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1 [Ano] Biotecnologia e Melhoramento Animal

2 Unidade - Biotecnologia e Melhoramento Animal MATERIAL TEÓRICO Responsável pelo Conteúdo: Prof a. Ms. Heloísa Orsini de Souza Revisão Textual: Prof a. Ms. Alessandra Fabiana Cavalcante 2

3 1 Introdução Define-se Biotecnologia como um conjunto de conhecimentos técnicos e de métodos que permitem a utilização dos seres vivos como parte do processo de produção industrial de bens e serviços (por definição de Antonio Paes de Carvalho VILLEN, 2011). A Biotecnologia utiliza recursos biológicos para as mais diversas finalidades. A manipulação de organismos vivos para a produção de substâncias remonta à antiguidade. Desde séculos antes de Cristo, grãos e frutos, como a uva, já eram utilizados para a fabricação de bebidas alcoólicas por meio de processos fermentativos por micro-organismos, mesmo não se conhecendo tais agentes naquela época. Em 1928 d.c., Alexander Fleming descobriu a penicilina (antibiótico liberado por fungos da espécie Penicillium notatum), que revolucionou a medicina e passou a ser produzido industrialmente. A Biotecnologia como ciência só passou a existir a partir da década de 50, quando houve a possibilidade de se manipular os genes e as moléculas de DNA área conhecida como engenharia genética. A manipulação do material genético permitiu a produção de moléculas de DNA recombinantes e a formação de indivíduos geneticamente modificados (transgênicos). Da mesma forma, permitiu avanço em métodos de identificação genética e de diagnóstico molecular, bem como o desenvolvimento de produtos terapêuticos e de vacinas, entre outras coisas. No Melhoramento Animal, a Biotecnologia foca o aumento quantitativo e qualitativo da produtividade das diversas espécies animais. Na pecuária e na saúde animal, a Biotecnologia é utilizada em princípios como a inseminação artificial, a clonagem e a transferência de embriões, a fertilização in vitro, a produção de animais transgênicos, a produção de antibióticos, hormônios e vacinas, entre outros. 3

4 2 Engenharia Genética ou Tecnologia do DNA Recombinante A engenharia genética, também chamada de tecnologia do DNA recombinante, corresponde a um conjunto de técnicas que permitem a manipulação do DNA. No Melhoramento Animal sua importância se relaciona ao auxílio das técnicas tradicionais de seleção e de cruzamentos, aumentando o progresso genético. Em Medicina Veterinária, a engenharia genética pode ser utilizada tanto para a identificação de genes, e consequentemente de potencialidades produtivas e de doenças genéticas, em animais ainda na fase embrionária, quanto para multiplicação e transferência de genes, na intenção de se transformar geneticamente indivíduos. 2.1 Identificação Genética A identificação genética, ou seja, a identificação de genes favoráveis ou deletérios para alguma característica nos animais é feita por meio de marcadores genéticos, também conhecidos como sondas. As sondas são moléculas utilizadas para localizar a presença de uma determinada sequência de nucleotídeos dentro do DNA animal, a qual é específica. Correspondem a fragmentos unifilamentares de DNA complementares (DNAc) à sequência que se procura no genoma animal, marcadas com radioisótopos (substâncias radioativas, responsáveis por impregnar chapas de radiografia), com compostos fluorescentes ou com substâncias que promovem uma reação de cor durante uma análise genética. A marcação com as sondas serve para mostrar se o gene que se procura existe ou não no genoma de um animal. Se sim, a sonda deve incorporar-se ao DNA e promover uma reação visível, o que não acontece se a sonda não encontrar o gene procurado (Figura 1). A sonda pode ser produzida sinteticamente, utilizando-se nucleotídeos específicos, desde que se conheça a sequência do gene que se procura. 4

5 Um exemplo de identificação genética utilizada no Melhoramento Animal é a busca de alelos que favoreçam a concentração de uma proteína chamada k-caseína no leite de vacas. A k-caseína promove a coagulação mais rápida do leite e a sua estabilidade térmica, características que são importantes na indústria de laticínios, especialmente na produção de queijos. A busca de alelos que favoreçam a produção de β-lactoglobulina, associada à maior concentração de proteínas e de gordura no leite, também é importante de acordo com o mercado consumidor de leite de populações bovinas, assim como a busca de alelos que favoreçam a produção de lactoalbumina, associada à maior produtividade leiteira. As sondas são também utilizadas também para identificar potencialidades ovulatórias em ovinos, de ganho muscular em bovinos, de tamanho de ninhada em suínos, entre outras. Desta forma, a marcação molecular facilita a seleção animal para fins econômicos e de produtividade. Figura 1: Representação esquemática da utilização de sondas na identificação genética 2.2 Multiplicação e Transferência de Genes Os objetivos gerais da multiplicação e da transferência de genes se associam à produção de sondas, ao estudo de sequência de DNA, à introdução de genes específicos em bactérias, para que estas produzam substâncias interessantes para os seres humanos (tais como a insulina), à produção de vacinas transgênicas (que contenham apenas a parte imunogênica de um determinado micro-organismo, excluindo seus fatores infectantes), à produção de biorreatores e outros indivíduos transgênicos. 5

6 A clonagem de um segmento de DNA é realizada por um procedimento laboratorial conhecido como amplificação. Para tal, de forma simplificada, fragmentos de DNA são submetidos a um gradiente de temperatura que promove a separação das fitas duplas das moléculas. As fitas são colocadas em contato com nucleotídeos livres de DNA e com enzimas com atividade semelhante à da DNA-polimerase (responsável por promover a inserção complementar de nucleotídeos nas cadeias-molde do DNA). O DNA pode também ser produzido a partir do RNA mensageiro para alguma proteína. Para tal, utiliza-se uma enzima conhecida como transcriptase reversa, que promove a formação de DNA a partir de uma molécula de RNA. A molécula produzida recebe o nome de DNA complementar (DNAc). O DNAc é então submetido à presença de nucleotídeos de DNA e da enzima DNA polimerase, permitindo que se formem fitas de DNA complementares a ele. Têm-se assim, moléculas de DNA de dupla-fita formados com base nas informações do RNA mensageiro. 3 Produção de Animais Transgênicos Os animais transgênicos correspondem a indivíduos manipulados geneticamente para que possuam um fragmento de DNA exógeno (nãopróprio) integrado ao seu e que consigam transmiti-lo aos seus descendentes. A intenção deste tipo de manipulação é melhorar as qualidades genéticas dos animais, visando, principalmente, o aumento da produtividade, o aumento da resistência a doenças, a deleção de genes deletérios (produção de animais chamados de knockout), a formação de biorreatores (indivíduos que produzem substâncias de interesse farmacêutico e biomédico de interesse humano), a adequação animal para a realização de xenotransplantes (transplantes interespecíficos), a confecção de modelos experimentais animais, etc. 6

7 A transgenia em animais teve seu início na década de 70 com camundongos principais modelos de estudos genéticos em mamíferos. Em animais de produção, como os bovinos, suínos e caprinos, a transgenia começou visando à formação de biorreatores, ou seja, de animais que conseguissem liberar em seus fluídos biológicos (leite, urina, sêmen, plasma sanguíneo etc.), elevadas quantidades de substâncias importantes na terapia de alguns processos patológicos humanos (biofármacos), tais como a insulina, alguns fatores de coagulação sanguínea, hormônios, etc. Para tal, genes humanos para a produção dessas substâncias eram inseridos no genoma animal de forma que este os produzisse em larga escala, liberando-os em seus fluídos corporais. É importante ressaltar que a produção de biorreatores não é um processo simples e demanda conhecimento e grande gasto financeiro e tempo, além de não ser um método seguro e eficaz para todas as substâncias. O interesse na transgenia para a formação de xenotransplantes também é crescente. A ideia geral é poder utilizar órgãos animais para transplantes humanos, tais como coração, fígado, rins etc., visto que a doação de órgãos humanos é deficitária em relação às necessidades. Neste sentido, os suínos ganham importância, visto que o tamanho e as características anatômicas e funcionais de seus órgãos são compatíveis com os dos humanos. Além disso, tais animais são bastante prolíficos, atingem a maturidade sexual cedo e são de fácil manutenção. O grande problema associado aos xenotransplantes é a rejeição imunológica dos órgãos transplantados. Desta forma, a transgenia nesses animais visa à inibição de algumas reações imunológicas, tais como a ativação do sistema complemento, além da remoção de componentes antigênicos dos órgãos suínos, entre outras coisas. Uma preocupação que se deve ter com esse procedimento é a possibilidade de transmissão de zoonoses também. Atualmente existe um interesse em se utilizar a transgenia na pecuária para o aumento quantitativo e qualitativo da produtividade animal. Assim, ações para aumentar a qualidade e a quantidade da carne e do leite, melhorar a qualidade da lã, aumentar a prolificidade, modificar a composição do leite, aumentar a resistência a doenças etc., têm sido tomadas. Algumas dessas ações são ainda experimentais. Alguns projetos em andamento são o aumento 7

8 da expressão de k-caseína no genoma de vacas transgênicas produtoras de leite, a expressão de uma enzima chamada de lisostafina (que possui um efeito bactericida sobre algumas bactérias do gênero Staphylococcus, responsáveis por causar mastite em vacas), a expressão do gene para a lactoalbumina bovina em suínos (na intenção de aumentar a produção leiteira e, consequentemente, o ganho de peso de leitões) e a expressão do gene da fitase bacteriana na saliva de suínos (o que diminui a excreção de fitatos fosfóricos nas fezes dos animais, que são poluentes ambientais). Existem algumas técnicas que podem ser utilizadas para se produzir um animal transgênico e serão descritas a seguir. 3.1 Micro-injeção Pró-Nuclear A técnica da micro-injeção pró-nuclear consiste na injeção de um determinado gene em um dos pró-núcleos de um zigoto em formação (quando o núcleo do espermatozoide e o núcleo do ovócito estão se fundindo). Por meio de uma micropipeta, genes são injetados dentro do núcleo do zigoto em formação (Figura 2). A integração do gene exógeno ao DNA do zigoto é difícil. Por essa razão, muitas cópias do gene são inseridas no interior das células. Em raras vezes (menos de 30% dos casos), o gene consegue se integrar nos cromossomos da célula, fazendo com que o indivíduo adulto manifeste o fenótipo associado a ele. Apesar da dificuldade, a micro-injeção pró-nuclear é uma metodologia amplamente empregada na produção de animais transgênicos. Figura 2: Representação esquemática da técnica de micro-injeção pró-nuclear 8

9 3.2 Vetores Virais Os vetores virais para a produção de animais transgênicos são bastante utilizados, especialmente os retrovírus, RNA-vírus que naturalmente possuem a capacidade de integrar seu material genético ao da célula que está infectando porque apresentam a enzima transcriptase reversa. Um exemplo de retrovírus utilizado para a produção de animais transgênicos é o HIV1 (vírus causador da síndrome da imunodeficiência adquirida humana, a AIDS). Antes de sua utilização como vetor, o HIV1 é manipulado geneticamente para que haja a exclusão de sua parte infectante e causadora da doença. Um gene exógeno é incorporado ao genoma viral e, a partir daí, promove-se a infecção por esse vírus (contendo material exógeno) de embriões em vários estágios de desenvolvimento. Os retrovírus são injetados no espaço perivitelínico (entre a zona pelúcida e a membrana) de ovócitos que serão posteriormente fecundados in vitro. A intenção é que, a partir da infecção retroviral, o material exógeno seja incorporado ao DNA dos embriões, promovendo a formação de indivíduos transgênicos. Uma desvantagem desta técnica é a limitação do tamanho do fragmento gênico que consegue ser incorporado no vírus (tais vírus não suportam genes de grande extensão). Outra limitação é que mesmo sendo manipulados para não se multiplicarem nem causarem doença no organismo hospedeiro, existem restrições quanto ao seu uso. 3.3 Utilização de espermatozoides como vetores Nesta técnica, espermatozoides são incubados em conjunto com o fragmento de DNA que deve ser incorporado por eles em uma solução. Os espermatozoides passam por um processo conhecido como eletroporação. Simplificadamente, pela técnica de eletroporação, os espermatozoides são submetidos a pulsos elétricos de curta duração e a alta voltagem que provocam a formação de poros na sua membrana celular, permitindo a penetração dos fragmentos de DNA exógenos no seu interior. Uma complicação desta técnica é a incorporação deste material genético exógeno no pró-núcleo do zigoto. Quando o espermatozoide se junta ao ovócito, há baixa incorporação do DNA exógeno ao genoma do hospedeiro. Além disso, o tratamento com eletroporação compromete a fecundação. 9

10 3.4 Utilização de células-tronco para formação de quimeras transgênicas A formação de indivíduos transgênicos mediada por células-tronco é uma técnica que apresenta bons resultados. Utilizam-se para tal, células de origem embrionária que continuam indiferenciadas (multipotentes) e que podem se diferenciar em qualquer outro tipo celular. Tais células são obtidas de embriões na fase blastocística (5 a 7 dias pós-fertilização), na qual ainda não existe diferenciação entre endoderme, mesoderme e ectoderme. As células-tronco obtidas dessa fase são cultivadas em laboratório e recebem a injeção de fragmentos de DNA exógeno, tornando-se células transgênicas. Tais células-tronco transgênicas são, então, incorporadas laboratorialmente em outros embriões na fase blastocística. As células transgênicas se misturam às células do embrião fazendo com que o embrião torne-se uma quimera (um híbrido composto por duas linhagens celulares diferentes, sendo uma delas a linhagem transgênica) (Figura 3). Tais embriões são implantados em fêmeas receptoras para gestação. O indivíduo formado (quimera) possui a habilidade de transmitir o DNA exógeno aos seus descendentes, produzindo uma prole transgênica, visto que, por meio desta técnica, suas células germinativas podem apresentar o material genético exógeno. A vantagem desta técnica é que as células-tronco são fáceis de se manter em cultura e de fácil incorporação do DNA exógeno in vitro. No entanto, uma limitação é que as quimeras produzidas têm que ser submetidas a uma série de cruzamentos absorventes para que consigam produzir indivíduos que apresentem o gene exógeno em todas as suas células (sejam completamente transgênicos). Figura 3: Representação esquemática da técnica de utilização de células-tronco para a confecção de quimeras transgênicas 10

11 3.5 Transferência Nuclear (TN) A técnica de transferência nuclear, também chamada de clonagem, teve sua origem no ano de 1997 com a divulgação internacional da produção de uma cópia idêntica (clone) de uma ovelha adulta a partir de células diferenciadas de suas glândulas mamárias. O clone foi chamado de Dolly e revolucionou a engenharia genética. Em linhas gerais, a TN consiste na utilização do material genético de um indivíduo para criar um novo indivíduo geneticamente idêntico. É realizada por meio da remoção microcirúrgica do núcleo de um ovócito maduro (que servirá como doador de citoplasma citoplasto) e a inserção neste citoplasto do núcleo de uma célula doadora, que poderá ser qualquer célula somática de outro indivíduo. A integração entre citoplasto e núcleo nesta construção é feita por meio de impulsos elétricos. A ideia é que, por meio de tal mecanismo, em conjunto com ativações químicas e físicas, a célula produzida passe a se comportar como um zigoto e se desenvolva em um embrião (Figura 4). O embrião é então congelado ou implantado diretamente no útero de uma fêmea receptora para que possa se desenvolver. A utilização do citoplasma de um óvulo para a produção do zigoto, ao invés da utilização direta de uma célula somática adulta, se relaciona à propriedade das células germinativas ao entrar em multiplicação (tais células são naturalmente programadas para se dividir, enquanto as células adultas já são células diferenciadas). A importância da TN na confecção de indivíduos transgênicos é que a manipulação celular in vitro permite que sejam realizadas inserções de genes exógenos no genoma, assim como a retirada de alelos não desejáveis (produção de indivíduos knockouts). Os indivíduos formados por essa técnica também não são quiméricos, o que facilita o processo de produção de transgênicos. No entanto, é importante ressaltar que animais clonados podem apresentar anomalias orgânicas além de envelhecimento precoce e tempo de vida reduzido. A TN é uma técnica promissora, mas ainda necessita de aperfeiçoamentos. 11

12 Figura 4: Representação esquemática da técnica de transferência nuclear 4 Inseminação Artificial A inseminação artificial corresponde a um conjunto de técnicas utilizadas para a promoção de cruzamentos artificialmente induzidos pelo homem. Por meio dela, existe a possibilidade de se manipular a reprodução e, mais do que isso, aumentar em grande escala a produtividade dos animais. Desta forma, a inseminação artificial é uma das ferramentas mais importantes do Melhoramento Animal, além de apresentar algumas vantagens sobre a monta natural, conforme descrito abaixo: Aumento da utilização de reprodutores geneticamente superiores, permitindo a utilização do sêmen de um indivíduo geneticamente superior para fertilizar um maior número de fêmeas do que seria possível por meio da monta natural; Facilitação da seleção animal, visto que animais jovens são testados mais cedo em relação à sua capacidade genética e reprodutiva; Facilitação do cruzamento industrial de indivíduos de portes diferentes (o que seria difícil conseguir pelo processo de monta natural); 12

13 Possibilidade de utilização de machos que apresentam algum tipo de impotência não transmissível aos descendentes como reprodutores de gerações seguintes (ex: impotência coeundi, associada a problemas na monta, tais como problemas no casco, ou na cópula, e não a falhas na espermatogênese); Possibilidade de utilização de animais idosos como reprodutores de gerações seguintes (banco de sêmen); Diminuição nos custos do cruzamento industrial, relacionados ao transporte e à estadia dos animais; Facilidade na utilização do sêmen, visto que pode ser congelado e utilizado posteriormente; Prevenção de doenças sexualmente transmissíveis; Facilitação do manejo reprodutivo. Algumas desvantagens da inseminação artificial são: Possibilidade de transmissão de características genéticas indesejáveis em larga escala; Aumento da consanguinidade, que pode trazer consequências indesejáveis para a prole; Necessidade de utilização de pessoal especializado na realização da técnica. De forma geral, a inseminação artificial pode ser realizada de três formas diferentes: por meio da utilização do sêmen fresco, por meio da utilização de sêmen resfriado e por meio da utilização de sêmen congelado. A viabilidade dos espermatozoides diminui consideravelmente da primeira à última técnica citada. No entanto, cada uma delas apresenta suas vantagens e desvantagens. A utilização da primeira técnica, com sêmen fresco, apesar de ser a técnica mais eficiente, exige que machos e fêmeas ao serem inseminadas estejam presentes no mesmo local físico, na mesma hora, o que nem sempre é possível. O sêmen resfriado, por sua vez, pode ser utilizado quando machos e fêmeas estiverem distantes, mas o período máximo de conservação dos espermatozoides é de 48 horas. O sêmen congelado exige tecnologia e recursos para a proteção dos espermatozoides durante o congelamento, 13

14 porém, pode ser mantido por tempo indeterminado e permite a confecção de uma reserva biológica do animal, podendo ser utilizado mesmo depois da sua morte. Independentemente da técnica utilizada, o sêmen deve ser sempre avaliado quanto à sua capacidade reprodutiva. Desta forma, avaliações físicas (aspecto, cor e viscosidade), do ph, do turbilhonamento (movimento em massa dos espermatozóides), da motilidade (células vivas e com movimento progressivo), do vigor (qualidade do movimento rápido ou lento) e de defeitos morfológicos, dentre outras coisas, devem ser realizadas, inclusive depois do descongelamento, se este for o caso. Em relação às fêmeas, deve-se avaliar para verificar a possibilidade de encontrarem condições apropriadas para a reprodução: saúde, características conformacionais apropriadas para recebimento do sêmen e gestação de filhotes, período de ovulação (para proporcionar a eficiência do encontro dos espermatozoides com os óvulos), etc. Quando possível, é importante promover a sincronização do cio de várias fêmeas, para facilitar a inseminação de todas ao mesmo tempo. 5 Fertilização In Vitro A fertilização in vitro corresponde ao processo de promoção da fecundação de forma laboratorial. É utilizada por algumas razões no Melhoramento Animal, especialmente quando se desejar a produção de clones e de animais transgênicos. Para a sua realização, é necessário que se obtenham óvulos de fêmeas por meio da aspiração de folículos ovarianos guiada por ultrassonografia ou por meio da punção de ovários de fêmeas que já vieram a óbito (especialmente no caso de animais silvestres) o ovário é viável por até seis horas após o óbito. Os folículos a serem utilizados devem apresentar um tamanho médio. Folículos pequenos não respondem ao tratamento hormonal utilizado no processo de fertilização in vitro, e folículos grandes se encontram em um estágio de desenvolvimento muito avançado para serem utilizados. 14

15 A partir da aspiração folicular são conseguidos óvulos não maduros. Desta forma é necessário que se realize um tratamento hormonal para que amadureçam in vitro e tornem-se aptos a receber os espermatozoides. Em relação aos espermatozoides, estes devem ser capacitados in vitro para que atinjam habilidades fecundativas. Em condições naturais, a capacitação dos espermatozoides ocorre no trato genital feminino, promovendo modificações que permitem a sua penetração no óvulo. A fecundação permite a produção in vitro de embriões, que são congelados e, posteriormente, implantados em fêmeas receptoras para serem gestados. 6 Clonagem de Embriões Por meio desta técnica, é possível que se obtenham clones de embriões provenientes de indivíduos geneticamente superiores. O processo parte do mesmo princípio pelo qual os gêmeos idênticos são formados. Utilizam-se células tronco embrionárias indiferenciadas e pluripotentes para a formação dos embriões. Para a realização da técnica, utiliza-se o citoplasma do óvulo de uma fêmea doadora (citoplasto) em conjunto com o núcleo de células de embriões na fase morular provenientes de uma fêmea geneticamente superior. O zigoto produzido é cultivado in vitro para se tornar um embrião e ser transferido a uma fêmea receptora. Por meio deste processo, é possível que se consiga diversos indivíduos idênticos geneticamente. O princípio de realização da técnica é o mesmo da transferência nuclear. A vantagem é repetir o material genético de alto valor de indivíduos geneticamente superiores, por meio de seus clones. 15

16 7 Transferência de Embriões Por meio desta técnica, embriões de uma fêmea gestante (doadora), de alto valor produtivo, são transferidos a outras fêmeas (receptoras; barrigas-dealuguel ), de menor valor reprodutivo no plantel, mas adaptadas à gestação. De forma resumida, para a realização do método, fêmeas geneticamente superiores são inseminadas artificialmente para a produção de embriões. Antes da realização da técnica, tais fêmeas são tratadas com hormônios (FSH hormônio folículo-estimulante) para promover ovulações múltiplas e, com isso, aumentar o número de embriões formados (que em condições naturais correspondem a um por gestação). Os embriões são então retirados de seus úteros por meio de aparato apropriado e lavagem intra-uterina e observados quanto a sua viabilidade em laboratório. Embriões viáveis são transferidos a fêmeas receptoras para que sejam gestados. O objetivo principal da transferência de embriões é o aumento em larga escala da progênie de fêmeas superiores (doadoras). Em condições normais, as fêmeas de bovinos, por exemplo, produzem apenas um descendente por ano. Por meio do processo de transferência de embriões é possível que se consigam vários bezerros desta fêmea de uma única vez. 16

17 Anotações 17

18 Referências ALBERTS, B.; BRAY, D.; LEWIS, J. Biologia Molecular da Célula. 4. ed. Porto Alegre: Artmed, GRIFFITHS, A. J. F. Introdução à Genética. 7. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p. NICHOLAS, F. W. Veterinary Genetics. New York: Oxford University Press, p. OTTO, P. G. Genética Básica para Veterinária. 4. ed. São Paulo: Roca, p. RAMALHO, M. A. P.; SANTOS, J. B.; PINTO, C. A. B. P. Genética na Agropecuária. 3. ed. Lavras: UFLA, p. RUMPF, R.; MELO, E. O. Produção de Animais Transgênicos Metodologias e Aplicações. Disponível em <http://www.agencia.cnptia.embrapa.br/recursos/145id-xwafoipolp.pdf>. Acesso em 15 set SNUSTAD, D. P.; SIMMONS, M. J. Fundamentos de Genética. 2. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p. VILLEN, R. A. Biotecnologia Histórico e Tendências. Disponível em < Acesso em 15 nov

19 Campus Liberdade Rua Galvão Bueno, São Paulo SP Brasil Tel: (55 11)

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