de fertilizantes e adubos nitrogenados, acarretando na diminuição dos custos de produção e gerando um impacto ambiental e social positivo, reduzindo a contaminação do ar e das águas pluviais em decorrência do acúmulo de nitratos e outros produtos tóxicos. Além disso, um de seus hospedeiros naturais, a cana-de-açúcar, apresenta uma importância significativa no setor agrícola, uma vez que o Brasil é atualmente o seu maior produtor

10 2 mundial, com produção de cerca de 27 milhões de toneladas de açúcar e 17 bilhões de litros de álcool/ano, (Conab, 2005) levando a uma economia de 29,16 milhões de U$ dólares/ano no país (Döbereiner, 1992; Baldani et al., 1997; Olivares, 1997; James e Olivares, 1998). Muitas bactérias patogênicas, simbiontes e comensais são capazes de transitar entre a vida no ambiente e no hospedeiro, e devem adaptar-se às mudanças repentinas na disponibilidade de nutrientes, assim como à resposta de defesa secundária do hospedeiro (Jefferson, 2004). G. diazotrophicus, por exemplo, deve-se adaptar à interação com insetos, esporos de fungos e principalmente a diferentes espécies de plantas e em diferentes circunstâncias. Um exemplo particularmente importante da adaptação bacteriana é a capacidade de crescer como biofilme como parte de uma comunidade séssil encoberta de polímeros secretados pela própria bactéria (Jefferson, 2004). O ciclo de desenvolvimento de um biofilme, embora organizado com fases distintas, ocorre com uma liberdade fenotípica que permite que as bactérias se adaptem às alterações impostas pelo ambiente ao qual estão submetidas. A transição entre um estado e outro é feita de maneira controlada e é altamente complexa sob o ponto de vista fisiológico, bioquímico e molecular (O Toole et al., 1999). O biofilme parece ser um modo de crescimento bacteriano que fornece as condições básicas para que permaneça em um nicho favorável, enquanto as culturas planctônicas seriam na verdade um artefato in vitro (Jefferson, 2004). A formação de biofilme por G. diazotrophicus pôde ser observada sobre lã-de-vidro através de microscopia eletrônica de varredura, onde foi analisado o padrão de biofilme de uma bactéria selvagem e uma mutante deficiente na formação de biofilme (Figura 2) A B C A D E F Figura 2: Estudo comparativo por microscopia eletrônica de varredura do padrão de biofilme formado pela bactéria selvagem (A) e a mutante EAL na formação de biofilme (B). Pádua et al., 2010 B

11 3 O genoma de G. diazotrophicus PAL5 foi depositado pela primeira vez no banco de genomas do NCBI (Nacional Center for Biotechnology information) em dezembro de 2007 e atualizado em julho de 2008, sendo composto por pares de nucleotídeos dispostos em um único cromossomo circular (número de acesso AM889285; 3,944,163 bp) e dois plasmídeos (Plasmídeo pgdipal5i com número de acesso AM e tamanho 38,818 bp e plasmídeo pgdipal5ii com número de acesso AM e tamanho 16,610 bp) (Bertalan et al., 2009). Após o sequenciamento de seu DNA e durante o trabalho de anotação do seu genoma, foram identificadas sequencias codificantes de proteínas componentes de vias biológicas importantes para a formação de biofilme, sendo que algumas eram compartilhadas com aquelas que estão ligadas à síntese de um polímero da família dos polihidroxialcanoatos, um bioplástico. Os bioplásticos são importantes no mecanismo bacteriano relacionado à adaptação e sobrevivência, conforme sugerido abaixo, e o biofilme também. A identificação de rotas metabólicas ligadas à síntese de polihidroxialcanoatos é uma forte sugestão de que G. diazotrophicus, possui potencial para ser empregada na indústria dos plásticos biodegradáveis. 1.2 O que é o Plástico? A palavra plástico deriva do grego plastikó, próprio para ser moldado ou modelado. (Andrade et al.2001). São materiais macromoleculares que podem ser moldados sob ação de temperatura e pressão; são basicamente constituídos por ligações covalentes entre carbonos que se repetem ao longo de uma cadeia denominada cadeia polimérica. (Mano e Mendes, 1999). Os produtos plásticos derivados do petróleo são largamente utilizados na construção civil, medicina, no setor automobilístico, na indústria farmacêutica, alimentícia, utensílios domésticos, brinquedos, calçados etc. O plástico é um produto muito versátil e ganhou um grande espaço no mercado por ser um material barato, leve e durável e tornando-se indispensável em nosso cotidiano, (Cangemi et al. 2005) o plástico possui propriedades interessantes como o isolamento térmico e elétrico, além de ser resistente à corrosão. Entretanto, devido às inúmeras vantagens e benefícios que os produtos plásticos nos oferecem, o uso dos mesmos vem aumentando significativamente nos últimos anos em

12 4 todo o mundo conforme mostra a tabela 1, chegando a mais de duzentos e sessenta e cinco milhões de toneladas de plástico produzidos por ano no mundo (Plastics Europe, 2011), consequentemente aumentando a quantidade de resíduos plásticos descartados no meio ambiente (Franchetti e Marconato, 2006). Devido a sua alta durabilidade e resistência, os plásticos sintéticos podem levar décadas e até séculos degradando no ambiente, além disso, a ausência de leis ambientais e conscientização da sociedade mundial em preservar o meio ambiente, tem tornado, o acúmulo desses resíduos ocasionados pelo descarte inadequado um dos grandes agravos ambientais de nosso século. Tabela 1: Produção mundial de plásticos em milhões de toneladas. Fonte: Plastics Europe, O consumo de plásticos no Brasil tem se tornado cada vez mais crescente. Segundo dados da ABIPLAST (2010), o brasileiro possui um consumo per capita médio de 28 kg de plástico por ano. Ainda com base nessa pesquisa foi observada uma produção de quase 5,2 milhões de toneladas de plástico de origem petroquímica no ano de 2009, quando também foi registrado um consumo de 5,4 milhões de toneladas, como ilustram respectivamente as figuras 3 e 4.

13 5 Figura 3: Produção do setor de produtos plásticos no Brasil (em milhões de toneladas). Fonte: ABIPLAST, Figura 4: Consumo aparente de produtos plásticos no Brasil (em milhões de toneladas). Fonte: ABIPLAST, Os diferentes tipos de plástico: Os plásticos são divididos em dois grandes grupos: os plásticos termorrígidos e os termoplásticos. Os plásticos termorrígidos, como o próprio nome sugere, são plásticos que uma vez moldados e endurecidos, não podem ser novamente fundidos. Desta forma estes plásticos não oferecem condições para serem reaproveitados através da reciclagem, como é o caso de plásticos usados na indústria automobilística, em telhas transparentes etc. (Guamá et al. 2008). Os termoplásticos por sua vez são sensíveis à temperatura, podendo ser facilmente moldados sob ação de temperatura e pressão. O processo pode ser repetido várias vezes, tornando viável a reciclagem dos mesmos (Parente, 2006). Os principais termoplásticos são: Polipropileno, polietileno, poliestireno, polibutileno e o PVC ou policloreto de vinila.

14 Polipropileno: O polipropileno (PP) tem origem no grupo dos polímeros poliolefínicos e é um dos mais importantes plásticos de massa. De aspecto transparente ou opaco, incolor ou colorido em todas as cores e tonalidades, embora a sua cor natural seja o branco leitoso, é obtido a partir da polimerização do propileno, que resulta da destilação do petróleo, num procedimento semelhante ao do polietileno de alta densidade (PEAD), isto é, sob pressão e na presença de catalisadores (Santos et al., 2004). O polipropileno é amplamente empregado em todo o mundo no setor automobilístico, utensílios domésticos, brinquedos, embalagens, isolamentos de cabos elétricos, dentre outras funções atendidas pelas suas características de baixa densidade associada a alta rigidez e dureza. A estrutura química do polipropileno é mostrada abaixo. Figura 5: Estrutura química do polipropileno Polietileno: O polietileno é considerado o polímero mais comum, pela cadeia simples (CH 2 - CH 2 ) n. Possui alta produção em escala mundial, sendo o polímero mais barato. O polietileno é sintetizado a partir da polimerização do etileno. São flexíveis, parcialmente cristalinos e inertes à maioria dos produtos químicos comuns, devido a sua natureza parafínica, seu alto peso molecular e sua estrutura parcialmente cristalina. Além disso, os polímeros etilênicos podem não apresentar toxicidade, podendo ser usados em contato com alimentos e produtos farmacêuticos (Coutinho et al, 2003).

15 Poliestireno: O poliestireno é um plástico que se obtém através da polimerização do estireno (um líquido oleoso, incolor e de forte odor). Caracteriza-se por ser um material muito frágil, apesar das vantagens que são: Resistência a humidade, brilhante, inodoro e não ser prejudicial à saúde (Gorni, 2003). O poliestireno é amplamente empregado na indústria por ser um material leve, econômico e de fácil manuseio, sendo utilizado na construção civil e confecção de caixas térmicas para armazenamento de bebidas e alimentos, sendo popularmente conhecido como isopor (Costa, 2007). Na figura 6, é mostrada a estrutura química do poliestireno. Figura 6: Estrutura química do poliestireno Polibutileno: O polibutileno caracteriza-se por ser um termoplástico de elevada resistência mecânica, tal característica, o permite ser usado em tubulações e sistemas de tubos aquecidos, uma vez que ele permite com que a velocidade do fluído aumente sem causar problemas de abrasão. Possui elevada flexibilidade mesmo a baixas temperaturas e

16 8 resistência a alguns agentes químicos como o cloro e agentes físicos como radiação UV (Cobrigas, 2009) PVC (Policloreto de vinila): O PVC é o material ideal para as mais diversas aplicações. É o único termoplástico que não é 100% derivado do petróleo, contendo em peso, 57% de cloro e 43% de eteno (Nunes et al, 2002). O policloreto de vinila consiste em um plástico que se obtém por polimerização do cloreto de vinilo. A fórmula geral do PVC é (CH 2 -CHCl)n. É um material termoplástico tenaz e rígido, mas que por ação de plastificantes pode se tornar flexível e elástico (Gorni, 2003). Devido a sua resistência à corrosão é empregado na elaboração de placas, tubos, placas, folhas e peças moldadas para torneiras e materiais de construção, isolantes de cabos elétricos e também um ponto de partida para fabricação de fibras e vernizes. Apesar de ser um termoplástico de vasta aplicação, em elevadas temperaturas pode liberar cloreto de hidrogênio que acumula-se na atmosfera, gerando assim um grave problema relacionado à eliminação dos seus desperdícios (Vieira, 2001). Atualmente, o PVC é o segundo termoplástico mais consumido em todo o mundo, com uma demanda mundial superior a 27 milhões de toneladas no ano de 2001, sendo a capacidade mundial de produção de resinas de PVC estimada em cerca de 31 milhões de toneladas/ano. Dessa demanda total, o Brasil foi responsável pelo consumo de cerca de 2,5% de resinas de PVC. Esses dados mostram o potencial de crescimento da demanda de resinas de PVC no Brasil, uma vez que o consumo per capita, na faixa de 4,0 kg/hab/ano, ainda é baixo quando comparado ao de outros países (Nunes et al, 2002). 1.4 Processos de reaproveitamento e destino dos resíduos plásticos: Todos os plásticos possuem em comum o fato de não serem biodegradáveis, pois são de origem petrolífera, podendo levar até séculos degradando no ambiente. Mas existe uma crescente demanda por sua produção e consumo, resultando na elaboração de algumas

17 9 estratégias que visam minimizar os impactos causados pelo acúmulo de resíduos plásticos. Algumas das estratégias empregadas são citadas abaixo: Incineração: É o termo usado para designar a combustão do lixo municipal. Um incinerador apropriadamente projetado e operado permite que a redução de volume de material a ser aterrado seja substancial. Em muitos países, a incineração é realizada para a conversão de resíduos plásticos em energia. Deve-se levar em conta que o valor energético dos plásticos é equivalente ao de um óleo combustível (37,7 MJ/kg) e, por esta razão, podem-se constituir em valiosa fonte energética (Cepis, 2004). Apesar da vantagem citada acima, a incineração ainda não é utilizada em grande escala devido ao elevado custo dos fornos de aquecimento e por ser um método potencialmente arriscado. Alguns plásticos como o cloreto de polivinila (PVC), quando em combustão liberam na atmosfera gases tóxicos, como o ácido clorídrico (HCl), uma substância tóxica, que quando acumulada na atmosfera pode gerar chuva ácida (Franchetti e Marconato, 2006). A reação da combustão do PVC está representada abaixo: 2[CH 2 CHCl]n + 5O 2 2HCl + 4CO 2 + 2H 2 O Reciclagem: É um método viável de reaproveitamento dos resíduos plásticos oriundos de lixões, sucatas e sistemas de coleta seletiva que são fundidos e transformados em novos produtos que poderão futuramente ser comercializados (Cangemi et al., 2005). Os programas de educação desenvolvidos nas escolas, comunidades e empresas estão dando suporte para a implantação de projetos de coleta seletiva, os quais, além de auxiliarem na geração de empregos e na conservação do meio ambiente, fornecem também matéria-prima de melhor qualidade para a indústria de reciclagem (Pires, 2002). A reciclagem de plásticos envolve um grande trabalho prévio de separação, identificação e limpeza dos materiais. Apesar desta demanda, o material reciclado é cerca de 50% mais barato que o polímero na forma virgem. No mundo, cerca de 20% dos

18 10 plásticos são reciclados. No Brasil, a reciclagem vem crescendo em volume e aumentando a diversidade e qualidade dos produtos reciclados (Franchetti e Marconato, 2006). Apesar da grande vantagem apresentada pela reciclagem, ainda há grandes desafios tais como: Dificuldade na separação dos diversos tipos de plásticos. Escassez de indústrias interessadas em comprar o material separado. Dificuldade em garantir um fornecimento contínuo de matéria prima de boa qualidade aos compradores Plásticos Biodegradáveis: Os plásticos biodegradáveis, também denominados plásticos biológicos ou bioplásticos, foram descobertos há cerca de 10 anos e ainda possuem uma participação mínima no mercado internacional (Franchetti e Marconato, 2006). Diferente dos plásticos convencionais derivados do petróleo, os bioplásticos uma vez lançados no meio ambiente, são degradados por microrganismos em um curto espaço de tempo, podendo com relativa facilidade integrar-se totalmente à natureza, sem causar danos à mesma, representando assim uma alternativa sustentável. Uma substância é biodegradável se os microrganismos presentes no meio ambiente forem capazes de convertê-la a substâncias mais simples, existentes naturalmente em nosso meio (Snyder, 1995). Em função de ser um material biodegradável, o bioplástico é considerado uma alternativa interessante para minimizar os impactos decorrentes de resíduos plásticos. Pesquisas com bioplástico vêm ocorrendo em todo o mundo, algumas envolvendo testes empregando óleo de mamona, cana-de-açúcar, beterraba, ácido lático, milho e proteína de soja, entre materiais de origem vegetal (Viveiros, 2003) e de origem microbiana (Squio e Aragão, 2004; Franchetti e Marconato, 2006). Polímeros da família dos polihidroxialcanoatos (PHAs), que são produzidos por algumas bactérias a partir de açúcares, possuem propriedades semelhantes às dos plásticos petroquímicos, com a vantagem de poderem ser biodegradados por microrganismos

19 11 presentes no meio ambiente, em curto espaço de tempo, após o descarte. O principal representante dos PHAs é o poli-β-hidroxibutirato (PHB), semelhante ao polímero sintético, polipropileno (PP), em propriedades físicas e mecânicas (Franchetti e Marconato, 2006). O polihidroxibutirato (Figura 7) serve a muitas bactérias como uma maneira de armazenar no interior celular, materiais que podem servir de reserva para obtenção de carbono e como fonte de energia para o caso de ausência de algum nutriente, podendo acumular até 90% de seu peso seco (Figura 8). Figura 7: Estrutura química do polihidroxibutirato. Figura 8: Fotomicrografia eletrônica de células bacterianas contendo grânulos do polímero biodegradável, da família dos polihidroxialcanoatos (PHA) acumulados no seu interior. Fonte: SILVA et al., Estes biopolímeros possuem propriedades físico-químicas e termoplásticas muito similares aos plásticos de origem petroquímica. São completamente biodegradáveis e biocompatíveis, produzidos a partir de matérias-primas renováveis, podendo ser reciclados e incinerados sem a geração de produtos tóxicos, o que os torna de grande aplicabilidade

20 12 em relação aos plásticos petroquímicos e possíveis candidatos a sua substituição (Byrom, 1987; Hanggi, 1995; Steinbuchel & Fuchtenbusch, 1998). O PHB pode ser amplamente utilizado na produção de embalagens de produtos de limpeza, higiene pessoal, recipientes para ferramentas agrícolas e vasos para mudas de plantas. Além disso, por ser biocompatível e facilmente absorvido pelo organismo humano, pode ser empregado na área médico-farmacêutica, prestando-se à fabricação de fios de sutura, próteses ósseas e cápsulas que liberam gradualmente medicamentos na corrente sanguínea (Bohmert et al., 2002). Algumas bactérias encontradas livremente na natureza - solo, água, plantas e efluentes - são responsáveis pela transformação de substratos em polihidroxialcanoatos (Byrom, 1987), e vem se tornando um valioso objeto de estudo nos últimos anos. Dentre os microrganismos produtores de PHAs, existe a bactéria Cupriavidus necator (Figura 9), que atualmente possui um amplo emprego na indústria dos bioplásticos, produzindo um polímero de alto peso molecular utilizando uma grande variedade de substratos orgânicos como frutose, glicose, acetato, lactato, glutamato, entre outros (Fiorese, 2008). Além dessa bactéria existem outros microrganismos produtores de PHA já descritos, como por exemplo Burkholderia sacchari, Bacillus megaterium e Pseudomonas oleovarans. Alguns microrganismos estão sendo foco de estudos avaliativos sobre o potencial de produção do polímero biodegradável, como é o caso da Gluconacetobacter diazotrophicus, o nosso objeto de estudo. Figura 9: Cupriavidus necator em fase de produção. Fonte: AMPE, 1995; SUDESH et al., 2000.

21 13 2 JUSTIFICATIVA: Considerando a grande demanda mundial de produtos plásticos e o constante apelo por uma política de conservação do meio ambiente, o presente trabalho busca elucidar como um interessante caminho pode ser traçado a partir do potencial desenhado na estrutura do genoma de G. diazotrophicus, podendo ser empregada na indústria do plástico biodegradável, utilizando como substrato principal, o bagaço da cana-de-açúcar. 3 OBJETIVOS: 3.1 Objetivos gerais: Abrir espaço para novas pesquisas qualitativas, a fim de avaliar o potencial de produção de biopolímero plástico por G. diazotrophicus, contribuindo futuramente para a preservação ambiental e para o aumento do conhecimento e o desenvolvimento de soluções tecnológicas e inovadoras para a substituição dos plásticos que causam poluição. 3.2 Objetivos específicos: O presente trabalho tem como principal objetivo, realizar a análise in silico das proteínas relacionadas na síntese de PHB com posterior quantificação por cromatografia gasosa, através do método descrito por Riss e Mai, 1988.

22 14 4 MATERIAIS E MÉTODOS: 4.1. Análise in silico: A sequência da proteína poly-beta-hydroxybutyrate polymerase de Cupriavidus necator (sinônimo Ralstonia eutropha) H16 (P ) do Genkbank, um banco de dados de sequências de DNA e de aminoácidos localizado no Centro Nacional de Informação Biotecnológica NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), foi empregada como base para identificação do seu ortólogo no genoma de G. diazotrophicus. O NCBI fornece um conjunto de ferramentas de bioinformática para analisar estas sequencias de DNA e de aminoácidos, como o Blast (Basic Local Aligment Search Tool), que permite comparar a sequencia de interesse, com base na similaridade identificada em um alinhamento local, com todas as sequências de domínio público depositadas no Banco (Altschul et al., 1997). Há várias modalidades de BLAST. A modalidade adotada neste trabalho foi o tblastx, onde a informação Query (segmento de DNA pesquisado e usado como isca) e base de dados (Subject) são sequências de nucleotídios. Antes mesmo de verificar a homologia, o programa realiza as seis traduções possíveis de cada sequência de nucleotídios, ou seja, tanto a seqüência pesquisada quanto cada uma das presentes na base de dados são transformadas em seis proteínas. Esta etapa é interessante já que as proteínas de dois organismos são mais parecidas entre si que os nucleotídios que as codificam. Após realizar todas as traduções possíveis, o programa faz alinhamentos entre seus resultados e devolve para proteína Query - proteína Subject. Nesta análise, apenas uma das seis leituras possui significado biológico; as demais geram resultados que são descartados. Neste trabalho só existe interesse em comparar a sequencia de interesse de C. necator H16 àquelas depositadas no Banco e derivadas de G. diazotrophicus PAL5. C. necator foi adotada como ponto de partida já que acumula o biopolímero em até 90% de seu peso seco, quando exposta a altas concentrações de açúcar (Pohlmann et al., 2006). O resultado da análise por BLAST serviu para a identificação de sequências com similaridade suficiente dentro do Banco Query de G. diazotrophicus permitindo atribuir a mesma função do segmento de DNA usado para a busca (derivada de C. necator), que teve a função conhecida experimentalmente. Um parâmetro calculado pelo BLAST é mostrado como valor "E". Este valor

23 15 expressa o grau de similaridade, sendo que quanto menor, menor a chance da identidade achada na comparação das sequencias ser por acaso. Além do BLAST, a análise in silico prosseguiu empregando outras Bases de dados mais comuns como as que são abrigadas pelo Instituto TIGR - Instituto para Pesquisa em Genômica (www.biochipnet.com/node/2103) e o banco de dados de proteínas Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk/). Com base no programa Clustaw, abrigado no Instituto de Bioinformática Europeu - European Molecular Biology Laboratory (EBI EMBL) (http://www.ebi.ac.uk/), as sequencias identificadas como PHB sintase em G. diazotrophicus, bem como a sequência de C. necator utilizada como isca e outras sequencias ortólogas derivadas de bactérias já integradas à indústria e produtoras do biopolímero de interesse foram alinhadas. O Clustaw realiza múltiplos alinhamentos com sequenciais de DNA e de proteínas para a construção das árvores filogenéticas. Embora o programa permita a personalização dos parâmetros de alinhamento múltiplo para a construção da árvore filogenética, este trabalho utilizou a configuração padrão oferecida, já que atendia às necessidades. As aproximações evolutivas apresentadas através das árvores filogenéticas são uma maneira de entender a relação entre os dados usados na comparação. O banco KEGG (http://www.genome.ad.jp/kegg) é a representação computacional completa da célula e do organismo, permitindo a predição, com altos níveis de complexidade, dos processos celulares a partir de informações moleculares e genômicas. Este Banco possui dados de genomas e de vias metabólicas de várias espécies; sendo também útil para o estudo das vias relacionadas à produção de PHB em G. diazotrophicus e de bactérias relacionadas, com interesse industrial. 4.2 Quantificação de PHB: Para quantificação da massa de PHB acumulado pela bactéria seguiu-se o método da propanólise visando a posterior análise por cromatografia gasosa, segundo método descrito por Riss e Mai (1988). Este método é baseado na hidrólise e transesterificação do P(3HB) com propanol e ácido clorídrico, levando à formação de um éster, o 3- hidroxibutirato de propila, que é quantificado por cromatografia gasosa.

24 16 Foram utilizadas culturas de G. diazotrophicus PAL5 cultivadas em meio DYGS com a seguinte composição em g L -1 : Glicose, 2; peptona, 1,5; extrato de levedura, 2; KH 2 PO 4, 0,5; MgSO 4.7H 2 O, 0,5; ácido glutâmico, 1,5; completados com água destilada até 1000 ml; ph 6,0; à 30ºC, durante 24 horas em tubos Falcon de 30 ml. Em seguida, o meio contendo a cultura foi lavado com água destilada estéril, em uma proporção 1:10 (meio/água), e sucessivamente foram realizadas duas centrifugações à 4000rpm à 5 ºC por 20 minutos cada uma. A massa de bactérias obtidas após a centrifugação foi lavada duas vezes com água destilada estéril e posteriormente transferida para tubos de vidro com vedação, com auxílio de 2 ml de propanólise. A propanólise consiste numa solução com proporção de 1 ml de ácido clorídrico: 4 ml de propanol, totalizando 5 ml de solução. Após a transferência do pellet bacteriano com auxílio da propanólise, para os tubos de vidro, foram adicionados 2 ml de dicloroetano, os tubos foram vedados e aquecidos em banho-maria a 100 ºC durante 2 horas. Após o tempo de aquecimento, retirou-se do banho, para resfriamento, o reagente dos tubos foi evaporado por completo, mesmo os tubos estando hermeticamente fechados, tornando-se necessária a repetição do experimento mais duas vezes, porém, ainda assim não foi obtido sucesso. Segundo Riss e Mai, após as duas horas de aquecimento, os tubos deveriam ser retirados do banho-maria, e após resfriamento, adicionados 4 ml de água destilada estéril, tornando-se possível a observação de uma separação de fases: Uma fase orgânica e uma fase aquosa. Da fase orgânica, eram extraídos 2 ml e desse volume eram adicionados 0,2 ml de uma solução de 40mg/ml de benzoato de etila em propanol que funciona como um padrão interno para a cromatografia gasosa. Após o preparo das amostras, alíquotas de 0,2 µl eram injetadas no cromatógrafo gasoso e quantificadas.

25 17 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO: O alinhamento por BLAST da proteina PHB polymerase da R. eutropha H16 com a da G. diazotrophicus PAL 5 revelou uma similaridade significativa, conforme evidenciado na figura 9. Figura 9: Matriz de ponto (alinhamento local por Blast2 seq) mostrando similaridade entre as sequências de poly-beta-hidroxibutirato sintase de Ralstonia eutropha H16, uma bactéria produtora de PHB e de G. diazotrophicus (similaridade = 5/9 = 56%) A relação ao nível de sequência sugere funções comuns. Foi realizada uma análise complementar a partir da busca de domínios conservados funcionais, usando as bases de dados mais comuns como os abrigados pelo Instituto TIGR- Instituto para Pesquisa em Genômica (www.biochipnet.com/node/2103) e o banco de dados de proteínas Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk/). A análise revelou similaridade com o domínio TIGR01836: PHA_synth_III_C (Evalue: 2.20e-34), correspondente a função sintase de ácido poli (R)-hidroxialcanóico classe III, subunidade PHAc. Este representa a subunidade PHAc de uma forma heterodimérica ácido de Poli hidroxialcanóico sintase (PHA). Excetuando-se os PHAc de Bacillus megaterium, todos os membros exigem Pha e (TIGR01834) para a atividade e são designadas de classe III. Esta enzima constrói polímeros de ésteres de carbono para armazenamento de energia que se acumulam nas inclusões bacterianas.

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