UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS DETERMINAÇÃO DA SOROPOSITIVIDADE PARA BRUCELOSE EM OVINOS NEKITA ÉVELY XIMENES MARTINS

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS DETERMINAÇÃO DA SOROPOSITIVIDADE PARA BRUCELOSE EM OVINOS NEKITA ÉVELY XIMENES MARTINS Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre, junto ao programa de Pós-graduação em Ciência Animal Tropical da Universidade Federal do Tocantins. Área de Concentração: Produção Animal ARAGUAÍNA/TO 2012

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3 UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS DETERMINAÇÃO DA SOROPOSITIVIDADE PARA BRUCELOSE EM OVINOS NEKITA ÉVELY XIMENES MARTINS Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre, junto ao programa de Pós-graduação em Ciência Animal Tropical da Universidade Federal do Tocantins. Área de Concentração: Produção Animal Orientador (a): Profa. Dra. Katyane de Sousa Almeida ARAGUAÍNA/TO 2012

4 Dados Internacionais de Catalogação Biblioteca UFT - EMZV M386d Martins, Nekita Évely Ximenes Determinação da Soropositividade para brucelose em ovinos -- Araguaína: [s.n.], f. : Il. Orientador: Profa. Dra. Katyane de Sousa Almeida Dissertação (Mestrado em Ciência Animal Tropical) - Universidade Federal do Tocantins, Brucella spp. 2. Epididimite. 3. Sorologia. 4. Ovis aries. I. Título CDD 636.3

5 DETERMINAÇÃO DA SOROPOSITIVIDADE EM OVINOS Dissertação aprovada como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre, tendo sido julgado pela Banca Examinadora formada pelos professores: Presidente: Profª Dra. Katyane de Sousa Almeida UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS Prof. Dr. Adriano Tony Ramos UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS Prof Dr. Marlos Gonçalves Sousa UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS Profª. Drª. Josir Laine Aparecida Veschi EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUÁRIA Profª. Drª. Bruna Alexandrino UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Araguaína, 23 de Fevereiro de 2012

6 6 A Deus, por guiar os meus passos Aos meus pais, Claudete e Francisco, que acreditaram nos meus sonhos Aos meus irmãos, pelo amor, apoio e amizade A todos os meus amigos, dos mais antigos aos mais recentes, em especial a Katyane pela amizade sincera e, por que não dizer, pelo amor dedicado. A todos a minha gratidão e o meu amor, que todos sintam-se amados!

7 7 AGRADECIMENTOS A Deus por tornar os meus sonhos possíveis. Aos meus pais, Claudete e Francisco, que dedicaram a vida para a formação dos meus irmãos e a minha, e nunca mediram esforços para tornar realidade os nossos sonhos, e às vezes esqueceram-se dos seus para satisfazer os nossos. Pai e mãe, meu porto seguro!!! Aos meus irmãos, Stéphany e Jonattan, pelo amor, apoio e pelos cuidados que, às vezes, penso ser excesso de zelo, mas não, é amor! E mana, muito obrigada por todas as suas contribuições na minha vida! Ao meu namorado, Henrique, pelo amor e pelas palavras de incentivo. Aos meus avós, Francisca e Raimundo Nonato, pelas longas conversas e brincadeiras que me faziam esquecer as horas... E ao vô Melquiades, que nem sempre está comigo, mas que também traz alegria à minha vida, quando nos encontramos. A Katyane pela orientação, mas em especial, pela amizade e amor dedicados. Ao professor Fagner, agora distante, mas muitas vezes me deu palavras de incentivo. Aos professores da banca examinadora, por aceitar o convite, especialmente aos professores Marlos e Mathias que contribuíram com o desenvolvimento da pesquisa. Aos meus amigos de longa data e aos que conheci no mestrado, e a todos que contribuíram direta ou indiretamente com a concretização deste trabalho. A todos o meu sincero muito obrigada!

8 8 BIOGRAFIA DA AUTORA NEKITA ÉVELY XIMENES MARTINS, filha de Claudete Moraes Martins e Francisco Ximenes Martins, nascida em Tocantinópolis, Estado do Tocantins, em 27 de abril de Em 2003, concluiu o Ensino Médio, no Centro Educacional Objetivo, ingressando no ano de 2005 na Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal do Tocantins, onde obteve o grau de Bacharel em Medicina Veterinária, em janeiro de 2010, e em março do mesmo ano, iniciou o curso de Mestrado no Programa de Pós-graduação em Ciência Animal Tropical na área de concentração em Produção Animal na Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal do Tocantins-UFT, tornando-se bolsista CAPES em abril do referido ano. No segundo semestre de 2011 foi professora voluntária da disciplina de Microbiologia Geral do Curso de Medicina Veterinária da Universidade Federal do Tocantins.

9 9 Viver! E não ter a vergonha de ser feliz, Cantar, cantar e cantar! A beleza de ser um eterno aprendiz... (Gonzaguinha)

10 10 SUMÁRIO RESUMO ABSTRACT LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS CAPÍTULO 1 1 INTRODUÇÃO REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Importância Histórico Agente etiológico Epidemiologia Distribuição Cadeia Epidemiológica Fonte de Infecção Vias de Eliminação Meios de Transmissão Porta de entrada Patogenia Sinais Clínicos Diagnóstico Prevenção e controle REFERÊNCIAS CAPÍTULO 2 Prevalência de anticorpos anti-b. ovis e anti-b. abortus em ovinos do município de Colinas, Tocantins, Brasil INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODOS Área de estudo Animais e Coleta das Amostras Inquérito Epidemiológico Testes sorológicos Prova de aglutinação rápida em placa com Antígeno Acidificado e Tamponado (AAT) Teste do 2-Mercaptoetanol (2-ME) Imunodifusão em Gel de Agar (IDGA) Fixação de Complemento... 47

11 11 3 RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO AGRADECIMENTOS REFERÊNCIAS... 61

12 12 RESUMO Determinação da soropositividade para brucelose em ovinos A brucelose é uma doença de caráter infeccioso causada por bactérias do gênero Brucella spp., que acomete várias espécies de animais domésticos e silvestres. Em ovinos a doença pode resultar em perdas econômicas, decorrentes dos distúrbios reprodutivos, como epididimite, orquite e abortamentos. Considerando-se a importância da brucelose na cadeia produtiva da ovinocultura e a ausência de dados soroepidemiológicos sobre a brucelose ovina no Estado do Tocantins, a pesquisa teve por objetivo determinar a soropositividade para brucelose em rebanhos de ovinos de 14 propriedades cadastradas na associação de ovinocultores do município de Colinas, Tocantins, Brasil. Foram coletadas 450 amostras de sangue de ovinos mestiços, jovens (90 até 180 dias) e animais em reprodução, obtidos assepticamente por meio da punção da veia jugular, e centrifugadas para separação do soro. Os soros foram analisados por meio da aglutinação rápida em placa com Antígeno Acidificado e Tamponado (AAT) e quando reagentes foi realizado o teste de Aglutinação Lenta em Tubos (SAT) e 2-Mercaptoetanol (2-ME), para pesquisar cepas lisas (Brucella abortus); já para pesquisa de cepas rugosas (Brucella ovis) foi feita a Imunodifusão em Gel de Agar (IDGA) e quando reagentes, Fixação de Complemento (FC). A análise estatística descritiva foi utilizada para o cálculo da frequência de soropositividade para cada cepa e o teste exato de Fisher para distribuição da prevalência nas categorias estudadas e para verificação da idade como fator de risco ou de proteção foi calculado a Odds Ratio (OR). Das amostras analisadas 31,55% reagiram ao teste de IDGA, dentre estas, apenas 2,81% foram confirmadas a positividade para B. ovis na FC; e na pesquisa de anticorpos anti-b. abortus por meio do AAT, 4,44% foram reagentes, dentre quais, 70% foram confirmadas a positividade no 2-ME. Os resultados obtidos em todos os testes sorológicos e, analisados pelo Teste de Fisher e OR demonstraram significância estatística entre a positividade e a faixa etária. A brucelose ovina é realidade no município de Colinas, tanto a causada por B. ovis quanto por B. abortus, sendo os animais em reprodução os mais predispostos à infecção. Portanto, sugere-se a realização de outros estudos epidemiológicos e a necessidade de medidas de controle e prevenção para combater esta enfermidade, nas propriedades do município. Palavras chave: Brucella spp.; epididimite; sorologia; Ovis aries

13 13 ABSTRACT Determination of seropositivity for brucellosis in sheep Brucellosis is an infectious disease caused by bacteria of the genus Brucella ssp, which can affect several species of domestic and wild animals. In sheep the disease can result in economic losses arising from reproductive disorders such as epididymitis, orchitis and abortions. Considering the importance of brucellosis in sheep industry production chain and the absence of data on the seroepidemiological ovine brucellosis in Tocantins, there search aimed to determine the seroprevalence of brucellosis in sheep flocks in 14 registered properties of the Sheep Breeders Association in the city of Colinas, Tocantins, Brazil. Were collected 450 blood samples from cross bred sheep, young (90 to 180 days) and animals in reproduction, aseptically obtained by jugular vein puncture, and centrifuged to separate serum. The sera were analyzed by rapid plate agglutination with Acidified Buffered Antigen and with the reagent samples was performed the technique of Slow Agglutination in tubes (SAT) and 2-Mercaptoethanol (2-ME), to search for smooth strains (Brucella abortus); the search for roughs trains (Brucella ovis) was performed with Agar Gel Immunodiffusion (AGID) and with reagent samples was performed the Complement Fixation (CF). The descriptive statistical analysis was used to calculate the frequency of seropositivity for each strain and Fisher's exact test was used for distribution of the categories studied in the prevalence and, for age verification as a risk or protective factor, was calculated Odds Ratio (OR).Of the analyzed samples 31.55% were reagent to the AGID test, among these, only 2.81% were confirmed positive by the CF test; in the analyzed sera by rapid plate agglutination with Acidified Buffered Antigen, 4.44% were positive, among these, 70% were confirmed positive in 2-ME test. The obtained results in all serological tests, and analyzed by Fisher's test, showed statistical significance and OR between positivity and age, showing that there was a greater chance of occurrence of brucellosis of in a reproduction animal. Therefore, it is suggested to realization of other epidemiological studies and the need for control and prevention measures to combat the disease in the properties of the municipality. Keywords: Brucella spp.; epididymitis; serology; Ovis aries

14 14 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AAT Antígeno Acidificado Tamponado ADAPEC Agência de Defesa Agropecuária do Tocantins ELISA Ensaio Imunoenzimático de Adsorção FC Fixação de Complemento GTA Guia de Trânsito Animal IDGA Imunodifusão em Gel de Agar IgG Imunoglobulina G IgM Imunoglobulina M LPS Lipopolissacarídeos MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento PCR Reação em Cadeia da Polimerase PNVCEO Plano Nacional de Vigilância e Controle da Epididimite Ovina PNCEBT Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose TPF Teste de Polarização Fluorescente SAT Soroaglutinação em Tubos SRA Soroaglutinação Rápida TECPAR Instituto de Tecnologia do Paraná

15 15 INTRODUÇÃO A ovinocaprinocultura é praticada em todo o mundo, sendo várias as finalidades de exploração, tais como, leite, pele e carne. Além disso, tem se destacado como uma atividade geradora de emprego, renda e segurança alimentar para o homem do campo. Contudo, ainda é desenvolvida em sistemas extensivos com reduzida aquisição de tecnologias (COSTA; LACERDA; FREITAS, 2010). No Brasil, segundo o IBGE (2010) a ovinocultura é uma atividade desenvolvida em todos os Estados, que juntos perfazem um total de cabeças, destacando-se as regiões Sul e Nordeste que são criadoras tradicionais de ovinos, como as maiores produtoras de carne, enquanto a região Norte participa com apenas cabeças, constituindo a região com menor produção. O desenvolvimento da ovinocultura na região Norte representa uma opção viável de rentabilidade econômica para os produtores, uma vez que deste animal se aproveita tudo, a carne, a pele, o leite e as vísceras, que são apreciadas na culinária da região como panelada e buchada. Além disso, é uma atividade que não necessita de grandes investimentos e o dinheiro empregado retorna às mãos do produtor num curto período, pois um rebanho ovino atinge rapidamente o peso de abate, quando comparado aos bovinos. Ademais, as condições climáticas da região são favoráveis ao desenvolvimento da criação de ovinos, de modo que, esses fatores são importantes para que a atividade se estabeleça como geradora de renda. A exploração de ovinos tem se tornado uma alternativa promissora para o agronegócio brasileiro, uma vez que o Brasil conta com reduzida oferta no consumo interno da carne e ainda, dispõe de grandes áreas de pastagens, mão de obra barata e rebanho expressivo (MADRUGA et al., 2005). Assim, poderia contribuir para o desenvolvimento econômico do país, devido apresentar algumas vantagens em detrimento à criação de bovinos, especialmente em se tratando da área de ocupação e o manejo. A rusticidade dos animais e a adaptabilidade às adversidades ambientais torna esta atividade importante aos pequenos e médios produtores, propiciando aumento na renda familiar (COSTA; LACERDA; FREITAS, 2010). Baseada nesta perspectiva, criadores do Estado do Tocantins tem investido na ovinocultura, que vem apresentando um crescimento significativo no efetivo rebanho (JARDIM e MENEZES, 2009).

16 16 Diante disso, a ovinocaprinocultura no Tocantins tornou-se lucrativa para os produtores por contribuir com a melhoria na qualidade de vida da população do campo, ao gerar empregos e incrementar a renda familiar, mas ainda não é desenvolvida como a principal atividade das propriedades rurais. Em geral os animais são adaptados às instalações, pastos utilizados anteriormente por bovinos, revelando simplicidade da criação (LOPES et al., 2008). Segundo dados do IBGE (2010), o Tocantins possui um rebanho ovino constituído por cabeças, o qual não é suficiente para abastecer o mercado. Desta forma, produtores vem buscando diversificação de suas propriedades investindo na atividade. Além disso, o Estado conta com condições ambientais propícias à exploração de ovinos (JARDIM e MENEZES, 2009). Assim, a criação de ovinos no Tocantins é uma realidade com boa perspectiva de crescimento nos próximos anos, uma vez que dispõe de forrageiras de boa qualidade, avanço na organização dos serviços veterinários oficiais, com consequente controle de doenças infectocontagiosas, facilitando o comércio de animais (MOURA SOBRINHO et al., 2008). Mesmo que se reconheçam melhorias nos serviços veterinários oficiais no Estado e no país, ainda é possível observar que a sanidade dos rebanhos ovinos, deixa a desejar, devido à existência de doenças infectocontagiosas como lentiviroses (maed-visna), leptospirose, linfadenite caseosa, febre catarral maligna e brucelose, ocasionando prejuízos econômicos e danos à saúde do animal e do homem. Segundo Moura Sobrinho et al. (2008), doenças parasitárias e infecciosas ainda são consideradas como o principal entrave para o desenvolvimento da ovinocultura. Portanto, para que a ovinocultura seja promissora e se consolide como uma atividade rentável no Estado é fundamental o estabelecimento de um manejo sanitário adequado e rigoroso, pois várias são as enfermidades que podem acometer os ovinos, como a brucelose, que afeta principalmente os órgãos genitais dos animais, ocasionando perdas econômicas, em consequência dos distúrbios reprodutivos, além de ser uma importante zoonose. No Brasil, estudos epidemiológicos e programas de controle de doenças infecciosas em ovinos, como a brucelose, são restritos. Entretanto, esta enfermidade tem demonstrado importância devido ao aumento da criação de ovinos e do conhecimento do agente como causador de doença (LIRA e MEGID, 2009). Por se

17 17 tratar de uma doença de grande impacto socioeconômico, decorrentes dos distúrbios reprodutivos e, devido a falta de estudos sobre brucelose em ovinos do Estado do Tocantins é de suma importância à realização de estudos soroepidemiológicos para implantação de medidas racionais de controle, visando reduzir as taxas de prevalência ou erradicar a doença.

18 18 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 1.1 Importância A saúde humana e animal estão intimamente relacionadas. O ser humano precisa dos animais para sua alimentação, desenvolvimento socioeconômico e como companhia. Contudo, os animais podem transmitir doenças ao homem, sendo estas denominadas de zoonoses, dentre as quais pode-se citar a brucelose (PESSEGUEIRO; BARATA; CORREIA, 2003). A brucelose é uma enfermidade infectocontagiosa de caráter antropozoonótico, causada por bactérias do gênero Brucella spp., considerada como um problema de grande impacto socioeconômico e sanitário, sendo responsável por desordens reprodutivas nos animais, tais como, diminuição na produção de leite, infertilidade, nascimentos de descendentes fracos e abortamentos, enquanto no homem causa febre intermitente com perda da capacidade de trabalho (CASTRO; GONZALEZ; PRAT, 2005; GUL e KHAN, 2007). Na saúde pública é considerada doença ocupacional que acomete principalmente trabalhadores de matadouros, laboratoristas, açougueiros e veterinários, ou seja, pessoas que trabalham direta ou indiretamente com os animais (MUKHTAR, 2010), sendo que várias espécies podem provocar sequelas e até morte no homem (LEÓN, 1994). A brucelose ovina é uma enfermidade de grande impacto na pecuária, pois acomete os órgãos genitais dos animais, sendo que nos machos ocasiona lesões como epididimite, orquite e vesiculite, enquanto nas fêmeas provoca vaginocervicite e endometrite associadas a abortamentos esporádicos (ARIAS e CÁRDENAS, 2007), além de ocasionar nascimento de animais fracos e morte perinatal, resultando em baixos índices reprodutivos (ESTEIN, 1999). Diante disso, a infecção por bactérias do gênero Brucella spp. é uma das causas mais importantes de problemas reprodutivos em animais domésticos, sendo que as perdas econômicas geradas pela brucelose vão além dos problemas reprodutivos, podendo citar as barreiras internacionais ao comércio de produtos de origem animal e perdas para as indústrias devido condenação de leite e carne, diminuição no preço da carne, leite e derivados, além de gastos com programas de controle, prevenção e pesquisas (JARDIM et al., 2006).

19 Histórico David Bruce, médico britânico, no ano de 1886 em Malta, isolou a bactéria causadora da febre ondulante, denominando de Micrococcus mellitensis. Bang e Stribolt, no ano de 1896, demonstraram que abortos em vacas haviam sido causados por um bacilo e, em 1905, Zammit, bacteriologista em Malta, evidenciou a presença de bactérias no leite de cabras, demonstrando seu potencial zoonótico e associou esse agente com o encontrado por Bruce. Entretanto foi em 1918 que Evans observou que havia um parentesco entre os agentes isolados por Bruce e Bang. Finalmente, em 1920, agruparam-se estes agentes no gênero Brucella spp., designando as espécies mellitensis e abortus. A denominação deste gênero foi uma homenagem a Bruce (CARVALHO, et al., 1995). Somente no ano de 1952 foi relatada B. ovis como agente causador de epididimite em ovinos por Budle e Boyes na Austrália (LÉON, 1994). No Brasil, os primeiros casos de brucelose foram reportados no ano de 1914 em bovinos no Rio Grande do Sul por Danton Seixas, e no Ceará em 1917, causando abortamentos em bovinos, equinos e ovinos (PAULIN e FERREIRA NETO, 2002). Posteriormente, pesquisas constando a prevalência nas regiões brasileiras foram divulgadas pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) em Entre os anos de 1988 e 1998, as taxas de prevalência relatadas foram de 4% e 5% (BRASIL, 2006). Quanto à brucelose em ovinos, causada por B. ovis, foi reportada em 1966, por Ramos no Rio Grande do Sul (RAMOS et al., 1966 apud CARVALHO JUNIOR et al.,2010). 1.3 Agente etiológico As brucelas são cocobacilos ou bacilos curtos (possuem entre 0,5 e 1,5 µm de comprimento), gram-negativos, parasitas intracelulares facultativos, não encapsuladas, imóveis, não formadores de esporos (GUL e KHAN, 2007). A estrutura das brucelas é constituída por uma parede celular rica em lipopolissacarídeos (LPS), componente mais abundante, também denominado de endotoxina; uma membrana citoplasmática interna constituída de glicoproteínas; e um espaço periplasmático (CASTRO; GONZALES; PRAT, 2005).

20 20 O gênero Brucella spp. inclui sete espécies: B. mellitensis, B. abortus, B. suis, B. canis, B. ovis, B. neotomae e B. microti (XAVIER et al., 2009), mas novas espécies foram incluídas no gênero durante alteração realizada pelo International Committee on Systematics of Procaryotes, Subcommittee on the Taxonomia of Brucella, sendo essas, B. ceti, B. pinnipedialis e B. inopinata (ICSP, 2010). Tal classificação baseia se nas características bioquímicas, patogenicidade e preferência por determinado hospedeiro (GODFROID et al., 2005; XAVIER et al., 2009). As brucelas crescem em meios cujo ph é alcalino, enriquecidos com 7% de sangue ou soro, em uma atmosfera com 10 a 20% de dióxido de carbono em cultivo primário (ROBLES, 1998). Baseado no aspecto das colônias em cultivo primário, as diferentes espécies são classificadas em lisas, como B. mellitensis, B. abortus, B. suis, B. neotomae; ou rugosas, como B. canis e B. ovis (CASTRO; GONZALES; PRAT, 2005). Essa morfologia está associada à composição bioquímica dos lipopolissacarídeos de membrana, que estão relacionados à virulência das espécies (BRASIL, 2006). A viabilidade desses micro-organismos, na ausência de parasitismo, depende das condições ambientais (LAGE et al., 2008). Diante disso, Brucella spp. pode resistir no ambiente por longos períodos, principalmente quando as condições de umidade, ph e temperatura são favoráveis, sendo que tais bactérias tem seu crescimento e multiplicação inibidos a 5ºC, mas podem resistir ao congelamento. Temperaturas acima de 63ºC e ph abaixo de quatro podem destruí-las. Ademais, são sensíveis à maioria dos desinfetantes comuns, como hipoclorito de sódio, álcool, formol e fenol (PESSEGUEIRO; BARATA; CORREIA, 2003). 1.4 Epidemiologia Distribuição A brucelose possui distribuição cosmopolita, sendo a prevalência variável em várias partes do mundo, como Ásia Ocidental, África e América, destacando-se como espécies mais prevalentes no mundo B. mellitensis, seguida B. abortus e B. suis (CASTRO; GONZALEZ; PRAT, 2005). No Brasil, a espécie de maior ocorrência é B. abortus, em bovinos, sendo as taxas de prevalência obtidas com Antígeno Acidificado Tamponado (AAT) e 2-Mercaptoetanol (2-ME) bastante variáveis,

21 21 estando entre 1,74% em Goiânia (ACYPRESTE et al., 2002) e 10,25% no Pará (MINERVINO et al., 2011), enquanto a brucelose em ovinos por B. mellitensis é de menor importância, pois trata-se de uma doença exótica, tendo maior relevância a infecção por B. ovis (POESTER et al., 2002). A brucelose ovina está presente em todos os países onde a ovinocultura é uma atividade de importância econômica (ROBLES, 1998), sendo que B. ovis foi reportada na Austrália, América do Norte e do Sul, Nova Zelândia, África do Sul e em vários países da Europa (OIE, 2012). A brucelose em pequenos ruminantes causada por B. abortus foi relatada em alguns países, como Venezuela (ARIAS et al., 2007), Egito, Índia, Emirados Árabes Unidos, Sudão e Omã (GUL e KHAN, 2007); Brasil (PEIXOTO et al., 2008), e, México (TORRES et al., 1997). No Brasil alguns autores realizaram estudos de prevalência para B. ovis e obtiveram diferentes resultados, dependentes do método de diagnóstico utilizado. Desta forma, por meio da Imunodifusão em Gel de Ágar (IDGA), Azevedo et al. (2004) obtiveram 11,3% de prevalência no Rio Grande do Norte, Pinheiro Junior et al. (2009) obtiveram 3,1% em Alagoas e Silva et al. (2009) obtiveram 3,27% de prevalência na Bahia, enquanto Nozaki et al. (2004) utilizando IDGA e ELISA, não obtiveram nenhum animal sororreagente em São Paulo e Clementino et al. (2007), por meio da IDGA e Fixação de Complemento (FC), encontrou 5,57% de sororreagentes no Semiárido da Paraíba Cadeia Epidemiológica Fonte de Infecção A infecção por Brucella spp. pode acometer animais domésticos e silvestres, estes últimos são reservatórios essenciais para persistência dos focos de infecção nas espécies domésticas, especialmente bovinos, bubalinos, caprinos, ovinos, equinos, suínos, caninos (GUL e KHAN, 2007). Dentre esses, os ungulados são considerados reservatórios naturais, servindo como fonte de infecção e manutenção do agente em ambientes sem interferência humana (PAULIN, 2003). Quase todos os animais domésticos podem ser acometidos pela brucelose, à exceção dos gatos, que são mais resistentes à infecção (GUL e KHAN, 2007). Além desses, animais marinhos também podem ser infectados (CASTRO; GONZALEZ; PRAT, 2005; XAVIER et al., 2009).

22 22 As espécies de Brucella spp. não possuem especificidade ao hospedeiro, mas parecem ter predileção a determinados animais. Assim, B. abortus acomete preferencialmente bovinos, enquanto B. mellitensis, B. suis, B. ovis e B. canis, acometem os caprinos, suínos, ovinos e canídeos, respectivamente (RIBEIRO; MOTTA; ALMEIDA, 2008); B. ceti e B. pinnipedialis acometem mamíferos marinhos (XAVIER et al., 2009). Desta forma, B. abortus infecta geralmente bovinos, podendo acometer outras espécies, como bubalinos, suínos, equídeos, caprinos, ovinos e caninos, sendo que nos suínos a doença é transitória e amena, servindo como fonte de infecção para bovinos; nos bubalinos a brucelose é semelhante a doença dos bovinos, ocorrendo abortamento e inflamação do trato genital; ovinos e caprinos também podem ser acometidos, embora os caprinos sejam mais resistentes à infecção e os equídeos sejam considerados hospedeiros terminais, manifestando abscessos de cernelha (PAULIN, 2003). B. ovis infecta naturalmente os ovinos. Todavia, em condições experimentais, caprinos foram infectados, mas a doença foi de baixa gravidade e de curta duração. Já em condições naturais, não foi comprovado à ocorrência da enfermidade em caprinos e outros animais (ESTEIN, 1999). Animais silvestres, como os cervídeos podem funcionar como reservatórios para B. abortus, contribuindo com a propagação da doença entre animais domésticos e outros animais. A doença nem sempre se manifesta em animais silvestres, considerados apenas hospedeiros terminais, podendo a infecção ser oriunda de bovinos (ELISEI et al., 2010) No ser humano a ocorrência da doença está diretamente relacionada com a proximidade dos animais, principalmente com os ruminantes e cães, que podem, direta ou indiretamente, transmitir o agente (MANCILLA et al., 2008) Vias de Eliminação Os animais assintomáticos e os que apresentam sinais clínicos da brucelose são capazes de eliminar o agente por meio das excreções e secreções corporais (MEGID; MATHIAS; ROBLES, 2010), tais como leite, secreções vaginais, prepuciais, sêmen, anexos placentários e fetos abortados (CASTRO; GONZALEZ; PRAT, 2005; ESTEIN, 1999; MANCILLA et al., 2008), nos quais sêmen, anexos placentários e

23 23 fetos abortados são considerados as principais vias de eliminação por conterem grande quantidade de bactérias (LAGE et al., 2008). Ocholi et al. (2005) conseguiram isolar B. abotus de secreção vaginal de ovelhas que sofreram abortamentos e de ovelhas prenhes. Ademais, também isolaram o mesmo agente no leite de vacas, sugerindo que a ocorrência da doença em ovinos esteja relacionada à criação consorciada de ovinos e bovinos. Segundo Estein (1999), os machos são os principais reservatórios da B. ovis, sendo o sêmen essencial na transmissão do agente. O mesmo autor ainda relata que as fêmeas são mais resistentes à infecção, e logo após o parto os sinais da doença podem desaparecer e estas aparentarem uma recuperação, entretanto, continuam eliminando o agente pelas secreções vaginais e uterinas. Contudo, Clementino et al. (2007) relataram que machos e fêmeas possuem a mesma probabilidade de serem acometidos pela brucelose Meios de Transmissão A transmissão da brucelose pode ocorrer por contato direto com tecidos de animais infectados e por via transplacentária; e por contágio indireto pela ingestão de alimentos e água contaminados (CASTRO; GONZALEZ; PRAT, 2005), fômites e inseminação artificial (BRASIL, 2006). A principal forma de transmissão para B. ovis em ovinos é a via venérea durante a monta natural, mas também há transmissão entre os machos pela lambedura do prepúcio (ESTEIN, 1999). Nos bovinos e bubalinos a transmissão venérea tem pouca importância, uma vez que o sêmen é depositado na vagina e não diretamente no útero. Com isso, as barreiras inespecíficas da vagina impedem o micro-organismo de chegar ao útero (BRASIL, 2006). No homem a transmissão da doença está relacionada principalmente ao contato direto com os animais ou com suas secreções, por meio de lesões cutâneas, aerossóis, inoculação conjuntival e ingestão de produtos derivados do leite (PESSEGUEIRO; BARATA; CORREIA, 2003) Porta de entrada

24 24 A penetração das brucelas no organismo dos hospedeiros pode ocorrer pelas vias digestiva, respiratória e pelas mucosas conjuntival, prepucial e vaginal, além da pele lesionada (BRASIL, 2006). Nos ovinos, a principal porta de entrada para B. ovis é a mucosa genital; já para B. abortus é por via digestiva, durante a ingestão de alimento ou água contaminados (LIRA e MEGID, 2009). Para bovinos e bubalinos, a via digestiva é considerada a principal porta de entrada do micro-organismo, mas também a respiratória pode servir como via de acesso ao organismo do hospedeiro (BRASIL, 2006). 1.5 Patogenia As alterações clínicas causadas pela Brucella spp. são variáveis e dependentes da espécie e do hospedeiro (XAVIER et al., 2009), mas geralmente as lesões são encontradas nos órgãos reprodutores e tecido retículo-endotelial. As lesões no trato reprodutor, na placenta e no feto de bovinos, ovinos, suínos e caprinos levam à infertilidade, associadas ou não ao abortamento (OCHOLI et al., 2005). Tais lesões são decorrentes do processo patológico da doença, que se iniciam com a entrada do agente pelas mucosas. Em seguida, o agente é transportado livremente ou dentro dos macrófagos através dos vasos linfáticos, aos linfonodos regionais, onde se multiplica ativamente e permanece por dias a meses. A partir daí, circula na corrente sanguínea, caracterizando um quadro agudo de bacteremia, que pode ocorrer durante vários períodos, favorecendo a disseminação da bactéria por todo organismo, especialmente nos órgãos ricos em células fagocitárias, como fígado, linfonodos, baço, bem como pulmões e rins, nos quais pode ocasionar lesões inflamatórias e anatomopatológicas, como hiperplasia linfoide, granulomas difusos, esplenomegalia, hepatomegalia e endocardite (BRASIL, 2006; LIRA e MEGID, 2009; PAULIN, 2003). Devido à preferência das brucelas por eritritol, álcool utilizado pelo micro-organismo como fonte de energia para seu crescimento, a maioria das lesões se concentra nos órgãos genitais (BRASIL, 2006; GUL e KHAN, 2007). Com a evolução da doença, o agente pode se estabelecer de forma crônica no trato genital, trinta dias após a infecção (BRASIL, 2006; CARTRO; GONZÁLEZ;

25 25 PRAT, 2005; PAULIN, 2003; ROBLES, 1998). Segundo Pessegueiro; Barata e Correia (2003), micro-organismos que provocam doença crônica, como é o caso das brucelas, encontram-se protegidos no interior dos macrófagos e do retículo endoplasmático rugoso de células inflamatórias, conferindo a capacidade de evitar ou suprimir a resposta imunológica, devido o agente possuir a capacidade de impedir a formação do fagolisossoma (GROSS et al., 2003) e degranulação de neutrófilos (CASTRO; GONZÁLEZ; PRAT, 2005). Assim, a invasão dos fagócitos contribui com a disseminação do agente para outros órgãos que não os genitais, como baço, fígado, coração e ossos, bem como para a sobrevivência da bactéria (GROSS et al., 2003). 1.6 Sinais Clínicos A brucelose em ovinos é uma doença infecciosa crônica causada especificamente por B. ovis (ROBLES, 1998), caracterizada por induzir lesões genitais, caracterizadas por epididimite e sêmen de qualidade variável (MEGID; MATHIAS; ROBLES, 2010), podendo resultar em subfertilidade ou infertilidade nos machos (CARVALHO JUNIOR et al., 2010), abortamentos nas fêmeas e mortalidade de cordeiros (XAVIER et al., 2009). B. mellitensis e, raramente, a B. abortus podem causar a doença em ovinos, sendo que a ocorrência dessas bactérias nesses animais está associada à criação consorciada de caprinos, bovinos e ovinos (OCHOLI et al., 2005), ademais, B. mellitensis não foi diagnosticada no Brasil (BRASIL, 2006). As lesões causadas por B. ovis se restringem ao trato reprodutor de fêmeas e machos, concentrando-se no epidídimo, testículo e vesículas seminais (CARVALHO JUNIOR et al., 2010; PAULIN, 2003), enquanto nas fêmeas B. ovis ocasiona cervicite e endometrite, podendo ou não estar associada a abortamentos (CARVALHO JUNIOR et al., 2010). O curso inicial da brucelose ovina é caracterizado por um quadro febril, desgaste físico, dispneia e inflamação dos órgãos genitais, sendo que nestes tecidos, a infecção pode se manifestar de forma aguda ou crônica (MEGID; MATHIAS; ROBLES, 2010). Nos casos agudos, os testículos apresentam-se aumentados de tamanho, há edema, exsudato fibrinoso na região da túnica vaginal, hiperemia testicular e edema do epidídimo. Por outro lado, na fase crônica há o surgimento no

26 26 de regiões hipertrofiadas e endurecidas à palpação testicular, deformações na cauda do epidídimo e a bolsa escrotal pode apresentar aderências fibrosas, obstruindo a cavidade que separa as túnicas (ROBLES, 1998). B. ovis pode provocar epididimite e redução da fertilidade dos carneiros, com sêmen de má qualidade, que apresenta concentração e motilidade espermática reduzidas (ESTEIN, 1999). A má qualidade do sêmen se deve à presença de lesões palpáveis no epidídimo, principalmente quando ambos estão afetados, pois a epididimite pode ser uni ou bilateral, mas comumente é unilateral, e as lesões testiculares são sempre secundárias à epididimite, ocorrendo principalmente atrofia testicular. Alterações nas vesículas seminais podem ser encontradas, incluindo edema e aumento de volume (CARVALHO JUNIOR et al., 2010). As lesões causadas pela B. abortus são mais intensas no útero de vacas e búfalas, onde há grande concentração de eritritol. À medida que este atinge concentração máxima na proximidade do parto, ocorre multiplicação do agente, que libera toxinas, resultando em lesão necrótica dos placentomas, prejudicando a circulação materno-fetal e ocasionando abortamento, especialmente quando a necrose é mais intensa. Quando a necrose é mais amena, o resultado é a retenção placentária (PAULIN, 2003). Nos machos, as lesões são semelhantes àquelas provocadas por B. ovis, tais como, reações inflamatórias uni ou bilaterais do epidídimo, testículo e vesícula seminal, com aumento de volume ou atrofia dos órgãos. Além disso, B. abortus pode provocar inflamações articulares, como as bursites (PAULIN, 2003) e, no homem, febre, dores articulares, sudorese, calafrios e ocasionalmente, inflamações dos órgãos genitais e endocardites (BORGES et al., 2009). Lira e Megid (2009) relataram que as manifestações da doença podem ser macroscópicas e microscópicas, restritas principalmente aos órgãos genitais. Nos machos infectados, os testículos podem não apresentar alteração ou podem estar aumentados pela presença de granulomas espermáticos. O epidídimo com contornos irregulares e firmes à palpação, decorrente de fibrose ou mineralização, e a bolsa escrotal espessa e com fibrosamento que impossibilita a mobilidade dos testículos. Ao corte histológico do epidídimo é possível a observação de edema intersticial com infiltrado perivascular de linfócitos, hiperplasia, degeneração hidrópica do epitélio e formação de granulomas constituídos de neutrófilos,

27 macrófagos, células gigantes e espermatozoides fagocitados. Os testículos podem apresentar edema, degeneração e calcificação dos túbulos seminíferos Diagnóstico A brucelose em animais de produção não possui um tratamento específico, pois as brucelas são intracelulares facultativas, requerendo o uso de antibióticos com boa penetração durante períodos prolongados, além da utilização combinada de classes desses medicamentos. Assim, o tratamento se torna inviável devido aos custos e muitas vezes os sinais clínicos não desaparecem, reduzindo apenas o surgimento de complicações (ESTEIN, 1999). Diante disso, o diagnóstico preciso e seguro se torna necessário para implantação de um controle racional e erradicação da doença (MÓLNAR et al., 2002). O diagnóstico de maior confiabilidade é obtido por meio do isolamento e identificação do micro-organismo em animais suspeitos (PINHEIRO JUNIOR et. al., 2008), a partir de amostras de sêmen, leite, secreções vaginais, anexos placentários, fígado, pulmão, linfonodos, testículos, epidídimo e vesículas seminais (BRASIL, 2006), utilizando-se meios comuns, como ágar sangue, ou seletivos, como Thayer- Martin, sendo a incubação em atmosfera controlada com 5%-10% de CO 2 em temperatura de 37ºC por um período de 7 a 14 dias. A identificação baseia-se na forma, aspecto, tamanho das células bacterianas individuais e das colônias, além das provas bioquímicas e características tintoriais (PAULIN, 2003). Entretanto, essa técnica possui sensibilidade limitada, alto custo e execução demorada. Diante disso, os métodos indiretos baseados em testes sorológicos são amplamente utilizados em programas de controle e erradicação da doença (JARDIM et al., 2006). Os testes AAT, 2-ME e FC são as principais provas laboratoriais para detectar anticorpos anti-b. abortus e anti-b. mellitensis (FERREIRA et al.,2003). O teste de Polarização Fluorescente (TPF) foi aprovado pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA) como teste confirmatório para cepas lisas (BRASIL, 2010). O AAT é uma técnica de triagem, que consiste numa prova de aglutinação antígeno-anticorpo, usado no diagnóstico de cepas lisas e em estudos epidemiológicos, sendo que os resultados positivos nesta técnica devem ser confirmados por outros testes, como o 2-ME ou FC (PESSEGUEIRO; BARATA;

28 28 CORREIA, 2003). O 2-ME tem como função inibir as reações inespecíficas decorrentes de IgM, melhorando a especificidade da técnica sem perda de sensibilidade (NOZAKI et al, 2004), enquanto a FC é utilizada para identificar anticorpos da classe IgG, de alta especificidade. Tais provas, associadas aos testes de triagem, aumentam a especificidade do diagnóstico (PESSEGUEIRO; BARATA; CORREIA, 2003). Ainda, a FC é uma prova de custo relativamente de baixo, pois utiliza reagentes disponíveis no país, não requerendo o uso de materiais e equipamentos importados (MATHIAS; MEIRELLES; BUCHALA, 2007), sendo considerado o teste confirmatório de maior compatibilidade com os testes bacteriológicos, ao detectar casos crônicos da doença quando as concentrações de IgG 1 estão baixas e ao eliminar IgM ( PAULIN, 2003). A polarização fluorescente é usada no diagnóstico de B. abortus, baseado na diferença das velocidades rotacionais entre as moléculas em solução, como complexo antígeno-anticorpo-conjugado e antígeno-conjugado isolado. O complexo que é maior gira a uma velocidade menor, resultando em uma lenta despolarização da luz, enquanto o antígeno-conjugado isolado, molécula menor, possui velocidade de rotação maior, fazendo com que a despolarização da luz seja mais rápida. A mudança de velocidade de rotação das moléculas é feita por um analisador de polarização fluorescente. A utilização de controles e soros titulados previamente permite o cálculo da quantidade de anticorpos no soro testado (BRASIL, 2006). Essa prova possui alta sensibilidade e especificidade, sendo rápido e de fácil execução, desde que praticado por pessoal treinado, embora requeira equipamentos e reagentes importados e mais caros que os testes convencionais determinados como padrão pelo MAPA. Mesmo assim devem ser adotados pelo Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose (PNCEBT), devido a confiabilidade e o desempenho do teste (MATHIAS et al., 2010). Segundo Nozaki et al. (2004), para o diagnóstico da B. ovis, o método de IDGA sem o tratamento dos soros dos animais testados com o 2-ME é altamente sensível. No entanto, Nozaki et al. (2011), ao estudarem a IDGA e o teste de Soroaglutinação Rápida (SRA), verificaram que a IDGA detectou menor número de animais positivos, mas foi capaz de identificar a positividade durante a fase crônica da doença, enquanto a SRA detectou maior número de animais positivos durante a fase aguda da doença. Com isso, os autores sugerem que essas técnicas devem ser usadas como testes de triagem para se detectar a presença de animais positivos em

29 29 rebanhos ovinos em diferentes fases da doença, destacando, ainda, que nos animais que apresentarem sintomatologia da doença, deve-se associar a IDGA e o exame clínico dos animais para o diagnóstico. Outros testes de diagnóstico podem ser utilizados, como Ensaio Imunoenzimático (ELISA) indireto e competitivo, e Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Para ELISA indireto são utilizados diversos protocolos, fazendo-se uso de kits comerciais contendo lipopolissacarídeos da parede celular das brucelas, sendo considerado de alta sensibilidade e especificidade semelhante aos testes de triagem (BRASIL, 2006). O ELISA competitivo é uma técnica rápida e prática que possibilita a distinção entre animais vacinados e não vacinados, porém é oneroso assim como o indireto (PAULIN, 2003). Trata-se de uma técnica rápida, a qual analisa várias amostras de uma só vez e de alta sensibilidade. Segundo Nozaki et al. (2004), a utilização das técnicas de ELISA e IDGA para o diagnóstico de B. ovis é mais confiável, uma vez que, juntos, proporcionam maior sensibilidade. A PCR é uma técnica complementar para o diagnóstico de brucelose a partir de material abortado, secreções do trato genital e excreções corporais, que detecta um segmento de DNA específico de Brucella spp. no material analisado, sendo considerada de alta sensibilidade e especificidade. Trata-se de uma técnica de custo mais elevado que requer extração do DNA alvo e definição dos primers dentro da sequência de DNA para melhores resultados (ELISEI et al., 2010). Mesmo diante de tantos testes de diagnósticos, ressalta-se que se faz necessário o diagnóstico diferencial entre a epididimite dos carneiros causada por B. ovis e outras causadas por Actinobacillus seminis e Haemophilus somnus (CARVALHO JUNIOR et al., 2010). Além disso, pode haver reações cruzadas nos testes de triagem para diagnóstico de cepas lisas e rugosas, gerando reações falsopositivas devido os antígenos serem compostos por estruturas presentes na parede celular das brucelas semelhantes às de outras bactérias gram-negativas, como Yersinia spp., Salmonella spp., Escherichia coli e Pseudomonas spp. (BRASIL, 2006). Dentre os testes supracitados, a IDGA e a FC são recomendados pelo MAPA para o diagnóstico de epididimite dos carneiros causada por B. ovis, sendo IDGA utilizado para triagem e o FC como confirmatório (BRASIL, 2004).

30 Prevenção e controle As medidas de prevenção e controle para brucelose em bovinos e bubalinos se apoiam em dois pilares, vacinação e diagnóstico, os quais permitem reduzir ou evitar a exposição dos animais ao agente e aumentar a resistência do rebanho às brucelas (JARDIM et al., 2006). Com isso, o PNCEBT determina a vacinação obrigatória de fêmeas entre 3 e 8 meses com a vacina B19 que contém amostra de B. abortus lisa, sendo também utilizada a vacinação de animais adultos com a RB51 constituída por amostra de B. abortus rugosa, em casos especiais, abate sanitário dos sororreagentes ao AAT e confirmados no 2-ME ou FC, controle do trânsito de animais, feito somente com certificado de teste negativo, interdição de propriedades com focos de brucelose e certificação de propriedades livres e monitoradas (BRASIL, 2006). A vacinação com RB51 somente é realizada em fêmeas com idade superior a 8 meses que não foram vacinadas com B19 entre 3 e 8 meses ou em adultas não reagentes aos testes de diagnóstico, em propriedades com focos de brucelose (BRASIL, 2007). Tais medidas são utilizadas pelo Plano Nacional de Vigilância e Controle da Epididimite Ovina (PNVCEO), com exceção da vacinação, que não existe para ovinos no país. Assim, o programa determina que o diagnóstico da B. ovis seja obtido por meio da realização da IDGA como prova de triagem em laboratórios credenciados e da FC como confirmatório, realizado somente por laboratórios oficiais. Assim, animais positivos pelo teste de IDGA e confirmados pela FC devem ser destinados ao abate sanitário, seguido de visita e interdição do estabelecimento onde ocorreu o caso (BRASIL, 2004). Segundo mesmo autor, o trânsito e a participação de animais machos não castrados, acima de seis meses, em feiras e exposições, se faz mediante a apresentação da guia de trânsito (GTA) acompanhado de testes negativos, sendo o IDGA conclusivo para o trânsito e válido durante o período do evento. Ainda como medida de controle, o programa prevê a certificação de propriedades livres de epididimite, obtido mediante três testes de IDGA negativos consecutivos e com intervalos semestrais, em todos os ovinos machos não castrados, com idade acima de seis meses, e eutanásia dos animais positivos. A certificação tem validade de 24 meses, durante os quais são realizados testes sorológicos semestralmente. Terminado os 24 meses, a certificação poderá ser

31 31 renovada, mediante a realização de testes sorológicos na categoria animal descrita acima (BRASIL, 2004). Algumas medidas, como evitar o contato de animais de propriedades não livres de epididimite, quarentena e realização de testes sorológicos para aquisição de novos lotes, seguido da desinfecção das propriedades, estão previstas em tal programa. Diante disso, o controle da infecção por B. ovis, deve se basear na eliminação dos machos com diagnóstico bacteriológico e/ou sorológico positivo (ESTEIN, 1999).

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37 37 UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS PREVALÊNCIA DE ANTICORPOS ANTI-B. ovis E ANTI-B. abortus EM OVINOS DO MUNICÍPIO DE COLINAS, TOCANTINS, BRASIL NEKITA ÉVELY XIMENES MARTINS ARAGUAÍNA/TO 2012

38 38 RESUMO Prevalência de anticorpos anti-b. ovis e anti-b. abortus ovinos do município de Colinas, Tocantins, Brasil A brucelose é uma enfermidade de caráter infeccioso, causada por bactérias do gênero Brucella spp., responsáveis por desordens reprodutivas nos animais, especialmente nos ruminantes. Devido à importância desta doença, objetivou-se determinar a soropositividade de ovinos para Brucella ovis e Brucella abortus em 14 propriedades cadastradas na associação de ovinocultores do município de Colinas, Tocantins, Brasil. Para isso, amostras de soro de 450 ovinos foram analisadas por meio da aglutinação rápida em placa com Antígeno Acidificado e Tamponado (AAT) e quando reagentes foi realizado o teste de Aglutinação Lenta em Tubos (SAT) e o 2-Mercaptoetanol (2-ME), para pesquisar cepas lisas (B. abortus); já para pesquisa de cepas rugosas (B. ovis) foi realizada a Imunodifusão em Gel de Agar (IDGA) e quando reagentes foi realizada a Fixação de Complemento (FC). Das amostras analisadas 142 (31,55%) reagiram ao teste de IDGA, dentre estas, apenas 4 (2,81%) foram confirmadas na FC; e por meio do AAT, apenas 20 (4,44%) foram positivas, das quais, 14 (70%) foram confirmadas no 2-ME. Os resultados obtidos em todos os testes sorológicos e, analisados pelo Teste de Fisher e OR demonstraram significância estatística entre a positividade e a faixa etária, sendo maior a chance de um animal em reprodução ser positivo para brucelose. Palavras chaves: Brucelose; epididimite; testes sorológicos.

39 39 ABSTRACT Prevalence of anti-b. ovis and anti-b. abortus in sheeps in the city of Colinas, Tocantins, Brazil Brucellosis is an infectious disease caused by bacteria of the genus Brucella spp. responsible for reproductive disorders in animals, especially ruminants. Considering the importance in of this disease, there search aimed to determine the seroprevalence of brucellosis in sheep of 14 registered properties of the Sheep Breeders Association in the city of Colinas, Tocantins, Brazil. Were collected 450 serum samples from ovines, analyzed by rapid plate agglutination with Acidified Buffered Antigen and with there agent samples was performed the technique of Slow Agglutination in tubes (SAT) and 2-Mercaptoethanol (2-ME), to search for smooth strains (Brucella abortus); the search for rough strains (Brucella ovis) was performed with Agar Gel Immunodiffusion (AGID) and with reagent samples was performed the Complement Fixation (CF).Of the analyzed samples 31.55% were reagent to the AGID test, among these, only 2.81% were confirmed positive by the CF test; in the analyzed sera by rapid plate agglutination with Acidified Buffered Antigen, 4.44% were positive, among these, 70% were confirmed positive in 2-ME test. The obtained results in all serological tests, and analyzed by Fisher's test, showed statistical significance and OR between positivity and age, showing that here was a greater chance of occurrence of brucellosis of in a reproduction animal. Keywords: Brucellosis; epididymitis; serological tests

40 40 1 INTRODUÇÃO O gênero Brucella spp. inclui sete espécies, B. mellitensis, B. abortus, B. suis, B. canis, B. ovis, B. neotomae e B. microti (XAVIER et al., 2009), mas as novas espécies B. ceti, B. pinnipedialis e B. inopinata foram incluídas no gênero durante alteração recente realizada pelo International Committee on Systematics of Procaryotes, Subcommittee on the Taxonomia of Brucella (ICSP, 2010). A brucelose em ovinos é uma doença infecciosa crônica, causada especificamente por B. ovis (ROBLES, 1998) e caracterizada por lesões genitais, resultando em epididimite e sêmen de qualidade variável (MEGID; MATHIAS; ROBLES, 2010). Dessa forma, pode resultar em subfertilidade ou infertilidade nos machos (CARVALHO JUNIOR et al., 2010), abortamentos nas fêmeas e mortalidade de cordeiros (XAVIER et al., 2009). B. mellitensis e raramente B. abortus também podem causar a doença em ovinos, estando a ocorrência dessas bactérias associada à criação consorciada de caprinos, bovinos e ovinos (OCHOLI et al., 2005). B. mellitensis ainda não foi diagnosticada no Brasil (BRASIL, 2006). Os animais domésticos e silvestres são importantes fontes de infecção, principalmente os ruminantes, ao excretarem grande quantidade de bactérias junto com os anexos placentários, leite e secreções genitais, os quais constituem as vias de eliminação do agente (CASTRO; GONZALEZ; PRAT, 2005). A transmissão da brucelose pode ocorrer por contato direto com tecidos de animais infectados e pela via transplacentária; e por contágio indireto pela ingestão de alimentos e água contaminados (CASTRO; GONZALEZ; PRAT, 2005), fômites e inseminação artificial (BRASIL, 2006), sendo a via venérea a principal forma de transmissão (ESTEIN, 1999). Já a penetração das brucelas no organismo dos hospedeiros se dá pelas vias digestiva, respiratória e pelas mucosas conjuntival, prepucial e vaginal, além da pele lesionada (BRASIL, 2006), destacando-se a mucosa genital para B. ovis e a via digestiva para B. abortus (LIRA e MEGID, 2009). As lesões causadas tanto por B. ovis quanto por B. abortus se restringem ao trato reprodutor, sendo que nos machos se concentram no epidídimo, testículo e vesículas seminais (CARVALHO JUNIOR et al., 2010; PAULIN, 2003), enquanto nas fêmeas B. ovis ocasiona cervicite e endometrite, podendo ou não está associada a abortamentos (CARVALHO JUNIOR et al., 2010), ao passo que B. abortus

41 41 geralmente estar envolvida em abortamentos e retenção plancetária, principalmente em vacas e búfalas (PAULIN, 2003). Assim, percebe-se uma predileção das brucelas pelo trato genital, no qual se encontra maior disponibilidade de eritritol, um álcool que é utilizado pelo micro-organismo como fonte de energia para seu crescimento (GUL e KAN, 2007). A brucelose em animais de produção não possui um tratamento específico (ESTEIN, 1999), por isso o diagnóstico preciso e seguro se torna necessário para implantação de um controle racional e erradicação da doença (MÓLNAR et al., 2002).O diagnóstico mais confiável da doença é obtido por meio do isolamento e identificação do micro-organismo em animais suspeitos (PINHEIRO JUNIOR et al., 2008). Entretanto, essa técnica possui sensibilidade limitada, alto custo e execução demorada. Diante disso, os métodos indiretos baseados em testes sorológicos são amplamente utilizados em programas de controle e erradicação da doença (JARDIM et al., 2006). Os testes do Antígeno Acidificado Tamponado (AAT), 2-Mercaptoetanol e Fixação do Complemento (FC) são as principais provas para detectar anticorpos anti-b. abortus e anti-b. mellitensis (FERREIRA et al., 2003). Já o teste de Polarização Fluorescente (TPF) foi aprovado pelo MAPA como teste confirmatório para cepas lisas (BRASIL, 2010). O diagnóstico da B. ovis é realizado por meio da Imunodifusão em Gel de Agar (IDGA), teste padrão de triagem utilizado nos laboratórios credenciados pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), além do teste de Fixação de Complemento como confirmatório para B. ovis (BRASIL, 2004). Mesmo diante de tantos testes, reações cruzadas na triagem para diagnóstico de cepas lisas e rugosas podem resultar em falsos positivos, devido aos antígenos serem compostos por estruturas presentes na parede celular das brucelas semelhantes às de outras bactérias gram-negativas, como Yersinia spp., Salmonella spp., Escherichia coli e Pseudomonas spp. (BRASIL, 2006). Considerando-se a escassez de dados sobre a ocorrência da brucelose e devido à ovinocultura garantir uma complementação da renda do pequeno produtor rural de Colinas, Estado do Tocantins, objetivou-se determinar a presença de anticorpos anti-brucella ovis e anti-brucella abortus em ovinos oriundos das propriedades rurais cadastradas na associação de ovinocultores daquele município.

42 42 2 MATERIAL E MÉTODOS 1.1 Área de estudo O município de Colinas faz parte da microrregião de Araguaína, estando situada a 277m de altitude em relação ao nível médio do mar, com latitude de ºS e longitude de ºW. A região está sob domínio climático tropical úmido, com temperatura média de aproximadamente 26º C, caracterizado por apresentar períodos de estiagem e períodos mais chuvosos, principalmente durante os meses de dezembro, janeiro e fevereiro (COLINAS, 2011). O trabalho foi realizado em 14 propriedades com criação de ovinos, cadastradas na associação de ovinocultores do município de Colinas, Estado do Tocantins, Brasil, as quais receberam visitas da equipe envolvida na pesquisa para coleta das amostras de sangue e aplicação de questionários aos produtores rurais, no período compreendido entre os meses de março a maio de 2010 e 2011, com a finalidade de diagnosticar a brucelose nos ovinos. 1.2 Animais e Coleta das Amostras O rebanho experimental foi constituído por animais mestiços, considerando-se duas categorias produtivas: jovens e animais em reprodução. Dentro de cada categoria, foram examinados 20% do total de animais em cada propriedade, exceção feita aos machos reprodutores, que foram examinados em sua totalidade. Para o cálculo da amostra utilizou-se o programa Epi Info 6.04 (Programa Integrado para uso em Epidemiologia), considerando-se a possibilidade de detecção da doença de 50% (correspondente a doenças de ocorrência desconhecida em determinada população), tendo como intervalo de confiança 95% e um erro estatístico de 5%, resultando em N amostral de 369 animais, ao qual foi acrescido 10% para reduzir potenciais perdas. Ao final, foram coletados, aleatoriamente, 450 amostras de sangue de ovinos, sendo 120 animais jovens e 330 em reprodução. As amostras foram obtidas assepticamente por punção da veia jugular externa, totalizando um volume de 10 ml por animal, sendo coletadas em tubos de ensaio sem anticoagulante. Terminada a coleta, as amostras foram transportadas em caixa isotérmica com gelo reciclável, ao Laboratório de Higiene e Saúde Pública da Universidade Federal do Tocantins, Campus de Araguaína, onde foram

43 43 centrifugadas a 800g por 10 minutos para separação dos soro, que foi aliquotado em microtubos de poliestireno em duplicata e armazenados a -20ºC até o momento da realização dos testes sorológicos. 1.3 Inquérito Epidemiológico Em cada propriedade foi aplicado um questionário epidemiológico para consecução de informações relativas à alimentação, fonte de água, sistema de criação, distúrbios reprodutivos, manejo sanitário, assistência técnica, contato com outros animais e conhecimento da doença em ovinos. 1.4 Testes sorológicos Para pesquisa de cepas lisas foi realizada como teste de triagem a prova de aglutinação rápida em placa com AAT. Quando reagentes na triagem, os soros foram submetidos aos testes SAT e 2-ME, segundo protocolo do manual técnico do PNCEBT. Para pesquisa de cepas rugosas (B. ovis) foi realizada a IDGA, sendo que os soros reagentes foram submetidos ao teste confirmatório de FC Prova de aglutinação rápida em placa com Antígeno Acidificado e Tamponado (AAT) Para realização da prova do AAT, as amostras de soro foram deixadas à temperatura ambiente por 30 minutos antes do início do teste. Posteriormente foram homogeneizadas para a retirada de 30 µl de soro, que foi disperso em placa de vidro para reação com 30 µl de antígeno, proveniente do TECPAR obtido por intermédio da Agencia de Defesa Agropecuária do Tocantins (ADAPEC), constituído de suspensão de B. abortus amostra corado com rosa bengala, diluído a 8,0% em solução tamponada em ph 3,63. O homogeneizado do soro testado e antígeno foi agitado por quatro minutos; na mesma placa ainda foram testados soros controles positivo e negativo. A leitura foi realizada em caixa de luz com fundo escuro, considerando-se positivo o soro capaz de aglutinar o antígeno e negativo o soro que não houve aglutinação do antígeno (Figura 1); os soros positivos nesta prova foram subsequentemente testados pela prova de aglutinação lenta em tubo, com e sem redução pelo 2-Mercaptoetanol.

44 44 Figura 1- Reações negativa (à esquerda) e positiva (centro para direita) no Antígeno Acidificado Tamponado Teste do 2-Mercaptoetanol (2-ME) Para a realização da SAT com e sem redução pelo 2-ME foram necessários dois conjuntos de quatro tubos, totalizando oito tubos para cada amostra de soro. Esses recipientes foram posicionados em prateleiras, formando duas filas devidamente identificadas, de modo que a primeira recebeu um T indicando pertencer a SAT; e segunda fila foi marcada com um M, correspondente ao 2-ME. Em cada um dos tubos foram adicionadas sequencialmente as quantidades de 80 µl, 40 µl, 20 µl e 10 µl de soro a testar. Seguindo-se com a prova, foram adicionados a cada um dos quatro tubos da prova lenta 2 ml de antígeno diluído 1:100 (0,045% de células) em salina fenicada a 5%. Em cada tubo das fileiras M foi acrescentado 1 ml de solução de 2-ME 0,1M (diluição em salina sem fenol), seguido de homogeneização e repouso por 30 minutos; decorrido esse tempo foi acrescentado a cada um dos tubos da fileira M 1 ml de antígeno diluído a 1:50 (0,09% de células) em salina sem fenol. Posteriormente, todas as fileiras (T e M) foram homogeneizadas, envoltas em papel alumínio e colocadas na estufa a 37 C durante 48 horas. A leitura foi realizada em caixa com iluminação indireta, sendo apreciada a clarificação da coluna líquida de cada tubo e a existência de grumos resistentes a uma suave agitação dos tubos. Assim, esses dois aspectos classificaram a reação como positiva completa (+), quando o líquido da mistura soro-antígeno aparecia translúcido ou claro e a agitação

45 45 suave não rompia os grumos (Figura 2); incompleta (I), quando a mistura soroantígeno aparecia parcialmente translúcida e uma suave agitação não rompia grumos (Figura 3); ou negativa (-), quando a mistura soro-antígeno aparecia turva e a agitação suave do tubo não revelava grumos (Figura 2) (BRASIL, 2006). Figura 2 - Reação positiva completa (à esquerda) e reação negativa (à direita) no teste 2- Mercaptoetanol. Figura 3 - Reação incompleta no teste 2-Mercaptoetanol.

46 Imunodifusão em Gel de Agar (IDGA) Os soros obtidos foram testados por IDGA para a detecção de anticorpos anti- B. ovis, fazendo-se a utilização dos kits comerciais provenientes do TECPAR, com antígeno composto por lipopolissacarídeos e proteínas de B. ovis, amostra Reo 198. A técnica foi realizada conforme recomendado pelo fabricante. Assim, antes da reação foi preparado o gel, seguindo com a deposição de 4,5mL do mesmo em lâminas microscópicas, que permaneceram em temperatura ambiente até a sua solidificação. Posteriormente, o gel foi perfurado com um molde padrão, formando um orifício central e outros seis em torno deste. Terminado a perfuração foram adicionados alternadamente, 25 µl do soro controle padrão e 25 µl dos soros dos animais a testar, nos orifícios periféricos e 25 µl do antígeno no orifício central. Depois de preparadas, as lâminas foram incubadas em câmara úmida por 48 horas, seguindo-se com a leitura em sistema de luz indireta e fundo escuro. A positividade da reação foi determinada pela formação de uma linha de identidade entre os soros testados e o antígeno (Figura 4) e a reação negativa quando não houve formação da linha de identidade (Figura 5) Figura 4- Reações positivas nos orifícios 1, 2 e 3 na Imunodifusão em Gel de Agar.

47 Figura 5- Reações negativas nos orifícios 1, 2 e 3 na Imunodifusão em Gel de Agar Fixação de Complemento Para confirmação dos testes positivos obtidos na IDGA empregou-se a FC, realizada no Laboratório de Diagnóstico de Brucelose do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva da Universidade Estadual Paulista, Campus de Jaboticabal, conforme descrição de Alton et al. (1988). A técnica realizada foi a microfixação, com incubação a 37º nas duas fases da reação e cinco unidades hemolíticas do complemento 50%. O complemento utilizado foi o soro de cobaio, com sistema hemolítico formado por hemácias de carneiro sensibilizadas com hemolisina (anticorpo de coelho contra hemácias de carneiro). A interpretação da prova foi baseou-se na formação de um botão de hemácias no fundo dos poços (Figura 6), levando-se em consideração o grau de hemólise. Os títulos dos soros foram determinados pela recíproca da maior diluição que apresentou 50% ou menos de hemólise, de modo que para a classificação dos resultados em positivos e negativos adotou-se a diluição 1:4 como ponto de corte.

48 48 Figura 6 Reações positiva (presença do botão de hemácias) e negativa na Fixação de Complemento. 2.5 Análise Estatística Para o cálculo da frequência de cada cepa dividiu-se o número de animais sorologicamente positivos pelo número de animais amostrados, utilizando-se análise estatística descritiva por meio de distribuição absoluta e relativa. Para avaliação dos resultados frente às categorias (animais jovens e em reprodução) utilizou-se o teste exato de Fisher, sendo ainda calculado Odds Ratio com intervalo de confiança de 95% para verificação da idade como possível fator de risco ou proteção. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa estatístico Graphpad Prism, versão 5.04, adotando-se um nível de significância de 5%.

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