PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL DANILO TANCLER STIPP

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1 PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL DANILO TANCLER STIPP ROTAVÍRUS SUÍNO GRUPO C (PoRV-C): ANÁLISE FILOGENÉTICA DO GENE VP6 DE ESTIRPES VIRAIS BRASILEIRAS E DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE INFECÇÕES SINGULARES E MISTAS (PoRV-A e PoRV-B) EM UM SURTO DE DIARRÉIA EM LEITÕES LACTENTES. Londrina/PR 2011

2 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE LONDRINA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL ROTAVÍRUS SUÍNO GRUPO C (PoRV-C): ANÁLISE FILOGENÉTICA DO GENE VP6 DE ESTIRPES VIRAIS BRASILEIRAS E DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE INFECÇÕES SINGULARES E MISTAS (PoRV-A e PoRV-B) EM UM SURTO DE DIARRÉIA EM LEITÕES LACTENTES. DANILO TANCLER STIPP Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal (Área de Concentração: Sanidade Animal) da Universidade Estadual de Londrina como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Ciência Animal. Orientador: Prof. Dr. Amauri Alcindo Alfieri Londrina 2011

3 DANILO TANCLER STIPP ROTAVÍRUS SUÍNO GRUPO C (PoRV-C): ANÁLISE FILOGENÉTICA DO GENE VP6 DE ESTIRPES VIRAIS BRASILEIRAS E DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE INFECÇÕES SINGULARES E MISTAS (PoRV-A e PoRV-B) EM UM SURTO DE DIARRÉIA EM LEITÕES LACTENTES. Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal (Área de Concentração: Sanidade Animal) da Universidade Estadual de Londrina como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Ciência Animal. Comissão Examinadora: Prof. Dr. Marcos Bryan Heinemann Universidade Federal de Minas Gerais Prof. Dr. Marco Antônio Bacellar Barreiros Universidade Federal do Paraná Prof. Dra. Roberta Lemos Freire Universidade Estadual de Londrina Prof. Dr. João Luis Garcia Universidade Estadual de Londrina Prof. Dr. Amauri Alcindo Alfieri Universidade Estadual de Londrina Londrina, 22 de julho de 2011.

4 O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Virologia Animal, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Centro de Ciências Agrárias da Universidade Estadual de Londrina, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Ciência Animal pelo Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal (Área de Concentração: Sanidade Animal), sob orientação do Prof. Dr. Amauri Alcindo Alfieri. Os recursos financeiros para o desenvolvimento do projeto foram obtidos junto às agências e órgãos de fomento à pesquisa, abaixo relacionados: 1. CNPq: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / MCT 2. CAPES: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / MEC 3. FAP/PR: Fundação Araucária de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Paraná / SETI 4. FINEP: Financiadora de Estudos e Projetos / MCT

5 DEDICATÓRIA A Deus À minha amada esposa Rejane Alves Mira Aos meus queridos pais Paulo José Marconi Stipp e Ana Maria Tancler Stipp À minha querida irmã Aline Tancler Stipp À minha avó paterna Ada M. Stipp (in memorian) Aos meus avôs maternos Geraldo Tancler (in memorian) e Nilza T. Tancler À grande amiga e colega Dalíria do Prado (in memorian)

6 AGRADECIMENTOS A Deus, por ter me iluminado ao longo deste trabalho, tornando possível a concretização desse sonho. À minha amada esposa Rejane, pela compreensão e muita paciência; carinho e, principalmente, pelo amor e companheirismo ao longo de mais esta jornada; lembranças e sentimentos que jamais se apagarão de minha memória e coração. Sempre te amarei. Aos meus queridos pais Paulo e Ana Maria, e à minha querida irmã Aline; pelo apoio em todos os momentos, sempre me auxiliando no que fosse necessário. Amo vocês. Aos meus tios Antônio Carlos M. Stipp e Mara Regina Stipp Balarin, pelos conselhos e por me mostrarem o caminho a ser seguido em minha carreira acadêmica, profissão esta digna e extremamente gratificante. A todos os meus familiares, em especial meus padrinhos Francisco e Carmem Tancler, e Rogério Tancler; ao meu tio Sérgio Henrique Tancler; e aos meus avós Geraldo Tancler (in memorian), Nilza T. Tancler e Ada Stipp (in memorian), que sempre estarão em meu coração; agradeço a todos pelo respeito e confiança nos momentos presentes. Ao professor e orientador Prof. Dr. Amauri A. Alfieri pela oportunidade concedida e confiança em mim depositada. Agradeço-o por todos os conselhos que recebi, pelo excelente convívio ao longo desses dez anos desde os tempos da Graduação; e pelo exemplo de profissionalismo a ser seguido. Agradeço-o ainda pela paciência no decorrer da realização deste parto distócico. Meu muito obrigado! À professora Dra. Alice Fernandes Alfieri pela orientação, atenção, confiança, e amizade em mais esta jornada. A todos os professores do curso de graduação em Medicina Veterinária e do Programa de Pós-graduação em Ciência Animal, em especial aos professores: Caio Abércio da Silva, Edson Luis A. Ribeiro, Ernst E. Müller, Italmar T. Navarro, Julio Augusto N. Lisboa, Julio Cesar de Freitas, Laurenil Gaste, Marcelo M. Seneda, Marilda C. Vidotto, Milton H. Yamamura, Nilva Maria F. Mascarenhas, Odilon Vidotto, Pedro Luíz de Camargo; muito obrigado pela amizade, conhecimento e formação acadêmica científica. Aos membros da Comissão Examinadora na banca de defesa: Prof. Dr. Marcos Bryan Heinemann, Prof. Dr. Marco Antônio Bacellar Barreiros, Prof. Dr. João Luis Garcia e Profa. Dra. Roberta L. Freire pelas valiosas contribuições ao presente trabalho. À Elis Lorenzetti, Kerlei Cristina Médici e Thaís Neris da Silva Medeiros pela ajuda indispensável, consideração e amizade durante todo o período de desenvolvimento deste trabalho. À grande amiga Maria Yoshie, meu muito obrigado pelos ensinamentos, puxões de orelha e momentos que jamais serão esquecidos. À grande amiga Dalíria do Prado (in memorian) pelos ensinamentos, pelo exemplo de integridade e profissionalismo. Que Deus a abençoe. Saudades... sempre em nossos corações.

7 Aos funcionários da Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-graduação (PROPPG) e Centro de Ciências Agrárias (CCA) pelo auxílio e atenção durante a realização dos trabalhos. A todos os funcionários do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva (DMVP) em especial ao José Aldivino (Microbiologia), José Roberto e Joãozinho (Patologia Clínica), por cada conversa, risadas e cumprimentos pelos corredores. Aos secretários do DMVP e Pós- Graduação, Reinaldo e Helenice, respectivamente, pela paciência e atenção. Aos meus grandes amigos que acompanharam minha jornada ao longo deste período de trabalho: Alexandre Redson Soares da Silva, Bruno Garcia Botaro, Danilo Laurenti Ferreira e Rafael Felipe Vieira, pelos conselhos, confiança, respeito e companheirismo, além dos momentos de descontração e muitas risadas; pessoas às quais serei eternamente grato. Aos eternos amigos e colegas que conheci e convivi no lab : Alexandre Amude, Betinha, Flora Kano, Jonas Espíndola, Juliana Dias, Marlise Claus, Michele Lunardi, Stellamaris Dezen, meu muito obrigado por toda ajuda e consideração, jamais me esquecerei de vocês. Aos demais amigos Aline Barry, Bruno Mazzer, Ceília de Souza, Claudia Tozato, Karina Flaiban, Kledir Spohr, Luciana Takemura, Patrícia Nunes da Silva, Rodrigo Otonel, Vanessa Japa Hashimoto, pessoas que certamente ficarão guardadas no lado esquerdo do peito, meu muito obrigado pela amizade em todos estes anos de convivência. A todos os estagiários e bolsistas de iniciação científica do laboratório de Virologia Animal da UEL que colaboraram com o desenvolvimento deste trabalho. À Universidade Estadual de Londrina pela estrutura e suporte fornecidos. Aos meus amigos e colegas de trabalho da Faculdade Integrado de Campo Mourão, ao qual tenho muito orgulho e carinho por ter feito parte desta Instituição, em especial o meu agradecimento a Bruno Menarin, Claudia Gebara, Clóvis Bassani, Damaris, Franciele Baptista, Julio César Severino, Ludmila Moroz, Paulo Emílio Prohmann, Roberta R. Fernandes, Roberta Toledo, Rodrigo Yanaka, Sabrina Rodigheri, Vitor S. Sartori e a todos os meus orientados e demais alunos. À Universidade Federal da Paraíba (UFPB / CCA), minha nova casa, à qual tenho me dedicado neste último ano e, se Deus quiser, permitirá que eu continue meu trabalho até o fim de minha vida. Meu muito obrigado aos meus novos amigos e colegas de trabalho e profissão da UFPB, pessoal arretado demais : Abraão R. Barbosa, Alexandre José Alves, Daniela Lafetá, Fabiana Satake, o flamenguista doente George D. Santos, Katerin B. Grondona, o pó de arroz carioca Luis Felipe Souza da Silva, o coxa branca fanático e enciclopédia do futebol brasileiro Luiz Eduardo Buquera, o vascaíno Michel Alves da Silva, o pernambucano Susie da Ilha do Retiro Rafael Lima, o amigo e sofredor gambá Ricardo R. Guerra, o grande amigo e tricolor bambi paulista Rodrigo N. Pereira, o amigo e cabra bom Suedney de Lima Silva, a chefia do Departamento de Ciências Veterinárias, Suzana A. Costa de Araújo e Valeska P. de Melo (obrigado pela liberação das atividades e paciência para o desenvolvimento do presente trabalho). Por fim, agradeço a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho; meu muito obrigado.

8 RESUMO STIPP, D.T. Rotavírus suíno grupo C (PoRV-C): Análise filogenética do gene VP6 de estirpes virais brasileiras e diagnóstico molecular de infecções singulares e mistas (PoRV-A e PoRV-B) em um surto de diarréia em leitões lactentes f. Tese (Doutorado em Ciência Animal, Área de Concentração: Sanidade Animal) - Universidade Estadual de Londrina, Londrina A diarreia neonatal é o principal problema sanitário que acomete leitões lactentes em todo o mundo. A diarréia é um problema multifatorial, determinada pela imunidade do hospedeiro, manejo zootécnico e agentes infecciosos como bactérias (Escherichia coli enterotoxigênica, Clostridium perfringens tipo C), protozoários (Cryptosporidium spp e Isospora suis) e vírus (rotavírus, coronavírus e calicivírus). O rotavírus suíno (PoRV) é descrito como a principal etiologia viral de enterite em leitões lactentes e recém desmamados em todo o mundo. O PoRV do sorogrupo C (PoRV-C) se distingue dos outros sorogrupos de PoRV pelas características antigênicas da proteína estrutural VP6 que é o principal alvo em técnicas de diagnóstico e análises moleculares. Este estudo teve por objetivo analisar a heterogeneidade genética de 15 estirpes de PoRV-C obtidas de episódios de diarreia em leitões provenientes de cinco estados brasileiros e descrever a participação de diferentes sorogrupos de rotavírus em um surto de diarreia em leitões em um rebanho vacinado contra a rotavirose. A diversidade genética das estirpes de PoRV-C foi analisada pela amplificação, sequenciamento e análise molecular de um produto com 1353 pb do gene da VP6. Filogeneticamente, as estirpes de PoRV-C avaliadas foram agrupadas em três clusters formados exclusivamente por estirpes de PoRV-C de origem suína, distintas das estirpes virais de origem bovina e humana. Em um surto de diarreia neonatal foram colhidas 15 amostras de fezes diarreicas de leitões lactentes com 1 a 4 semanas de idade. A presença de PoRV-A, PoRV-B e PoRV-C foi avaliada por técnicas moleculares (RT-PCR e SN-PCR). PoRV foi identificado em 14 (87,5%) amostras fecais sendo 81,2%, 56,2% e 18,7% das amostras positivas para o PoRV-C, PoRV-A e PoRV- B, respectivamente. Infecções mistas, ocasionadas por mais de um sorogrupo de PoRV, foram predominantes ocorrendo em 9 (64,3%) amostras fecais avaliadas. A associação mais frequente envolveu a presença de PoRV-A e PoRV-C. A caracterização molecular das estirpes de PoRV-A identificadas no surto demonstrou a presença do genotipo G4P[6]. Os resultados permitiram identificar, pela primeira vez, grande variabilidade genética no gene 5 (VP6) de estirpes virais brasileiras de PoRV-C indicando que, a exemplo de PoRV-A, existe diversidade molecular nas estirpes virais circulantes. O estudo de avaliação da infecção pelo rotavírus em rebanhos suínos regularmente vacinados contra a rotavirose demonstrou a importância do constante monitoramento da etiologia das diarreias neonatais em rebanhos vacinados, particularmente com relação à etiologia múltipla envolvendo diferentes grupos antigênicos de PoRV. Destaca-se ainda a importância da genotipagem das estirpes de PoRV- A identificadas nas amostras de fezes diarreicas de leitões de rebanhos vacinados com o objetivo de esclarecer as possíveis causas de falhas vacinais. Palavras-chave: suínos, diarréia, rotavírus grupo C, diagnóstico, filogenia.

9 ABSTRACT STIPP, D.T. Porcine rotavirus group C (PoRV-C): Phylogenetic analyses of VP6 gene of wild-type Brazilian strains and molecular diagnosis of single and mixed (PoRV-A and PoRV-B) infections in a diarrhea outbreak in suckling piglets p. Thesis (Doctor s Degree in Animal Science) Londrina State University, Londrina Neonatal diarrhea is the major piglet health problem in pig productions worldwide. Diarrhea is the result of the association of several factors that include host immunity, management procedures and infectious agents as bacteria (enterotoxigenic Escherichia coli, Clostridium perfringens type C), protozoa (Cryptosporidium spp and Isospora suis) and virus (rotavirus, coronavirus and calicivirus). Porcine rotavirus (PoRV) is the main cause of viral enteritis in suckling and weaned piglets. Porcine rotavirus group C (PoRV-C) is distinguished from other rotavirus groups by antigenic features of the structural protein VP6 that constitutes a frequent target of diagnostic assays and molecular analysis. The aim of the present study was to analyze the genetic heterogeneity of 15 PoRV-C strains from five Brazilian states and to describe the involvement of different rotavirus serogroups in an outbreak of diarrhea in piglets from a herd vaccinated against rotavirosis. The genetic diversity of the PoRV-C strains was investigated by amplification, sequencing and molecular analysis of a 1,353 bp VP6 gene product. Phylogenetically, the PoRV-C strains analyzed were ranged in three clusters exclusively formed by PoRV-C of porcine lineages, different from bovine and human virus strains. In a neonatal diarrhea outbreak episode, 15 diarrheic fecal samples were collected from piglets from 1 to 4-weeks-old. The presence of PoRV-A, PoRV-B and PoRV-C was analyzed by molecular techniques (RT-PCR and SN-PCR assays). PoRV was detected in 14 (87.5%) samples, where 81.2%, 56.2%, and 18.7% were positive to PoRV-C, A, and B, respectively. Mixed infections, caused by more than one PoRV serogroups, were predominant in 9 (64.3%) fecal, samples. The most frequent association involved the presence of PoRV-A and PoRV-C. The molecular characterization of wild-type PoRV-A strains detected in the diarrhea outbreak identified the presence of G4P[6] genotype. The results showed for the first time, a great genetic variability of gene 5 (VP6) of Brazilian PoRV-C strains, indicating that, like PoRV-A, the existence of molecular diversity among circulating PoRV-C strains. The study of rotavirus infection in a pig herd regularly vaccinated against rotavirosis demonstrates the importance of a constantly neonatal diarrhea etiology screening in vaccinated herds, particularly regarding to mixed etiology involving multiple antigenic PoRV groups. Note also the importance of genotyping of the PoRV-A strains identified in diarrheic fecal samples from piglets of vaccinated herds in order to clarify the possible causes of vaccine failure. Keywords: Swine, diarrhea, rotavirus, rotavirus group C, diagnosis, phylogeny.

10 SUMÁRIO 1 - REVISÃO DE LITERATURA Rotavirose suína Rotavírus História e taxonomia RV-A RV-B RV-C Caracterização eletroforética e características das proteínas constituintes das camadas interna, intermediária e externa do capsídeo do RV-C Perfil eletroforético do RV-C e diversidade genômica Proteína VP Proteína VP Proteína VP Epidemiologia da rotavirose suína Diagnóstico do rotavírus grupo C Profilaxia e controle Referências OBJETIVOS 2.1. Geral Específicos ARTIGOS PARA PUBLICAÇÃO 3.1 VP6 gene heterogeneity of group C porcine rotavirus strains. Abstract Introduction Materials and Methods Results Discussion References Porcine rotavirus group C (PoRV-C) single and mixed infections (PoRV-A, PoRV-B) as cause of a piglet diarrhea outbreak in vaccinated pig herd. Abstract References CONCLUSÕES ANEXOS A. Lista de reagentes B. Soluções e tampões C. Protocolo de técnicas

11 LISTA DE FIGURAS VP6 gene heterogeneity of group C porcine rotavirus strains. Fig.1. Fig.2. Neighbor-Joining (Tamura-Nei model) tree based on complete sequences of VP6 gene of 15 Brazilian PoRV-C wild-type strains ( ) described in this study and eight reference strains acquired from GenBank with complete RV-C VP6 sequences. The names of RV-C strains and GenBank accession numbers are listed in Table 2. The scale bar is proportional with the phylogenetic distance Phylogenetic tree of the VP6 gene of the Brazilian PoRV-C strains showing its genetic relationship with other RV-C strains. RV-A srains CMP12/03 (Porcine), KJ9-1 (Bovine) and PA169 (Human); and RV-B strains RUBV282 (Bovine) and WH-1 (Human), were used as out-groups. The shape markers of Brazilian PoRV-C are according to the pig herds State location (Mato Grosso do Sul [ ], Minas Gerais [ ], Paraná [ ], Rio Grande do Sul [ ] and Santa Catarina [ ]).The names, original hosts and GenBank accession numbers of RV-A, B and C strains are listed in Table 2. The number adjacent to the node represents the bootstrap value. Scale bar shows genetic distance expressed as nucleotide substitutions per site

12 12 LISTA DE TABELAS VP6 gene heterogeneity of group C porcine rotavirus strains. Table 1. Table 2. Table 3. Table 4. Table 5. Table 6. Table 7. Table 8. Brazilian PoRV-C wild-type strains with VP6 gene sequences performed in the study, their origin and year collected GenBank accession numbers of the VP6 genes of the Brazilian PoRV-C strains, reference RV-C strains and out group strains used in phylogenetic and sequence analyses Estimates of evolutionary divergence between the Brazilian PoRV-C and outgroup RV-A reference strains. The numbers of base differences per site from between PoRV-C sequences are shown Estimates of evolutionary divergence between Porcine I clustered strains. The numbers of base differences per site from between PoRV-C sequences are shown Estimates of evolutionary divergence between Porcine II clustered strains. The numbers of base differences per site from between PoRV-C sequences are shown Estimates of evolutionary divergence between Porcine III clustered strains. The numbers of base differences per site from between PoRV-C sequences are shown Estimates of evolutionary divergence between Porcine I, Porcine II, Porcine III, Bovine and Human clusters. The numbers of base differences per site from between PoRV-C sequences are shown Nucleotide and deduced amino acid sequence comparison of the VP6 of the Brazilian PoRV-C strains with that of the other strains Porcine rotavirus group C (PoRV-C) single and mixed infections (PoRV-A, PoRV-B) as cause of a piglet diarrhea outbreak in vaccinated pig herd. Table 1. Groups of porcine rotavirus (PoRV) identified by RT-PCR assay in a diarrhea outbreak in weaning piglets

13 13 LISTA DE QUADROS Revisão de Literatura Quadro 1. Frequência de detecção do rotavírus suíno grupo A em fezes de leitões Quadro 2. Frequência de detecção do rotavírus suíno grupo B em fezes de leitões Quadro 3. Frequência de detecção do rotavírus suíno grupo C em fezes de leitões... 30

14 14 1. REVISÃO DE LITERATURA

15 15 Rotavirose suína As diarreias neonatais constituem importante problema sanitário que afeta a produção de rebanhos suinícolas, independentemente do nível de tecnificação da criação, sendo observadas tanto em países desenvolvidos quanto em desenvolvimento. Os prejuízos econômicos determinados pelas diarreias podem comprometer a longevidade da exploração econômica de suínos devido aos aumentos nas taxas de morbidade e mortalidade; bem como, pelas despesas adicionais de mão de obra e medicação com o tratamento dos animais enfermos. Os episódios de diarreia em animais jovens determinam ainda alterações consideráveis nas taxas de conversão alimentar e de ganho de peso, ocasionando problemas de manejo em consequência da desuniformidade dos lotes. A desidratação, o desequilíbrio eletrolítico e a acidose são os sinais clínicos mais frequentes. Os animais doentes se apresentam imunossuprimidos, predispondo-os a outras infecções, principalmente as respiratórias (PAUL; LYOO, 1993; WIELLER et al., 2001; CALDERATO et al., 2001; ALFIERI et al., 2007). Em leitões, as diarreias ocorrem tanto em animais lactentes quanto recémdesmamados. As fases de maternidade e creche representam o período de maior desafio à sanidade entérica dos leitões (KATOULI et al., 1995). A imaturidade imunológica e falha na proteção passiva são as principais causas da maior susceptibilidade dos animais na maternidade (SPENCER et al., 1989). No período pós-desmame, a primeira e a segunda semanas constituem-se em fatores de risco para diarreias, principalmente devido às alterações de ordem social e alimentar a que os animais são expostos em decorrência do manejo (MELIN et al., 2000; ALFIERI et al., 2007). A etiologia das diarreias é complexa e fatores ambientais, nutricionais e vários agentes infecciosos como vírus, bactérias, parasitas e toxinas bacterianas podem estar envolvidos nesta síndrome. A importância relativa dos agentes etiológicos é variável e o predomínio de

16 16 um determinado agente em rebanhos, regiões ou mesmo a sua distribuição sazonal, está relacionada com a intensidade e a regularidade com que medidas de caráter higiênicosanitário são adotadas (JANKE, 1989; JOHNSON et al., 1992; CICIRELLO; GLASS, 1994; ALFIERI et al., 2007). As causas infecciosas mais comuns das diarreias em suínos nos períodos do pré e do pós-desmame no Brasil são representadas pelos enteropatógenos Escherichia coli, rotavírus, Isospora suis, Cryptosporidium spp e Clostridium perfringens. Estes agentes causam diarreia cuja intensidade pode variar desde branda a grave, podendo culminar com a morte dos animais comprometidos (MELIN et al., 2004). As variações nos sinais clínicos e nas taxas de morbidade e de mortalidade são devidas às diferenças na virulência e/ou na dose infecciosa do patógeno; da associação entre microrganismos; de aspectos relacionados ao hospedeiro como o estatus imunológico e a idade; e de fatores relacionados ao meio ambiente e ao manejo como limpeza, desinfecção, umidade e ventilação, entre outros (ALFIERI et al., 2007). A semelhança dos sinais clínicos, independentemente do agente etiológico, impossibilita a determinação da etiologia com base apenas nos parâmetros clínicos (DRIESEN et al., 1993). Com relação à etiologia viral das diarreias, os rotavírus (RV) são considerados a principal causa de infecções entéricas em mamíferos e em aves jovens em todo o mundo. A gama de hospedeiros é extensa e, além de seres humanos, inclui várias espécies de animais de produção destacando-se, principalmente pelo impacto econômico que representa ao setor produtivo, as infecções em leitões, bezerros e em aves jovens como frangos de corte e perus (McNULTY, 1978; ESTES et al., 1981; HO et al., 1988; ESTES; COHEN, 1989; ALFIERI et al., 2007). A rotavirose suína caracteriza-se por comprometer animais jovens, entre a segunda e a quarta semanas de vida (BOHL, 1978; UTRERA et al., 1984; WIELER et al., 2001; ALFIERI et al., 2007). A morbidade da rotavirose suína é alta, principalmente nas primoinfecções,

17 17 porém a mortalidade é variável e oscila entre 7-20% (BOHL, 1978). As matrizes prenhes, quando portadoras, eliminam o RV por meio das fezes para o ambiente, principalmente nos dias que antecedem ao parto, sendo fonte de infecção para os leitões (RUBIO et al., 1988). Em infecções naturais os animais eliminam o RV tanto nas fezes normais quanto diarréicas (DEWEY et al., 2003). A transmissão dos RV ocorre por via fecal-oral, com a ingestão de água e/ou alimentos contaminados com fezes. Há relatos da possibilidade da transmissão por aerosóis, principalmente quando as condições de umidade e ventilação do ambiente são favoráveis (COOK et al., 1996; KAPIKIAN et al., 2001). Os RV são, geralmente, espécie-específicos, porém a ocorrência de infecções entre diferentes espécies animais, denominadas infecções heterólogas, tem sido demonstrada (COOK et al., 2004). O RV se replica, principalmente, em ambientes com grande concentração de animais e com condições de higiene desfavoráveis, infectando as células epiteliais das vilosidades intestinais (KAPIKIAN et al., 2001). Somente partículas com tripla camada protéica conseguem aderir-se aos enterócitos. O RV apresenta tropismo por enterócitos maduros das porções média e alta das vilosidades do intestino delgado, principalmente terço final de jejuno e inicial de íleo, de animais e de seres humanos jovens (LUNDGREN; SVENSSON, 2001). No processo de replicação viral ocorre a lise das células infectadas. A redução da capacidade de absorção dos enterócitos e a descamação do epitélio intestinal, com atrofia das vilosidades, causam o quadro diarréico (KAPIKIAN et al., 2001). Os sinais clínicos iniciam por volta do terceiro dia pós-infecção e os animais podem excretar o vírus por até oito dias após o início dos sinais clínicos (DEWEY et al., 2003). Os animais apresentam, principalmente, diarreia de consistência pastosa à líquida e de curta duração, em média por três dias. A desidratação é frequente em leitões muito jovens, onde a infecção é mais grave (THEIL et al., 1985a).

18 18 Rotavírus Histórico e taxonomia Os RV são membros da família Reoviridae e pertencem ao gênero Rotavirus. A partícula viral é de simetria icosaédrica, com aproximadamente 70 a 90 nm de diâmetro, não apresenta envelope lipoprotéico e o capsídeo é constituído por três camadas concêntricas de proteínas. O genoma viral é formado por 11 segmentos de RNA fita dupla (dsrna) que codificam seis proteínas estruturais (VP viral protein) e seis proteínas não-estruturais (NSP non-structural protein). A nomenclatura das VPs (VP1; VP2; VP3; VP4; VP6 e VP7) e das NSPs (NSP1; NSP2; NSP3; NSP4; NSP5; NSP6), presentes em partículas virais maduras, são seguidas por números em ordem decrescente da massa molecular. As proteínas VP1, VP2 e VP3 formam a camada interna, ou core, do capsídeo viral; a proteína VP6 constitui a camada intermediária, e as proteínas VP4 e VP7 formam a camada externa do capsídeo (ESTES; COHEN, 1989; MIDTHUN; KAPIKIAN, 1996). A proteína VP4 tem função essencial no ciclo de replicação do vírus, incluindo a ligação ao receptor celular e a penetração em células hospedeiras. A função da VP7, durante a interação inicial, ainda não está bem estabelecida (ZARATE et al., 2004). Com base na especificidade antigênica da VP6 os RV são classificados em sete grupos sorológicos (sorogrupos) denominados de A a G. Todos os membros de cada sorogrupo, independentemente da espécie animal de origem, apresentam seu próprio antígeno comum que é antigenicamente distinto entre os sorogrupos (ESTES; COHEN, 1989). Rotavírus grupo A (RV-A) A proteína VP4 exerce influência direta na patogenicidade e na atenuação das estirpes de RV-A e apresenta epítopos neutralizantes que, juntamente com a VP7, estão associados à

19 19 neutralização sorotipo-específica e à proteção contra a infecção. Com isso, à semelhança do vírus influenza, os RV apresentam classificação sorológica binária onde devem ser consideradas, simultaneamente, as especificidades antigênicas das proteínas VP4 e VP7, formadoras da camada externa do capsídeo viral (HOSHINO et al., 1985; OFFIT et al., 1986). Para a padronização da nomenclatura, os sorotipos de RV-A relacionados à VP4, são denominados sorotipos P devido a sua susceptibilidade à clivagem proteolítica. Os sorotipos relacionados ao polipeptídeo VP7, por ser de constituição glicoproteica, são denominados sorotipos G (ESTES; COHEN, 1989). A identificação por métodos sorológicos dos sorotipos G e P de RV-A apresenta uma série de limitações como: i) alta taxa de amostras não sorotipadas nos levantamentos epidemiológicos; ii) grande número de infecções mistas ou variantes antigênicas; iii) não caracterização de sorotipos P por meio de ensaios imunoenzimáticos comerciais (ALFIERI, 1999). Com isso, a genotipagem passou a ser utilizada como uma técnica alternativa à sorotipagem dos RV-A. Atualmente são reconhecidos 24 genotipos G (G1 a G24) e 33 genotipos P (P[1] a P[33]) demonstrando a ampla diversidade antigênica desse grupo de RV (KAPIKIAN et al., 2001; MARTELLA et al., 2006; KHAMRIN et al., 2007; URSU et al., 2009; COLLINS et al., 2010). Os genotipos de RV-A mais frequentemente encontrados em suínos são G3, G4, G5 e G11 que estão associados com P[6] ou P[7] (WINIARCZYK et al., 2002; BARREIROS et al., 2003). Outros P tipos têm sido descritos em RV isolados ou presentes em amostras fecais como P7[5]; P1A[8]; P[13]; P12[19]; P14[23] (LIPRANDI et al., 2003; MARTELLA et al., 2005). As principais combinações entre os genotipos G e P de RV-A suíno são G5P[7] (OSU), G4P[6] (Gottfried), G11P[7] (YM), e G3P[7] (CRW8) (BARREIROS et al., 2003; PARRA et al., 2008).

20 20 Apesar da caracterização dos RV, particularidades sobre a replicação do genoma viral e as diversas fases que envolvem a morfogênese ainda não foram esclarecidas (ARNOLDI et al., 2007). A proteína NSP2, assim como a proteína NSP5 participam nos processos de formação do viroplasma e de replicação viral durante infecções naturais (CAMPAGNA et al., 2005; SILVESTRI et al., 2004). A NSP5 apresenta massa relativamente pequena (21,7 kda) quando comparada com outras proteínas, assumindo a forma de um octâmero quando em solução. Análises moleculares utilizando a proteína NSP2 como sequência alvo têm demonstrado resultados satisfatórios na detecção do RV-B de origem humano e animal (GOUVEIA et al, 1991). Uma proteína não-estrutural de grande relevância é a NSP4, devido ao seu envolvimento com a morfogênese viral e sua atividade enterotóxica (MARTELLA et al., 2003). Estudos com a proteína NSP4 do RV-A, sugerem a sua classificação em cinco genogrupos: i) genogrupos A, B e C isolados de leporinos, equinos, bovinos, suínos, símios, caninos e felinos e seres humanos nos quais análises filogenéticas mostram o agrupamento das estirpes sempre em um mesmo ramo, sugerindo evolução constante entre estas estirpes virais; ii) genogrupos D e E, encontrados somente em camundongos e aves, respectivamente (CIARLET et al., 2000). Rotavírus grupo B (RV-B) Tanto a caracterização antigênica e molecular quanto a prevalência dos RV-B ainda não estão bem esclarecidas (TSUNEMITSU et al., 1999), principalmente devido à dificuldade de adaptação desse grupo de RV em culturas celulares (THEIL; SAIF, 1985). Estudos moleculares, direcionados aos genes que codificam as proteínas do capsídeo interno, indicam particularidades nos RV-B quando comparados aos RV-A e RV-C (CHEN et al., 1991).