IRRADIAÇÃO GAMA NO CONTROLE BACTERIOLÓGICO DO TOMATE (Lycopersicon esculentum Mill.) COMERCIALIZADO NO CEASA-PE

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1 N o 242 DISSERTAÇÃO DE MESTRADO IRRADIAÇÃO GAMA NO CONTROLE BACTERIOLÓGICO DO TOMATE (Lycopersicon esculentum Mill.) COMERCIALIZADO NO CEASA-PE AUTOR: MARIA CLÁUDIA VALÉRIO VICALVI RECIFE - PERNAMBUCO - BRASIL OUTUBRO

2 UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE TECNOLOGIA E GEOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE ENERGIA NUCLEAR PROGRAMA DE PÓS - GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIAS ENERGÉTICAS E NUCLEARES (PROTEN) MARIA CLÁUDIA VALÉRIO VICALVI IRRADIAÇÃO GAMA NO CONTROLE BACTERIOLÓGICO DO TOMATE (Lycopersicon esculentum Mill.) COMERCIALIZADO NO CEASA-PE (DISSERTAÇÃO) RECIFE-PERNAMBUCO-BRASIL AGOSTO- 2011

3 IRRADIAÇÃO GAMA NO CONTROLE BACTERIOLÓGICO DO TOMATE (Lycopersicon esculentum Mill.) COMERCIALIZADO NO CEASA-PE

4 MARIA CLÁUDIA VALÉRIO VICALVI IRRADIAÇÃO GAMA NO CONTROLE BACTERIOLÓGICO DO TOMATE (Lycopersicon esculentum Mill.) COMERCIALIZADO NO CEASA-PE Dissertação submetida ao Programa de Pós- Graduação em Tecnologias Energéticas e Nucleares do Departamento de Energia Nuclear da Universidade Federal de Pernambuco, para obtenção do título de Mestre em Tecnologias Energéticas e Nucleares. Área de Concentração: Aplicação de Radioisótopos na Agricultura e Meio Ambiente. ORIENTADOR: Prof Dr. Waldeciro Colaço (DEN-UFPE) RECIFE-PERNAMBUCO-BRASIL AGOSTO

5 V627i Vicalvi, Maria Cláudia Valério. Irradiação gama no controle bacteriológico do tomate (Lycopersicon esculentum Mill) comercializado no CEASA-PE. / Maria Cláudia Valério Vicalvi. - Recife: O Autor, f. : il., tab. Orientador: Prof. Dr. Waldeciro Colaço. Dissertação (Mestrado) Universidade Federal de Pernambuco. CTG. Programa de Pós-Graduação em Tecnologias Energéticas e Nucleares, Inclui Referências Bibliográficas. 1. Bactérias. 2. Conservação de alimentos. 3. Esterilização. 4. Radurização. 5. Tempo de prateleira. I. Colaço, Waldeciro (orientador). II. Título CDD (21. ed.) UFPE/BDEN/

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7 AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus, por ter me dado forças, saúde, coragem para lutar e conseguir chegar até aqui. À minha querida e amada mãezinha que acreditou em mim desde o início e me incentivou a ir por este caminho. Mãe, TE AMO! A meu orientador, Professor Dr. Colaço que me deu a oportunidade e acreditou em mim. Obrigada mesmo. À Professora Kêsia por todos os ensinamentos, conselhos, conversas, rizadas. MUITO obrigada professora por confiar em mim. MUITO OBRIGADA MESMO! À minha co-co Evelyne Solidônio, uma amiga pra todas as horas e que me incentivou a fazer mestrado desde o início. A todas as pessoas que fazem parte do Laboratório de Fármacos e Ensaios Antimicrobianos: Professora Norma Gusmão, Rosilma, Flávia (Preta), Persinho (Preto), Erik (Café com leite), Glêzia Renata, Guilherme, Cecília Pp, Mari, Mayra, Nelânia, Diana, Rita, Amanda, Juliana Tiné, Aliny, Orlandinho e Luis Carlos, muito obrigada pelas conversas, pelas horas de discontração, pela ajuda na execução dos meus experimentos, sem vocês seria mais difícil chegar até aqui. Ao GREEN, Márcio, Moacir e Patryk pelos momentos de estudo, de diversão, por ter tornado o mestrado prazeroso. Obrigada, meus amigos, amo vocês. Ao AMOR da minha vida, meu noivo lindo, Eduardo (Vida), que com muita paciência, carinho, compreensão e sabedoria, ajudou-me em todos os momentos, dos mais fáceis aos mais difíceis. Obrigada, meu amor, sem você minha dissertação não seria a mesma. TE AMO MUITO. A todos on funcionários e professores que fazem parte do Departamento de Energia Nuclear. Obrigada pelos ensinamentos, pela ajuda, pelo suporte para que meu trabalho fosse desenvolvido com êxito. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela bolsa de estudos concedida. Enfim, a todos aqueles que de uma maneira ou de outra me ajudaram a concluir mais esta etapa da minha vida. Sou muito grata a vocês.

8 O prazer aperfeiçoa a atividade Aristóteles Quanto mais os homens se erguerem acima da pobreza e de uma vida de expedientes, mais a decência prevalecerá em sua conduta e a sobriedade nos seus sentimentos William Godwin

9 IRRADIAÇÃO GAMA NO CONTROLE BACTERIOLÓGICO DO TOMATE (Lycopersicon esculentum Mill.) COMERCIALIZADO NO CEASA-PE Autor: Maria Cláudia Valério Vicalvi Orientador: Prof Dr. Waldeciro Colaço RESUMO O tomate é um dos frutos mais consumidos no mundo. Está entre os produtos agrícolas recordistas em perdas, em razão da sua elevada perecibilidade. Apesar disso, são escassos os estudos referentes à conservação pós-colheita de tomates. São ainda indefinidas as tecnologias e o tempo de vida útil para os diferentes cultivares desse fruto. Sua contaminação se dá desde o período pré-colheita até o pós-colheita. As doenças veiculadas por alimentos contaminados com micro-organismos patogênicos são um grave problema de saúde pública. As bactérias da família Enterobacteriaceae e Micrococcaceae são as responsáveis pelos grandes surtos de gastrenterites em seres humanos, que podem ocorrer devido à bactéria per se ou por toxinas produzidas. O desenvolvimento de tecnologias que tornem o alimento seguro para o consumo humano vem crescendo nos últimos anos. Os métodos de preservação do alimento empregam processos físicos ou químicos. A irradiação consiste num método físico preventivo de segurança alimentar que pode reduzir as perdas do pós-colheita eliminando pragas de insetos em frutas, grãos, ou temperos, eliminando organismos deteriorantes de alimentos, inibindo o brotamento de vegetais e retardando o amadurecimento de frutas. Objetivando avaliar o potencial esterilizante das doses de 1,0; 1,5; e 2,0 kgy de radiação ionizante oriundas do Cobalto-60 em tomates comercializados no CEASA-PE fizemos a contagem geral em UFC/g, isolamos, identificamos e testamos a susceptibilidade à antimicrobianos do controle e nas amostras irradiadas e observamos o tempo de vida de prateleira dos tomates antes e após o uso da radiação.utilizamos três lotes contendo 80 tomates cada um. 20 foram destinados ao grupo controle e 20 tomatesforam destinados para cada dose de radiação. Para a análise microbiológica os tomates foram cortados, sendo retiradas as cascas e estas foram pesadas, a fim de obter amostras pesando 25g. Cada amostra foi transferida a um Erlenmeyer contendo água esterilizada, agitando-se o conjunto por 15 minutos. Alíquotas das águas de lavagem foram semeadas por esgotamento nos meios Agar sangue de carneiro, nos seletivos e diferenciais.os experimentos foram realizados no período de Agosto/2010 a Março/2011 no Laboratório de Fármacos e Ensaios Antimicrobianos do Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco. Após crescimento, foram realizadas as contagens de colônias, o isolamento e a identificação. As provas de susceptibilidade a antibióticos foram realizadas segundo o CLSI (Clinical Laboratory Standard Institute). O tempo de vida de prateleira foi observado de sete em sete dias. Os resultados revelaram contaminação em todos os grupos de tomates analisados. Isolamos e identificamos 16 espécies de enterobactérias e 11 de Staphylococcus spp. Os micro-organismos apresentaram sensibilidade à maioria dos antibióticos testados. A análise estatística mostrou que houve diferença estatística significantiva (p < 0,05) entre o grupo controle e os grupos que foram irradiados quanto à esterilização dos tomates. Os tomates irradiados tiveram um acréscimo significativo no tempo de vida de prateleira. Concluiu-se que a dose de 2,0 kgy foi a mais eficiente para a esterilização e o aumento de vida de prateleira dos tomates. Palavras-chave: bactérias, conservação de alimentos, esterilização, radurização, tempo de prateleira.

10 GAMMA IRRADIATION IN BACTERIOLOGICAL CONTROL OF TOMATO (Lycopersicon esculentum Mill.) SOLD AT CEASA-PE Author: Maria Cláudia Valério Vicalvi Adviser: Prof Dr. Waldeciro Colaço SUMMARY The tomato is one of the most consumed fruit in the world and is among the agricultural products on record losses, due to their high perishability. Nevertheless, there are few studies on the postharvest life of tomatoes and therefore are still undefined technologies and useful life for different cultivars of this fruit. Its contamination occurs from the pre-to post-harvest crop. The diseases carried by contaminated food with pathogenic micro-organisms are a serious public health problem. The bacteria of the Enterobacteriaceae and Micrococcaceae are responsible for large outbreaks of gastroenteritis in humans that may occur due to bacteria per se or by toxins produced by them. Thus, the development of technologies that make the food safe for human consumption has been growing in recent years. Preservation methods employ to them physical or chemical processes. Among these methods, irradiation is a preventive method for food safety. Irradiation can reduce post-harvest losses by killing insect pests in fruits, grains, spices, or by reducing food spoilage organisms,inhibiting the sprouting of plants and delaying the ripening of fruit. The objective of this research was to evaluate the potential of 1,0 ; 1,5; and 2,0 kgy of ionizing radiation coming from the Cobalt-60 in tomatoes sold in the CEASA-PE, specificaly making the overall count in CFU / g, isolating, identifying and testing the susceptibility of antimicrobials against micro-organisms of the material analyzed in control and irradiated samples and watch the shelf life of tomatoes before and after the use of radiation. For the study, three lots containing 80 tomatoes each were used. Of these, 20 were used as the control group and 20 tomatoes for the doses. For microbiological analysis tomatoes were sliced, and removing the shells and they were weighed in order to obtain samples weighing 25g. Each sample was added to an Erlenmeyer containing sterile water, shaking it all in 15 minutes. Aliquots of the washings were plated on selective medium by exhaustion and differentials. After growth, were performed a colony counting, isolation and identification. The antibiotic susceptibility tests was performed following the CLSI (Clinical Laboratory Standard Institute). The shelf life was observed seven on seven days. The results revealed contamination in all tomatoes groups analyzed. Were isolated and identified 16 species of Enterobacteriaceae and 11 of Staphylococcus spp. The micro-organisms were sensitive to most antibiotics tested. Statistical analysis showed that there was statistical difference between the control groups and the tomatoes with p < 0,05 that were irradiated on the sterilization of tomatoes. Tomatoes irradiated had a significant increase in the time of shelf life. It was concluded that the dose of 2.0 kgy is the most efficient dose for sterilization and increased shelf life of tomatoes. Keywords: bacteria, food preservation, sterilization,radurization, shelf life.

11 LISTA DE FIGURAS Página Figura 1 - Fluxograma de amostragem para a análise microbiológica (A); Fluxograma de amostragem para a avaliação do tempo de vida de prateleira(b) Figura 2 - Esquema para a contagem e o isolamento dos micro-organismos a partir da água de lavagem das amostras controle e das irradiadas. EMB: Agar eosina-azul de metileno; HE: Agar entérico de Hektoen; SS: Agar Salmonella-Shigella Figura 3 - Esquema de isolamento e identificação de Enterobactérias. SIM: Agar sulfetoindol- motilidade; TSI: Agar tríplice açúcar-ferro Figura 4 - Esquema de isolamento e identificação de Staphylococcus spp Figura 5 - Esquema de antibiograma segundo CLSI, A - Padronização dos inóculos. B - Semeio em meio Müller Hinton. C - Colocação dos discos de antibióticos nas placas semeadas. D - Leitura e interpretação dos resultados segundo CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) Figura 6 - Foto das amostras e do irradiador de cobalto-60 Gammacell 220 Excel - MDS Nordion. (1): local onde são colocadas as amostras; (2): painel de controle; (3): frutos embalados Figura 7- Prova de fermentação dos carboidratos para Citrobacter freundii: 1. MIO negativo, 2. LIA negativo, 3. Arabnose positiva, 4. Rafnose, 5. Sorbitol, 6. Xilose, 7. Mio-inositol negativo Figura 8 Teste bioquímicos para identificação de Citrobacter freundii: A. Produção de H 2 S positiva; B. Citrato positivo; C. Uréia positiva; D. TSI ácido/ácido Figura 9 - Prova de fermentação dos carboidratos para Citrobacter youngae: 1. Arabnose positiva, 2. Rafnose negativa, 3. Sorbitol, 4. Xilose, 5. Mio-inositol negativo Figura 10 - Testes bioquímicos identificação de Citrobacter youngae: A. produção de H 2 S positiva; B. Citrato positivo; C. Uréia positiva; D.TSI; alcalino/ácido Figura 11 - Prova de fermentação dos carboidratos para Enterobacter aerogene: 1. Arabnose positiva, 2. Rafnose, 3. Sorbitol, 4. Xilose, 5. Mio-inositol Figura 12 - Testes bioquímicos para identificação de Enterobacter aerogenes: A. produção de H 2 S negativa; B. Citrato positivo; C. Uréia negativa D. TSI; ác/ácido Figura 13 - Prova de fermentação dos carboidratos para Enterobacter cloacae: 1. MIO positivo, 2. LIA negativo, 3. Arabnose positiva 4. Rafnose, 5. Sorbitol, 6. Xilose, 7. Mioinositol negativo Figura 14- Testes bioquímicos para identificação de Enterobacter cloacae: A. produção. de H 2 S negativa; B. Citrato positivo C. Uréia positiva D.TSI ácido/ácido

12 Figura 15 - Prova de fermentação dos carboidratos para Enterobacter cowanii: 1. MIO negativo,2. LIA negativo, 3. Arabnose, 4. Rafnose, 5. Sorbitol, 6. Xilose, 7. Mio-inositol negativo Figura 16 - Testes bioquímicos para identificação de Enterobacter cowanii: A. produção de H 2 S negativa; B. Citrato positivo C. Uréia D.TSI ácido/ácido Figura 17 - Prova de fermentação dos carboidratos para Enterobacter intermedius: 1. MIO positivo, 2. LIA negativo,3. Arabnose, 4. Rafnose, 5. Sorbitol, 6. Xilose, 7. Mio-inositol negativo Figura 18 - Testes bioquímicos para identificação de Enterobacter intermedius: A. produção de H 2 S negativa; B. Citrato positivo C. Uréia negativa D.TSI ácido/ácido Figura 19 - Prova de fermentação dos carboidratos para Enterobacter sakazakii: 1. Arabnose, 2. Rafnose, 3. Sorbitol negativo, 4. Xilose, 5. Mio-inositol Figura 20 - Testes bioquímicos para identificação de Enterobacter sakazakii: A. produção de H 2 S negativa; B. Citrato positivo C. Uréia negativa D.TSI:ácido/ácido Figura 21 - Prova de fermentação dos carboidratos para Klebsiella oxytoca: 1.LIA positiva, 2. MIO negativo, 3. Arabnose, 4. Rafnose, 5. Sorbitol, 6. Xilose, 7. Mio-Inositol Figura 22 - Testes bioquímicos para identificação de Klebsiella oxytoca: A. indol positivo; B.Citrato positivo C. Uréia negativa D. TSI:ác/ác Figura 23 - Prova de fermentação dos carboidratos para Klebsiella pneumoniae: 1. MIO negativo, 2. LIA positivo, 3. Arabnose, 4. Rafnose, 5. Sorbitol, 6. Xilose negativa, 7. Mionositol Figura 24 - Testes bioquímicos de identificação para identificação de Klebsiella pneumoniae: A. indol negativo; B. Citrato positivo C. Uréia positiva D.TSI: ác/ác Figura 25 - Prova de fermentação dos carboidratos para Kluyvera ascorbata: 1. MIO positivo, 2. LIA positivo, 3. Arabnose, 4. Rafnose, 5. Sorbitol, 6. Xilose, 7. Mio-Inositol negativo Figura 26 - Testes bioquímicos para identificação de Kluyvera ascorbata: A. indol positivo; B. Citrato positivo C. Uréia negativa D.TSI: ác/ác Figura 27- Prova de fermentação dos carboidratos para Pantoea agglomerans: 1. MIO negativo, 2. LIA negativo, 3. Arabnose, 4. Rafnose negativa, 5. Sorbitol, 6. Xilose, 7. Mio- Inositol negativo Figura 28 - Testes bioquímicos para identificação de Pantoea agglomerans: A. indol positivo; B. Citrato positivo C. Uréia negativa D.TSI: alc/ác Figura 29 - Prova de fermentação dos carboidratos para Salmonella houtenae: 1. Arabnose 2. Rafnose negativa, 3. Sorbitol, 4. Xilose, 5. Mio-Inositol negativo Figura 30 - Testes bioquímicos para identificação de Samonella houtenae: A. produção de H 2 S positiva; B.Citrato positivo C. Uréia negativa D.TSI: alc/ác

13 Figura 31 - Prova de fermentação dos carboidratos para Serratia marcescens: 1. MIO positivo, 2. LIA positivo, 3. Arabnose 4. Rafnose, 5. Sorbitol positivo, 6. Xilose, 7. Mio- Inositol Figura 32 - Testes bioquímicos para identificação de Serratia marcescens: A. indol negativo; B. Citrato positivo C. Uréia negativa D.TSI: ác/ác Figura 33 - Prova de fermentação dos carboidratos para Serratia odorífera biogrupo.1. MIO positivo, 2. LIA positivo, 3. Arabinose, 4. Rafinose, 5. Sorbitol, 6. Xilose, 7. Mio-inositol negativo Figura 34 - Testes bioquímicos para identificação Serratia odorífera biogrupo 1: A. indol positivo, B. citrato positivo, C. uréia negativa, D. TSI ác/ác Figura 35 - Prova de fermentação dos carboidratos para Shigella sonnei: 1. Arabnose positiva, 2. Rafnose 3. Sorbitol, 4. Xilose, 5. Mio-Inositol Figura 36 - Testes bioquímicos para identificação de Shigella sonnei: A. indol negativo; B.Citrato negativo C. Uréia negativa D.TSI: alc/ác Figura 37 - Prova de fermentação dos carboidratos para Yersinia intermedia: 1. Arabnose, 2. Rafnose 3. Sorbitol, 4. Xilose, 5. Mio-Inositol negativo Figura 38 - Testes bioquímicos para identificação de Yersinia intermedia: A. indol positivo; B. Citrato negativo C. Uréia positiva D.TSI: ác/ác Figura 39 - Glicose (1); Maltose (2); Sacarose (3); Lactose (4); Manitol (5); Manose (6); Arabnose (7); Trealose (8); Xilose(9); Rafnose(10) Figura 40 - Glicose (1); Maltose (2); Sacarose (3); Lactose (4); Manitol (5); Manose (6); Arabnose (7); Trealose (8); Xilose(9); Rafnose(10) Figura 41- Prova da coagulase em tubo positiva Figura 42 - Glicose (1); Maltose (2); Sacarose (3); Lactose (4); Manitol (5); Manose (6); Arabnose (7); Trealose (8); Xilose(9); Rafnose(10) Figura 43 - Glicose (1); Maltose (2); Sacarose (3); Lactose (4); Manitol (5); Manose (6); Arabnose (7); Trealose (8); Xilose(9); Rafnose(10) Figura 44 - Glicose (1); Maltose (2); Sacarose (3);Lactose (4); Manitol (5); Manose (6); Arabnose (7); Trealose (8);Xilose (9); Rafnose (10) Figura 45 - Glicose (1); Maltose (2); Sacarose (3); Lactose (4); Manitol (5); Manose (6); Arabnose (7); Trealose (8); Xilose (9); Rafnose (10) Figura 46- Uréia positiva Figura 47 - Glicose (1); Maltose (2); Sacarose (3);Lactose (4); Manitol (5); Manose (6); Arabnose (7); Trealose (8); Xilose(9); Rafnose (10) Figura 48 - Coagulase positiva... 52

14 Figura 49 - Glicose (1); Maltose (2); Sacarose (3);Lactose (4); Manitol (5); Manose (6); Arabnose (7);Trealose (8);Xilose(9);Rafnose(10) Figura 50 - Glicose (1); Maltose (2); Sacarose (3); Lactose (4); Manitol (5); Manose (6); Arabnose (7); Trealose (8); Xilose (9); Rafnose (10) Figura 51 - Glicose (1); Sacarose (2); Lactose (3); Manitol (4); Manose (5); Arabnose (6); Trealose (7); Xilose (8); Rafnose (9) Figura 52 - Glicose (1); Maltose (2); Sacarose (3); Lactose (4); Manitol (5); Manose (6); Arabnose (7) ;Trealose (8); Xilose(9); Rafnose(10) Figura 53 - Uréia positiva Figura 54 Resistência à novobiocina (1) e Sensibilidade à polimixina B (2) Figura 55 - Resistência de Klebsiella oxytoca à Ampicilina como indicado na seta vermelha 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7. ciprofloxacina, 8. tetraciclina, 9. amoxicilina+ácido clavulânico Figura 56 - Resistência de Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae à Ampicilina como indicado na seta vermelha. 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7. ciprofloxacina, 8. tetraciclina, 9. amoxicilina+ácido clavulânico Figura 57 - Resistência de Enterobacter cloacae à Ampicilina, cefoxitina e amoxicilina+ácido clavulânico e resistência intermediária à Cefalotina como indicado nas setas vermelhas: 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7.ciprofloxacina, 8. tetraciclina, 9. amoxicilina+ácido clavulânico Figura 58 - Resistência de Enterobacter cowanii à Ampicilina como indicado na seta vermelha. 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7.ciprofloxacina, 8. tetraciclina, 9. amoxicilina+ácido clavulânico Figura 59 - Resistência intermediária de Enterobacter sakazakii à Ampicilina e resistência à Cefoxitina e Amoxicilina+ácido clavulânico como indicado nas setas vermelhas. 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7.ciprofloxacina, 8. tetraciclina, 9. amoxicilina+ácido clavulânico Figura 60- Resistência de Enterobacter aerogenes à Ampicilina e Cefoxitina como indicado nas setas vermelhas. 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7. ciprofloxacina, 8. tetraciclina, 9. amoxicilina+ácido clavulânico Figura 61 - Resistência de Enterobacter intermedius à Ampicilina e Cefoxitina e resistência intermediária à Cefalotina como indicado nas setas vermelhas. 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7.ciprofloxacina, 8. tetraciclina, 9. amoxicilina+ácido clavulânico Figura 62 - Resistência intermediária de C. freundii à Cefalotina e resistência à Cefoxitina como indicado nas setas. 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7.ciprofloxacina, 8. tetraciclina, 9. amoxicilina+ácido clavulânico... 61

15 Figura 63 - Resistência intermediária de C. youngae à Ampicilina, Cefalotina e Cefoxitina como indicado nas setas vermelhas. 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7.ciprofloxacina, 8. tetraciclina, 9. amoxicilina+ácido clavulânico Figura 64 - Resistência de Serratia marcescens a Cefalotina. 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7. tetraciclina, 8. ciprofloxacina 9. amoxicilina+ácido clavulânico Figura 65 - Resistência intermediária de Serratia odorifera biogrupo I à Ampicilina como indicado na seta vermelha. 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7. tetraciclina, 8. ciprofloxacina, 9. amoxicilina+ácido clavulânico Figura 66 - Sensibilidade de Pantoea agglomerans frente os antibióticos testados. 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7. tetraciclina, 8. ciprofloxacina, 9. amoxicilina+ácido clavulânico Figura 67 - Sensibilidade de Kluyvera ascorbata frente os antibióticos testados. 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7. tetraciclina, 8. ciprofloxacina, 9. amoxicilina+ácido clavulânico Figura 68 - Sensibilidade de Shigella sonnei frente os antibióticos testados. 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7. tetraciclina, 8. ciprofloxacina 9. amoxicilina+ácido clavulânico Figura 69 - Resistência de Salmonella entérica subespécie houtenae à Cefoxitina como incicado na seta vermelha. 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7. tetraciclina, 8. ciprofloxacina 9. amoxicilina+ácido clavulânico Figura 70 - Sensibilidade de Yersinia intermedia aos antibióticos testados. 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7. tetraciclina, 8. ciprofloxacina 9. amoxicilina+ácido clavulânico Figura 71 - Resistência de S. cohnii subespécie cohnii à Penicilina e resistência intermidária à Eritromicina como indicado nas setas. 1. penicilina, 2.oxacilina, 3.tetraciclina, 4.ciprofloxacina, 5.linezolida, 6. clindamicina, 7. eritromicina, 8. gentamicina 9. cloranfenicol Figura 72 - Resistência de S. fleuretti à Penicilina e Oxacilina como indicado nas setas. 1. penicilina, 2. oxacilina, 3. tetraciclina, 4. ciprofloxacina, 5. linezolida, 6.clindamicina, 7. eritromicina, 8. gentamicina 9. cloranfenicol Figura 73 - Resistência de S.succinus à Penicilina e Eritromicina como indicado nas setas. 1. penicilina, 2.oxacilina, 3. tetraciclina, 4. ciprofloxacina, 5. linezolida, 6. clindamicina, 7. eritromicina, 8. gentamicina 9. cloranfenicol Figura 74 - Resistência de S. xylosus à Penicilina como indicado na seta vermelha. 1. penicilina, 2. oxacilina, 3. tetraciclina, 4. ciprofloxacina, 5. linezolida, 6. clindamicina, 7. eritromicina, 8. gentamicina 9. cloranfenicol

16 Figura 75 - Sensibilidade de S. gallinarum a todos antibióticos. 1. penicilina, 2. oxacilina, 3. tetraciclina, 4. ciprofloxacina, 5. linezolida, 6. clindamicina, 7. eritromicina, 8. gentamicina 9. cloranfenicol Figura 76 - Resistência de S. arlettae à Penicilina, Oxacilina, Linezolida, Clindamicina e Eritromicina como indicado nas setas. 1. penicilina, 2. oxacilina, 3. tetraciclina, 4. ciprofloxacina, 5. linezolida, 6. clindamicina, 7. eritromicina, 8. gentamicina 9. cloranfenicol Figura 77 - Sensibilidade de S.saprophyticus subespécie bovis aos antimicrobianos testados. 1. penicilina, 2. oxacilina, 3. tetraciclina, 4. ciprofloxacina, 5. linezolida, 6. clindamicina, 7. eritromicina, 8. gentamicina, 9. cloranfenicol Figura 78 - Sensibilidade de S.equorum aos antimicrobianos testados. 1. penicilina, 2. oxacilina, 3. tetraciclina, 4.ciprofloxacina, 5. linezolida, 6. clindamicina, 7. eritromicina, 8. gentamicina, 9. cloranfenicol Figura 79 - Resistência de S.lugdunensis à Tetraciclina como incicado na seta. 1. penicilina, 2.oxacilina, 3. tetraciclina, 4. ciprofloxacina, 5. linezolida, 6. clindamicina, 7. eritromicina, 8. gentamicina 9. cloranfenicol Figura 80 - Resistência intermediária de S.aureus à Eritromicina como incicado na seta. 1. penicilina, 2. oxacilina, 3. tetraciclina, 4. ciprofloxacina, 5. linezolida, 6. clindamicina, 7. eritromicina, 8. gentamicina 9. cloranfenicol Figura 81 - Sensibilidade de S. intermedius a todos antibióticos testados. 1. penicilina, 2. oxacilina, 3. tetraciclina, 4. ciprofloxacina, 5. linezolida, 6. clindamicina, 7. eritromicina, 8. gentamicina, 9. cloranfenicol Figura 82 - Tempo de prateleira do Lote 1, 2 e

17 LISTA DE TABELAS Página Tabela 1 - Autorização para irradiação de alimentos no Brasil Tabela 2 - Contagem geral de micro-organismo em UFC/g no meio sangue, no grupo controle e no irradiado e análise estatística Tabela 3 - Características diferenciais das enterobactérias (bacilos Gram-negativos) isoladas Tabela 4 - Características diferenciais dos Staphylococcus spp. (cocos Gram-positivos) Tabela 5 - Susceptilidade das Enterobactérias frente os antimicrobianos testados Tabela 6 - Suceptibilidade dos Staphylococcus spp. frente os antimicrobianos testados... 67

18 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ANVISA CEASA CENA CLSI CNEN EMB FAO HE IBRAF IAEA IME IPEN JECFA kgy PG PME SIM SS OCDE TSI WHO Agência Nacional de Vigilância Sanitária Centro de Abastecimento Alimentar de Pernambuco Centro de Energia Nuclear na Agricultura Clinical Laboratory Standard Institute Comissão Nacional de Energia Nuclear Ágar Eosina-azul de metileno Food and Agriculture Organization Ágar entérico de Hektoen Instituto Brasileiro de Frutas International Atomic Energy Agency Instituto Militar de Engenharia Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares Joint Expert Committee and Food Addittives Quilo Gray Poligalacturonase Pectinametilesterase Ágar sulfeto-indol-motilidade Agar Salmonella-Shigella Organization for Economic Co-operation and Development Ágar tríplice açúcar-ferro World Health Organization

19 SUMÁRIO Página 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA O tomate Fatores de Contaminação Bactérias que causam doenças e suas toxinas Shigella spp Salmonella spp Klebsiella spp Staphylococcus aureus Staphylococcus coagulase negativa Irradiação: um processo de descontaminação Irradiação de alimentos no mundo: histórico Irradiação de alimentos no Brasil Aspectos legislativos da irradiação de alimentos MATERIAL E MÉTODOS Seleção de amostras Análise microbiológica Isolamento e identificação de Enterobactérias Isolamento primário Identificação dos isolados Identificação de Enterobacterias Isolamento e identificação de Staphylococcus spp Análise do perfil de sensibilidade dos micro-organismos identificados frente a diferentes antibióticos Irradiação das amostras Preparo das amostras e irradiador Análise estatística RESULTADOS E DISCUSSÃO Contagem de colônias em unidades formadoras de colônias (UFC/g) Isolamento e identificação de Enterobactérias e Staphylococcos spp Enterobactérias Citrobacter freundii Citrobacter youngae Enterobacter aerogenes... 33

20 Enterobacter cloacae Enterobacter cowanii Enterobacter intermedius Enterobacter sakazakii Klebsiella oxytoca Klebsiella pneumoniae subespécie pneumoniae Kluyvera ascorbata Pantoea agllomerans Salmonella enterica subespécie houtanae Serratia marcescens Serratia odorífera biogrupo I Shigella sonnei Yersinia intermedia Staphylococcus coagulase positiva e coagulase negativa Staphylococcus arlettae Staphylococcus aureus subespécie aureus Staphylococcus cohnii subespécie cohnii Staphylococcus equorum Staphylococcus fleuretti Staphylococcus gallinarum Staphylococcus intermedius Staphylococcus saprophyticus subespécie bovis Staphylococcus succinus Staphylococcus xylosus Determinação do Perfil de Resistência e Sensibilidade dos micro-organismos isolados Susceptibilidade de Enterobactérias Klebsiella oxytoca Klebsiella pneumoniae Enterobacter cloacae Enterobacter cowanii Enterobacter sakazakii Enterobacter intermedius Citrobacter freundii Citrobacter youngae Serratia marcescens... 62

21 Pantoea agglomerans Kluyvera ascorbata Shigella sonnei Salmonella enterica subespécie houtenae Yersinia intermedia Susceptibilidade dos Staphylococcus spp Staphylococcus cohnii subespécie cohnii Staphylococcus fleuretti Staphylococcus succinus Staphylococcus xylosus Staphylococcus gallinarum Staphylococcus arlettae Staphylococcus saprophyticus subespécie bovis Staphylococcus equorum Staphylococcus lugdunensis Staphylococcus aureus subespécie aureus Staphylococcus intermedius Avaliação do tempo de vida de prateleira CONCLUSÕES REFERÊNCIAS ANEXO 1 - Composição e procedimento de preparação dos meios de cultura utilizados na metodologia ANEXO 2 Padronização dos tamanos dos halos (mm) de acordo com o CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) para Enterobactérias ANEXO 3 - Padronização dos tamanhos dos halos (mm) de acordo com o CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) para Staphylococcus spp

22 1 INTRODUÇÃO A preocupação com a segurança alimentar vem crescendo nos últimos anos, gerando uma série de discussões entre organizações governamentais, instituições de ensino e indústrias alimentícias, sobre programas que assegurem à população o acesso a produtos que não sejam prejudiciais à saúde. Sendo assim, a comercialização de alimentos por ambulantes representa riscos à saúde da população em virtude da condição higiênico-sanitária dos produtos comercializados (MALLON; BORTOLOZO, 2004). Apesar da evolução tecnológica das últimas décadas, quanto às técnicas de conservação e higiene dos alimentos, as doenças por eles transmitidas têm sido consideradas um grave problema de saúde pública, em escala mundial, sendo os alimentos reconhecidos como o principal vetor das enfermidades entéricas agudas (OLIVEIRA et al., 2003). Em todas as fases de seu processamento, o alimento deve estar livre e protegido de contaminação física, química e biológica. Tais contaminações podem ser de procedência humana, animal e do meio ambiente, tais como luz, ar, umidade e temperatura (MÜRMANN et al., 2005). A ocorrência de toxinfecções alimentares (TIA s) possui uma correlação elevada com manipulação e conservação inadequada dos alimentos (MÜRMANN et al., 2004). O Brasil é um dos três maiores produtores mundiais de frutas, superando 39 milhões de toneladas produzidas em 2005, ampliando suas exportações a cada ano. Segundo o Instituto Brasileiro de Frutas (IBRAF), de janeiro a junho de 2007 foram exportadas 372 mil toneladas, contra 326 mil no mesmo período do ano anterior, o que representa um crescimento de 14% em volume. Quanto ao valor, as exportações dos seis primeiros meses de 2007 representaram US$ 203 milhões, 30% a mais que em 2006, ou seja, US$ 156 milhões. Com vistas a ampliar o mercado externo, produtores e exportadores buscam medidas que aumentem a segurança e a vida útil das frutas, como a técnica de irradiação (PEROZZI, 2007). A irradiação com propriedade ionizante é um fenômeno físico que por transferência de energia, em doses controladas, pode ser vantajosa no uso da conservação ou com finalidades sanitária, fitossanitária ou tecnológica (Resolução RDC n 21, de 26 de janeiro de 2001).

23 2 Diante do exposto e sabendo da importância de se consumir frutos com qualidade, este trabalho tem como objetivo avaliar os efeitos da radiação gama do 60 Co nas doses de 1,0; 1,5; e 2,0 kgy na descontaminação de amostras comerciais de tomate (Lycopersycon esculentum Mill.) bem como, isolar, identificar, avaliar o perfil de sensibilidade de Enterobactérias e Staphylococcus spp. e observar o tempo de vida de prateleira dos tomates antes e após o uso da radiação que são comercializados no CEASA-PE, atualmente denominado de CEAGEPE.

24 3 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 O tomate O tomate, assim como a berinjela, o pimentão, jiló, batata e fumo pertence à família Solanaceae. A planta é uma dicotiledônea da ordem tubiflorae, gênero Lycopersicon (CAMARGO, 1992; GOULD, 1992; SILVA; GIORDANO, 2000; FILGUEIRA, 2003), subgênero Eulycopersicum, espécie Lycopersicon esculentum Mill. O nome Mill veio de MILLER, que em 1754 propôs pela primeira vez a classificação botânica e o nome Lycopersicon. São encontrados diferentes cultivares, que variam em função do grupo e da região do cultivo. É uma planta herbácea, de caule redondo, piloso e macio quando jovem tornando-se fibroso e anguloso com o passar do tempo. As folhas são alternas compostas medindo de 11 a 32 cm. Possui flor hermafrodita, sendo considerada uma planta autógama, embora possa ocorrer pequena taxa de polinização cruzada. As flores se apresentam em forma de cachos, são pequenas e amarelas; as pétalas são lanceoladas e largas. Os cachos de flores podem ser simples (não ramificados) ou composto (ramificados). O fruto é carnoso, com 2 ou mais lóculos. As sementes são uniformes, pequenas, com pelos bem curtos (GOULD, 1992). A espécie Lycopersicon esculentum Mill. é originária do norte do Chile expandindo-se até o Equador, entre o Oceano Pacífico e os Andes. Foi cultivado largamente no México, de onde foi levado para a Europa no período entre 1535 a Inicialmente, o tomateiro foi usado como planta ornamental e era considerado venenoso pelos orientais. Somente a partir do século XIX, passou a ser consumido como alimento, e logo se difundiu pelo mundo, sendo hoje o fruto mais industrializado e de maior importância econômica para muitos países. Foi introduzido no Brasil, pelos imigrantes italianos, na virada do século XX e desenvolveu-se rapidamente a partir da década de 70, colocando o Brasil entre um dos maiores produtores mundiais. É um dos frutos mais consumidos e plantados, não só no Brasil, como no mundo. É fonte de vitaminas A e C e de sais minerais como potássio e magnésio (EMBRAPA, 2006). Este fruto está entre os produtos agrícolas recordistas em perdas, em razão da sua elevada perecibilidade. Apesar disso, os estudos referentes à conservação pós-colheita de tomates são escassos, portanto são ainda indefinidas as tecnologias e o tempo de vida útil para os diferentes cultivares desse fruto (KLUGE et al.,1996; LUENGO; MOITA, 2001; PESTANA et al., 2002; CHITARRA; CHITARRA, 2005; FERREIRA; FREITAS, 2005).

25 4 A produção brasileira de tomates para a industrialização teve início no século XX, por meio do cultivo de tomates rasteiros. Essa cultura experimentou grande impulso, apenas na década de 50, no Estado de São Paulo, viabilizando a implantação de diversas agroindústrias. Na década de 80, expandiu-se no Nordeste, especialmente em Pernambuco e norte do Estado da Bahia. Seu cultivo foi favorecido face às condições climáticas existentes nesta região durante um maior período de tempo no ano. Isto devido à expectativa de evitar a formação de estoque de polpa e reduzir o período de ociosidade da indústria na entressafra. Porém, a partir de 1991, ocorreu uma redução da área plantada, provocada pela maior oferta de polpa no mercado internacional e pelo ataque severo da traça-do-tomateiro, cientificamente chamada de Tuta absoluta (JAIME, 1998). Atualmente são cultivados no Brasil cerca de 18 mil hectares de tomateiros rasteiros, cuja produção é toda destinada à industria, com uma produção anual em torno de toneladas, concentradas principalmente na região dos cerrados do centro-oeste e também no oeste de São Paulo, onde são cultivados cerca de quatro mil hectares ( EMBRAPA, 2010). A espécie Lycopersicon esculentum Mill., uma das mais cultivadas em todo o mundo, apresenta diferentes variedades para atender às mais diversas demandas do mercado de tomate de mesa e para o processamento industrial (SILVA; GIORDANO, 2000; FONTES; SILVA, 2002). Dentre as cultivares desejadas pelo mercado, deve-se escolher aquelas com resistências às doenças causadas por micro-organismos como, Verticilium e Fusarium, pois, quando presentes, determinam o insucesso da cultura. Além disso, deve-se atentar ao tamanho e uniformidade dos frutos (FONTES; SILVA, 2002). No mercado, existem diversas cultivares disponíveis para o cultivo, provenientes de diferentes grupos como a Santa Cruz (oblongo), caqui ou salada (redondo), italiano e cereja (ANDREUCCETTI et al., 2003a; FILGUEIRA, 2003). Tomates do grupo cereja, Lycopersicon esculentum variedade cerasiforme, exibem frutos pequenos, redondo alongados, com dois a três centímetros de diâmetro, dois lóculos, polpa fina e pesam em média de 15 a 25 g (FILGUEIRA, 2003). São representados pelos cultivares cereja rubi (EMBRAPA, 1993), Cocktail Red Vine, Alongado Red sugar, Renata DRC e Sindy DRC (SAKAMA, 2001), Moutain Belle (FONTES; SILVA, 2002), entre outras. O amadurecimento do tomate é marcado por modificações texturais, associadas ao metabolismo de carboidratos da parede celular, que culminam com a redução da firmeza. À medida que o fruto vai atingindo a sua maturidade, as substâncias pécticas da parede celular vão sendo solubilizadas, transformando a pectina insolúvel (protopectina) em pectina solúvel, resultando no amaciamento ou perda de firmeza da polpa. Esse amolecimento ocorre em

26 5 razão da diminuição das forças coesivas que mantêm as células unidas decorrentes da decomposição da protopectina pela ação das enzimas poligalacturonase (PG) e pectinametilesterase (PME) (FACHIN, 2003; VILAS BOAS et al, 2000). Várias mudanças ocorrem durante o amadurecimento do fruto, uma delas é a perda da textura firme que está relacionada com a estrutura e composição da parede celular, principalmente da fração péctica que, quando degradada provoca o amolecimento nos frutos do tomate (BARRET REINA et al., 1994; MOURA et al, 1999; FACHIN, 2003). No tomate, a medida da textura é influenciada pela espessura da casca, firmeza da polpa e pela estrutura interna do fruto, ou seja, relação pericarpo/material placental (BARRET REINA et al., 1994). A qualidade do tomate está relacionada ao estádio de maturação do fruto, pois é ele que define o momento da colheita. O estádio verde maduro (início de mudança de cor) é considerado o primeiro indicador visual para o índice de maturação. A cor é o atributo de qualidade mais atrativo para o consumidor (CHITARRA; CHITARRA, 1990a). Por sua vez, está relacionada à aparência, ao teor de açúcares, acidez, textura, sabor e suculência (MALUNDO et al, 1995; ZAMBRANO et al, 1996; BALDWIN et al., 1998; AUERSWALD et al., 1999a; MOURA et al, 1999; AZODANLOU et al., 2003) que são decorrentes do processo de maturação. Tomates cultivados no sistema convencional, colhidos em estádio vermelho, apresentam maiores teores de açúcares, vitamina C e ácidos orgânicos, esses constituintes são mais importantes para o sabor e afetam diretamente a qualidade do fruto (ZAMBRANO et al, 1996; MOURA et al, 1999). O ponto de colheita determina a maior ou menor resistência do fruto ao manuseio, sua capacidade de completar a maturação, sua aparência e qualidade (EMBRAPA, 1993; GAYET et al., 1995; CASQUET, 1998; FONTES ; SILVA, 2002). Na fase pós-colheita, a qualidade dos frutos depende dos recursos tecnológicos disponíveis na cadeia de comercialização. A seleção da tecnologia está relacionada ao tipo e destino do produto, devendo ser consideradas as condições locais e o treinamento de pessoal (CHITARRA, 1994). O manejo correto da temperatura é importante, pois no período pós-colheita as transformações são mais rápidas com o aumento deste fator nos frutos. Normalmente, os tomates são colhidos e rapidamente comercializados, sendo pouco utilizada a refrigeração. Em temperatura ambiente, a vida útil de tomates é variada, dependendo do grau da maturação, cultivar, manejo de pós-colheita e embalagem. Porém, se espera uma conservação de poucos

27 6 dias, uma vez que a temperatura ambiente a que são expostos, favorece a sua rápida deterioração (KLUGE; MINAMI, 1997; SANINO et al., 2003). As alterações nos tomates durante o processo da colheita até o consumidor são principalmente mecânicas, fisiológicas e patológicas (HARVEY, 1978). Danos mecânicos ocorrem durante o manuseio do produto (colheita, seleção, embalagem, transporte e exposição). Danos fisiológicos e patológicos ocorrem, principalmente, nas fases de produção, transporte e exposição. A mensuração e a quantificação dos danos físicos e perdas decorrentes, sempre foram um desafio. Algumas alternativas são relatadas na literatura sobre diferentes metodologias para quantificação de danos físicos. Halsey (1955) relata para tomates, a utilização de escalas de notas relacionadas à severidade e à intensidade do dano físico. Defeitos fisiológicos ocorrem devido às anomalias hereditárias, ou são atribuídos às condições externas desfavoráveis durante a fase de crescimento e maturação. Tais como geadas tardias ou baixas temperaturas, granizo, raios solares, chuvas e ventos, que afetam as folhas e os frutos do tomateiro (CHITARRA; CHITARRA, 1990). Tanto temperatura alta como a incidência de raios solares provoca despigmentação de algumas áreas dos frutos, principalmente em variedades que desenvolvem poucas ramas ou as perderam por ataque de parasitas (CHITARRA; CHITARRA, 1990). Chuvas insistentes e prolongadas durante a floração de tomateiros podem ocasionar danos importantes, em relação à fecundação das flores ou mesmo durante a maturação dos frutos, originando frutos rajados e favorecem a podridão apical e tomates com menor teor de sólidos solúveis totais (HARVEY, 1978). Ventos, além de prejudicar o ciclo evolutivo da planta, promovem a queda de frutos quando a planta não está com a estrutura de sustentação adequada (CHITARRA; CHITARRA, 1990; SILVA; GIORDANO, 2000; FERREIRA, 2003). Não foi encontrado nenhum estudo realizado no Brasil ou no exterior quantificando, comparativamente, os agentes patogênicos no tomate orgânico e no convencional. Não é comum a contaminação do tomate durante a produção, mas, essa pode ocorrer durante a colheita ou no pós-colheita se o ambiente estiver contaminado com coliformes fecais, provenientes de adubo orgânico (MORETTI, 2009). Dentre as principais bactérias do grupo de coliformes fecais presentes em fezes de animais, estão Escherichia coli e Salmonella spp., que podem provocar surtos de toxinfecção alimentar, quando atingem quantidades elevadas nos alimentos, e enfermidades

28 7 entéricas, que podem ser transmitidas ao homem por hortaliças contaminadas (MORETTI et al., 1998). 2.2 Fatores de Contaminação Diversos passos na cadeia de produção de vegetais são fontes potenciais de contaminação microbiana. A água de irrigação contaminada, o emprego de esterco nãotratado como fertilizante, fezes de animais silvestres, domésticos ou de humanos podem comprometer os produtos antes da colheita. Após, a contaminação pode ser o resultado do uso de água ou gelo contaminado, manuseio impróprio, a presença de animais no ambiente de processamento, o uso de equipamentos contaminados e a contaminação cruzada (BEUCHAT, 1996). Tanto as águas de abastecimento, quanto as de irrigação de frutas e hortaliças, do ponto de vista microbiológico, são de grande importância na veiculação de micro-organismos patogênicos, em especial os habitualmente eliminados com as fezes. Entretanto, as técnicas de isolamento e identificação, de todos os micro-organismos patogênicos a partir da água, são muitas vezes complicadas e onerosas e a obtenção dos resultados demandaria muito tempo (CHAGAS et al., 1981). Em condições ideais, a água de irrigação não deve incluir nenhum micro-organismo patogênico, nem tão pouco, bactérias indicadoras de contaminação fecal. Habitualmente, a qualidade microbiológica da água potável é avaliada de forma indireta por meio dos denominados indicadores de contaminação fecal. O grupo dos coliformes é o principal indicador usado para esse fim. A presença de algum membro deste grupo em águas tratadas sugere contaminação depois do tratamento da mesma (BASUALDO et al., 2001). Conforme Franco e Landgraf (2008), a microbiota das mãos e roupas dos manipuladores pode ser oriunda do solo, água, poeira e outros ambientes. Outra fonte importante são as fossas nasais, a boca e a pele. Em condições muito precárias de higiene os micro-organismos do trato gastrointestinal também podem contaminar as mãos dos manipuladores e, consequentemente, os alimentos por eles preparados. Alimentos que sofrem manipulação são potencialmente capazes de causar intoxicação estafilocócica e os manipuladores são importantes fontes de contaminação de Staphylococcus aureus (CUNHA NETO et al., 2002). Conseqüentemente, surtos de intoxicação alimentar são freqüentemente relatados e os causados por Staphylococcus aureus são os mais comuns, pois

29 8 havendo condições favoráveis a sua multiplicação, proliferam em poucas horas, certas cepas produzem uma toxina termoestável que é responsável pelo quadro clínico (RADDI et al., 1988). As falhas nos procedimentos de higienização de equipamentos e utensílios permitem que os resíduos aderidos aos equipamentos e superfícies se transformem em potenciais fontes de contaminação cruzada (CHESCA et al., 2003). A limpeza e desinfecção dos equipamentos é operação fundamental no controle sanitário em indústrias de alimentos, muitas vezes negligenciadas, ou efetuadas em condições inadequadas (MENDONÇA; GRANADA, 1999). 2.3 Bactérias que causam doenças e suas toxinas A microbiota dos vegetais frescos é originária principalmente do solo, das formas de cultivo (convencional ou hidropônica), da água de irrigação, do ar, dos insetos e animais. É representada basicamente pelas espécies da família Enterobacteriaceae e Pseudomonadaceae (SANT ANA et al., 2002). Os principais micro-organismos causadores de doenças de origem alimentar são: Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter jejuni, Escherichia coli (E. coli enteropatogênica, E. coli enteroinvasora, E. coli enterotoxigênica, E. coli enterohemorrágica), Yersinia enterocolitica, Vibrio parahaemolyticus e Listeria monocytogenes (MALLON ; BORTOLOZO, 2004) Shigella spp. As bactérias do gênero Shigella são bacilos Gram-negativos, não formadores de esporos, pertencentes à família Enterobacteriaceae. Esse gênero é constituído por quatro espécies. Cada uma delas possui distintos sorogrupos: S. dysenteriae (grupo A) com 13 sorotipos, S. flexneri (grupo B) com 06 sorotipos, S. boydii (grupo C) com 18 sorotipos e S. sonnei (grupo D) com 01 sorotipo (SANTOS FILHO, 2003). Cada sorotipo é designado pelo nome da espécie seguido de um número. Shigella flexneri 2 é o sorotipo mais encontrado nos pacientes de paises subdesenvolvidos; entretanto Shigella dysenteriae 1 é conhecida como o

30 9 Bacilo de Shiga e produz a forma mais grave de diarréia, que pode evoluir para sepse e coagulação intravascular disseminada (ESPAÇO REAL MÉDICO, 2009). A shigelose é a infecção diarréica bacteriana mais comunicada. Os humanos servem como hospedeiros naturais, e a doença é transmissível por via fecal-oral; um número tão pequeno quanto 200 micro-organismos viáveis é suficiente para causar a doença (KONEMAN et al., 2008). Os sintomas iniciais mais comuns que sugerem shigelose incluem febre, diarréia aquosa com dores e câimbras abdominais e mialgia generalizada. Também pode ser precocemente observada a perda de líquido e de eletrólitos, devido à ação de enterotoxinas sobre as células do epitélio intestinal. Após dois ou três dias, os movimentos intestinais tornam-se menos frequentes e a quantidade de matéria fecal decresce. Mas a presença de sangue vermelho-brilhante e muco nas fezes, e o estabelecimento de tenesmo (pressão ao evacuar) indicam a fase disentérica da doença, sugerindo que ocorreu penetração bacteriana no intestino (KONEMAM et al., 2008). A espécie mais comum nos Estados Unidos é a S. sonnei; ela causa uma disenteria relativamente leve chamada diarréia dos viajantes. No outro extremo, a infecção com S. dysenteriae frequentemente resulta em disenteria grave e prostração. A toxina responsável é surpreendentemente virulenta e é conhecida como a toxina Shiga (TORTORA et al., 2005). As bactérias do gênero Shigella são os principais agentes de enterocolite, sendo S. flexneri e S. sonnei isolados mais frequentemente no Brasil (FRANCO; LANDGRAF, 2008). A doença humana causada por Shigella é chamada de shigelose ou desenteria bacilar, na qual essa bactéria é transmitida por alimentos, dedos contaminados, fezes e moscas. Apesar da maioria dos casos serem disseminados através da transmissão pessoa a pessoa, já foram relatados muitos surtos de infecção ocasionados pela ingestão de alimentos ou água contaminados (JAWETS et al., 2000) Salmonella spp. O gênero Salmonella pertence à família Enterobacteriaceae e compreende bacilos Gram-negativos não produtores de esporos. São anaeróbios facultativos, produzem gás a partir de glicose (exceto S. typhi) e são capazes de utilizar o citrato como única fonte de carbono. A maioria é móvel, por meio de flagelos peritríquios, exceção feita à S. pollurum e à S. gallinarum, que são imóveis (FORTUNA; FRANCO, 2005).

31 10 As salmonelas são o grupo mais complexo das Enterobacteriaceae, com mais de sorotipos descritos no esquema de Kauffman-White. Neste esquema, as salmonelas estão agrupadas (A, B, C) com base nos antígenos somáticos O. Estão subdivididas em sorotipos (1,2) de acordo com seus antígenos flagelares, ou seja, A1, A2, B1, B2 (KONEMAN et al., 2008). As doenças causadas por Salmonella costumam ser subdivididas em três grupos: a febre tifóide, causada por Salmonella typhi, as febres entéricas, causadas por Salmonella paratyphi (A, B, C) e as enterocolites (ou salmoneloses), causadas pelas demais salmonelas (FRANCO; LANDGRAF, 2008). A salmonela primeiramente invade a mucosa intestinal multiplicando-se. Ocasionalmente, atravessa a mucosa intestinal até o sistema linfático e cardio-vascular e dali pode se disseminar para afetar muitos órgãos. Normalmente há uma febre moderada, acompanhada de náuseas, dor abdominal, cólicas e diarréia. Até um bilhão de salmonelas por grama pode ser encontrado nas fezes de uma pessoa infectada durante a fase aguda da doença (TORTORA et al., 2005). Segundo Koneman (2008), podem ser diferenciados quatro tipos clínicos de infecções por Salmonella: (1) gastroenterite, a manifestação mais freqüente, (2) bacteremia e septicemia; (3) febre entérica (4) um estado de portador, no qual as pessoas com infecção prévia, em especial por Salmonella typhi, podem continuar excretando o micro-organismo nas fezes até um ano após a remissão dos sintomas. As endotoxinas correspondem à fração lipídica do lipopolissacarídeo que compõe a membrana celular externa de Salmonella e de outras enterobactérias, e são responsáveis pelo efeito tóxico que essas bactérias apresentam quando sofrem lise celular (FRANCO; LANDGRAF, 2008). A Salmonella é um dos micro-organismos mais envolvidos em casos e surtos de doenças de origem alimentar em diversos países, inclusive o Brasil. A sua patogenicidade varia de acordo com o tipo sorológico, idade e condições de saúde do hospedeiro (FRANCO; LANDGRAF, 2008). Entre as bactérias patogênicas abrangidas na Portaria 451, existe tolerância zero para a Salmonella spp. em 25g de qualquer alimento para consumo humano (BRASIL, 1997).

32 Klebsiella spp. As bactérias do gênero Klebsiella são bacilos Gram-negativos, pertencentes à família Enterobacteriacea. São capsuladas e por causa dos antígenos, muitos sorotipos já foram identificados (TRABULSI et al., 1999). Segundo Tortora (2005), muitos membros do gênero Klebsiella são encontrados no solo ou na água. Muitos dos isolados são capazes de fixar nitrogênio da atmosfera. Algumas espécies de Klebsiella possuem cápsulas constituídas de polissacarídeos que recobrem os antígenos somáticos. Essas espécies podem ser identificadas usando-se teste de intumescimento capsular com anti-soros específicos. As infecções humanas do trato respiratório são causadas particularmente pelos tipos capsulares um e dois, enquanto as do trato urinário são causadas pelos tipos 8, 9, 10 e 24 (JAWETS et al., 2000) Staphylococcus aureus As bactérias do gênero Staphylococcus são cocos Gram-positivos, pertencentes à família Micrococcaceae e por se dividirem em planos diferentes, quando vistos ao microscópio, aparecem na forma de cachos de uva. São anaeróbias facultativas, com maior crescimento em condições aeróbias, quando, então, produzem catalase (FRANCO; LANDGRAF, 2008). O homem e os animais são os principais reservatórios de Staphylococcus aureus. A cavidade nasal é o principal hábitat dos estafilococos no homem e, a partir deste foco, atingem tanto a epiderme, feridas, bem como o ar, água, solo, leite, esgoto e qualquer superfície ou objeto que tenha entrado em contato com o homem (KLOOS, 1990). Os Staphylococcus aureus causam intoxicação provocada pela ingestão do alimento que apresenta a toxina pré-formada. Portanto, o agente causal não é a bactéria per se, mas várias toxinas (A, B, C 1, C 2, C 3 D, E) produzidas por essa bactéria, conhecidas como enterotoxinas. Os sintomas variam desde náuseas e vômitos a espasmos abdominais e diarréias. Podem também ser observados, em casos severos, muco e sangue no vômito e nas fezes. A infecção estafilocócica pode ser fatal em recém-nascidos e pessoas idosas (RADDI et al., 1988).

33 12 Largamente distribuído na natureza por conta das peculiaridades do seu habitat, são transmitidos aos alimentos por manipuladores, na maioria dos casos, por portadores e também por animais (CASTRO; IARIA, 1984). As cepas produtoras de uma ou ambas as toxinas são responsáveis pela síndrome da pele escaldada. Nesta condição clínica, observa-se a formação de bolhas em amplas áreas corpóreas, com posterior aparecimento de escaras nas camadas superficiais da pele (KONEMAM et al., 2008). A síndrome do choque tóxico é uma enfermidade de múltiplos sistemas causada por uma toxina ainda desconhecida liberada pelo Staphylococcus aureus, caracterizada por uma síndrome clínica que inclui febre, hipotensão, vertigem ortostática, eritrodermia e vômitos de intensidade variada, diarréia, insuficiência renal, cefaléia, calafrios, faringite e conjuntivite (KONEMAM et al., 2008; TORTORA et al., 2005) Staphylococcus coagulase negativa Os estafilococos são em sua maioria catalase-positivos e pertencem à família Micrococcaceae. Os estafilococos que produzem a coagulase são Staphylococcus aureus subespécie aureus, o Satphylococcus aureus subespécie anaerobius,o Staphyloccus intermedius e o Staphylococcus lutrae. Aqueles que são coagulase-negativo são designados como os estafilococos coagulase-negativa ou não Staphylococcus aureus. São descritas 31 espécies de estafilococos coagulase-negativa e a mais comumente encontrada é o S. epidermidis (DRUGSWELL, 2011). Tais micro-organismos são bactérias Gram-positivas, comumente encontradas como habitantes da pele, da cabeça e dos membros superiores e inferiores, bem como do ouvido e das axilas (PATRYCK, 1990). Embora os Staphylococcus aureus coagulase-positiva, sejam o principal agente de intoxicação alimentar, alguns pesquisadores enfatizam que os estafilococos coagulasenegativa (ECN) podem produzir as enterotoxinas estafilocócicas, podendo contribuir para a intoxicação alimentar (CUNHA et al., 2006). 2.4 Irradiação: um processo de descontaminação Os métodos de preservação dos alimentos empregam processos físicos ou químicos. Dentre tais métodos, a irradiação de alimentos consiste num método preventivo de segurança

34 13 alimentar. Com o descobrimento e desenvolvimento de técnicas utilizando material radioativo, muitos, setores foram beneficiados, um deles foi o setor alimentício que através de radiações ionizantes conseguiu obter resultados que podem amenizar e até mesmo evitar uma série de problemas quanto as enfermidades de origem alimentar (ROCHA; SOUZA, 2007). A irradiação pode reduzir as perdas do pós-colheita matando pragas de insetos em frutas, grãos, ou temperos, reduzindo organismos deteriorantes de alimentos, inibindo o brotamento de vegetais e retardando o amadurecimento de frutas (HACKWOOD,1991). Por outro lado, o processo de irradiação pode ser usado como uma medida de saúde pública de intervenção para o controle de doenças de origem alimentar (THAYER, 1990; PAHO, 1992). Isto é extremamente importante uma vez que nas últimas duas décadas, doenças de etiologia microbiana tornaram-se um problema crescente de saúde pública em todo o mundo (DIEHL; JOSEPHSON, 1994). Com base em estudos experimentais e estimativas teóricas, a comissão conjunta de especialistas em alimentos irradiados FAO/WHO/IAEA (WHO, 1981), criou em 1981 uma recomendação a qual tem, desde 1985, sido inclusa na legislação brasileira: a) Raios Gamas de radionuclídeos como o 60 Co com máxima energia de 1.33 Mev ou o 137 Cs com máxima energia de 0.66Mev; b) Raios-X produzidos por fontes de máquinas operadas em cinco Mev ou menos; c) Aceleradores de elétrons com energia de 10 Mev ou menos. Dependendo da dosagem de radiações ionizantes, as quais submetemos os alimentos, podemos chamar o processo de: Radapertização ou esterilização: é o tratamento do alimento com uma dose de energia ionizante suficiente para prevenir a decomposição e a toxidez de origem microbiana, sejam quais forem o tempo e as condições de armazenamento do produto, desde que este não seja contaminado novamente. As doses requeridas nesse processo geralmente estão entre 25 e 45 kgy (DIEHL, 1995; SATIN, 1997). Radiciação: é o tratamento do alimento com uma dose de energia ionizante suficiente para reduzir o número de bactérias patogênicas viáveis e não produtoras de esporos, de forma que não sejam detectadas por métodos de análises bacteriológicas nos alimentos tratados. Esse tratamento também inativa parasitas presentes nos alimentos. As doses requeridas nesse processo geralmente estão entre 2 a 8 kgy (DIEHL,1995; SATIN, 1997).

35 14 Radurização: pode ser encarada como um processo semelhante à pasteurização. Causa a redução na contagem de micro-organismos deterioradores viáveis. As doses utilizadas se encontram na faixa entre 0,4 kgy a 2,5 kgy. A radurização pode ser utilizada para prevenir brotamentos em bulbos e tubérculos, retardar o tempo de maturação de frutas, prevenir a deterioração por fungos em frutas e hortaliças e controle de infestação por insetos e ácaros. Doses de 2,0 kgy reduzem e eliminam bactérias. Muitas frutas e vegetais toleram doses de radiação de no mínimo 0,25 kgy sem haver mudança em sua qualidade (DIEHL,1995; SATIN, 1997; LACROIX; OUATTARA, 2000) Irradiação de alimentos no mundo: histórico O início da história da irradiação de alimentos é a história da radiação em si. Roentgen descobriu os raios-x em 1895, Becquerel reconheceu a radioatividade em Uma explosão de pesquisa sobre os efeitos biológicos das radiações ionizantes em organismos vivos seguiu essas descobertas. Inventores empreendedores logo descobriram aplicações práticas da radiação. A patente britânica número 1609 foi emitida em 1905 para J. Appleby e A. J. Banks por sua invenção trazer uma melhoria na condição dos alimentos e na sua conservação geral. Eles propuseram o tratamento de alimentos, principalmente cereais, com alfa, beta e raios gama do rádio (Ra) ou outras substâncias radioativas, salientando a vantagem excepcionalmente marcada de uma ausência total do uso direto ou emprego de compostos químicos. B. Schwartz do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos sugeriu o uso de raios-x para inativar triquinas na carne de porco em Uma patente francesa foi concedida em 1930 para o engenheiro alemão O. Wüst por uma invenção para matar bactérias em alimentos embalados pelo tratamento com Raios-X. Nenhuma dessas propostas levou a uma aplicação prática, simplesmente porque as fontes de radiação disponíveis naquele tempo, máquinas de Raios-X ou isótopos radioativos, não eram suficientemente potentes para tratar alimentos em quantidades comerciais (DEL MASTRO, 1999). No entanto, a evolução tecnológica, durante a II Guerra Mundial produziu o equipamento que poderia ser adaptado para melhorar o processamento de radiação. Tubos Klystron desenvolvidos para radar foram utilizados para a construção de aceleradores de elétrons de alta energia, e radioisótopos gerados em reatores nucleares tornaram-se

36 15 disponíveis para compor grandes fontes de raios gama. Os primeiros estudos sobre a conservação de alimentos utilizando radiação como fonte, foram descritos por Josephson (1983). Em meados dos anos 50, os programas nacionais de pesquisa sobre irradiação de alimentos foram igualmente posto em curso na Bélgica, Canadá, França, República Federal da Alemanha, Países Baixos, Polônia, União Soviética e o Reino Unido. O primeiro uso comercial da irradiação de alimentos ocorreu em 1957 na Alemanha, quando uma fabricante de especiarias em Stuttgart começou a melhorar a qualidadade higiênica de seus produtos através da irradiação com os elétrons, usando um gerador Van Graaff (DEL MASTRO, 1999). Em 1960, foi autorizada, no Canadá, a irradiação de batatas para a inibição de brotação, e uma fonte de cobalto-60 começou a irradiar as batatas em 1965 (IAEA, 1966). O Projeto Internacional na Área de Irradiação de Alimentos (IFIP) foi criado em 1970 e teve o objetivo específico de levar a cabo um programa de pesquisa mundial sobre a segurança sanitária de alimentos irradiados. Desenvolvido sob o patrocínio da FAO, IAEA e da OCDE, com 19 países participantes. Este número cresceu mais tarde para 24 países (DIEHL, 1995). Os resultados obtidos no Projeto Internacional e nos programas de exames nacionais foram repetidamente avaliados pelo Comitê Misto FAO / IAEA / WHO sobre a salubridade dos alimentos irradiados (JECFA). Este Comitê concluiu em 1980 que a irradiação de qualquer produto alimentar até uma dose média global de 10 kgy não apresentaram risco de toxicidade, nem problemas nutricionais especiais ou microbiológicos (WHO, 1981). Com base na decisão JECFA de março de 1980, a Comissão do Codex Alimentarius adotou em 1983 a Norma Geral para alimentos irradiados e um Código de Práticas Internacionais Recomendadas para a operação de instalações de irradiadores. A Organização Mundial de Saúde incentivou a utilização do processo, o que é descrito como ''uma técnica para preservar e melhorar a segurança alimentar (WHO; FAO, 1988). Em 1997, a FAO / IAEA / WHO com um Grupo de Estudo em Alta Dose de Radiação analisou os resultados dos estudos de segurança realizados em alimentos irradiados com doses superiores a 10 kgy. Poucos alimentos toleraram doses acima de 10 kgy, sem perda de qualidade. Por outro lado, estudos a longo prazo de alimentação de animais com alimentos irradiados com doses tão elevadas quanto 70 kgy não apresentaram efeito adverso na saúde relacionado ao tratamento. O Grupo de Estudo concluiu que alimentos irradiados por qualquer

37 16 dose adequada para atingir o objetivo tecnológico pretendido é seguro para consumir e nutricionalmente adequado (WHO, 1999). Outras implementações pioneiras de irradiação de alimentos foram: a irradiação comercial de batatas introduzida em 1973 no Shihoro, Hokkaido, Japão (UMEDA, 1983); a irradiação por elétrons para a desinfestação de grãos importados em 1980 no Porto Odessa (antiga União Soviética); a descontaminação por radiação de carne de frango mecanicamente separada na França desde 1991 (SADAT; VOLLE, 2000); a descontaminação por radiação de certos produtos da pesca nos Países Baixos, Bélgica e França; a descontaminação por radiação de salsichas fermentadas (Nham) na Tailândia; a esterilização por radiação de alimentos no espaço nos Estados Unidos; algumas refeições congeladas na África do Sul, e irradiação das culturas do bulbo, desde a década de 1990 na China e na Índia (THOMAS, 2001) Irradiação de alimentos no Brasil No Brasil, as primeiras pesquisas com irradiação de alimentos foram feitas da década de 50, pelo Centro de Energia Nuclear na Agricultura, em Piracicaba (SP). Mesmo com a permissão, em 1985, do uso da irradiação para conservação de alimentos, os estudos se restringiram quase que exclusivamente às instituições de pesquisas, uma vez que o país contava com um número restrito de especialistas (ORNELLAS et al., 2006). Os primeiros artigos que foram publicados sobre irradiação de alimentos no Brasil datam de 1968 (WIENDL, 1968; WIENDL; BERTI, 1968). A seção de Entomologia do Centro de Energia Nuclear para Agricultura da Universidade de São Paulo (CENA) desenvolveu uma grande quantidade de pesquisas sobre irradiação de alimentos e insetos sendo Frederico W. Wiendl, pioneiro no campo. Entre 1968 e 1970 alguns estudos foram realizados na Universidade Federal de Rio Grande do Sul. A Comissão Nacional de Energia Nuclear (CNEN) e o Instituto Militar de Engenharia (IME), no Rio de Janeiro dedicaram alguns trabalhos de investigação e de avaliação internacional entre 1978 e Desde 1991, a pesquisa sobre irradiação de alimentos também tomou lugar no Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN) em São Paulo, um dos institutos pertencentes à CNEN e tinha como objetivo principal o desenvolvimento de técnicas para identificar alimentos irradiados, um novo campo de estudo no Brasil (DEL MASTRO, 1999).

38 17 Essa escolha baseou-se no seguinte: em conjunto, a Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação (FAO) / Agência Internacional de Energia Atômica (IAEA) / Organização Mundial de Saúde (WHO), realizaram uma reunião com uma comissão de peritos sobre a salubridade dos alimentos irradiados, em Genebra, de 27 de outubro a três de novembro de 1980, e concluiu, entre outras coisas, qualquer produto alimentar até uma dose média global de 10 kgy não apresentou risco de toxicidade, nem problemas nutricionais especiais ou microbiológicos, portanto, testes toxicológicos em alimentos assim tratados não é mais necessário (WHO, 1981) Aspectos legislativos da irradiação de alimentos O decreto n º , de 29 de Agosto 1973 que estabelece normas gerais para a irradiação de alimentos foi publicado no Diário Oficial em 30 de agosto de Tal decreto caracteriza o que é um alimento irradiado e define as normas para o armazenamento, transporte, distribuição, importação, exportação e exposição até a venda ou entrega ao consumidor de alimentos irradiados, bem como a dose de irradiação ionizante limitante para o processo (BRASIL, 1973). Esse decreto foi seguido de duas diretivas do Ministério da Saúde: nº 9, de 8 de Março de 1985 e nº 30, de 25 de Setembro de 1989 (ANVISA, 2010). Em geral, os alimentos podem ser expostos a radiações ionizantes, cuja energia é inferior ao limiar das reações nucleares que poderiam induzir radioatividade ao material irradiado. A irradiação de alimentos ou grupos de produtos alimentares só pode ser autorizada nos casos em que o trabalho técnico e científico foi realizado por instituições nacionais ou internacionais de investigação devidamente aprovado pela Comissão Nacional de Energia Nuclear, demonstrando que: Os alimentos irradiados são seguros para consumo; O efeito da irradiação sobre os nutrientes essenciais na alimentação compara favoravelmente com os prejuízos sofridos quando o alimento é tratado por processos convencionais; Os alimentos irradiados são salutares e a irradiação é eficaz para atingir o objetivo tecnológico pretendido (DEL MASTRO, 1999). É responsabilidade da Comissão Nacional de Alimentação do Ministério da Saúde elaborar uma Tabela de alimentos ou grupos de alimentos cuja irradiação é autorizada, indicando em cada caso: o tipo de radiação e nível de energia que é permitido, a dose de radiação nominal a ser aplicada, os efeitos da irradiação, e os tratamentos que devem ser

39 18 utilizados antes, durante ou após a irradiação para atingir o objetivo desejado (DEL MASTRO, 1999). A diretiva de 1985 aprovou uma norma geral para a irradiação de alimentos, e as condições de irradiação de certos alimentos. As autorizações individuais concedidas em 1985 e 1989 são apresentadas na Tabela 1 e são seguidas até o momento atual segundo Del Mastro, Tabela 1 - Autorização para irradiação de alimentos no Brasil Produtos Finalidade da irradiação Dose Max. Permitida (kgy) Arroz Desinfestação Batata Inibição do brotamento Cebola Inibição do brotamento Feijão Desinfestação Milho Desinfestação Trigo Desinfestação Farinha de trigo Desinfestação Temperos desinfestação, descontaminação Papaia Desinfestação, controle de amadurecimento Morangos Extensão da vida de prateleira Peixe e produtos de peixe Aves domésticas Abacate, abacaxi, goiaba, laranja, limão, manga, melão, tomate, caqui Extensão da vida de prateleira, descontaminação e desinfestação Extensão da vida de prateleira,descontaminação Desinfestação de insetos, controle de amadurecimento, extensão de vida de prateleira,redução da carga microbiana Ano de aprovação Atualmente, a ANVISA no Brasil, aprovou a resolução RDC n 21 de 26 de janeiro de 2001, Regulamento Técnico para Irradiação de Alimentos, que permite a irradiação de qualquer alimento com a condição de que a dose máxima absorvida seja inferior àquela que comprometa as propriedades funcionais ou os atributos sensoriais do alimento, e que a dose mínima absorvida seja suficiente para alcançar o objetivo pretendido (SANTOS et. al., 2003).

40 19 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Seleção de amostras Foram utilizados três lotes de tomates maduros, íntegros, sem danos à casca ou interior, comercializados em diferentes boxes na feira-livre do CEAGEPE, Recife-PE. Cada lote foi composto por oitenta frutos, divididos em quatro grupos, com quinze frutos para compor a amostra controle, e quinze frutos para as doses de 1,0; 1,5 e 2,0 kgy (ensaio em triplicata). Para a avaliação do tempo de vida de prateleira, foram separados de cada lote 20 frutos, sendo estudados cinco frutos para representar cada grupo (Figura 1). Grupo 1.1 controle Grupo 1.1 controle LOTE 1 60 unidades Grupo 1.2 Dose de 1kGy Grupo1.3 Dose de 1,5kGy LOTE 1 20 unidades Grupo 1.2 Dose de 1kGy Grupo1.3 Dose de 1,5kGy Grupo1.4 Dose de 2,0kGy Grupo1.4 Dose de 2,0kGy Grupo 2.1 controle Grupo 2.1 controle LOTE 2 60 unidades Grupo 2.2 Dose de 1kGy Grupo 2.3 Dose de 1,5kGy LOTE 2 20 unidades Grupo 2.2 Dose de 1kGy Grupo 2.3 Dose de 1,5kGy Grupo 2.4 Dose de 2kGy Grupo 2.4 Dose de 2kGy Grupo 3.1 controle Grupo 3.1 controle LOTE 3 60 unidades Grupo 3.2 Dose de 1kGy Grupo 3.3 Dose de 1,5kGy LOTE 3 20 unidades B Grupo 3.2 Dose de 1kGy Grupo 3.3 Dose de 1,5kGy Grupo 3.4 Dose de 2kGy Grupo 3.4 Dose de 2kGy A B Figura 1 - Fluxograma de amostragem para a análise microbiológica (A); Fluxograma de amostragem para a avaliação do tempo de vida de prateleira(b).

41 Análise microbiológica O procedimento experimental foi composto por duas séries de análises microbiológicas. A primeira foi feita com as amostras do produto in natura e a segunda com amostras do produto após a irradiação. Os tomates foram acondicionados em embalagens fechadas e conduzidos até o laboratório de Fármacos e Ensaios Antimicrobianos no Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco. 3.3 Isolamento e identificação de Enterobactérias Isolamento primário Em um frasco contendo 225 ml de água destilada estéril foram adicionados 25g da casca da fruta que correspondem em média a cinco tomates. O conjunto foi agitado mecanicamente por 15 minutos (CABRINI et al., 2002). Após o período de agitação, alíquotas da água de lavagem foram retiradas com alça de platina calibrada (1µL) e foram semeadas em esgotamento em triplicata nos meios Ágar Sangue de Carneiro, Ágar Eosina Azul de Metileno (EMB), Ágar entérico de Hektoen (HE), Ágar Salmonella-Shigella (SS) e Ágar Manitol. As placas foram incubadas a 35º C por 24 horas. Após incubação, as colônias foram reisoladas para posterior identificação (KONEMAM et al., 2008) (Figura2). Todo o ensaio foi feito em triplicata para as amostras do grupo controle e das irradiadas. (Os meios utilizados, bem como o modo de preparo encontram-se descritos no anexo 1, pág. 98).

42 21 Isolamento Primário 25g de casca (5 tomates) ml de água destilada estéril Agitação por por 15 minutos 15 minutos Solução de lavagem Semeio de alíquotas (1µL) para crescimento e incubação a 35º C por 24 h MANITOL SANGUE EMB HE SS Figura 2 - Esquema para a contagem e o isolamento dos micro-organismos a partir da água de lavagem das amostras controle e das irradiadas. EMB: Agar eosina-azul de metileno; HE: Agar entérico de Hektoen; SS: Agar Salmonella-Shigella.

43 Identificação dos isolados Após reisolamento, as colônias foram submetidas à coloração de GRAM para a separação dos micro-organismos em Gram-positivos e Gram-negativos e observação da morfologia (KONEMAN, 2008). Em seguida foram realizados os testes bioquímicos para identificação Identificação de Enterobacterias As colônias características que se apresentaram Gram-negativas e na forma de bacilos foram submetidas aos seguintes testes bioquímicos para identificação: Teste de utilização fermentativa da glicose, lactose e sacarose (meio TSI); Teste de motilidade, avaliação da produção de Indol e produção de H 2 S (meio SIM); produção de Urease (caldo uréia de Stuart); e teste de utilização de Citrato de Sódio ou Citrato de Simmons e prova da utilização de carboidratos (Figura 3) (SANTOS FILHO, 2003). MICRO-ORGANISMOS ISOLADOS COLORAÇÃO DE GRAM PROVAS BIOQUÍMICAS CITRATO URÉIA SIM TSI UTILIZAÇÃO DE CARBOIDRATOS Figura 3 - Esquema de isolamento e identificação de Enterobactérias. SIM: Agar sulfeto-indolmotilidade; TSI: Agar tríplice açúcar-ferro.

44 Isolamento e identificação de Staphylococcus spp. Após incubação, foram observadas as colônias com características sugestivas de Staphylococcus spp. encontradas no Ágar Sangue de Carneiro e Agar Manitol que foram reisoladas e submetidas às seguintes provas de identificação: prova da catalase, prova da coagulase, seguidos de crescimento em Ágar Manitol salgado, teste DNAse, prova da utilização de carboidratos, sensibilidade a novobiocina (5µg) e produção de urease.sendo este procedimento feito para as colônias isoladas das amostras do grupo controle e das irradiadas (SANTOS FILHO, 2003; KONEMAN, 2008) (Figura 4).

45 24 1ª ETAPA COLORAÇÃO DE GRAM 2ª ETAPA CATALASE + COAGULASE + - DNAse MANITOL POLIMIXINA B UTILIZAÇÃO DE CARBOIDRATOS URÉIA CALDO NITRATO RESISTÊNCIA A NOVOBIOCINA Figura 4 - Esquema de isolamento e identificação de Staphylococcus spp.

46 Análise do perfil de sensibilidade dos micro-organismos identificados frente a diferentes antibióticos Para o teste de susceptibilidade antimicrobiana das colônias isoladas a partir das amostras do grupo controle e das irradiadas foi utilizado o procedimento adotado pelo CLSI (2010), que consiste em transferir três a cinco colônias de cada micro-organismo identificado de uma cultura de 16 a 18 horas a 35 ºC, para um tubo com 5 ml de água estéril. Após turvação da solução a um valor correspondente ao tubo 0,5 de turbidez da Escala de McFarland, a suspensão foi semeada, utilizando swab estéril embebido com solução em placa contendo o Ágar Müeller Hinton em três sentidos diferentes, girando a placa num ângulo de 60º após cada aplicação. Os discos de antibióticos foram colocados sobre a superfície do meio semeado assepticamente, obedecendo a uma distância mínima de 15 mm. Para as enterobactérias os antibióticos utilizados foram: Ampicilina (10µg), Cefalotina (30µg), Cefoxitina (30µg), Cefotaxima (30µg), Cefepime (30µg), Gentamicina (10µg), Tetraciclina (30µg), Ciprofloxacina (5µg), Amoxicilina + Ác. Clavulânico (20/10µg) e para os Staphylococcus spp. : Ciprofloxacina, Clindamicina, Cloranfenicol, Eritromicina, Gentamicina, Linezolida, Oxacilina, Tetraciclina e Penicilina. As placas assim preparadas foram submetidas à incubação a 35 ± 2 C. Após 16 a 18 horas de incubação, as placas foram examinadas e os diâmetros das zonas de inibição foram medidos e classificados de acordo com a Tabela M100/S20 do CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) (Figura 5) (anexos dois e três, pág. 101)

47 26 A 3 a 5 colônias 5 ml de soro fisiológico Turbidez equivalente ao tubo 0,5 da escala da Mc Farland B C Incubação a 35 C por 16 a 18 horas Discos de antibióticos D Figura 5 - Esquema de antibiograma segundo CLSI, A - Padronização dos inóculos. B - Semeio em meio Müller Hinton. C - Colocação dos discos de antibióticos nas placas semeadas. D - Leitura e interpretação dos resultados segundo CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute).

48 Irradiação das amostras Preparo das amostras e irradiador Para proceder à irradiação, as amostras foram embaladas individualmente em papel filme estéril, a fim de evitar contaminações posteriores. Todo o procedimento foi realizado dentro da capela de fluxo laminar e em seguida devidamente identificadas quanto à dose de irradiação a que foram submetidas. O material preparado como descrito foi submetido à irradiação (grupos de 10 frutos por cada etapa) com raios gama, em irradiador com fonte de cobalto-60 Gammacell 220 Excel - MDS Nordion (Figura 6) com taxa de dose de 6,060 kgy/h em Janeiro de 2011, utilizando as doses: 1,0; 1,5 e 2 kgy. O procedimento foi realizado no laboratório GammaLab do Departamento de Energia Nuclear da Universidade Federal de Pernambuco Figura 6 - Foto das amostras e do irradiador de cobalto-60 Gammacell 220 Excel - MDS Nordion. (1): local onde são colocadas as amostras; (2): painel de controle; (3): frutos embalados. 3.6 Análise estatística Para avaliar se as doses empregadas foram eficazes foi utilizado o Teste t-student com o auxílio do software statistic 6.0.Os resultados terão significância estatística quando o p < 0,05.

49 28 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Contagem de colônias em unidades formadoras de colônias (UFC/g) No primeiro ensaio para as amostras controle e para o experimento irradiado, utilizando o meio Agar sangue de carneiro, foi observada contaminação em todos os grupos controle de tomates analisados com valores em Unidades Formadoras de Colônias por grama. Houve uma variação de 3,4x10 5 a 7,7x10 5 no grupo controle. As amostras irradiadas mostraram os seguintes valores: de 1x10 5 a 3,0x10 5 para a dose de 1,0 kgy, 1,2x10 4 a 1,3x10 4 para 1,5 kgy e 1,3x10 4 a 1,6x10 4 para 2,0 kgy.. Realizada a análise estatística, os p valores encontrados foram de 0,071316;0, ; 0, respectivamente com significância para as doses de 1,5 e 2,0 kgy onde p < 0,05 (Tabela 2). Tabela 2 - Contagem geral de micro-organismo em UFC/g no meio sangue, no grupo controle e no irradiado e análise estatística. Experimento 1 Controle (D.V.) 1 kgy 1,5 kgy 2,0 kgy Grupo 1 4,7x10 5 (4,7) 3,0x10 5 (5,5) 1,3x10 4 (0,5) 1,6x10 4 (1,1) Grupo 2 7,7x10 5 (8,2) 1x10 5 (2) 1,2x10 4 (1,1) 1,3x10 4 (0,5) Grupo 3 3,4x10 5 (5,3) 1,5x10 5 (3) 1,3x10 4 (0,5) 1,3x10 4 (0,5) Relação p-valor Controle X 1 kgy 0, Controle X 1,5 kgy 0, Controle X 2 kgy 0, Experimento 2 Controle (D.V.) 1 kgy 1,5 kgy 2 kgy Grupo 1 1,1 x 10 5 (2,6) 1,6 x 10 4 (1,1) 1,3 x 10 4 (0,5) 0 Grupo 2 1,66 x 10 5 (3,2) 4,3 x 10 4 (2,1) 0 0 Grupo 3 8 x 10 4 (1) 2,3 x 10 4 (1,5) 1,3 x 10 4 (0,5) 1 x 10 4 Relação p-valor Controle X 1 kgy 0, Controle X 1,5 kgy 0, Controle X 2 kgy 0, Experimento 3 Controle (D.V.) 1 kgy 1,5 kgy 2 kgy Grupo 1 1,66x10 6 (5,8) 9,9x10 5 (4,1) 2,5x10 5 (1,1) 0 Grupo 2 1,83x10 6 (5,8) 1,01x10 6 (3,7) 1,3x10 5 (2) 1,6x10 4 (0,5) Grupo 3 1,50x10 6 (4,1) 9,7x10 5 (2) 2,8x10 5 (2) 1 x 10 4 Relação p-valor Controle X 1 kgy 0, Controle X 1,5 kgy 0, Controle X 2 kgy 0,000064

50 29 Para o segundo experimento, também fazendo a contagem em meio ágar sangue, as variações encontradas foram 8x10 4 a 1,66x10 5 para o grupo controle. Para as doses usadas, as variações foram 1,6x10 4 a 4,3x10 4, 0 a 1,3x10 4 e 0 a 1x10 4 respectivamente. Realizada a análise estatística, os p valores encontrados em se comparando o grupo controle com as demais doses empregadas, foram de 0,026038, 0, e 0, respectivamente, havendo significância com p < 0,05 ( Tabela 3). Para o terceiro experimento, as variações encontradas foram de 1,50x10 6 a 1,83x10 6 para o grupo controle e para as doses foram de 9,7x10 5 a 1,01x10 6 referente a 1,0 kgy, 1,3x10 5 a 2,8x10 5 para a de 1,5 kgy e para a dose de 2,0 kgy variaram de 0 a 1,6x10 4. Realizando-se a análise estatística entre o grupo controle e as doses utilizadas no trabalho, os p valores encontrados foram de 0,000089; 0, e 0, respectivamente havendo significância com p < 0,01 (Tabela 4). A resolução RDC nº 12 de 02/01/2002 da Agência Nacional Sanitária do Ministério estabelece como padrão, o máximo de 5x10 2 número mais provável (NMP) de coliformes fecais por grama de fruta e ausência de Salmonella spp. em 25g do fruto. Embora não existam na Legislação padrões para bactérias mesófilas totais e coliformes totais, de forma geral, é preconizado que alimentos contendo contagens microbianas da ordem de g -1 são impróprios para o consumo humano devido à perda do valor nutricional, alterações organolépticas, riscos de deterioração e/ou presença de patógenos. Nas amostras do grupo controle analisadas neste trabalho a contagem de bactérias atingiu os valores proibidos pela legislação, mostrando assim a inapropriedade dos frutos para o consumo. Dartora (2007) estudou tomates e encontrou bactérias mesófilas aeróbias na ordem de 10 8 para amostras não higienizadas com cascas. Para as amostras que não foram higienizadas, porém tiveram suas cascas retiradas a ordem encontrada foi de 10 2 comprovando que a grande maioria dos micro-organismos patógenos encontrados no tomate estão na casca. O presente trabalho também pesquisou micro-organismos nas cascas e encontrou valores aproximados ao encontrado pelo autor. Segundo Franco e Landgraf (2008), a maioria dos alimentos apresenta alterações quando são detectados números de bactérias Mesófilas Aeróbias superiores a 10 5 UFC/g de alimento. Oliveira et al., (2006) realizando trabalho no qual visavam analisar as condições microbiológicas das hortaliças (alface e tomate) em Belém-PA, encontraram nas amostras de tomate os valores de contagem padrão de bactérias mesófilas aeróbias variando de 10 a

51 30 2,1x10 2 UFC/g. Esses valores ficaram abaixo dos encontrados nesta pesquisa. Os frutos estudados por Olveira et al.(2006) tiveram a contagem de micro-organismos dentro dos limites da Legislação, o que não ocorreu com os tomates analisados nste estudo. Moreira et al. (2005), fizeram a contagem de colônias em tomates minimamente processados e encontraram contagem de mesófilos da ordem de 10 6 para o grupo considerado como controle e ao irradiar com 0,5 kgy, conseguiu um diminuição de 4 ciclos logarítmicos. Nizakat et al. (2005), testaram em tomates, sua microflora inicial, seu sabor e a firmeza quando tratou os frutos com doses de zero a 3 kgy. Os valores encontrados para fungos e bactérias variaram de 2,5x10 6 a 1x10 2 e 2,5x10 7 a 2,4x10 2 respectivamente. Na dose de 0,5 kgy, já não se encontravam mais coliformes fecais, sendo estes totalmente eliminados na dose de 1,0 kgy. Schmidt et al. (2006), utilizaram doses de radiação entre 0,7 kgy e 0,95 kgy em estudo realizado com tomates frescos para avaliar a qualidade microbiológica e a segurança dos frutos.não houve diferença na redução dos micro-organismos entre os tratamentos utilizados. E sugeriu que uma dose maior que 1,0 kgy poderia ser usada para melhorar os resultados encontrados. O presente trabalho, na dose de 2,0 kgy houve redução de até 6 ciclos logarítmicos, valores estes um pouco acima dos encontrados por Moreira et al., (2006) e semelhantes aos encontrados por Nizakat et al., (2006) Isolamento e identificação de Enterobactérias e Staphylococcos spp Enterobactérias As colônias que foram isoladas dos tomates do grupo controle e dos irradiados seguiram para os testes bioquímicos confirmatórios após a identificação presuntiva nos meios seletivos e diferenciais (Tabela 3). Com os testes bioquímicos foi possível confirmar a presença de enterobactérias e identificar 43 cepas divididas em 16 espécies. Das espécies identificadas apenas uma foi isolada após o uso da radiação sendo esta na dose de 1,0 kgy.

52 Tabela 3 - Características diferenciais das enterobactérias (bacilos Gram-negativos) isoladas Microorganismos C. freundii (5)* C. youngae (4) E. aerogenes (1) E. cloacae (8) E. cowanii (5) E. sakazakii (1) K. oxytoca (3) K. pneumoniae Subesp. pneumoniae (5) K. ascorbata (1) P. agglomerans (3) S. entérica subesp. houtenae (1) S. marcescens (2) S. odorífera biogrupo I (1) Indol V V - - V - + V.M V ND - V V + V + V Citrato V V H 2 S V Uréia V + - V V - V V - + LIA MIO Motilidade V V Gás V V V V V + V TSI ác/ác alc/ác ác/ác ác/ác ác/ác ác/ác ác/ác ác/ác ác/ác alc/ác alc/ác ác/ác ác/ác alc/ác ác/ác Fenilalanina V V - V Mio-inositol V V - V + V - Sorbitol V V V Arabnose V Rafnose V V V V Xilose V + V + V: variável; +: positivo; -: negativo; ác. : ácido; Alc.: alcalino; TSI: tríplice açúcar-ferro; H 2S:sulfeto de hidrogênio; LIA:lisina descarboxilase; MIO: ornitina descaboxilase; V.M.: vermelho de metila; (* ): número de cepas encontradas S. sonnei (1) Y. intermedia (1) 31

53 Citrobacter freundii Foram isoladas cinco colônias desse mircro-organismo das amostras controle no meio Ágar sangue com as provas bioquímicas demonstradas nas figuras 7 e A B C D Figura 7- Prova de fermentação dos carboidratos para Citrobacter freundii: 1. MIO negativo, 2. LIA negativo, 3. Arabnose positiva, 4. Rafnose, 5. Sorbitol, 6. Xilose, 7. Mio-inositol negativo Figura 8 Teste bioquímicos para identificação de Citrobacter freundii: A. Produção de H 2 S positiva; B. Citrato positivo; C. Uréia positiva; D. TSI ácido/ácido. Anoop et al. (2003), relataram que as bactérias do gênero Citrobacter, são habitantes natural do intestino humano. Também afirmaram que ela é responsável por episódios esporádicos e epidêmicos de meningite com alta incidência de abscesso cerebral. Thurm; Gericke (1994), isolaram 38 cepas de Citrobacter freundii em uma U.T.I neonatal. A alimentação dada aos neonatos foi um veículo importante na disseminação hospitalar da bactéria. C. freundii foi relatado como causa de doença gastrointestinal associada à ingestão de queijo Brie importado (Centers for disease control and prevention, 1983). Franco; Landraf (2008) descreveram que as bactérias do gênero Citrobacter podem ser encontradas em muitos alimentos, o que explicaria a presença de tais micro-organismos nos tomates Citrobacter youngae Foram isoladas quatro colônias das amostras controle no meio Ágar sangue, com características bioquímicas representadas nas figuras 9 e 10.

54 A B C D Figura 9 - Prova de fermentação dos carboidratos para Citrobacter youngae: 1. Arabnose positiva, 2. Rafnose negativa, 3. Sorbitol, 4. Xilose, 5. Mio-inositol negativo Figura 10 - Testes bioquímicos identificação de Citrobacter youngae: A. produção de H 2 S positiva; B. Citrato positivo; C. Uréia positiva; D.TSI; alcalino/ácido. Geser et al., (2011), analisaram amostras fecais de bovinos e porcos na Suiça e isolaram Citrobacter youngae, mostrando que esses animais são reservatórios desses microoragnismos. Manganello et al., (2001), realizando um estudo em 112 cepas isoladas de pacientes em um hospital universitário em Buenos Aires, separaram e identificaram as cepas,das quais 6 eram de Citorbacter youngae. Mostrando assim o gênero Citrobacter como um patôgeno oportunista mais frequentemente isolado de fezes e urinas de pacientes. Urbanová; Pácová (1997), isolaram 59 cepas de matérias-primas e alimentos (leite cru, salas de ordenha agrícolas, carne de salsicha, batata crua, queijo, alimentos congelados pronto para o forno, produtos de confeitaria e pratos frios), destas três eram de Citrobacter youngae e 14 eram de Citrobacter freundii, sugerindo uma contaminação secundária. Por ser um micro-organismo muito frequente em alimentos em geral sua presença nas amostras de tomate analisadas pode ser justificada Enterobacter aerogenes Foi isolada uma colônia de E.aerogenes no meio Ágar sangue, com as características bioquímicas ilustradas nas figuras 11 e 12.

55 A B C D Figura 11 - Prova de fermentação dos carboidratos para Enterobacter aerogene: 1. Arabnose positiva, 2. Rafnose, 3. Sorbitol, 4. Xilose, 5. Mio-inositol. Figura 12 - Testes bioquímicos para identificação de Enterobacter aerogenes: A. produção de H 2 S negativa; B. Citrato positivo; C. Uréia negativa D. TSI; ác/ácido. Lima Neto et al. (2007), em uma pesquisa feita com 10 tipos de saladas e 80 amostras de carne de frango comercializadas em Fortaleza fizeram a contagem para coliformes. Dos coliformes termotolerantes, o Enterobacter aerogenes teve 27 cepas isoladas. Santos et al. (2003), realizaram um estudo na mão de manipuladores de alimentos enterais em um hospital particular de João Pessoa e fez a contagem de coliformes fecais, bactérias mesófilas aeróbias e Staphylococos coagulase-positivo e de enterobactérias, encontrando em duas das cinco amostras analisadas Enterobacter aerogenes e Klebsiella pneumoniae. Miranda; Silva (2008), pesquisaram enterobactérias em baratas encontradas num hospital e encontraram 34 cepas de bactérias divididas em 7 espécies, dentre elas Enterobacter aerogenes. Em estudo feito com tomates, melão cantaloupe, uva itália e melancia in natura, foram encontardas enterobactérias nas amostras analisadas. Em 30% das amostras analisadas foram isoladas e identificadas cepas de Enterobacter aerogenes e Klebsiella pneumoniae. A alta disseminação desses micro-organismos justifica a presença dos mesmos nos frutos analisados (VICALVI, 2007) Enterobacter cloacae Foram isoladas oito colônias do grupo controle no meio Ágar sangue, com características bioquímicas demonstradas nas figuras 13 e 14.

56 A B C D Figura 13 - Prova de fermentação dos carboidratos para Enterobacter cloacae: 1. MIO positivo, 2. LIA negativo, 3. Arabnose positiva 4. Rafnose, 5. Sorbitol, 6. Xilose, 7. Mio- inositol negativo. Figura 14- Testes bioquímicos para identificação de Enterobacter cloacae: A. produção. de H 2 S negativa; B. Citrato positivo C. Uréia positiva D.TSI ácido/ácido. Em estudo realizado com baratas dentro das instalações de um hospital em Goiânia foram isoladas Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumonia, Serratia marcensces e Enterobacter aerogenes (PRADO et al. 2002). A Enterobacter cloacae é encontrada amplamente distribuída na água, esgoto, solo e vegetais justificando-se assim a presença desse micro-organismo no tomate analisado. Faz parte da microbiota entérica comensal e acredita-se que não causa diarréia; também está associada a uma variedade de infecções oportunistas que afetam as vias urinárias e o trato respiratório, podendo causar ferimentos cutâneos e septicemia (KONEMAN, 2008) Enterobacter cowanii Cinco colônias foram isoladas no meio Ágar sangue, dentre elas três nas amostras controle e duas após o tomate irradiado na dose de 1,0 kgy, com características bioquímicas ilustradas nas figuras 15 e A B C D Figura 15 - Prova de fermentação dos carboidratos para Enterobacter cowanii: 1. MIO negativo,2. LIA negativo, 3. Arabnose, 4. Rafnose, 5. Sorbitol, 6. Xilose, 7. Mio-inositol negativo. Figura 16 - Testes bioquímicos para identificação de Enterobacter cowanii: A. produção de H 2 S negativa; B. Citrato positivo C. Uréia D.TSI ácido/ácido.

57 36 Em estudo realizado em massa de pão de centeio, percebeu um aumento do composto folato e mais tarde foram identificadas duas bactérias produtoras de folato, a Enterobacter cowanii e a Pantoea agglomerans (KARILUOTO et al., 2006) Enterobacter intermedius Foi isolada uma colônia das amostras controle no meio Ágar sangue com características bioquímicas expressas nas figuras 17 e A B C D Figura 17 - Prova de fermentação dos carboidratos para Enterobacter intermedius: 1. MIO positivo, 2. LIA negativo,3. Arabnose, 4. Rafnose, 5. Sorbitol, 6. Xilose, 7. Mio-inositol negativo. Figura 18 - Testes bioquímicos para identificação de Enterobacter intermedius: A. produção de H 2 S negativa; B. Citrato positivo C. Uréia negativa D.TSI ácido/ácido. As bactérias Enterobacter intermedius são muito isoladas de água e solo (KONEMAN et al., 2008), o que justificaria a presença nas amostras de tomates analisadas. Em trabalho realizado com isolamento de enterobactérias em ovos produzidos em uma granja, foi isolado Enterobacter intermedius, Enterobacter sakazakii dentre outras, sugerindo a má sanitização do local de produção dos mesmos (MUSGROVE et al.,2009). Em 1999, o Departamento de qualidade da água do estado de Utah (EUA), em uma pesquisa feita na qualidade da água para beber, fez a contagem para colifirmes fecais e dentre eles encontraram Enterobacter intermedius, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, dentre outras Enterobacter sakazakii Para esta espécie de Enterobacter foi isolada uma colônia das amostras controle no meio Ágar sangue, com características bioquímicas representadas nas figuras 19 e 20.

58 A B C D Figura 19 - Prova de fermentação dos carboidratos para Enterobacter sakazakii: 1. Arabnose, 2. Rafnose, 3. Sorbitol negativo, 4. Xilose, 5. Mio-inositol. Figura 20 - Testes bioquímicos para identificação de Enterobacter sakazakii: A. produção de H 2 S negativa; B. Citrato positivo C. Uréia negativa D.TSI:ácido/ácido. Embora o reservatório deste micro-organismo não esteja bem caracterizado, um número crescente de relatos tem associado às fórmulas lácteas infantis em pó como fonte e veículo de infecção (IVERSEN; FORSYTHE, 2003). A taxa de mortalidade causada por Enterobacter sakazakii é alta (40-80%), e a infecção decorrente está associada à bacteremia, necrose enterocolítica e meningitis infantis (VAN ACKER et al., 2001). Enterobacter sakazakii é um ser patógeno oportunista em humanos que tem sido implicado em formas graves de septicemia (LAI, 2001). E. sakazakii é um patógeno emergente de origem alimentar que tem sido descoberto em muitos países desenvolvidos. É provável que exista uma subnotificação importante de infecções em todos os países (AIGBEKAEN; OSHOMA, 2010) Klebsiella oxytoca Em relação a este patógeno foram isoladas três colônias no meio Ágar sangue das amostras controle, com características bioquímicas exibidas abaixo nas figuras 21 e A B C D Figura 21 - Prova de fermentação dos carboidratos para Klebsiella oxytoca: 1.LIA positiva, 2. MIO negativo, 3. Arabnose, 4. Rafnose, 5. Sorbitol, 6. Xilose, 7. Mio-Inositol Figura 22 - Testes bioquímicos para identificação de Klebsiella oxytoca: A. indol positivo; B.Citrato positivo C. Uréia negativa D. TSI:ác/ác.

59 38 Infecções causadas por Klebsiella são a segunda causa mais freqüente de bacteremia dos Gram-negativos. Desde o início de 1980, isolados de Klebsiella oxytoca vem sendo reconhecidos como clinicamente significativos (AL-ANAZI et al.,2008; KORVICK et al.,1992; Wu SW et al., 1991). Em um estudo realizado no Hospital da Universidade de São Paulo em pacientes submetidos à colangiopancreatografia retrógrada endoscópica, foram coletadas amostras de sangue antes e após a realização do exame para a verificação da existência ou não de bacteremia e foram isoladas quatro cepas de Klebsiella oxytoca em amostras sanguíneas após a realização do exame (CAMPOS et al.,1997). Para verificar a contaminação de ambientes, utensílios e equipamentos de preparo de alimentos em serviço de alimentação hospitalar foram avaliadas 50 amostras coletadas pela técnica de swab. Após realização dos testes de identificação, encontram cepas de Klebsiella oxytoca em ambiente, equipamento e dieta enteral (PINTO et al. 2004) Klebsiella pneumoniae subespécie pneumoniae Desta espécie de bactéria foram isoladas três colônias das amostras controle no meio Ágar sangue com características bioquímicas ilustradas nas figuras 23 e A B C D Figura 23 - Prova de fermentação dos carboidratos para Klebsiella pneumoniae: 1. MIO negativo, 2. LIA positivo, 3. Arabnose, 4. Rafnose, 5. Sorbitol, 6. Xilose negativa, 7. Mionositol. Figura 24 - Testes bioquímicos de identificação para identificação de Klebsiella pneumoniae: A. indol negativo; B. Citrato positivo C. Uréia positiva D.TSI: ác/ác. Klebsiella faz parte dos coliformes e são importantes devido à sua capacidade de desenvolver reações indesejáveis nos alimentos (FRANCO; LANDGRAF, 2008).

60 39 As bactérias da espécie K. pneumoniae subespécie pneumoniae é isolada mais frequentemente de amostras clínicas. Pode causar uma variedade de infecções extrapulmonares, incluindo enterite e meningite, infecções urinárias e septicemia (KONEMAN et al., 2008). Uma síndrome característica surge quando o abcesso do fígado é acompanhado por bacteremia causada por K. pneumoniae e, por vezes, endoftalmite ou meningite. Isso normalmente é uma infecção adquirida na comunidade, que ocorre em pacientes com diabetes mellitus. Adiconalmente, K. pneumoniae tem sido reconhecida como uma possível causa para pneumonias adquiridas na comunidade (KO el al., 2002). Em um estudo colaborativo feito por cientistas do mundo, foram analisados 455 casos de pneumonia causada por Klebsiella pneumoniae. Eles concluiram que esta bactéria é um patógeno muito comum em hospitais. Podendo causar infecções do trato urinário, pneumonia nosocomial e infecções intra-abdominais (WEN-CHIEN et al., 2002) Kluyvera ascorbata Apenas uma colônia foi isolada das amostras controle no meio Ágar sangue com as características bioquímicas demonstradas nas figuras 25 e A B C D Figura 25 - Prova de fermentação dos carboidratos para Kluyvera ascorbata: 1. MIO positivo, 2. LIA positivo, 3. Arabnose, 4. Rafnose, 5. Sorbitol, 6. Xilose, 7. Mio-Inositol negativo Figura 26 - Testes bioquímicos para identificação de Kluyvera ascorbata: A. indol positivo; B. Citrato positivo C. Uréia negativa D.TSI: ác/ác. Kluyvera está presente no meio ambiente como um organismo de vida livre, na água, esgoto, pias hospitalares e alguns animais. Nos seres humanos, faz parte da microbiota normal do trato digestivo. Também pode ser encontrada na urina, muco, fezes e sangue (YOGEV;

61 40 KOZLOWSK,1990). Esta espécie tem sido cada vez mais encontrada em crianças hospitalizadas (CARTER et al., 2008). A presença dessa bactéria na água e no esgoto poderia justificar o aparecimento desses micro-organismos no material analisado. Foram observadas graves infecções em imunodeprimidos e imunocompetentes, envolvendo principalmente o trato gastrointestinal e urinário, tecidos moles, com alguns relatos de sepse, peritonite, além de infecções hospitalares (CARTER; EVANS, 2005) Pantoea agllomerans Em relação a esse micro-organismo foram isoladas duas colônias das amostras controle no meio Ágar sangue com as características bioquímicas ilustradas nas figuras 27 e A B C D Figura 27- Prova de fermentação dos carboidratos para Pantoea agglomerans: 1. MIO negativo, 2. LIA negativo, 3. Arabnose, 4. Rafnose negativa, 5. Sorbitol, 6. Xilose, 7. Mio- Inositol negativo Figura 28 - Testes bioquímicos para identificação de Pantoea agglomerans: A. indol positivo; B. Citrato positivo C. Uréia negativa D.TSI: alc/ác. As bactérias da espécie Pantoea agglomerans podem causar doença em casos raros. Ela foi encontrada em feridas de sangue e urina, como patógeno oportunista (ABBOTT, 1995; LAPORT et al., 2002; KRATZ et al., 2003). As bactérias da espécie Pantoea agglomerans são comumente encontrado em plantas, animais solo, água e alimentos. Embora raramente reconhecida como um agente de infecções hospitalares endógenas, podem causar epidemias entre os pacientes internados quando associado ao uso de produtos contaminados por via intravenosa devido à sua capacidade a crescer em fluidos de infusão comercial (FERNADES et al., 2000; BICUDO et al., 2007).

62 41 Drudy et al., (2006) em pesquisa feita em fontes ambientais e alimentos, várias espécies da família Enterobactereaceae, dentre elas Pantoea agglomerans e Enterobacter sakazakii Salmonella enterica subespécie houtanae Dessa espécie de enterobactéria foi isolada uma colônia no meio Ágar sangue proveniente das amostras controle e suas características bioquícas estão representadas nas figuras 29 e A B C D Figura 29 - Prova de fermentação dos carboidratos para Salmonella houtenae: 1. Arabnose 2. Rafnose negativa, 3. Sorbitol, 4. Xilose, 5. Mio-Inositol negativo. Figura 30 - Testes bioquímicos para identificação de Samonella houtenae: A. produção de H 2 S positiva; B.Citrato positivo C. Uréia negativa D.TSI: alc/ác. Em um estudo realizado entre no estado de São Paulo foram isolados diversos sorovares de salmonella, dentre elas a Salmonella enterica subespecie houtenae. (FERNADES et al., 2006), Em 2004, Lourenço et al., isolaram em uma homocultura feita em um paciente portador de HIV, a bactéria da espécie Salmonella enterica subespécie houtenae.o autor acreditam que este tenho sido o primeiro caso desse sorovar de Salmonella dessa espécie em humanos. Outro caso aconteceu com um menino com a doença granulomatose crônica, da pele e de culturas sanguíneas, as bactérias da espécie Salmonella enterica subespécie houtenae também estavam presentes num abscesso cerebral do paciente (MA et al.,2003).

63 Serratia marcescens Neste estudo foram isoladas duas colônias de S. marcescens das amostras controle no meio Ágar sangue com as características bioquícas ilustradas nas figuras 31 e A B C D Figura 31 - Prova de fermentação dos carboidratos para Serratia marcescens: 1. MIO positivo, 2. LIA positivo, 3. Arabnose 4. Rafnose, 5. Sorbitol positivo, 6. Xilose, 7. Mio-Inositol Figura 32 - Testes bioquímicos para identificação de Serratia marcescens: A. indol negativo; B. Citrato positivo C. Uréia negativa D.TSI: ác/ác. A espécie Serratia marcescens é considerada um importante patógeno humano em infecções do trato urinário, feridas cirúrgicas, pneumonia, meningites e bacteriemias (BERTHELOT et al., 1999). Em 1999, pesquisadores acompanharam os casos de infecção hospitalar durante sete meses em uma UTI neonatal de um Hospital Escola de Taiwan e detectaram 09 casos de infecção por Serratia marcescens (JANG et al., 2000). Demaio et al., (1996) isolaram S. marcescens na microbiota intestinal de mosquitos, o que poderia revelar a presença desses insetos no local de armazenamento ou até mesmo no de distribuição mostrando a falta de cuidado na distribuição dos frutos avaliados Serratia odorífera biogrupo I Uma colônia de Serratia odorífera biogrupo I foi iosalada no Agar Sangue das amostras do grupo controle contendo as características bioquímicas representadas abaixo nas figuras 33 e 34.

64 A B C D Figura 33 - Prova de fermentação dos carboidratos para Serratia odorífera biogrupo.1. MIO positivo, 2. LIA positivo, 3. Arabinose, 4. Rafinose, 5. Sorbitol, 6. Xilose, 7. Mio-inositol negativo Figura 34 - Testes bioquímicos para identificação Serratia odorífera biogrupo 1: A. indol positivo, B. citrato positivo, C. uréia negativa, D. TSI ác/ác. Serratia odorifera biogrupo I foi raramente isolada de seres humanos, e infecção causada por este micro-organismo tem sido raramente documentada. Em 1992, o primeiro caso de sepse hospitalar devido a S. odorifera biogrupo 1 foi descrito (MERMEL; SPIEGEL, 1992). Chávez-Lopez et al.( 2006), isolaram diversas enterobactérias de queijo pecorino (queijo de ovelha), e dentre as cepas isoladas, encontaram Serratia odorífera biogrupo I e Enterobacter sakazakii. Outro estudo foi realizado no ar dentro de uma casa de engorda de aves numa fazenda na Polônia e diversas cepas do genêro Serratia foram isoladas, dentre elas Serratia odorífera, Serratia marcescens, Serratia ficaria dentre outras (VUCEMILO et al.,2005). Portanto, mesmo encontrada em nossos experimentos, essa espécie não representa danos (perigo) à saúde humana Shigella sonnei Apenas uma colônia foi isolada a partir das amostras controle no Agar Sangue contendo características bioquímicas demonstradas nas figuras 35 e A B C D Figura 35 - Prova de fermentação dos carboidratos para Shigella sonnei: 1. Arabnose positiva, 2. Rafnose 3. Sorbitol, 4. Xilose, 5. Mio-Inositol Figura 36 - Testes bioquímicos para identificação de Shigella sonnei: A. indol negativo; B.Citrato negativo C. Uréia negativa D.TSI: alc/ác.

65 44 Shigella sonnei é o sorotipo mais comumente associado a doenças diarréicas nos Estados Unidos. Foi o agente bacteriano mais comum associado com enfermidades epidêmicas transmitidas pela água entre 1986 e 1988 no mesmo país (KONEMAN et al., 2008). O que poderia justificar a presença de tais micro-organismos no tomate analisado. Em Sydney, entre janeiro e julho de 2000, 148 casos de infecções gastrointestinais causadas por S. sonnei foram relatados ao sudeste Unidade de Saúde Pública de Sidney (MCIVER et al., 2002). Durante julho e agosto de 1998, oito surtos associados à shigelose em restaurantes nos Estados Unidos e no Canadá foram causados por uma cepa comum de Shigella sonnei. Uma pesquisa epidemiológica constatou que os surtos eram devido à ingestão de salsa que vai como enfeite em cima dos alimentos (NAIMI et al., 2003). Vicalvi (2007), numa pesquisa realizada com tomate,melão cantaloupe, uva itália e melância encontrou em 30% das amostras cepas de Shigella flexneri. Esse dados mostram a necessidade de se higienizar melhor os alimentos desde o plantio até o momento da venda do produto Yersinia intermedia Foi isolada uma colônia no Agar Sangue a partir das amostras do controle com as características bioquímicas ilustradas nas figuras 37 e A B C D Figura 37 - Prova de fermentação dos carboidratos para Yersinia intermedia: 1. Arabnose, 2. Rafnose 3. Sorbitol, 4. Xilose, 5. Mio-Inositol negativo. Figura 38 - Testes bioquímicos para identificação de Yersinia intermedia: A. indol positivo; B. Citrato negativo C. Uréia positiva D.TSI: ác/ác.

66 45 Sinha et al., (2000) em um estudo feito em Déli, capital da Índia, coletaram 50 amostras de águas residuais, e pesquisaram a existência de Yersinia. Após estudo, foram identificadas cepas de Yersinia intermedia e Yersinia enterocolitica nos locais analisados. Ramiréz et al., (2000), realizaram uma pesquisa em 50 amostras de carnes comercializadas na Cidade do México, e encontraram 706 colônias de Yersinia nas carnes tanto cruas como pré-cozidas. Dessas colônias isoladas 49% eram cepas de Yersinia enterocolitica e 27% de Yersinia intermedia. Yucel e Ulusoy (2006) realizando um estudo em 200 lacticínios, entre leites e queijos, fizeram a contagem para bactérias do gênero Yersinia spp. Após a pesquisa encontram 7,2% e 7,1% de contaminação por Yersinia intermedia em leite e queijos respectivamente. As bactérias isoladas neste trabalho, em sua totalidade, 16 espécies de enterobactérias, provieram em sua maioria das amostras controle dos tomates. Após o uso da irradiação, apenas as bactérias da espécie Enterobacter cowanii resistiram à dose de 1,0 kgy. Dussault et al., (2009) em trabalho, encontraram Pantoea agglomerans após o uso da radiação. Avaliaram também o efeito da irradiação-γ sobre os ácidos graxos e muropeptídeos de duas cepas de Pantoea agglomerans e concluíram que os efeitos da irradiação na membrana bacteriana são percebidos e poderia desempenhar um papel importante na resposta celular e capacidade de sobreviver neste ambiente rígido Staphylococcus coagulase positiva e coagulase negativa As colônias que foram isoladas dos tomates pertencentes ao grupo controle e aos irradiados seguiram para os testes bioquímicos confirmatórios após a identificação presuntiva nos meios seletivos e diferenciais (Tabela 4). Com os testes bioquímicos foi possível confirmar a presença de Staphylococcus e identificar 11 espécies.

67 Tabela 4 - Características diferenciais dos Staphylococcus spp. (cocos Gram-positivos). Microorganismos S.arlettae (3) * S. aureus subespécie aureus (1) S. cohnii subespécie cohnii (1) S.equorum (1) S. fleuretti (7) S. gallinarum (2) S. intermedius (2) S. lugdunensis (1) S. saprophyticus subespécie bovis (1) S. succinus (7) S. xylosus (8) Glicose Maltose + + V 1 V + + V ND + Sacarose ND + Lactose V - V V V Manitol + + V + ND + V ND + Manose + + V Arabnose V ND V Trealose _ Xilose V ND + Rafnose V 1 - Uréia NT NT NT NT - + NT NT NT + + Polimixina B NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT S Novobiocina NT NT NT NT R NT NT NT R NT R Coagulase : positivo; -: negativo; NT: não testado; V: variável; V 1 : reação variável, porém com reações positivas lentas ou tardias; S: sensível; R: resistente; ND: não disponível; (*):número de cepas encontradas. 46

68 Staphylococcus arlettae Foram isoladas três colônias no Agar Sangue das amostras controle que se apresentavam brancas e puntiformes e as características bioquímicas estão demonstradas na figura Figura 39 - Glicose (1); Maltose (2); Sacarose (3); Lactose (4); Manitol (5); Manose (6); Arabnose (7); Trealose (8); Xilose(9); Rafnose(10). O Staphylococcus arlettae é encontrado em mamíferos, aves e é de comprovada importância clínica nos humanos (KONEMAN et al., 2008). Rajeev et al., (2009), em um estudo realizado com vacas mestiças leiteiras, coletou 100 amostras de leite e isolou 121 colônias de bactérias, 57,85% destas eram Gram-positivas, e delas a maioria eram cepas de Saphylococcus aureus, Staphylococcus arlettae, S. intermdius, S. equorum, dentre outras. Serapicos (2008), avaliou uma estação de tratamento de águas residuais, que recebe principalmente efluentes domésticos e isolou diversas espécies de Staphylococcus, dentre elas Staphylococcus arlettae, S. equorum e S. cohnii Staphylococcus aureus subespécie aureus Foi isolada uma colônia no Agar Sangue, que se apresentava branca e puntiforme, contendo as características bioquímicas ilustradas nas figuras 40 e 41. A cepa foi isolada das amostras do grupo controle.

69 Figura 40 - Glicose (1); Maltose (2); Sacarose (3); Lactose (4); Manitol (5); Manose (6); Arabnose (7); Trealose (8); Xilose(9); Rafnose(10). Figura 41- Prova da coagulase em tubo positiva. Xavier et al., (2007), realizou um estudo em uma creche de Natal-RN para pesquisar a prevalência de Satphylococcus aureus nas mãos dos 65 manipuladores de alimentos do estabelecimento e encontrou que 35,4% deles tinham essa bactéria nas mãos. E 73,84% deles não faziam o uso de antimicrobianos. Almeida Filho; Nader Filho (2000), realizaram um estudo em 80 amostras de queijo frescal comercializados em diversos pontos comerciais de Poços de Caldas-MG, e constataram que 40 amostras (50,0%) apresentaram contagens de Staphylococcus aureus acima de 10 3 UFC/g, valor este estabelecido como sendo o limite máximo permitido pelo Ministério da Saúde para o queijo tipo Minas "frescal" produzido industrialmente. Vicalvi (2007) encontrou em 30% das amostras analisadas de tomates e melão cantaloupe Staphylococcus aureus. Rosa et al., (2000) também observaram a presença de Staphylococcus aureus em amostras de vegetais minimamente processados, sugerindo altos riscos para a ocorrência de toxiinfecções alimentares.

70 Staphylococcus cohnii subespécie cohnii Apenas uma colônia foi ioslada no Agar Sangue das amsotras do grupo controle e se apresentava branca e puntiforme. As características bioquímicas estão representadas na figura Figura 42 - Glicose (1); Maltose (2); Sacarose (3); Lactose (4); Manitol (5); Manose (6); Arabnose (7); Trealose (8); Xilose(9); Rafnose(10). S. cohnii subespécie cohnii é amplamente encontrada em humanos, fazendo parte da microbiota normal da pele (KONEMAN et al. 2008). O que sugere uma contaminação cruzada com relação aos frutos analisados. Szewczyk et al., (2003) estudando o ambiente hospitalar, isolaram 159 cepas de S.cohnii suespécie cohnii do ambiente, 26 cepas da pele de prematuros hospitalizados e 49 cepas do pessoal da enfermaria. Soares et al. (2008), com o objetivo de isolar e identificar espécies de Staphylococcus spp. em 24 isolados clínicos oriundos de humanos, identificou que Staphylococcus cohnii subsp. cohnii foi a espécie mais prevalente no material analisado Staphylococcus equorum Foi isolada uma colônia no Agar Sangue que se apresentava branca e puntiforme e com características bioquímicas representadas na figura 43. Esta cepa foi oriunda das amostras controle analisadas.

71 Figura 43 - Glicose (1); Maltose (2); Sacarose (3); Lactose (4); Manitol (5); Manose (6); Arabnose (7); Trealose (8); Xilose(9); Rafnose(10). Nováková et al., (2006) fizeram testes confirmatórios para Staphylococcus novobiocina resistente, em 11 isolados clínicos de pacientes e confirmou a presença de Staphylococcus equorum em material clínico relevante. Cordero; Zumalacárregui (2000) estudaram a flora microbiana de sal utilizada na produção de presunto curado espanhol, dentre as 369 espécies de estafilococos encontradas, 18,55% foram de S.equorum. Coton et al., (2010) estudou a biodiversidade dos estafilococos coagulase-negativos, isolados na França a partir de queijos e de linguiças, sendo o número de cepas 227 e 204 respectivamente, e isto foi comparado com 297 isolados clínicos de humanos. Para amostras de alimentos relacionados, as principais espécies encontradas corresponderam a Staphylococcus equorum (28,5%) Staphylococcus fleuretti Desse micro-organismo foram isoladas sete colônias no Agar Sangue, sendo uma colônia isolada após a irradição dos tomates na dose de 1,5 kgy. Apresentavam-se brancas e puntiformes e com as características bioquímicas ilustradas na figura Figura 44 - Glicose (1); Maltose (2); Sacarose (3);Lactose (4); Manitol (5); Manose (6); Arabnose (7); Trealose (8);Xilose (9); Rafnose (10).

72 51 Em uma fazenda orgânica, leite, queijos, bem como swabs de ovelha e dos agricultores foram coletados. Seguindo os estudos para identificaçao, 13 espécies de bactérias foram identificadas, entre elas Staphylococcus fleuretti (EHRICHT et al., 2009). Bactéiras da espécie Staphylococcus fleuretti foram isoladas de queijos feitos a partir de leite de cabra cru (VERNOZY-ROZAND et al., 2000). Não foram encontrados relatos na literatura do isolamento de S.fleuretti em alimentos após o uso da radiação na dose de 1,5 kgy como neste trabalho Staphylococcus gallinarum Foram isoladas duas colônias no Agar Sangue a partir das amostras controle desse micro-organismo que se apresentavam brancas e puntiformes e contendo as características bioquímicas representadas nas figuras 45 e Figura 45 - Glicose (1); Maltose (2); Sacarose (3); Lactose (4); Manitol (5); Manose (6); Arabnose (7); Trealose (8); Xilose (9); Rafnose (10). Figura 46- Uréia positiva Nemoto et al., (2008) investigando uma possível rota peroral de endocardite infecciosa (EI), a ocorrência de Staphylococcus na cavidade oral, examinou amostras de saliva e placa supragengival de 56 adultos sistemicamente e periodontalmente saudáveis com idades entre anos de idade, e identificou 9 espécies de Staphylococcus em 344 isolados. Desses 1,8% eram Staphylococcus gallinarum. Yu et al., (2008) isolaram de um paciente com hepatite B crônica,partindo de amostras de sangue, bactérias da espécia Staphylococcus gallinarum. Paciente ferido com um prego de ferro foi isolado de amostras sanguíneas do mesmo, bactérias da espécie S. gallinarum (TIBRA et al., 2009).

73 Staphylococcus intermedius Dessa espécie de Staphylococcus foram isoladas duas colônias no Agar Sangue das amostras controle, que se apresentavam brancas e puntiformes. Suas características bioquímicas estão ilustradas nas figuras 47 e Figura 47 - Glicose (1); Maltose (2); Sacarose (3);Lactose (4); Manitol (5); Manose (6); Arabnose (7); Trealose (8); Xilose(9); Rafnose (10). Figura 48 - Coagulase positiva Encontrado como parte da microbiota de cães, bisões, cavalos, gatos esse microorganismo pode causar infecções urinárias, ósseas e do sistema nervoso central em várias espécies animais. S.intermedius é o estafilococo coagulase-positivo predominantemente isolado a partir de pele canina infectada e normal. Esse micro-organismo foi recuperado de feridas infectadas de seres humanos que foram mordidos por cães (KONEMAN et al., 2008; POTTUMARTHY et al., 2004) Staphylococcus lugdunensis Foi isolada uma colônia no Agar Sangue, que se apresentava branca e puntiforme, contendo as características bioquímicas ilustradas na figura Figura 49 - Glicose (1); Maltose (2); Sacarose (3);Lactose (4); Manitol (5); Manose (6); Arabnose (7);Trealose (8);Xilose(9);Rafnose(10).

74 53 Mariano (2000) realizou uma pesquisa em 481 amostras de leite de cabra para a identificação de estafilococos coagulase- positiva e estafilococos coagulase- negativa. Com a técnica do miniapi, foram identificadas cepas produtoras de enterotoxinas, dentre elas o S. lugdunensis. Andrade (2009) pesquisou em 300 amostras de queijo coalho a ocorrência de estafilococos coagulase-positiva e coagulase-negativa, e encontrou cepas de S. lugdunensis em 14% do material analisado Staphylococcus saprophyticus subespécie bovis Foi isolada uma colônia no Agar Sangue desse micro-organismo que se apresentava branca e puntiforme. Suas características bioquímicas estão demonstradas na figura Figura 50 - Glicose (1); Maltose (2); Sacarose (3); Lactose (4); Manitol (5); Manose (6); Arabnose (7); Trealose (8); Xilose (9); Rafnose (10). Schlegelova et al., (2008) em um estudo com Staphylococcus spp. isolados obtidos entre 2000 e 2006 a partir de leite, carne gêneros alimentícios produzidos a partir desses e as superfícies de processamento (usinas e fazendas) na República Checa, identificaram 23 espécies do gênero Staphylococcus, dentre eles Staphylococcus saprophyticus subespécie bovis Staphylococcus succinus Foram isoladas sete colônias no Agar Sangue, das quais, quatro após a irradiação do tomate na dose de 1,0 kgy. Apresentavam-se brancas e puntiformes e suas características bioquímicas estão representadas na figura 51.

75 Figura 51 - Glicose (1); Sacarose (2); Lactose (3); Manitol (4); Manose (5); Arabnose (6); Trealose (7); Xilose (8); Rafnose (9). Nováková et al., (2006) isolaram 5 cepas de Staphylococcus succinus que foram encontrados em isolados clínicos. Blaiotta et al., (2004) analisaram 109 cepas isoladas de queijos, salsichas, leite cru, carnes de aves crua e salame e encontraram 10 de Staphylococcus succinus. Não há relatos na literatura sobre o isolamento de Staphylococcus succinus após o uso da radiação na dose de 1,0 kgy em alimentos, como ocorreu com este trabalho Staphylococcus xylosus Foram isoladas oito colônias dessa espécie de Staphylococcus no Agar Sangue, que se apresentavam brancas e puntiformes. Suas características bioquímicas estão ilustradas nas figuras 52, 53 e 54e são semelhantes a relatos na literatura (KONEMAN et al.,2008) Figura 52 - Glicose (1); Maltose (2); Sacarose (3); Lactose (4); Manitol (5); Manose (6); Arabnose (7) ;Trealose (8); Xilose(9); Rafnose(10). 1 2 Figura 53 - Uréia positiva Figura 54 Resistência à novobiocina (1) e Sensibilidade à polimixina B (2).

76 55 Esse micro-organismo é encontrado tanto em homens quanto em outros primatas. Foi causa de infecções das vias urinárias inferiores e superiores e de endocardite associada ao uso de drogas endovenosas. Também já foi isolado a partir de sangue e bílis de um paciente com 11 anos de idade com transplante hepático e cardíaco (KONEMAN et al., 2008). Staphylococcus xylosus são comumente isolados de roedores, porém cepas dessa bactéria, assim como de Staphylococcus carnosus podem ser encontradas em produtos fermentados, como produtos cárneos (CIROLINI et al., 2009). Nesta pesquisa foram isoladas 11 espécies de estafilococos, sendo as espécies S. fleuretti e S. succinus isoladas também após o uso da radiação nos tomates analisados e as demais espécies das amostras controle. Duas espécies são coagulase-positivas, Staphylococcus aureus subespécie aureus e Staphylococcus intermedius. As demais são coagulase-negativa e apesar da legislação brasileira não estabelecer níveis de tolerância para os Staphylococcus coagulase negativo, algumas espécies desse grupo apresentam interesse médico por produzirem enterotoxinas, dentre estas estão S. capitis, S. conhnii subsp cohnii, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. saprophyticus, S. schleiferi, S. warneri, S. xylosus e S. chromogenes, (BORGES et al., 2008), algumas delas isoladas e identificadas neste trabalho. O isolamento desses micro-organismos nos tomates sugere a manipulação inadequada dos mesmos, desde o momento do plantio até o pós-colheita Determinação do Perfil de Resistência e Sensibilidade dos micro-organismos isolados Susceptibilidade de Enterobactérias Foram testados os 43 micro-organismos divididos em 16 espécies para a avaliação do perfil de sensibilidade aos antimicrobianos. Dessas cepas, três de Enterobacter cowanii foram isoladas após o uso da radiação, as demais cepas foram isoladas das amostras do grupo controle. Das 43 cepas isoladas de enterobactérias, todas foram sensíveis à Cefotaxima, Cefepime, Gentamicina, Tetraciclina e Ciprofloxacina. E mostraram maior resistência à Cefoxitina e Ampicilina como indicado na tabela 5. Foram considerados micro-organismos multirresistentes aqueles que apresentam resistência a dois ou mais grupos de antibióticos seguindo os critérios de TEXEIRA et al., 2004.

77 Tabela 5 - Susceptilidade das Enterobactérias frente os antimicrobianos testados Microorganismos AMP CFL CFA CTX CPM GEN TET CIP AMC R RI S R RI S R RI S R RI S R RI S R RI S R RI S R RI S R RI S C.freundii C.youngae E.aerogenes E.cloacae 37,5-62, ,5 12, E.cowanii E.intermedius E.sakazakii K.oxytoca K.pneumoniae K.ascorbata P.agglomerans S.houtenae S.marcescens S.odorifera S.sonnei Y.intermedia S: sensível; R: resistente; RI: resistência intermediária; AMP: Ampiciina; CFL: Cefalotina; CFA: Cefoxitina; CTX: Cefotaxima; CPM: Cefepime; GEN: Gentamicina; TET: Tetraciclina; CIP: Ciprofloxacina; AMC: Amoxicilina+ ác. clavulânico. 56

78 Klebsiella oxytoca Das três cepas isoladas de K.oxytoca todas vieram das amostras controle. Uma mostrou-se sensível a todos os antimicrobianos testados, uma mostrou resistência à Ampicilina (Figura 55) e a outra apresentou resistência intermediária à Ampicilina Figura 55 - Resistência de Klebsiella oxytoca à Ampicilina como indicado na seta vermelha 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7. ciprofloxacina, 8. tetraciclina, 9. amoxicilina+ácido clavulânico Klebsiella pneumoniae Foram testadas a susceptibilidade de cinco cepas isoladas de K. pneumoniae subespécie pneumoniae a partir das amostras controle dos frutos, dessas 2 foram sensíveis a todos os antimicrobianos, duas apresentaram resistência intermediária à Ampicilina e uma foi resistente à ampicilina (Figura 56) e sensível aos demais antibióticos Figura 56 - Resistência de Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae à Ampicilina como indicado na seta vermelha. 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7. ciprofloxacina, 8. tetraciclina, 9. amoxicilina+ácido clavulânico.

79 58 Gales (1997) avaliou a sensibilidade de amostras de K. pneumoniae coletadas no Hospital São Paulo à ciprofloxacina e identificou que 100% das amostras eram sensíveis a esta droga, resultados também encontrados neste estudo. Klebsiella pneumoniae representa um importante patógeno em episódios gastrentéricos no homem e nos animais, com elevados índices de resistência e multirresistência aos antimicrobianos, especialmente em casos de bacteriemia e pneumonia em pacientes hospitalizados (LINCOPAN et al., 2005) Enterobacter cloacae Oito cepas desse micro-organismo isoladas das amostras controle foram testadas frente os antimicrobianos e três foram resistentes à Ampicilina, quatro foram resistentes à Cefalotina e três apresentaram resistência intermediária, sete foram resistentes à Cefoxitina, quatro foram resistentes à Amoxicilina + Ácido clavulânico e duas apresentaram resistência intermediária ao mesmo Figura 57 - Resistência de Enterobacter cloacae à Ampicilina, cefoxitina e amoxicilina+ácido clavulânico e resistência intermediária à Cefalotina como indicado nas setas vermelhas: 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7.ciprofloxacina, 8. tetraciclina, 9. amoxicilina+ácido clavulânico. Calil et al.(2001), em um estudo feito em 4 fases,encontrou na primeira fase, 32% dos pacientes colonizados por bactérias multirresistentes, principalmente Enterobacter cloacae. Pela sua alta incidência, esta bactéria foi considerada o principal marcador de resistência no estudo. Na segunda fase, 33% eram colonizados por Enterobacter, mas apenas 10,8% com cepas multirresistentes. Na terceira etapa do estudo, a E. cloacae foi isolada em apenas 18 pacientes, dentre 162 com cultura positiva. Além disso, apenas duas cepas de E.cloacae foram multirresistentes. Desde então, em média, foram identificadas duas cepas de Enterobacter

80 59 cloacae multirresistentes a cada ano. Esses resultados estão iguais aos encontrados neste trabalho no que diz respeito à multirresistência de E.cloacae a antibióticos Enterobacter cowanii Foram estudadas cinco cepas e delas, três foram isoladas após o uso da radiação nos tomates estudados. Das amostras controle duas cepas apresentaram resistência intermediária à Ampicilina e uma resistência intermediária à Cefalotina. Nas amostras que foram irradiadas, as três cepas isoladas se apresentaram resistentes à Ampicilina Figura 58 - Resistência de Enterobacter cowanii à Ampicilina como indicado na seta vermelha. 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7.ciprofloxacina, 8. tetraciclina, 9. amoxicilina+ácido clavulânico Enterobacter sakazakii Uma cepa de E. sakazakii que foi isolada da amostra controle foi testada e apresentou resistência à Cefoxitina e amoxicilina+ácido clavulânico e resistência intermediária à Ampicilina (Figura 59) Figura 59 - Resistência intermediária de Enterobacter sakazakii à Ampicilina e resistência à Cefoxitina e Amoxicilina+ácido clavulânico como indicado nas setas vermelhas. 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7.ciprofloxacina, 8. tetraciclina, 9. amoxicilina+ácido clavulânico.

81 Enterobacter aerogenes Uma cepa de E. aerogenes que foi isolada da amostra controle foi testada e apresentou resistência à Ampicilina e Cefoxitina (Figura 60) Figura 60- Resistência de Enterobacter aerogenes à Ampicilina e Cefoxitina como indicado nas setas vermelhas. 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7. ciprofloxacina, 8. tetraciclina, 9. amoxicilina+ácido clavulânico Enterobacter intermedius Uma cepa de E. intermedius foi isolada do grupo controle e quando testada apresentou resistência à Ampicilina e Cefoxitina (Figura 61) Figura 61 - Resistência de Enterobacter intermedius à Ampicilina e Cefoxitina e resistência intermediária à Cefalotina como indicado nas setas vermelhas. 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7.ciprofloxacina, 8. tetraciclina, 9. amoxicilina+ácido clavulânico.

82 Citrobacter freundii Cinco cepas de C. freundii foram isoladas das amostras controle e testadas. Duas apresentaram resistência intermediária à Cefalotina e Cefoxitina e três resistência à Cefoxitina (Figura 62) Figura 62 - Resistência intermediária de C. freundii à Cefalotina e resistência à Cefoxitina como indicado nas setas. 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7.ciprofloxacina, 8. tetraciclina, 9. amoxicilina+ácido clavulânico Citrobacter youngae Foram isoladas e testadas quatro cepas de C. freundii isoladas das amostras controle frente os antibióticos e duas foram sensíveis a todos antibióticos testados, uma apresentou resistência intermediária à Ampicilina, Cefalotina e Cefoxitina (Figura 63) e outra resistência intermediária à Cefalotina e Cefoxitina Figura 63 - Resistência intermediária de C. youngae à Ampicilina, Cefalotina e Cefoxitina como indicado nas setas vermelhas. 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7.ciprofloxacina, 8. tetraciclina, 9. amoxicilina+ácido clavulânico.

83 Serratia marcescens As duas cepas de Serratia marcescens isoladas das amostras controle apresentaram resistência à Cefalotina e sensibilidade aos demais antibióticos (Figura 64) Figura 64 - Resistência de Serratia marcescens a Cefalotina. 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7. tetraciclina, 8. ciprofloxacina 9. amoxicilina+ácido clavulânico Serratia odorifera biogrupo I A cepa de Serratia odorifera biogrupo I isolada da amostra controle apresentou resistência intermediária à Ampicilina e sensibilidade aos demais antibióticos (Figura 65) Figura 65 - Resistência intermediária de Serratia odorifera biogrupo I à Ampicilina como indicado na seta vermelha. 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7. tetraciclina, 8. ciprofloxacina, 9. amoxicilina+ácido clavulânico. Para as espécies Citrobacter freundii, Enterobacter spp e Serratia spp, a indução à produção de beta-lactamase AmpC pode ser observada com antibióticos como: ampicilina, amoxicilina, cefalosporinas de espectro reduzido e cefoxitina, que também sofrem a ação

84 63 dessa mesma enzima, gerando seleção de bactérias resistentes a essas drogas (ROSSI; ANDREAZZI, 2005). Isso justifica a resistência de tais micro-organismos nos frutos analisados Pantoea agglomerans As três cepas de Pantoea agglomerans isoladas a partir das amostras controle foram sensíveis a todos os antimicrobianos testados (Figura 66) Figura 66 - Sensibilidade de Pantoea agglomerans frente os antibióticos testados. 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7. tetraciclina, 8. ciprofloxacina, 9. amoxicilina+ácido clavulânico Kluyvera ascorbata A cepa de Kluyvera ascorbata isolada da amostra controle foi sensível a todos os antimicrobianos testados (Figura 67) Figura 67 - Sensibilidade de Kluyvera ascorbata frente os antibióticos testados. 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7. tetraciclina, 8. ciprofloxacina, 9. amoxicilina+ácido clavulânico.

85 Shigella sonnei A cepa de Shigella sonnei isolada a partir da amostra controle dos frutos analisados foi sensível a todos os antimicrobianos testados (Figura 68) Figura 68 - Sensibilidade de Shigella sonnei frente os antibióticos testados. 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7. tetraciclina, 8. ciprofloxacina 9. amoxicilina+ácido clavulânico Salmonella enterica subespécie houtenae A cepa isolada de Salmonella enterica subespécie houtenae que foi isolada da amostra controle foi resistente à Cefoxitina e sensível aos outros antimicrobianos testados (Figura 69) Figura 69 - Resistência de Salmonella entérica subespécie houtenae à Cefoxitina como incicado na seta vermelha. 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7. tetraciclina, 8. ciprofloxacina 9. amoxicilina+ácido clavulânico.

86 Yersinia intermedia A cepa de Yersinia intermedia isolada a partir da amostra controle foi sensível a todos os antimicrobianos testados (Figura 70) Figura 70 - Sensibilidade de Yersinia intermedia aos antibióticos testados. 1. ampicilina, 2. cefalotina, 3. cefoxitina, 4. cefotaxima, 5. cefepime, 6. gentamicina, 7. tetraciclina, 8. ciprofloxacina 9. amoxicilina+ácido clavulânico. O uso indiscriminado de antibióticos em várias práticas, incluindo as práticas médicas, veterinárias e agrícolas, resultam em uma pressão seletiva sobre as bactérias, contribuindo para a seleção de micro-organismos com os padrões de resistência aos antibióticos. A presença e resistência de bactérias resistentes aos antibióticos tem sido descrita em diversos ambientes, incluindo solos, as águas superficiais e de consumo e alimentos e representa um problema crescente de saúde pública (ZAMORA et al., 2006). Com isso, pode-se se justificar a presença de micro-organismos resistentes ou multirresistentes neste trabalho. As enterobactérias representam no ambiente hospitalar, um grande problema a ser enfrentado, principalmente por apresentarem resistência a várias classes de antimicrobianos, dificultando assim, a conduta terapêutica. Estudos de vigilância de resistência aos antimicrobianos nestes ambientes demonstram que em países da América Latina a resistência em bacilos Gram-negativos é mais preocupante que em Gram-positivos (SADER, 2000).

87 Susceptibilidade dos Staphylococcus spp. Foram testados os 34 micro-organismos divididos em 11 espécies, desses, cinco cepas, uma de S.fleuretti e quatro de S. succinus foram isoladas após o emprego da radiação nas amostras de tomate. A seguir foram analisadas e identificadas para a avaliação do perfil de sensibilidade aos antimicrobianos. As 34 cepas que foram isoladas de Staphylococcus spp. foram 100% sensíveis a Ciprofloxacina e Gentamicina e foram mais resistentes à Penicilina (45,45%) e Tetraciclina (36,36%) (Tabela 6). Foram considerados micro-organismos multirresistentes aqueles que apresentam resistência a dois ou mais grupos de antibióticos segundo os critérios de TEXEIRA et al., 2004.

88 Micro - organismos Tabela 6 - Suceptibilidade dos Staphylococcus spp. frente os antimicrobianos testados PEN OXA TET CIP LNZ CLI ERI GEN CLO R RI S R RI S R RI S R RI S R RI S R RI S R RI S R RI S R RI S S. arlettae S. aureus S. cohnii S. equorum S. fleuretti 14,29-85,71 14,29-85,71 14,29-85, ,29 85, S. gallinarum S. intermedius S. lugdunensis S. saprophyticus subsp. bovis S. succinus 28,58-71, ,29-85, S. xylosus 12,5-87, ,5-87, R: resistente; RI: resistência intermediária; S: sensível; %: percentagem de sensibilidade, resistência ou resistência intermediária aos antibióticos testados; PEN: Penecilina; OXA: Oxacilina; TET: Tetraciclina; CIP: Ciprofloxacina; LNZ: Linezolida; CLI: Clindamicina; ERI: Eritromicina; GEN: Gentamicina; CLO: Cloranfenicol. 67

89 Staphylococcus cohnii subespécie cohnii Uma cepa de S. cohnii foi isolada da amostra controle e testada apresentando resistentência à Penicilina e resistência intermediária à Eritromicina (Figura 71) Figura 71 - Resistência de S. cohnii subespécie cohnii à Penicilina e resistência intermidária à Eritromicina como indicado nas setas. 1. penicilina, 2.oxacilina, 3.tetraciclina, 4.ciprofloxacina, 5.linezolida, 6. clindamicina, 7. eritromicina, 8. gentamicina 9. cloranfenicol. Das 16 cepas de Staphylococcus coagulase-negativa isoladas de queijo tipo coalho, 93,8% apresentaram resistência à Tetraciclina, 81,2% à Eritromicina, 56,2% à Oxacilina, 43,8% à Gentamicina, 25% ao Sulfasotrin e 18,8% à Cefalotina (RAPINI et al., 2004). Essas porcentagens superaram as descritas para Penicilina G (69,2%) e (74,4%) e para Eritromicina (25%) e (2,3%) segundo Oliveira et al. (1999) e Sena (2000), respectivamente, para Cefalotina(13,5%) e Gentamicina (2%) (Oliveira et al., 1999) e para Oxacilina (41,9%) (Sena, 2000). Sensibilidades de cepas isoladas de queijos à Gentamicina (100%) (Sena, 2000; Rapini et al., 2003) e ao Sulfasotrin (96%) e à Cefalotina (84%) (Rapini et al., 2003) foram também descritas. Igualmente a este trabalho 100% das cepas estudadas nesta pesquisa foram sensíveis à Gentamicina Staphylococcus fleuretti Sete cepas de S. fleurretti foram testadas, sendo uma isolada após o uso da radiação no tomate, apresentando resistentência à Penicilina, Oxacilina (Figura 72). Quatro foram sensíveis a todos antibióticos, uma apresentou resistência à Tetraciclina e uma resistência intermediária à Eritromicina.

90 Figura 72 - Resistência de S. fleuretti à Penicilina e Oxacilina como indicado nas setas. 1. penicilina, 2. oxacilina, 3. tetraciclina, 4. ciprofloxacina, 5. linezolida, 6.clindamicina, 7. eritromicina, 8. gentamicina 9. cloranfenicol Staphylococcus succinus Sete cepas de S.succinus foram testadas, sendo quatro isoladas após o uso da radiação no tomate, com uma delas apresentando resistentência à Penicilina. Cinco foram sensíveis a todos antibióticos e uma apresentou resistência à Penicilina e Eritromicina (Figura 73) Figura 73 - Resistência de S.succinus à Penicilina e Eritromicina como indicado nas setas. 1. penicilina, 2.oxacilina, 3. tetraciclina, 4. ciprofloxacina, 5. linezolida, 6. clindamicina, 7. eritromicina, 8. gentamicina 9. cloranfenicol Staphylococcus xylosus Oito cepas de S. xylosus que foram isoladas a partir do grupo controle, foram testadas sendo seis sensíveis a todos antibióticos, uma apresentou resistência à Tetraciclina e outra à Ampicilina (Figura 74).

91 Figura 74 - Resistência de S. xylosus à Penicilina como indicado na seta vermelha. 1. penicilina, 2. oxacilina, 3. tetraciclina, 4. ciprofloxacina, 5. linezolida, 6. clindamicina, 7. eritromicina, 8. gentamicina 9. cloranfenicol Staphylococcus gallinarum Duas cepas de S.gallinarum isoladas a partir das amostras controle de tomate foram testadas, sendo todas sensíveis aos antibióticos testados (Figura 75) Figura 75 - Sensibilidade de S. gallinarum a todos antibióticos. 1. penicilina, 2. oxacilina, 3. tetraciclina, 4. ciprofloxacina, 5. linezolida, 6. clindamicina, 7. eritromicina, 8. gentamicina 9. cloranfenicol Staphylococcus arlettae Três cepas de S.arlettae foram isoladas das amostras controle e testadas, tendo uma cepa com multirresistência e uma resistente à Tetraciclina e Cloranfenicol (Figura 76).

92 Figura 76 - Resistência de S. arlettae à Penicilina, Oxacilina, Linezolida, Clindamicina e Eritromicina como indicado nas setas. 1. penicilina, 2. oxacilina, 3. tetraciclina, 4. ciprofloxacina, 5. linezolida, 6. clindamicina, 7. eritromicina, 8. gentamicina 9. cloranfenicol. A presença de micro-organismos resistentes a antibióticos está diretamente relacionada ao o uso indiscriminado de agentes antimicrobianos no tratamento de doenças humanas, bem como na pecuária, onde são muito utilizados para aumento da eficiência alimentar e das taxas de crescimento em animais de diferentes espécies. Mais recentemente, cepas de bactérias multirresistentes foram responsáveis por diversos surtos em todo o mundo e o arsenal terapêutico tem se tornado cada vez mais escasso. Em humanos, geralmente as infecções causadas por essas cepas são mais graves, aumentando os custos e o tempo do tratamento (SANTOS et al, 2006). O aumento e a disseminação de micro-organismos multirresistentes em ambiente hospitalar é de grande preocupação e continua a desafiar o controlador de infecção e as práticas epidemiológicas. A freqüência com que a contaminação cruzada ocorre varia de 13 a 34,6%. A situação é preocupante quando se observa que a prevalência de infecções hospitalares envolvendo bactérias multirresistentes tem continuamente aumentado em muitos paises desde a década de 80. Bactérias multirresistentes têm se tornado endêmicas em vários hospitais, até mesmo quando implementadas medidas de controle (FERREIRA et al., 2011; BOYCE et al.,1997).esses relatos justificam a presença de micro-organismos resistentes ou até multirresistentes neste trabalho.

93 Staphylococcus saprophyticus subespécie bovis Uma cepa de S. saprophyticus subespécie bovis foi isolada da amostra controle e testada apresentando-se sensível a todos antimicrobianos (Figura 77) Figura 77 - Sensibilidade de S.saprophyticus subespécie bovis aos antimicrobianos testados. 1. penicilina, 2. oxacilina, 3. tetraciclina, 4. ciprofloxacina, 5. linezolida, 6. clindamicina, 7. eritromicina, 8. gentamicina, 9. cloranfenicol Staphylococcus equorum Uma cepa de S. equorum isolada da amostra do grupo controle foi testada, e apresentou sensibilidade a todos antimicrobianos (Figura 78) Figura 78 - Sensibilidade de S.equorum aos antimicrobianos testados. 1. penicilina, 2. oxacilina, 3. tetraciclina, 4.ciprofloxacina, 5. linezolida, 6. clindamicina, 7. eritromicina, 8. gentamicina, 9. cloranfenicol.

94 Staphylococcus lugdunensis Uma cepa de S. lugdunensis isolada da amostra controle foi testada e apresentou resistência à Tetraciclina (Figura 79) Figura 79 - Resistência de S.lugdunensis à Tetraciclina como incicado na seta. 1. penicilina, 2.oxacilina, 3. tetraciclina, 4. ciprofloxacina, 5. linezolida, 6. clindamicina, 7. eritromicina, 8. gentamicina 9. cloranfenicol Staphylococcus aureus subespécie aureus Uma cepa de S. aureus subespécie aureus foi isolada da amostra controle e testada. Apresentou resistência intermediária à Eritromicina (Figura 80) Figura 80 - Resistência intermediária de S.aureus à Eritromicina como incicado na seta. 1. penicilina, 2. oxacilina, 3. tetraciclina, 4. ciprofloxacina, 5. linezolida, 6. clindamicina, 7. eritromicina, 8. gentamicina 9. cloranfenicol. Antes da introdução dos antimicrobianos na prática clínica, a letalidade da bacteriemia por Staphylococcus aureus ultrapassava 80%, e mais de 70% dos pacientes desenvolviam infecções metastática. No final dos anos 1960, as taxas de resistência tanto hospitalares como comunitárias chegavam a 90% e 70%, respectivamente, em algumas regiões da Europa.

95 74 Atualmente, a maioria dos S. aureus que causam infecção ou simplesmente colonizam adultos saudáveis é resistente à penicilina (MIMICA; MENDES, 2007). Castro et al., (2009) em uma pesquisa com 34 cepas isoladas de S. aureus retratou que três isolados apresentaram o fenótipo de multirresistência, ou seja, além da resistência aos β-lactâmicos foram resistentes a outras três classes de drogas. A resistência a várias drogas não β-lactâmicas também foi relatada por Idrees et al. (2009). As drogas não β-lactâmicas para as quais um maior número de isolados foi resistente foram gentamicina, azitromicina e ciprofloxacina. Gandra et al., (2009), estudou cepas isoladas de embutidos e queijos colonais e observou que 100% das cepas foram resistentes aos antibióticos ampicilina, vancomicina, cefloxatina e penicilina, sendo que uma cepa de estafilococos coagulase-positiva, originária de embutidos, demonstrou resistência a oito antibióticos diferentes. Sensibilidade intermediária aos antibióticos clindamicina, ciprofloxacina e eritromicina foi apresentada por 81,8% das cepas e 72,7% ao cloranfenicol. É importante destacar que cepas com sensibilidade intermediária apresentam o potencial para se tornar resistentes. Todas as cepas testadas apresentaram-se sensíveis apenas ao antibiótico sulfazotrim, utilizado em tratamentos para infecções urinárias, e 81,8% à cefalotina. As cepas de S. aureus e S. cohnii isoladas neste trabalho apresentaram 100% de resistência intermediária à eritromicina, 100 % das cepas de S. cohnii foram resistentes à penicilina, resultado semelhante ao trabalho apresentado por Gandra et al., contudo 100% das cepas foram sensíveis à clindamicina, ciprofloxacina e gentamicina diferentemente das cepas estudadas pelo referido autor Staphylococcus intermedius Duas cepas de S.intermedius foram isoladas das amostras controle e testadas, apresentando-se sensíveis a todos os antimicrobianos testados (Figura 81).

96 Figura 81 - Sensibilidade de S. intermedius a todos antibióticos testados. 1. penicilina, 2. oxacilina, 3. tetraciclina, 4. ciprofloxacina, 5. linezolida, 6. clindamicina, 7. eritromicina, 8. gentamicina, 9. cloranfenicol Os dois principais fatores envolvidos no desenvolvimento da resistência aos antibióticos em bactérias são a pressão seletiva e a presença de genes de resistência (WITTE, 2000). Os genes que codificam resistência aos antimicrobianos podem estar localizados no cromossomo ou nos plasmídios. O DNA cromossômico é relativamente mais estável, enquanto que o DNA plasmidial é facilmente transportado de uma linhagem para outra por conjugação bacteriana, permitindo uma transferência de genes em conjunto incluindo os de resistência a antimicrobianos (KONEMAN et al., 2008). Esses fatores justificam a resistência dos Staphylococcus spp. aos antimicrobianos testados neste trabalho. 4.4 Avaliação do tempo de vida de prateleira A avaliação do tempo de vida de prateleira dos tomates antes e após o uso da radiação foi feita a partir da observação dos aspectos visuais dos frutos quanto ao início do apodrecimento do mesmo. Os frutos foram observados de sete em sete dias e em seguida mês a mês. Os frutos considerados como grupo controle do primeiro lote estiveram viáveis, sem sinais de apodrecimento por no máximo um mês embalados em papel filme estéril e armazenados na temperatura ambiente ± 25 ºC. Observou-se que na dose de 1,0 kgy houve uma indução do prologamento na vida de prateleira de mais 14 dias. Quando utilizada a dose de 1,5 kgy, houve um acréscimo de 30 dias na vida de prateleira em comparação com o grupo controle. Para a dose de 2,0 kgy, os tomates tiveram uma vida útil de 92 dias (Figura 82).

97 76 Germano; Wiendl (1996) observaram em abacates da variedade Fortuna que as radiações induziram um prolongamento na vida de prateleira que na testemunha era de sete dias, para 11,2 dias quando irradiados com a dose de 75 Gy e para 15,2 dias se irradiados com 100 Gy doses bem abaixo das utilizadas neste trabalho. Figura 82 - Tempo de prateleira do Lote 1, 2 e 3. Na análise do segundo lote de frutos, o lote considerado menos contaminado pelas análises estatísticas, a duração dos tomates do grupo controle foram de 40 dias. Para a dose de 1,0 kgy houve um aumento de 15 dias em relação aos frutos controle. Quando aplicada a dose de 1,5 kgy, o tempo de vida dos frutos foi de 70 dias e para a dose de 2,0 kgy os frutos permaneceram por 106 dias, partindo da data inicial do experimento. O terceiro e último lote, foi o lote mais contaminado, e o tempo de vida dos frutos não foi maior que os encontrados nos lotes anteriores, tendo o grupo controle a permanência de 14 dias. Quando aplicada a dose de 1,0 kgy nos frutos, houve o acréscimo de 10 dias em relação ao grupo controle. Na dose de 1,5 kgy observou-se que os frutos duraram 35 dias partindo do dia inicial do experimento e para os tomates que foram irradiados a 2,0 kgy a duração foi de 45 dias a contar da data inicial do experimento.

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