Amplificação cruzada de primers SSR para a espécie Cichla kelberi (Tucunaré amarelo) do reservatório Serra da Mesa Goiás

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1 Amplificação cruzada de primers SSR para a espécie Cichla kelberi (Tucunaré amarelo) do reservatório Serra da Mesa Goiás Introdução 1 Ramilla dos Santos Braga (UEG) Thaís Guimarães de Castro (UFG) Mariana Pires de Campos Telles (UFG) Samantha Salomão Caramori (UEG) ramillabraga@hotmail.com A evolução da biotecnologia possibilitou o avanço de várias técnicas na área da Genética, pois facilitou os estudos ainda escassos de espécies importantes da nossa fauna e flora (Ferreira & Gratapalia, 1998). Dentre estas técnicas existem os marcadores moleculares que são ferramentas eficazes no conhecimento do genoma das espécies, permitindo várias pesquisas que funcionam como mecanismos de ações que auxiliam no conhecimento genético dos espécimes e consequentemente em planos de conservação da espécie (Artoni & Matiello, 2003). Dentre os maçadores genéticos podemos destacar os microssatélites, também conhecidos como SSR (Simple Sequence Repeat), que são regiões genômicas caracterizadas por repetições de bases organizadas em tandem e em motivos de di, tri ou tetranucleotídeos (Ferreira & Gratapalia, 1998). Este tipo de marcador molecular é bastante usado em estudos genéticos, pois é capaz de identificar diferenças nas regiões homológas entre as espécies, ou seja, nos fornece informações acerca da diversidade gênica dos indivíduos de determinada população. São definidos por corresponderem às regiões altamente repetitivas, com expressão codominante, multialelismo, além de serem abundantes e reproduzíveis. Também apresentam a vantagem de transferibilidade em outros genomas, podendo ser encontrados tantos em regiões de transcrição e neutras do DNA e serem baseados na técnica de PCR (polymerase chain reaction), técnica marcada pela facilidade de reprodução e confiabilidade dos dados (Gasic et al., 2009; Matioli & Passos-Bueno, 2001). Limitações como, o grande investimento financeiro e profissional estão envolvidas na aplicabilidade e desenvolvimento dos marcadores SSR específicos para cada espécie (Ferreira & Grattapalgia, 1998). Felizmente, os microssatélites são regiões nucleotídicas conservadas em genomas de espécies relacionadas evolutivamente o que possibilita a transferibilidade de marcadores SSR entre espécies ou em nível superior, como no caso de gêneros diferentes, mas da mesma família (Caixeta, 2006). O processo de transferibilidade é baseado na similaridade genética das espécies, considerando a homologia das regiões flanqueadoras das sequências de microssatélites (Oliveira et. al, 2006). Neste contexto o grupo biológico mais representativo dos vertebrados, a ictiofauna é bastante estudada geneticamente, pois através do processo de transferibilidade muitos gastos são reduzidos e ao mesmo tempo possibilita a compreensão da estruturação gência de populações próximas evolutivamente. A abundância de espécies neotropicais de habitat dulcícola favorece a existência de

2 trabalhos que busquem amenizar diversos impactos causados a estas que são constantemente ameaçadas por exploração inadequada do ecossistema em que são inseridas (Agostinho, 2007) e a construção de reservatórios desponta neste aspecto por constituir-se um bloqueio físico ás atividades biológicas desenvolvidas pelas espécies existentes no ambiente aquático ou que dele dependem (Agostinho, 2007; Luiz et al., 2003). No lago Serra da Mesa pode ser encontrada a espécie de tucunaré, Cichla kelberi (Kullander & Ferreira, 2006), conhecido pela sua cor amarelo, podendo ser empregado em várias utilidades pesqueiras. Este peixe exibe comportamento sedentário que estimula o desenvolvimento de populações distintas ecologicamente e geneticamente ao longo do reservatório (Oliveira et al., 2008). Dessa maneira o objetivo deste trabalho é testar a amplificação cruzada de locos microssatélites desenvolvidos para várias espécies da ictiofauna no genoma de Cichla keberi, encontrada no lago artificial Serra da Mesa. Objetivo geral Testar a amplificação cruzada de locos microssatélites desenvolvidos para várias espécies da ictiofauna no genoma de Cichla keberi, encontrada no lago artificial Serra da Mesa. Objetivos específicos Identificar locos heterólogos que possam ser usados em estudos genéticopopulacionais da espécie Cichla kelberi; Analisar se há amplificação cruzada de locos heterólogos de espécies de peixes de ordens diferentes da espécie em estudo; Caracterizar os locos que foram transferidos para espécie Cichla kelberi, verificando a presença ou não de polimorfismo; Fornecer informações acerca da genética da espécie Cichla kelberi, associando a fatores ecológicos. Material e métodos As coletas foram realizadas no período de no reservatório Serra da Mesa, totalizando três coletas. A coleta dos indivíduos foi feita em seis pontos amostrais localizados próximos à jusante dos seguintes afluentes: Rio Bagagem, rio Maranhão, Rio Tocantizinho e Rio Traíras, em que foram armadas redes de espera de diferentes malhas, 2.4, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 e 16 cm, permanecendo 24 horas em cada ponto. Para aumentar o número de indivíduos capturados foi utilizada a metodologia de pesca comum (com vara e isca artificial). A extração de DNA dos indivíduos coletados seguiu o protocolo descrito por Taggart et al., (1992), com as etapas de maceração do tecido usando STE e precipitção do DNA com cloreto de sódio e etanol. Logo após a etapa de extração de DNA houve a quantificação das amostras em gel de agarose 1% com o uso do marcador molecular Low DNA Mass Ladder (Invitrogen ), corado com brometo de etídeo (Lima et al., 2008), para posteriormente 2

3 realizar a diluição das amostras para prosseguir com as outras etapas. A reação de PCR das amostras procedeu num termociclador em que consistiu-se das seguintes fases: desnaturação, anelamento e extensão das moléculas de DNA com temperatura inicial de 94 C a 5, 30 ciclos de 94 C a 1, X C a 1, 72 C a 1 e 72 C a 7. Para o processo de amplificação cruzada 26 locos desenhados para as espécies Cichla piquiti, Prochilodus argenteus, Piaractus mesopotamicus foram testados no genoma de Cichla kelberi. Os produtos de amplificação foram visualizados em eletorforese vertical em poliacrilamida 6% e corado com nitrato de prata e uso do marcador molecular 10 bp. Para as análises da heterozigosidade esperada e observada, probabilidade de exclusão de paternidade (Q), definida como a exclusão de uma falsa paternidade, a probabilidade de identidade genética (I), que avalia se os genótipos de dois indivíduos escolhidos aleatoriamente são idênticos foi utilizado o programa Identity 1.0 (Wagner & Sefc, 1999). Resultados e Discussão As temperaturas de anelamento dos 26 locos avaliados variaram entre 44 e 62º C. Até o momento, quatro apresentaram sucesso de amplificação cruzada para Cichla kelberi, e foram padronizados com as temperaturas de anelamento 54º C (Tuc 4, Tuc 16) e 56º C (Tuc 11 e Tuc 10). Os outros locos não apresentaram amplificação cruzada, portanto não foram analisados em todos os indivíduos da população coletados. Considerando os três indivíduos do teste inicial, os alelos obtidos apresentaram os seguintes tamanhos: 195 pb (Tuc 4), 185 pb (Tuc 10), 168 pb (Tuc 11) e 212/220 pb (Tuc 16). Para verificar se houve realmente transferibilidade genética, os locos amplificados nos testes foram analisados na população com 21 indivíduos, coletados em pontos aleatórios do reservatório Serra da Mesa. Os locos Tuc 4, Tuc 11 e Tuc 10 foram monomórficos e apenas o Tuc 16 teve polimorfismo na população. A variação de alelos por loco foi baixa, pois apenas no loco Tuc 16 foram encontrados dois alelos. A heterozigosidade esperada (He) e heterozigosidade observada (Ho) foram de zero para os locos Tuc 4, Tuc 10, Tuc 11 devido estes locos serem monomórficos. O conjunto de locos não oferece informações acerca da diversidade genética das populações, pois os locos Tuc 4, Tuc 10 e Tuc 11 podem enviesar os resultados, mascarando regiões variáveis do genoma (Lima et al., 2008). A He e Ho foram de 0,42 e 0,38, respectivamente, para o Tuc 16. Assim, este loco está próximo do Equilíbrio de Hardy-Weinberg, indicando que as freqüências alélicas e genotípicas para este loco são estáveis para os indivíduos testados. Os baixos níveis de heterozigosidade observada provavelmente têm relação com o efeito fundador, processo ecológico e genético, causado pela formação recente do reservatório Serra da Mesa. Este efeito pode ter sido ocasionado quando o represamento iniciou-se, em que as espécies de tucunaré, tanto Cichla kelberi e Cichla piquiti, eram encontradas no baixo Rio Tocantins (Lima & Souza, 2010), o qual é um dos integrantes do reservatório. Em resumo, este processo recruta poucos indivíduos para formar uma nova população, levando a fixação de alguns alelos nesta e consequentemente, a baixa variabilidade genética, provocada pela endogamia, resultante do efeito fundador (Aho, et al., 2006; Freitas & Galetti Jr, 2005). Ao contrário do que ocorreu no trabalho de Carvalho et al.(2009), em que a amplificação cruzada de regiões genômicas de Cichla piquiti para Cichla kelberi apresentou-se bastante satisfatória, neste trabalho o sucesso da transferibilidade é 3

4 inferior a 50%. Este fato é bastante interessante pela questão que as espécies de tucunaré que compõem o lago Serra da Mesa são do mesmo gênero e mesma família. Assim, era esperado que a maioria dos locos testados fosse transferida para o genoma de Cichla kelberi, aumentando o número de primers que podem ser usados em estudos genético-populacionais da espécie. Uma possível explicação para este fato é que a espécie Cichla kelberi pode apresentar regiões microssatélites diferentes daquelas já amplificadas para o genoma de Cichla piquiti. Essas diferenças podem ser ocasionadas por crossing over, slippage (erros da enzima da DNA polimerase), originando microssatélites de tamanhos diferentes que impedem a amplificação cruzada (Borém & Caixeta, 2009). Em relação aos locos desenvolvidos para as espécies Prochilodus argenteus e Piaractus mesopotamicus e a não transferibilidade destes locos no genoma de Cichla kelberi pode ser associada à distância evolutiva destas espécies com a espécie analisada, evidenciada pela classificação taxonômica das espécies, em que Prochilodus argenteus e Piaractus mesopotamicus pertencem à ordem Characiforme enquanto Cichla kelberi é incluído na ordem Perciforme (Caixeta, 2006). Conclusão Com a baixa taxa de transferibilidade encontrada para a espécie Cichla keberi sugere-se que sejam feitos mais estudos relacionadas à genética deste peixe para que se tenham marcadores moleculares que propiciem informações mais robustas sobre a dinâmica genética populacional e ecológica de Cichla kelberi em ambientes naturais e introduzidos. Além que, com este trabalho podemos conhecer dados acerca da genética desta espécie, propiciando a realização de mais estudos genético-populacionais que possa aferir mais sobre a presença desta em espécie. Agradecimento Agradeço a Pró-Reitoria de Pesquisa e Extensão da Universidade Estadual pela bolsa de iniciação científica, concedida durante o período de um ano para a execução deste trabalho. Também agradeço ao Laboratório de Genética e Biodiversidade da Universidade Federal de Goiás pela infra-estrutura, a Naturae, empresa pela qual são financiados projetos neste laboratório e que contribuiu financeiramente para a realização dos experimentos. Ao IBAMA pela toda logística empregada durante as coletas em campo. Referências Bibliográficas AGOSTINHO, A. A. Ecologia e manejo de recursos pesqueiros em reservatórios do Brasil. Maringá: Eduem AHO, T.; Rönn, J.; PIIRONEN, J.; BJÖRKLUND, M. Impacts of effective population size on genetic diversity in hatchery reared Brown trout (Salmo trutta L.) populations. Aquaculture, v. 253, n. 1-4, p ARTONI, R. F. ; MATIELLO, M. C. A. Genética de peixes neotropicais. I. Aspectos da conservação genética dos peixes no Parque Estadual de Vila Velha, Paraná, Brasil. Ci. Biol. Saúde, v. 9, n. 2, p BORÉM, A. CAIXETA. E. T. Marcadores Moleculares. 2 Ed. Viçosa: Folha de Viçosa p. 4

5 CAIXETA, E. T.; OLIVEIRA, A. C. B.; BRITO, G. G.; SAKIYAMA, N. S. Tipos de marcadores moleculares. In: BORÉM, A.; Caixeta, E. T. (ed). Marcadores moleculares. Viçosa, MG, pp. CARVALHO, D. C.; OLIVEIRA, D. A. A.; SAMPAIO, I.; BEHEREGARAY, L. B. Microsatellite markers for the Amazon peacock bass (Cichla piquiti). Molecular Ecology Resources, n. 9, p FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. Brasília 3ª ed.: EMBRAPA-CERNAGEN. Documento pp. FREITAS, P. D.; GALETTI JR, P. M. Assessment of the genetic diversity in five generations of commercial broodstock line of Litopenaeus vannamei shrimp. African Journal of Biotechnology, v. 4, n. 12, p GASIC, K.; HAN, Y.; KERTBUNDIT, S.; SHULAEV, V.; IEZZONI, A. F.; STOVER, E. W.; BELL, R. L.; WISNIEWSKI, M. E.; KORBAN, S. S. Characteristics and transferibiity of new apple EST-derived SSRs to other Rosaceae species. Mol. Breedin., v. 23, p KULLANDER, S.O.; FERREIRA, E.J.G. A review of the South American cichlid genus Cichla, with descriptions of nine new species (Teleostei: Cichlidae). Ichthyological Exploration of Freshwaters, v. 17, n. 4, p LIMA, C. B.; SOUZA, R. L. Tucunaré amarelo (Cichla kelberi). Bicho da vez, n. 20, p LIMA, J. S. TELLES, M. P. C. RESENDE, L. V. GOUVEIA, F. O. BONI, T. A. Amplificação cruzada e padronização de marcadores microssatélites em Colossoma macropomum (tambaqui). Rev. Biol. Neotrop., v. 5, n. 2, p LUIZ, E. A.; GOMES, L. C.; AGOSTINHO, A. A.; BULLA, C. K. Influência de processos locais e regionais nas assembléias de peixes em reservatórios do Estado do Paraná, Brasil. Acta Scientiarum: Biological Sciences, v. 25, n. 1, p MATIOLI, S. R. PASSO-BUENO, M. R. S. Métodos baseados em PCR para análise de polimorfismos de ácidos nucléicos. In: MATIOLI, S. R. (ed). Biologia Molecular e Evolução. Holos, pp. OLIVEIRA, V. F. OLIVEIRA, A. V. PRIOLI, A. J. PRIOLI, S. M. A. P. Obtaining 5S molecular markers for native ande invasive Cichla populations (Perciformes - Cichlidae), in Brazil. Acta Sci. Biol. Sci., v. 30, n. 1, p OLIVEIRA, E. J. PÁDUA, L. G. ZUCCHI, M. I. VENCOVSKY, R. VIEIRA, M. L. C. Origin, evolution ande genome distribution of microssatélites. Genectis and Molecular Biology, v. 29, n. 2, p TAGGART, J. B.; HYNES, R. A.; PRODOHL, P. A.; FERGUSSON, A. A simplified protocol for routine total DNA isolation from salmonid fishes. Journal of Fish Biology, n. 40, p

6 WAGNER, H. W. SEFC, K. M. IDENTITY Freeware program for the analysis of microsatellite data, Centre for Applied Genetics, University of Agricultural Sciences. Vienna p. 6