Campylobacter em granja avícola. Campylobacter in a poultry farm. Introdução

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1 RPCV (21) 96 (54) REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Campylobacter em granja avícola Campylobacter in a poultry farm Carvalho 1, A.C.F.B.; Lima 2, V.H.C.; Pereira, G. T 3 ; SchockenIturrino, R.P. 4 1 Docente da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias Unesp, Câmpus de Jaboticabal Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução Animal DMVPRA, Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castelane s/n CEP , Jaboticabal,SP, Brasil, 2 Discente estagiário no DMVPRA da FCAV Unesp, Campus Jaboticabal, bolsista da FAPESP 3 Docente da FCAV Unesp, Câmpus Jaboticabal Depto de Ciências Exatas 4 Docente da FCAV Unesp, Campus Jaboticabal Depto de Patologia Veterinária Resumo: Com o objetivo de investigar a disseminação de Campylobacter em granjas avícolas, pesquisouse a presença deste agente em 192 amostras de zaragatoas cloacais, 17 amostras de camas, 17 amostras de rações, 17 amostras de água, 34 pool de fezes coletados na camada superficial das camas e 7 amostras de fezes de rato em duas granjas comerciais de frango, situadas na região de Ribeirão PretoSP., Brasil, durante o período de 6 ciclos diferentes e cuja criação de cada ciclo era de dias. Foram isolados Campylobacter jejuni em 32 (16,7%) amostras de zaragatoas cloacais, 3 (1,8%) amostras de camas, 1 (,6%) amostra da ração e 6 (17,7%) nos pool das fezes da cama, totalizando (5,6%) isolamentos. A presença de Campylobacter foi detectada em quatro lotes a partir do 28º dia nas zaragatoas cloacais, 35º dia no pool das fezes e do º dia na cama e ração, entretanto um dos lotes de cada granja foi negativo para o agente durante o período de um ciclo. Na aplicação do teste exacto de Fisher as amostras foram comparadas entre semanas, tendo as diferenças entre o número de amostras positivas a partir das zaragatoas cloacais sido estatisticamente significativas (p<,5 e p<,1) a partir do dia 35 para um dos lotes e a partir do dia para dois lotes, quando comparado com as semanas anteriores. PalavrasChave: Campylobacter, avicultura Summary: The objective of this work was to investigate the dissemination of Campylobacter in the poultry farms. It was collected 192 cloacal swabs, 17 poultry litter, 17 feed, 17 water samples, and 34 faeces pool from the surface layer of the litter and 7 mice faeces samples. All samples came from two commercial farms, from the region of Ribeirão PretoSP, Brazil, and were analysed during 6 different cycles of days each. Campylobacter jejuni were isolated in 32 (16.7%) cloacal swabs samples, 3 (1.8%) in poultry litter, 1 (.6%) in feed and 6 (17.7%) in the pool of faeces from the litter respectively totalling (5.6%) isolaments. The presence of Campylobacter was detected in four lots from the 28 th day in the cloacal swab, 35 th day in faeces pool and in nd day in the poultry litter and feed, on the other hand one of the lots of each farm was negative for this agent during one cycle. The application of Fishers test showed that the cloacal swabs presented statistical difference (p<,5 and p<,1), beginning in day 35 for one of the samples and beginning in day for two samples, when compared with the previous weeks. KeyWords: Campylobacter, poultry raising. Introdução Nos últimos anos têmse reconhecido Campylobacter jejuni como uma causa comum de gastroenterite e enterocolite em humanos, principalmente nos países em desenvolvimento (Saleha et al., 1998), o qual vem se destacando como um dos microrganismos emergentes de origem alimentar em diversas partes do mundo (Aquino et al., 1995; Skirrow, 1977). Evidências epidemiológicas têm sugerido os produtos de origem animal, especialmente os produtos avícolas, como principal veículo para infecção humana (Harris et al., 1986; Machado et al., 1994; Rampling et al., 1989), uma vez que o trato intestinal das aves domésticas tem sido demonstrado como o principal reservatório de Campylobacter jejuni (Machado, 1992) e que aproximadamente 3 a 1% das aves transportam este agente no intestino (Doyle, 1988). Campylobacter jejuni tem sido detectado a partir de fezes de frangos em 83% (Grant et al., 198), 86,8% (Jaramilo et al., 1983) e 9% (Blaser et al., 198) das amostras examinadas. Desta maneira, durante o processamento de abate, as carcaças e vísceras comestíveis podem se contaminar e o agente ser detectado no produto acabado e pronto para o consumo (Almeida e Serrano, 1987; Sakuma et al., 1992; Carvalho e Costa, 1996; Carvalho, 1998). De acordo com Bailey (1993), na granja as principais fontes de contaminação dos lotes, podem ser a ração contaminada, a transmissão horizontal e o ambiente de criação contaminado, envolvendo vetores como roedores, insetos, pássaros silvestres, animais domésticos e o homem. Rodrigues et al. (1998) pesquisaram Campylobacter nas fezes de rato preto com taxas de isolamento de 57,% (31/54), demonstrando a importância destes como reservatório do agente. A cama também deve ser considerada como uma provável fonte de disseminação (Bailey et al., 1991; Genigeorgis, 1987). O papel da cama na transmissão 191

2 RPCV (21) 96 (54) e no estabelecimento perpétuo da infecção por Campylobacter jejuni foi demonstrado por Montrose et al. (1985) em aves de capoeira, através da infecção artificial das aves, detectando o agente na cama pelo menos 63 dias após a infecção. Fatores responsáveis pela introdução e disseminação de Campylobacter jejuni em aves de produção comercial foram estudados por Kazwala et al. (199) e Berndtson et al. (1996), sugerindo a cama, pés dos tratadores e água como os principais veiculadores do agente. Tendo em vista a importância do Campylobacter em saúde pública e baseado nos dados encontrados na literatura de que as aves obtidas em nosso comércio apresentamse constantemente contaminadas por esse agente, sentiuse a necessidade de realizar um estudo sob as nossas condições de criação, objetivando estudar o nível de contaminação dos lotes (ração, água dos bebedouros, zaragatoa cloacal, fezes da camada superficial da cama e dos roedores e a cama das aves) e sua evolução, para que medidas profiláticas possam ser tomadas minimizando assim o problema. Materiais e métodos O estudo foi realizado em duas granjas comerciais de frango localizadas na região de Ribeirão Preto SP, Brasil, envolvendo 6 lotes de aves, cujo ciclo de criação era de dias, e o número de aves por pavilhão variava entre 15 (para a granja A) a 2 (para a granja B). O nº de pavilhões era de 8 e 32 respectivamente. Nos pavilhões, a água clorada era fornecida por bebedouros do tipo pendular e a cama composta por maravalha virgem, com troca a cada término de ciclo. Os lotes 1 e 3 foram acompanhados na granja A e os lotes 2, 4, 5 e 6 na B, sendo os lotes provenientes de pavilhões diferentes. Para o isolamento do Campylobacter foram colhidas semanalmente, nos dias 7, 14, 21, 28, 35 e, 5 amostras de cama das aves ao redor dos bebedouros e próximo das áreas ensolaradas, totalizando 17 amostras; 5 amostras da ração em diferentes pontos dos comedouros tipo semiautomático e automático, perfazendo um total de 17 amostras; 5 amostras de água dos bebedouros, obtendo então 17 amostras; 5 amostras cloacais colhidas através de zaragatoa, somandose ao final 192 amostras; 1 amostra de fezes da cama (de um pool de 5 amostras colhidas sobre a cama), totalizando 34 amostras e 1 amostra de fezes de roedores (colhida na forma de pool de 5 amostras) ao redor e dentro dos pavilhões, finalizando em 7 amostras em virtude da desratização ocorrida na granja, de forma que ao final do experimento totalizaramse 743 amostras. As amostras cloacais, foram colhidas através de zaragatoas estéreis diretamente das cloacas e imediatamente depositadas em tubos contendo 5 ml de caldo tioglicolato ph 7,2, mantendoas em geladeira a temperatura de 5 o C por 12 horas. As amostras da cama e da ração foram recolhidas em sacos plásticos estéreis, levadas ao laboratório e pesadas. Para cada 5 gramas das amostras, adicionouse ml de caldo tioglicolato ph 7,2 mantendose por 12 horas à temperatura de 5 ºC. As amostras de fezes, obtidas na camada superficial da cama das aves e as dos roedores, foram recolhidas em sacos plásticos estéreis, transportadas para o laboratório, retirandose 1 g de cada uma para o estudo. A esta 1 g de fezes foi adicionado 5 ml de caldo tioglicolato ph 7,2 mantendose por 12 horas à temperatura de 5 ºC. Decorrido o período de 12 horas em geladeira, as amostras cloacais, da cama, ração e das fezes foram semeadas em meio seletivo para Campylobacter composto por agar brucella adicionado de suplemento FBP (,25% de sulfato ferroso,,25% piruvato de sódio e,25% metabisulfito de sódio), acrescido de 2 ml de uma mistura de antibióticos composta por cefalotina (15µg/ml), trimetoprim (5µg/ml), anfotericina B (5µg/ml), vancomicina (1µg/ml), polimixina B (2,5 UI/ml) e meio básico com ph final 7,2 (Carvalho, 1992) e incubadas a ºC por 4872 horas, em jarras para cultivo em anaerobiose com atmosfera de microaerofilia, obtida pelo método de lã de aço, conforme técnica descrita por Magalhães et al. (1982). Ao final do período de incubação as colônias foram examinadas, selecionandose as que apresentaram características similares às descritas para Campylobacter (Smibert, 1974). As colônias típicas ou suspeitas do gênero foram confirmadas através da morfologia microscópica pela coloração de Gram, observandose a presença de bacilos Gram negativos com formas típicas em S, asa de gaivota ou cedilha, a motilidade observada pela técnica de Bryner e Frank (1955), pelas reações da oxidase e catalase e pelos teste culturais segundo Smibert (1974). As amostras de água foram colhidas em frascos de 1 ml, mantidas em caixas isotérmicas com gelo e processadas imediatamente após chegada ao laboratório, através da técnica de contagem de bactérias descrita por Barrow e Tucker (1986). De cada amostra de água, após homogeneizada, foi retirado uma alíquota de 1 ml e esta diluída em PBS ph 7,4 procedendose a diluição decimal em tubos de ensaio contendo,9 ml de PBS ph 7,4. De cada diluição,,1ml foi retirado e pingado em agar seletivo para Campylobacter. O resultado obtido consistiu em unidade formadora de colônias (UFC/ml) da amostra. Análise estatística Aplicouse o teste exacto de Fisher aos resultados obtidos, realizandose comparações entre o número de isolamentos por lote entre os diferentes dias de coleta e o tipo de amostra analisada. Resultados As tabelas 1, 2 e 3 apresentam os resultados obtidos no presente trabalho. Podemos verificar que das 743 amostras colhidas nas duas granjas comerciais estudadas, (5,6%) foram positivas para Campylo 192

3 RPCV (21) 96 (54) bacter jejuni, sendo 32 amostras (16,7%) provenientes dos zaragatoas cloacais, 3 (1,8%) das camas, 1 (,6%) da ração e 6 amostras (17,7%) do pool de fezes colhidas sobre a cama. As amostras de fezes de ratos e as amostras das águas dos bebedouros foram negativas. Tabela 1 Número e freqüência total de isolamentos de Campylobacter segundo os tipos de amostras processadas. de Rato Das 193 amostras colhidas na granja A, foram isolados 3 (1,5%) Campylobacter jejuni, sendo 2 em zaragatoa cloacal e 1 na cama (tabela 2), o que ocorreu ao O dia e ambos provenientes do lote 3. Tabela 2 Número e freqüência de isolamentos de Campylobacter segundo os tipos de amostras processadas na Granja A (lotes 1 e 3). de Rato Das 55 amostras colhidas na granja B, 39 (7,1%) foram positivas para Campylobacter jejuni (tabela 3). Tabela 3 Número e freqüência de isolamentos de Campylobacter, segundo os tipos de amostras processadas na Granja B (lotes 2, 4, 5 e 6). de Rato *: Desratização do local Número de amostras Número Número * (16,7) 3 (1,8) 1 (,6) 6 (17,7) (5,6) 2 (4,8) 1 (2,2) 3 (1,5) 3 (2) 2 (1,6) 1 (,8) 6 (24) 39 (7,1) Em relação ao período em que ocorreu o isolamento de Campylobacter, destacamos que no lote 2 este se deu ao 28º dia para as amostras das zaragatoas cloacais, ao 35º dia no pool das fezes e também nas zaragatoas cloacais, enquanto que no º dia o isolamento ocorreu no pool das fezes, nas zaragatoas cloacais e na cama. No lote 4 não houve isolamento, entretanto no lote 5 o isolamento foi detectado aos 28 o dia nas zaragatoas cloacais; aos 35º dia no pool das fezes e nas zaragatoas cloacais e aos º dia no pool das fezes, zaragatoas cloacais, ração e camas e no lote 6 estes ocorreram aos 35º e º dia no «pool» das fezes e nas zaragatoas cloacais. A sequência de isolamentos obtidos nos vários tipos de amostras revela em alguns lotes uma progressiva contaminação do meio ambiente (tabela 4). Tabela 4 Tipo de amostras onde se obtiveram isolamentos, por lote e por semana Lotes O 35 O Realizaramse comparações estatísticas entre o número de isolamentos obtidos por lote e tipo de amostra, entre os diferentes dias de coleta (tabelas 5 e 6), a fim de verificar se haveria diferença significativa na instalação do agente nos pavilhões a partir do 21º dia de vida das aves, uma vez que, a literatura menciona que o isolamento raramente ocorre antes das 3 4 semanas de vida. Tabela 5 Níveis mínimos de significância (p) obtidos (1) no teste exacto de Fisher aplicado entre os dias de coleta para os lotes 2 e 3 nas amostras das zaragatoas cloacais. Dias de coleta *p <,5: significativo a 5% **p <,1: significativo a 1% (1) Níveis acima da diagonal referemse ao lote 2 e abaixo ao lote 3 No lote 2 encontraram diferenças significativas entre os isolamentos a partir de amostras de zaragatoas cloacais colhidas no 35º e º dia, quando comparadas com as do 21º dia da colheita. Tabela 6 Níveis mínimos de significância (p) obtidos (2) no teste exacto de Fisher aplicado entre os dias de coleta para os lotes 5 e 6 nas amostras das zaragatoas cloacais Dias de coleta º,22 21º,22,1** 28º,23,22 28º,22,22,1** *p <,5: significativo a 5% **p <,1: significativo a 1% (2) Níveis acima da diagonal referemse ao lote 5 e abaixo ao lote 6 A diferença do número de isolamentos do agente no 35º dia da coleta foi estatisticamente significativa para o lote 5, quando comparado com os 21º e 28º dias, enquanto que no lote 6, a diferença significativa de isolamento ocorreu quando foi comparado o dia com os 21º, 28º e o 35º dias da colheita. A mesma análise estatística foi aplicada para as amostras das camas, pool das fezes e da ração, sendo o resultado não significativo entre os dias comparados. 35º,3*,28,22 35º,1**,3*,3* O º,76**,12,5 º,9,5,9 193

4 RPCV (21) 96 (54) Discussão Verificouse neste estudo uma maior freqüência de Campylobacter jejuni nas amostras de pool das fezes (17,7%) em relação aos outros tipos de amostras. Pela análise estatística aplicada, apenas as amostras das zaragatoas cloacais (16,7%) é que obtiveram diferenças estatisticamente significativas na comparação do número de isolamentos entre semanas, podendo as mesmas serem consideradas como o fator responsável pela contaminação dos lotes 2, 5 e 6 a partir de 21º dia de povoamento. Os resultados observados quanto ao isolamento do agente nos lotes a partir do 28º dia de vida das aves são coincidentes com os descritos na maioria da literatura consultada, e principalmente com os resultados observados por JacobReitsma et al. (1995) e Pokamunski et al. (1986). As amostras referentes ao lote 1 e ao 4 foram negativas para Campylobacter durante o ciclo estudado, resultados negativos em alguns lotes de granjas contaminadas foram observados por JacobReitsma et al. (1995). Tendo em vista tais resultados não podemos descartar a possibilidade de que nestes lotes as aves poderiam não estar colonizadas com Campylobacter, uma vez que o mecanismo de colonização intestinal por parte dos microrganismos pode sofrer influência de fatores imunológicos, aliados às diversificações da dieta alimentar durante a criação e assim afetar a colonização e a disseminação do agente (Bailey, 1987; Machado, 1992). Associado a este fator, operações como limpeza, desinfecção de rotina, bom manejo e manutenção do vazio sanitário, podem contribuir para eliminação da bactéria na instalação (Giessen et al. 1992; Berndtson et al. 1996). Os isolamentos de Campylobacter jejuni obtidos nas zaragatoas cloacais da presente pesquisa foram inferiores aos encontrados por Pokamunski et al. (1986), os quais obtiveram isolamentos ao redor de 46,3% para as zaragatoas cloacais e de 53,7% no conteúdo cecal, demonstrando a elevada prevalência de Campylobacter nas fezes de frangos, entretanto estatisticamente significativo, demonstrando desta maneira que este tipo de amostra pode ter sido a principal responsável pela contaminação dos lotes 2, 5 e 6, a partir do 21º dia do povoamento dos pavilhões. JacobReitsma et al. (1995), lembram que as aves contaminadas podem eliminar de 1 6 a 1 9 UFC/g de fezes, indicando as fezes como potencial fonte de introdução e disseminação do agente dentro do lote. Aliado a estes fatores, o hábito coprofágico das aves auxilia na rápida disseminação do Campylobacter no lote (Sterne et al.,1988) e, uma vez isolado no bando, a propagação é rápida e elevada proporção de aves excretará Campylobacter até ao abate (Doyle, 1988), como pode ser observado na presente pesquisa. Embora o pool das fezes colhidas sobre a cama não tenha apresentado significância estatística na comparação entre os dias de coleta, não devemos descartar a possibilidade das fezes serem um meio de disseminação do agente entre as aves. No que diz respeito à ração, o isolamento do agente ocorreu apenas nas amostras provenientes do lote 5, e que o mesmo se deu somente no º dia da colheita. Contudo devese levar em consideração que a positividade ocorreu no final do ciclo de vida das aves, sendo as mesmas abatidas com dias, o que não permitiu uma melhor análise do fator ração como potencial veiculador do agente. Com relação à água, há fortes evidências que os procedimentos de cloração da água efetivamente são eficazes na inativação do Campylobacter jejuni (Blaser et al. 1986, Bjerklle, 1999), sendo este procedimento normalmente adotado nas granjas comerciais estudadas. Apesar dos roedores terem sido sugeridos como possíveis fontes de transmissão horizontal (Evans,1992; Shane 1992; Rodrigues et al., 1998), não foi isolado o agente nas amostras de fezes de rato uma vez que a granja B sofreu o processo de desratização de suas instalações durante o período de pesquisa, dificultando assim a continuidade das colheitas. A detecção de resultado positivo para as amostras de camas nos lotes 2, 3 e 5, ocorrida aos dias de idade, impossibilitou o melhor acompanhamento da cama como uma possível fonte de disseminação, concordando com Doyle e Romam (1982) e Smitherman et al. (1984), os quais justificam a baixa taxa de isolamento em conseqüência da elevada sensibilidade desta bactéria para as condições adversas da cama. Por essa razão, as amostras de cama não são recomendadas para monitorizar a infecção com Campylobacter, segundo Bhatia et al. (1979). Perante os resultados encontrados e discutidos, podese chegar à conclusão de que as aves contaminadas constituem a principal fonte de contaminação nas granjas comerciais estudadas, não descartando, no entanto, a possibilidade da contaminação dos lotes por outras vias horizontais, através da cama e ração. Os diferentes mecanismos de colonização e a enorme variedade de origens destes microrganismos patogênicos associado com diferentes fatores que afetam a susceptibilidade do hospedeiro para a colonização, indicam a complexidade de pesquisas necessárias para o controle de Campylobacter durante a produção avícola. Bibliografia ALMEIDA, P. F., SERRANO, A. M. (1987) Ocorrência de Campylobacter fetus suspécie jejuni em carcaças de frango e suínos. Rev Microbiol, v. 18, p AQUINO, M. H. C., FRANCO, R. M., TIBANA, A. (1995) Campylobacter jejuni na avicultura: importância e método de controle. Hig. Alim, v. 9, n. 36, p BAILEY, J. S. 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