Fosforilação oxidativa

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1 Fosforilação oxidativa A fosforilação oxidativa é um processo metabólico em que as enzimas/transportadores envolvidos são proteínas da membrana interna da mitocôndria que, no seu conjunto, catalisam a formação de (a partir de ADP + ) e a oxidação do NADH (e do FADH 2 ) pelo oxigénio molecular. 2,5 ADP + 2,5 2,5 + 2,5 H 2 ( G +125 KJ; endergónico) NAD ½ 2 H 2 + NAD + ( G -214 KJ; exergónico) Peter Mitchell, A máquina de acoplagem está na membrana interna da mitocôndria A componente exergónica do processo é a oxidação do NADH pelo oxigénio. Porque o potencial de oxi-redução do par redox 2 /H 2 é muito positivo (Eº = + 0,815) e o do par NADH/NAD + tem um valor negativo elevado (Eº = - 0,315) os electrões têm tendência a moverem-se do NADH para o 2. processo de oxidação do NADH pelo oxigénio é catalisado por 3 complexos proteicos (I, III e IV) que usam a energia libertada no processo oxidativo para bombear (contra gradiente) protões da matriz da mitocôndria para o espaço intermembranar. A porina da membrana externa da mitocôndria permite a passagem de moléculas com massa g/mol existe equilíbrio (igual ph) entre o espaço intermembranar e o citosol. NAD ½ 2 H 2 + NAD + Eº = 1,13 V Keq = 1,7 * atm -1/2 Gº = -217 KJ NADH

2 Quantos protões são bombeados da matriz para a mitocôndria quando um NADH é oxidado por um átomo de oxigénio? Actualmente pensa-se que poderão ser 10. Complexo I: NAD + Q + 4 (dentro) NAD + + QH2 + 4 (fora) Complexo III: QH2 + 2 Cyt c (Fe 3+ ) + 2 (dentro) Q + 2 Cyt c (Fe 2+ ) + 4 (fora) Complexo IV: 2 Cyt c (Fe 2+ ) + ½ (dentro) H Cyt c (Fe 3+ ) + 2 (fora) H + Actividade dos complexos I, III e IV da cadeia respiratória: xidação do NADH pelo oxigénio NAD ½ 2 H 2 + NAD + e transporte acoplado de protões 10 (dentro) 10 (fora) matriz I Q III cyt c IV H2 NADH NAD + ½ 2 + NAD + 10 (dentro) H 2 + NAD (fora) processo de bombeamento de protões cria na mitocôndria um gradiente eléctrico (positivo no lado externo) e químico (maior [ ] no lado externo). Criado o gradiente electroquímico os protões têm tendência a passar do citosol para a matriz mas, apesar da pequenez da partícula, o processo não ocorre por difusão simples (a carga positiva dos protões impede a sua dissolução nos lipídeos da membrana). A síntase do (ou complexo V) é visível por Microscopia Electrónica e os protões podem regressar à matriz através do seu componente Fo. A síntase do funciona como a turbina de uma barragem: a passagem dos protões a favor do gradiente electroquímico fornece a energia necessária para a síntese de. A síntase do permite fazer a acoplagem entre o processo de transporte de protões (a favor do gradiente electroquímico; exergónico) e a síntese de (processo endergónico) As duas actividades da síntase do (transporte de protões e síntese de ) são indissociáveis: embora ainda não se saiba com rigor o número de protões que são transportados pela síntase do (Fo + F1) crê-se que podem ser 3: ADP (fora) + H (dentro)

3 s processos celulares em que se hidrolisa ocorrem quase todos no citoplasma. + H 2 ADP + Para que o processo de síntese de possa ocorrer tem de entrar para dentro da mitocôndria o ADP e o formados. 3 transportador de é um simporter: cada que entra é acompanhado por um. Admitindo acoplagem perfeita entre fosforilação na síntase do e oxidação do NADH pelo oxigénio quantos s se podem formar quando um NADH é oxidado por um átomo de oxigénio ( ½ de 2 )? Cadeia respiratória: ½ 2 + NAD + 10 (dentro) H 2 + NAD (fora) Síntase do + simporter do + antiporter ADP/: ADP (fora) + H (dentro) matriz I Q III cyt c IV 10 V Simp. + 3 Quantos entram na mitocôndria para que possa ocorrer a síntese de 1? Actualmente crê-se que devem ser 4 (3 na síntase e 1 no simporter do ). NADH NAD + H2 NADH Razão P: = 2,5 2,5 ADP + 2,5 2,5 Se acoplagem perfeita: oxidação de 1 NADH por 1 = 2,5 A desidrogénase do succinato (complexo II) e a desidrogénase do glicerol-3-p não são bombas, contêm FAD como grupo prostético e reduzem a coenzima Q sem a participação do complexo I. Glicerol-3-P + Q di-hidroxiacetona-p + QH2 Cadeia respiratória: ½ 2 + FADH (dentro) H 2 + FAD + 6 (fora) Síntase do + simporter do + antiporter ADP/: ADP (fora) + H (dentro) Glicerol-3-P Dihidroxiacetona-P matriz dg3p-fad Q III cyt c IV V II-FAD Simp. succinato fumarato H2 1,5 ADP + 1,5 1,5 succinato + Q fumarato + QH2 Quantos s podem ser sintetizados quando 1 succinato (ou 1 glicerol-3-p) é oxidado por um átomo de oxigénio na cadeia respiratória? Se acoplagem perfeita: oxidação de 1 FADH 2 por 1 = 1,5 FADH2 Razão P: = 1,5

4 A oligomicina é uma droga que, adicionada a uma preparação de mitocôndrias, se liga à componente Fo da síntase de impedindo a sua actividade. Será que a oligomicina também impede o funcionamento da cadeia respiratória? atractilosídeo é uma droga que, adicionada a uma preparação de mitocôndrias, se liga ao antiporter /ADP impedindo a sua actividade. Será que o atractilosídeo também impede o funcionamento da cadeia respiratória? Adicionada a uma preparação de mitocôndrias a oligomicina liga-se à componente Fo da síntase de bloqueando a entrada de protões: o gradiente é demasiado alto para a acção das bombas da cadeia respiratória Deixa de haver consumo de nutrientes e de oxigénio. Adicionada a uma preparação de mitocôndrias o atractilosídeo tem, na cadeia respiratória, o mesmo efeito da oligomicina: sem ADP a síntase de não funciona e os protões não entram para a matriz......o gradiente é demasiado alto para a acção das bombas da cadeia respiratória Deixa de haver consumo de nutrientes e de oxigénio. s processos de oxidação dos nutrientes e de síntese de estão acoplados: embora actuem directamente em proteínas que não fazem parte da cadeia respiratória a oligomicina e o atractilosídeo impedem a oxidação dos nutrientes e o consumo de oxigénio. Cadeia respiratória: 3 ligomicina + 3 Atractilosídeo ½ 2 + NADH + 10 H+ (dentro) H 2 + NAD H+ (fora) ½ 2 + FADH (dentro) H 2 + FAD + 6 (fora) Se os protões não puderem entrar na matriz o gradiente electroquímico aumenta. Contra um gradiente demasiado elevado as bombas da cadeia respiratória acabam por parar de funcionar. Certos venenos actuam directamente bloqueando a cadeia respiratória. cianeto bloqueia o transporte de electrões entre o citocromo c e o 2 (complexo IV) na presença de cianeto o NADH, o FADH2, o QH2 e o citocromo c mantêm-se no estado reduzido, não há consumo de oxigénio e a morte sobrevém porque deixa de haver síntese de e as células esgotam o seu em segundos. A rotenona bloqueia o transporte de electrões entre o NADH e a coenzima Q (complexo I) na presença de rotenona o NADH mantêm-se no estado reduzido, enquanto o FAD, a coenzima Q e o citocromo c são oxidados pelo oxigénio. Contudo, a morte também sobrevém porque a acumulação de NADH acaba por bloquear todos os processos oxidativos dos nutrientes deixando de haver síntese de.

5 Na glicólise aeróbia o NADH formado no citosol é oxidado na cadeia respiratória mas... não existe na membrana interna da mitocôndria um transportador para o NADH. transporte dos equivalentes redutores do NADH formado no citosol para a matriz pode envolver a lançadeira do malato; nela cooperam (para além doutras enzimas e transportadores) a desidrogénase do malato e o antiporter do malato e do α-cetoglutarato. Neste caso, o NADH citosólico gera NADH na matriz da mitocôndria. No músculo e no cérebro é mais importante a lançadeira do glicerol- 3-P e nela cooperam 2 isoenzimas: a) a desidrogénase do glicerol-3-p do citosol (dependente do NADH) b) a desidrogénase do glicerol-3-p da face externa da membrana interna da mitocôndria (que tem como grupo prostético o FAD) Neste caso os equivalentes redutores fazem um bypass ao complexo I. Se houver acoplagem perfeita entre oxidação e fosforilação, na oxidação de um mole de glicose podem formar-se (1) admitindo a lançadeira do malato = 32 s (28+4) glicose 2 NAD NADH 2 piruvato I 2 piruvato 2 NAD 2 C NADH 2 acetil-coa 2 4 C 2 (2) admitindo a lançadeira do glicerol-3-p = 30 s (26+4) 6 NAD + dg3p II 6 NADH 2 FAD 2 FADH 2 Q III cyt c IV 6 2 H2 28 ADP+ V 26 Simp. Um automóvel aumenta de velocidade quando aumentamos a velocidade com que a gasolina é injectada no motor. E nos seres vivos como é que é regulada a velocidade de oxidação dos nutrientes? A 1ª resposta veio de estudos com mitocôndrias isoladas ainda antes de o modelo de Mitchell ter sido proposto (ADP = acelerador). Adaptando essa resposta à teoria de Mitchell. ADP e síntase do gradiente electroquímico da membrana mitocondrial cadeia respiratória [NADH] e [NAD + ] desidrogénases do ciclo de Krebs, glicólise e oxidação em β I dg3p-fad Q III cyt c II-FAD NADH NAD + desidrogénases IV H2 Chance e Williams (1955) JBC 217:383 V Simp. ADP

6 A resposta de Chance e Williams é, pelo menos, incompleta. Dados experimentais obtidos in vivo mostram que as concentrações celulares do ADP,, NAD + e NADH sofrem variações pouco marcadas, mesmo em situações em que as velocidades do consumo de oxigénio e nutrientes e a velocidade de síntese/hidrólise de aumentam muitas vezes consumo de 2 Controlo Dobutamina NADH NAD+ ADP Sharma e col. (2005) J Physiol 562: 593 Estudo em porcos. A administração de um agonista β aumentava o consumo de 2 pelo coração mas não provocava variação nas concentrações dos metabolitos estudados. Para explicar esta ausência de variação na concentração do, ADP, NAD + e NADH terá de se admitir que algo exterior ao sistema estimula as enzimas envolvidas nos processos oxidativos de tal forma que as velocidades são iguais em todos os passos. nutrientes NAD + H 2 desidrogénases Cadeia respiratória C 2 NADH 2 (fora) (dentro) ADP+ Síntase do ases vel.1 = vel.2 = vel.3 = vel.4 X Ainda não se sabe o que é o X; poderá haver vários X e um deles pode ser o ião Ca 2+. Adaptado de Korzeniewski (2006) Am J Physiol Heart Circ Physiol 291: 1466 Quando um músculo é estimulado por um nervo motor ocorre despolarização que induz uma cadeia de fenómenos... Que efeitos provoca o Ca 2+ na célula? nutrientes NAD + H 2 (fora) ADP+ Com origem no meio extracelular ou no retículo sarcoplasmático o Ca 2+ move-se para o citoplasma. [Ca 2+ ] citoplasmático 100 vezes (0,1 10 µm) desidrogénases Cadeia respiratória C 2 NADH 2 desidrogénase do glicerol-3-p desidrogénases do piruvato do isocitrato do α-cetoglutarato Complexo IV (dentro) Síntase do Síntase do ases ase da actinamiosina ase do Ca 2+ [Ca 2+ ] na matriz da mitocôndria Ca 2+ mitocôndrial Ca 2+ citoplasmático

7 dinitrofenol é um desacoplador da fosforilação oxidativa: adicionado a uma preparação de mitocôndrias isoladas, permite a oxidação dos nutrientes (e o consumo de 2 ) ocorra na ausência de fosforilação do ADP. dinitrofenol permite a passagem de protões para a matriz (a favor do gradiente) através de um mecanismo independente da síntase do. dinitrofenol abre buracos na barragem que deixam passar protões que não passam pelas turbinas (síntase do ). A intoxicação com dinitrofenol provoca aumento do consumo de 2, febre elevada e morte. Porquê? dinitrofenol impede a síntese de mas descarrega a barragem... A teoria de Chance e Williams pode explicar porque há aumento do consumo de 2. facto de os processos de oxidação dos nutrientes serem exotérmicos explica a febre I Q III cyt c IV 1 NADH NAD + + n/10 + n/10 NADH NADH H2 10 2,5 ADP + 2,5 V Simp. 2,5 n UCP1 Se a acoplagem não é perfeita para manter uma determinada velocidade de síntese de é necessário aumentar a velocidade de oxidação do NADH. SNS leak bebé humano tem tecido adiposo castanho, onde existe termogenina (UCP1) cuja actividade é estimulada pelo SNS. A UCP1 (Uncoupling Protein 1) é uma proteína da membrana da mitocondria que, como a síntase do, deixa passar a favor do gradiente mas não sintetiza. A passagem dos diminui o gradiente electroquímico facilitando a tarefa (estimulando) dos complexos I, III e IV.