COMPARAÇÃO DE DUAS TÉCNICAS PARA ISOLAMENTO DE Leptospira spp A PARTIR DO TECIDO RENAL DE OVINOS RESUMO

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1 Ciência Animal, 13(1):33-37, 2003 COMPARAÇÃO DE DUAS TÉCNICAS PARA ISOLAMENTO DE Leptospira spp A PARTIR DO TECIDO RENAL DE OVINOS (Comparasion between two techniques for isolation of Leptospira spp from ovine renal tissue) Sérgio Santos de AZEVEDO* 1, Clebert José ALVES 2, Fabiano da Silva LIMA 3, Inácio José CLEMENTINO 3 & Carolina de Souza Américo BATISTA 3 1 Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia/Universidade de São Paulo; 2 Departamento de Medicina Veterinária da Universidade Federal de Campina Grande; 3 Bolsista PIBIC/CNPq. RESUMO A leptospirose é uma zoonose amplamente difundida no Brasil e que acarreta elevados prejuízos para a economia nacional. Os ovinos representam um importante elo de transmissão da leptospirose, visto que aparentemente sadios, podem albergar leptospiras e eliminá-las no meio ambiente, propiciando a disseminação para outras espécies, inclusive aos seres humanos. Procedeu-se o isolamento de Leptospira spp a partir do tecido renal de ovinos abatidos no Matadouro Público de Patos, Paraíba, no período de setembro de 1999 a julho de O material examinado constituiu-se de 80 amostras de rins de ovinos. As técnicas de isolamento utilizadas foram a da pipeta Pasteur e das diluições seriadas. Quatro amostras foram positivas para a técnica da pipeta Pasteur, enquanto que, para a técnica das diluições seriadas, as amostras foram negativas. A análise estatística não revelou diferenças significativas entre as técnicas (P = 0,125). PALAVRAS-CHAVE: Leptospirose, isolamento, ovinos. ABSTRACT Leptospirosis is a zoonotic disease, widespread in Brazil, that causes high economic losses. Sheep represent an important link in leptospire transmission. Although apparently healthy, they may have leptospires and eliminate them into their surroundings, which favors dissemination to other species, even to humans. The isolation of Leptospira spp was performed in kidney tissue of sheep raised in Patos, Paraíba State, Brazil, from September to July of Samples of kidney tissue of 80 sheep slaughtered in the Patos Public Abattoir were collected. The kidney samples were processed according to the Pasteur pipette and tenfold dilutions techniques. The results showed four positive samples for the pipeta Pasteur technique, while for the tenfold dilutions technique all the samples negative. No statistical significance was observed between the techniques (P = 0.125). KEY WORDS: leptospirosis, isolation, sheep. * Autor para correspondência Rua Francisco Justino de Morais, s/n, , Ouro Branco-RN 33

2 INTRODUÇÃO A leptospirose é uma zoonose amplamente difundida no Brasil e que acarreta elevados prejuízos para a pecuária nacional. O seu principal impacto é o comprometimento do desempenho reprodutivo dos rebanhos acometidos (VASCONCELLOS, 1993). Os surtos se produzem por exposição à água contaminada com urina ou tecidos provenientes de animais infectados (SILVA & SILVA, 1983; FAINE et al., 1999). A doença encontra-se disseminada mundialmente e, embora tenha nos ovinos reduzida incidência, sua disseminação entre eles é um fato real e crescente, sendo agravado em propriedades que adotam sistemas de criação consorciada com outras espécies (LANGONI et al., 1995). Dentre os animais domésticos utilizados com finalidade econômica e social, sem dúvida a ovinocultura tem valor destacado no meio rural da região Nordeste do Brasil. A infecção de ovinos por Leptospira spp pode manifestar-se sob a forma aguda, crônica ou inaparente (RAFYI et al., 1967; BATRA et al., 1991). Esta última é muito mais freqüente do que as outras e desperta pouca atenção dos pesquisadores devido à dificuldade no diagnóstico (RAFYI et al., 1967; ALVES, 1996). No entanto, do ponto de vista epidemiológico, é uma forma muito importante em face da perspectiva de que animais com infecção inaparente podem garantir a persistência do agente nos rebanhos acometidos (BLENDEN, 1976). O diagnóstico laboratorial da leptospirose tem por objetivo o atendimento de três questões fundamentais: a primeira é a de confirmar ou não a suspeita clínica do caso; a segunda é a de que tal confirmação se estabeleça o mais rápido possível, a fim de orientar a terapia específica do paciente comprometido e a terceira é a identificação do sorotipo envolvido. As duas primeiras questões podem ser esclarecidas com o emprego de provas sorológicas, dentre as quais se destaca a reação de soroaglutinação microscópica. No entanto, a terceira só poderá ser esclarecida através do isolamento do agente em meio de cultura ou por inoculação em animais de laboratório, com a sua posterior tipificação, segundo métodos imunológicos (SANTA ROSA, 1970; FAINE et al., 1999). Sendo assim, o isolamento de leptospiras é de grande importância, pois permite o conhecimento exato dos diversos sorovares existentes em determinada região, facilitando, deste modo, o controle da enfermidade (VASCONCELLOS, 1987). O objetivo do presente trabalho foi realizar o isolamento de Leptospira spp através das técnicas da pipeta Pasteur e das diluições seriadas, a partir do tecido renal de ovinos abatidos no Matadouro Público de Patos, Estado da Paraíba, bem como estudar comparativamente as técnicas de isolamento empregadas. MATERIAL E MÉTODOS Animais Foram utilizados para esta investigação 80 ovinos beneficiados no Matadouro Público de Patos, no período de setembro de 1999 a julho de Amostras Os rins de ovinos obtidos no Matadouro Público de Patos foram retirados da cavidade abdominal dos animais tomando-se todos os cuidados assépticos, sendo separados em sacos plásticos, armazenados em uma caixa de isopor com gelo e levados imediatamente para o Laboratório de Doenças Transmissíveis da UFCG/Campus de Patos. No laboratório, os rins foram submetidos a uma desinfecção por submersão em hipoclorito de sódio a 5% por 20 minutos. A seguir, os rins foram levados para a capela estéril do laboratório e processados através das técnicas da pipeta Pasteur e das diluições seriadas. Diluente O diluente utilizado para o preparo das suspensões dos órgãos foi a solução salina tamponada de Sorensen estéril (SANTA ROSA, 1970). Meios de cultura Os meios de cultura utilizados nesta investigação foram o meio semi-sólido de Fletcher 34

3 e o meio de EMJH. Estes meios foram preparados de acordo com a indicação do fabricante e em seguida enriquecidos com 10% de soro normal estéril de coelho, previamente inativado a temperatura de 56 o C em banho-maria por 30 min. Técnicas de isolamento Foram utilizadas as técnicas da pipeta Pasteur e das diluições seriadas, conforme a metodologia descrita por PASSOS et al. (1988). A técnica da pipeta Pasteur foi realizada da seguinte maneira: com o emprego de uma espátula aquecida ao rubro, procedeu-se a cauterização da superfície externa dos rins trabalhados. A seguir, as áreas tratadas foram perfuradas pela extremidade de uma pipeta Pasteur estéril, realizando-se alguns movimentos rotatórios a fim de facilitar a extração de um diminuto fragmento, que foi imediatamente semeado nos diferentes meios de cultura. A técnica das diluições seriadas foi executada adotando-se o seguinte procedimento: foram pesados e macerados os fragmentos de rins de modo que se obteve uma suspensão de 10% (peso/volume) em solução salina tamponada de Sorensen estéril. Esta suspensão foi submetida a uma centrifugação a 2000 rotações por minuto, durante cinco minutos, objetivando-se a retirada de restos celulares grosseiros; a seguir, sob condições de assepsia e com seringa e agulha estéreis, foram preparadas diluições de razão dez, obtendo-se as concentrações finais de 1,0%, 0,1% e 0,01%, que foram semeadas nos diferentes meios de cultura. Os tubos semeados foram incubados a 28 o C e permaneceram nas estufas por 12 semanas, sendo as leituras realizadas semanalmente através de microscopia de campo escuro. Análise estatística A comparação das técnicas de isolamento foi estabelecida pelo teste estatístico de Mc Nemar (ZAR, 1999), para populações relacionadas, adotando-se o nível de significância de 0,05, através do programa SPSS for Windows RESULTADOS Na Tab. 1 encontram-se os resultados dos exames realizados nas 80 amostras de tecido renal de ovinos abatidos no Matadouro Público de Patos-PB. Para a técnica da pipeta Pasteur, quatro amostras (5%) foram confirmadas como positivas, enquanto que, para a técnica das diluições seriadas, as amostras foram negativas. A análise estatística dos resultados discordantes, segundo o teste de Mc Nemar, não revelou diferenças significativas entre as técnicas de isolamento empregadas (P = 0,125). Tabela 1. Isolamento de Leptospira spp a partir do tecido renal de ovinos abatidos no Matadouro Público de Patos, Estado da Paraíba, Brasil, no período de setembro de 1999 a julho de 2000, segundo a técnica de isolamento e a natureza dos resultados. Pipeta Pasteur Diluições seriadas Total Positivo Negativo Positivo (5%) Negativo (95%) Total 0 (0,0%) 80 (100%) 80 (100%) P = 0,125 (Teste de Mc Nemar) 35

4 DISCUSSÃO Relativamente aos resultados das técnicas de cultivo realizadas com o material proveniente dos ovinos, constatou-se que a técnica da pipeta Pasteur foi superior a das diluições seriadas, diferentemente de RIEDEMANN & ZAMORA (1990), que constataram uma superioridade da técnica das diluições seriadas, utilizando 81 rins de bovinos. PASSOS et al. (1988), utilizando tecido renal de hamsters inoculados com a estirpe A de Leptospira interrogans sorovar pomona (que apresentava 39 passagens em hamsters), constataram que a técnica das diluições seriadas foi superior à da pipeta Pasteur. Já os mesmos autores, utilizando tecido renal de hamsters inoculados com a estirpe B de Leptospira interrogans sorovar pomona (que apresentava duas passagens em hamsters), constataram que a técnica da pipeta Pasteur foi equivalente à das diluições seriadas, diferentemente do presente trabalho. Isso pode ser explicado pelo fato daquele experimento ter sido conduzido em condições de controle do material examinado, ou seja, animais de laboratório e cepaspadrão, diferentemente das condições de trabalho adotadas para a presente investigação, onde o material (tecido renal de ovinos) foi proveniente de matadouro, onde a possibilidade de contaminação é maior quando comparada a outros ensaios experimentais. Os trabalhos de isolamento realizados em diferentes países retratam a importância dos ovinos como fontes de infecção de leptospiras. CACCHIONE et al. (1963), na Argentina, conseguiram isolar o sorovar ballum de um ovino com leptospirose aguda, através da semeadura de um fragmento de fígado em meio de Korthof. ELLIS et al. (1983), na Austrália, isolaram os sorovares pomona, australis e hebdomadis, através da semeadura em meio de EMJH, de fragmentos de rins provenientes de fetos abortados e de cordeiros que nasceram mortos ou tiveram morte neonatal. CERRI et al. (1996), na Itália, isolaram o sorovar hardjo de amostras de tecido renal de três ovelhas soropositivas pela soroaglutinação microscópica. No presente trabalho, o isolamento foi realizado a partir de animais que não apresentavam quaisquer sinais clínicos da doença (infecção inaparente), o que é importante do ponto de vista epidemiológico, pois os animais assintomáticos eliminam constantemente o agente, garantindo a sua persistência no meio ambiente (BLENDEN, 1976; VASCONCELLOS, 1987; FAINE et al., 1999). Desta forma, o isolamento de Leptospira spp de tecido renal proveniente de animais assintomáticos reveste-se de importância na medida em que a identificação de sorovares prevalentes em uma determinada região poderá definir ações de controle da enfermidade. Em relação à microrregião de Patos, semi-árido nordestino, o isolamento é de grande importância, pois segundo TORTEN (1979) e ALVES (1996), embora exista a tendência de se relacionar altas precipitações com a ocorrência da doença, esta condição não é necessária para a manutenção do agente e sua transmissão, bastando para tanto a introdução do portador. Os dados obtidos neste trabalho indicam que a leptospirose existe na microrregião de Patos e que os ovinos podem ser fontes de infecção, já que estes animais podem manter a leptospirúria por até 11 meses (COUSINS et al., 1989), expondo o homem do meio rural ao perigo da doença ocupacional na medida em que o contato se estabelece quase que diariamente com o animal. CONCLUSÃO Foi isolada Leptospira spp a partir do tecido renal de ovinos abatidos no Matadouro Público de Patos. Os valores discordantes entre as técnicas da pipeta Pasteur e das diluições seriadas estão situados dentro da expectativa do acaso. As amostras isoladas serão tipificadas para posterior publicação. AGRADECIMENTOS Agradecemos ao CNPq pelas bolsas de iniciação científica concedidas. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALVES, C. J. Influência de fatores ambientais sobre a proporção de caprinos soro reatores para a leptospirose em cinco centros de criação do estado 36

5 da Paraíba, Brasil. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v.33, p.54, BATRA, H.; CHANDIDRAMANI, N. K.; MANDOKHOT, U. V. Clinical, bacteriological, serological, pathological and metabolic studies of Leptospira interrogans serovar wolffi infection in sheep. Indian Journal of Animal Science, v.61, p. 6-12, BLENDEN, D. C. Aspectos epidemiológicos de la leptospirosis. In: REUNION INTERAMERICANA SOBRE EL CONTROL DE LA FIEBRE AFTOSA Y OTRAS ZOONOSIS, 8, Guatemala, Washington D.C., Organizacion Panamericana de la Salud. p , CACCHIONE, R. A.; CEDRO, V. C. F.; BULGINI, M. J. D.; CASCELI, S.; MARTINEZ, E. S. Leptospirose ovina. Investigación sobre su frequencia en la Argentina. Aislamiento y classificación de uma cepa ovina. Buenos Aires, Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuaria, Instituto de Zoonosis (Serie Técnica, 24), CERRI, D.; NUVOLONI, R.; EBANI, V.; PEDRINI, A.; MANI, P.; ANDREANI, E.; FARINA, R. Leptospira interrogans serovar hardjo in the kidneys and genital tracts of naturally infected sheep. New Microbiology, v.19, p , COUSINS, D.V.; ELLIS, T. M.; PARKINSON, J.; McGLASHAN, C. H. Evidence for sheep as a maintenance host for Leptospira interrogans serovar hardjo. Veterinary Record, v.124, p , ELLIS, W. A.; BRYSON, D. G.; NEILL, S. D.; McPARLAND, P. J.; MALONE, F. E. Possible involvement of leptospires in abortion, stillbirths and neonatal deaths in sheep. Veterinary Record, v.112, p , FAINE, S.; ADLER, B.; BOLIN, C.; PEROLAT, P. Leptospira and Leptospirosis. MediSei, Melbourne, 272p LANGONI, H.; MARINHO, M.; BALDINI, S.; SILVA, A. V.; CABRAL, K. G.; SILVA, E. D. Pesquisa de aglutininas antileptospíricas em soros de ovinos no estado de São Paulo, Brasil, utilizando provas de macroaglutinação em placa e soroaglutinação microscópica. Revista Brasileira de Medicina Veterinária, v.17, p , PASSOS, E. C.; VASCONCELLOS, S. A.; ITO, F. H.; YASUDA, P. H.; JÚNIOR, R. N. Isolamento de leptospiras a partir do tecido renal de hamsters experimentalmente infectados com Leptospira interrogans sorotipo pomona. Emprego das técnicas da pipeta Pasteur e das diluições seriadas em meio de Fletcher tratado com o 5-Fluor-Uracil ou sulfato de neomicina. Revista da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, v.25, p , RAFYI, A.; MAGHAMI, G.; NIAK, A. L. Leptospirosis in ovine and caprine. Bulletin of the Office International des Epizooties, v.68, p.43-59, RIEDEMANN, T. M.; ZAMORA, M. V. Comparacion de dos técnicas de aislamiento de Leptospira interrogans a partir de riñones de bovinos. Archivos de Medicina Veterinaria, v.2, p , SANTA ROSA, C. A. Diagnóstico laboratorial das leptospiroses. Revista de Microbiologia, v.1, p , SILVA, M. V. D.; SILVA, E. D. F. Possíveis causas de aborto em caprinos. Comunicado técnico. EMBRAPA Centro Nacional de Pesquisa de Caprinos, v.12, p.1-9, TORTEN, M. Leptospirosis. In: STEELE, J. H.; STOENNER, H.; KAPLAN, W. (Eds). Handbook series in zoonosis. Seccion A: Bacterial, rickettsial and micotic diseases. Boca Raton, CRC Press, p , VASCONCELLOS, S. A. Leptospirose Animal. In: III Encontro Nacional em Leptospirose. Rio de Janeiro, p.62-66, VASCONCELLOS, S. A. O papel dos reservatórios na manutenção da leptospirose na natureza. Comunicações Científicas da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, v.11, p.17-24, ZAR, J. H. Bistatistical analysis. Prentice Hall, Upper Saddle River, 663 p Recebido em: Aceito em:

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