Métodos e Técnicas em Parasitologia Clínica

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1 Métodos e Técnicas em Parasitologia Clínica Populações que não dispõem de água potável correm alto risco de infecções (Foto OMS). Habitação rústica infestada de insetos triatomíneos e habitada por pacientes com a Doença de Chagas. Áreas endêmicas de malária no Brasil Doenças do sistema respiratório (6%) Causas desconhecidas e outras (12%) Doenças Infecciosas e parasitárias (33%) A OMS mostrou que as principais causas de morte no mundo (1997) eram as doenças infecciosas e parasitárias, responsáveis por 33% de todos os óbitos. Vinham, em 2º lugar, as doenças do sistema circulatório (29%) e, em 3º, os cânceres (12%). Importância do diagnóstico Prevalência significativa no mundo (OMS) NTD Doenças Tropicais Negligenciadas Doenças do sistema circulatório (29%) Cânceres (12%) Causas peri e neonatais (7%) Causas maternas 585 (1%) 1

2 Expectativas do diagnóstico Métodos laboratoriais Médico diagnóstico acurado. Paciente conforto na coleta, poucas coletas. Laboratório custo x benefício (baixo custo, fácil interpretação, rapidez, simplicidade). Recurso indispensável para o diagnóstico das infecções Estudo dos parasitos Epidemiologia Relação parasito-hospedeiro Critérios de cura Exame parasitológico do sangue Exame parasitológico do sangue Hemoscopia Doenças parasitárias com estágios no sangue. Malária, filariose, doença de Chagas. Parasito vivo ou fixado e corado. Mais indicado o uso de material fresco método executado imediatamente após colheita de sangue. Coleta do sangue Punção da polpa digital ou lóbulo da orelha. Punção venosa. Exame parasitológico do sangue Exame parasitológico do sangue Exame direto Gota no centro da lâmina coberta com lamínula. Adicionar salina ou citrato. Avaliação imediata. Visualização de parasitos vivos movimentação dos flagelos agitam hemácias. Tripanossomos Escassez de parasitos ou pouca mobilidade preparação de lâminas fixadas e coradas. Preparação de lâminas Gota espessa Parasitos escassos. 3 ou 4 gotas de sangue próximas espalhadas de forma circular. Gota estendida Distensão de uma gota sobre a lâmina. 2

3 Exame parasitológico do sangue Xenodiagnóstico Preparação de lâminas Corantes Diagnóstico de Doença de Chagas. Giemsa necessário fixação prévia com álcool metílico. Leishman não é necessário fixação com álcool (presente na fórmula). Método introduzido por Brumpt em 1914 é largamente empregado ainda nos dias atuais no diagnóstico da doença de Chagas. Xenodiagnóstico Multiplicação do T. cruzi no trato digestivo do triatomíneo permite sua detecção nas fezes ou na urina dos insetos alimentados com sangue do paciente ou de animais suspeitos. Utilização de ninfas de 3 o a 5 o estágio de desenvolvimento, as quais são criadas em condições controladas em laboratório, sendo portanto livres do parasita. Xenodiagnóstico 1. Ninfas de 3 o a 5 o estágio 2. Ninfas em jejum alimentar de 20 a 30 dias. 3. Pequenas caixas cobertas com tela, aplicadas diretamente sobre o hospedeiro por 30 a 60 minutos (humamos, a caixa é aplicada no antebraço). 4. Exame dos insetos para pesquisa do T. cruzi é realizada aos 30 e 60 dias após o repasto sangüíneo. 1. Exame macroscópico verificar a consistência das fezes, presença de muco, sangue ou vermes adultos. 1. Métodos quantitativos avaliar intensidade da parasitemia. Kato-Katz Coprotest 2. Exame microscópico - ovos ou larvas de helmintos - Cistos ou trofozoítos 2. Métodos qualitativos presença de parasitas. Método direto Métodos de enriquecimento número pequeno de formas parasitárias eliminadas. 3

4 Escolha do método: Não existe método único capaz de identificar todos os parasitos. Métodos gerais: 1. Sedimentação espontânea (Hoffman, Pons e Janner HPJ). 2. Centrifugação (MIFC e Coprotest). Maioria dos pedidos não é relatada a suspeita clínica: > Realização de um dos métodos gerais Relato de suspeita clínica: > Método geral e método específico devem ser realizados Melhor exame: 1. Fácil execução 2. Menor tempo 3. Identificação de maior número de parasitos Qualidade dos exames: 1. Técnica correta 2. Um exame isolado negativo não deve ser conclusivo 3. Produção de cistos, ovos ou larvas não é constante e uniforme CADASTRO DO PACIENTE: - Número de registro de identificação do paciente gerado pelo LAB - Nome completo do paciente; - Tipo de convênio; - Idade, sexo; - Telefone e/ ou endereço do paciente; - Nome e contato do responsável em caso de menor de idade ou incapacitado; - Nome do solicitante; - Data e hora do atendimento; - Horário da coleta, quando aplicável; - Exames solicitados e tipo de amostra; - Informações adicionais: medicamento em uso (laxantes, antiácidos, ingestão de meios de contrastes) - Data prevista para entrega do laudo; DADOS CLÍNICOS - Origem geográfica do paciente; - Deslocamento em áreas endêmicas (com datas); - Antecedentes parasitários; - Tratamento já recebidos; - Resultados anteriores ( fezes hemograma ); - Suspeita clínica. Coleta e conservação 1. Evacuação deve ser feita em recipiente limpo e seco e as fezes transferidas para recipiente próprio. 2. Fezes sem conservador devem ser enviadas ao laboratório imediatamente. 3. Coleta de amostras múltiplas dias alternados e utilização de conservador. 4

5 O laudo deve conter no mínimo: LAUDO a) identificação do laboratório; Conservadores: Formol 10% MIF (mercurocromo, iodo e formol) SAF- fixador usado para conservar cistos e trofozoitos. Coloração Lugol Iodo, iodeto de potássio e água destilada. Utilizada para corar ovos, cistos e larvas. b) endereço e telefone do laboratório; C) identificação do RT; D) número de registro do RT no respectivo conselho; E) identificação do profissional que liberou o exame; F) número de registro do laboratório no respectivo conselho; G) nome e registro de identificação do cliente no laboratório; H) data da coleta da amostra; i) data de emissão do laudo; J) nome do exame, tipo de amostra e método analítico; K) resultado do exame; L) limitações técnicas da metodologia e dados para interpretação; M) observações pertinentes. LAUDO CONTROLE DE QUALIDADE Resultado - Negativo No material examinado, não foram encontrados ovos ou larvas de helmintos, nem cistos ou trofozoitos de protozóarios. Resultado - Positivo Presença de Ovos de Ascaris lumbricoides Cistos de Giardia duodenalis Método Empregado: Direto, Lutz ou HPJ, Kato-Katz. Observações: coleta amostra única três amostras em dias alternados. Controle Interno da Qualidade: duplo cego; amostra aleatória. Controle Externo da Qualidade; Devem ser documentados!!! Exame direto a fresco: 1. 2 a 3 gotas de salina em lâmina. 2. Tocar comum palito vários pontos das fezes, transferindo para a lâmina. 3. Espalhar as fezes na lâmina. 4. Para identificação de cistos de protozoários e larvas de helmintos corar com lugol. 5. Examinar a lâmina com objetiva de 10X e/ou 40X. Técnica com baixa sensibilidade Sedimentação espontânea (Hoffman, Pons e Janer ou Lutz): 1. 2g de fezes em um frasco Borrel e 5 ml de água, triturar bem. 2. Acrescentar mais 20 ml de água. 3. Filtrar a suspensão em cálice utilizando gaze dobrada em quatro e lavar os detritos com mais 20 ml de água. 4. Completar o volume do cálice (200 ml) com água. 5. Deixar a suspensão em repouso de 2 a 24h. 6. Sobrenadante límpido, colher uma amostra do sedimento utilizando pipeta. 7. Corar a lâmina com lugol e examinar em objetivas de 10X e/ou 40X. 5

6 Sedimentação por centrifugação (MIFC) 1. Colher as fezes em MIF. 2. Homogeneizar bem, 3. Filtrar a suspensão em gaze dobrada em quatro. 4. Transferir 1 a 2 ml do filtrado em tubo cônico de centrifugação. 5. Adicionar 4 a 5 ml de éter sulfúrico e agitar vigorosamente (desengordurar o material). 6. Centrifugar a 1500 rpm por 1 minuto. 7. Descartar o sobrenadante. 8. Adicionar uma gota de lugol ao sedimento e recolher uma parte para análise em lâmina e cobrir com lamínula. Coprotest sedimentação por centrifugação 6

7 Faust Centrífugo-Flutuação g de fezes em 20 ml de água (homogeneizar bem). 2. Filtrar em gaze e transferir para um tubo de hemólise. 3. Centrifugar a rpm por 1 minuto. 4. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em água. (Repetir esta operação até o sobrenadante fique claro) 5. Ressuspender o sedimento em solução de sulfato de zinco a 33%. (densidade = 1,18 g/ml) 6. Centrifugar novamente. Faust Centrífugo-Flutuação Os cistos e alguns oocistos de protozoários e ovos leves de helmintos ficarão na película superfícial. Retirar com alça de platina, adicionar uma gota de lugol e analisar em lâmina. Baermann-Moraes 1. Colocar 8 a 10 g de fezes em uma gaze dobrada. 2. Colocar sobre um funil fechado com um tubo de borracha. Adicionar água (45 C) ao funil em quantidade suficiente para entrar em contato com as fezes. 3. Deixar uma hora em repouso. 4. Recolher 5 a 7 ml de água em tubo e centrifugara rpm por 1 minuto. 5. Colher o sedimento sem desprezar o sobrenadante, adicionar o lugol e examinar ao microscópio. (avaliar a presença de larvas) Rugai 1. Retirar a tampa do recipiente que acondiciona as fezes e envolvêlo em gaze (fazendo uma pequena trouxa). 2. Colocar o material com a abertura para baixo num cálice de sedimentação com água aquecida (45 C). 3. Deixar uma hora em repouso. 4. Colher o sedimento no fundo do cálice, corar com lugol e observar ao microscópio. 7

8 Kato Katz 1. Preparar uma solução de verde malaquita (conservar as fezes e clarificar as formas parasitárias). 2. Cortar papel celofane semipermeável em pedaços de 24X30mm e deixá-los mergulhados na solução de verde malaquita por pelo menos 24 horas. 3. Comprimir as fezes com um pedaço de tela meiálica. Nesta malha passam ovos de helmintos e detritos menores do que eles. 4. Retirar as fezes que passaram para a parte superior da tela e transferi-las, com o auxílio de um palito, para o orificio (6mm de diâmetro) de um cartão retangular de plástico, colocado sobre uma lâmina de microscopia. Kato Katz 5. Após encher completamente o orificio, retirar o cartão, cuidadosamente, deixando as fezes (aproximadamente 42mg) sobre a lâmina de vidro. 6. Cobrir as fezes com a lamínula de papel celofane embebida na solução de verde malaquita, inverter a lâmina, sobre uma folha de papel absorvente e comprimi-la. 7. Aguardar uma a duas horas e examinar ao microscópio. Exame quantitativo número de ovos encontrados X 23 = opg Método de Graham (fita gomada) 1. 5 a 6 cm de fita adesiva transparente com tiras de papel nas extremidades para identificação. 2. Colocar a fita sobre o fundo de um tubo de ensaio com o lado adesivo voltado para fora. 3. A porção aderente deve ser encostada várias vezes à mucosa da região perianal, e em seguida colar na lâmina. 4. Examinar a lâmina em microscópio. Material deve ser colhido de manhã, antes que o paciente se levante ou realize qualquer tipo de higiene. Indicado: Adulto e ovos de E. vermiculares e proglotes de T. saginata. Resistência natural Mecanismos protetores passivos Revestimento cutâneo Mucosas Conjuntiva ocular e secreção lacrimal Temperatura do corpo Tensão do O 2, ph e potencial de oxi-redução Substratos para crescimento e desenvolvimento indisponíveis Ausência de mecanismos que estimulam desencistamento, eclosão do ovo ou desenvolvimento larvário Ausência de receptores (aderência e endocitose) Imunidade Anticorpos protetores ou funcionais reação com Ag parasitário levando à morte ou bloqueio do desenvolvimento Anticorpos não-funcionais indicam presença, mas sem capacidade de eliminação ou controle utilidade diagnóstica!!! 8

9 Evasão dos parasitos ao sistema imunológico Schistosoma Mimetismo imunológico Superfície externa que reveste todo o corpo do verme adulto presença de antígenos semelhantes aos do hospedeiro (sistema ABO) Toxoplasma gondii Após fagocitose, impede a fusão dos lisossomos com o vacúolo de fagocitose. Taquizoítas Trypanosoma cruzi Experiência em ratos macrófagos com inumeros flagelados em multiplicação for a dos fagossomos. Mecanismo de escape Descamação e renovação da membrana externa - eliminação do complexo Ag-Ac. A demonstração da presença do parasito ou de seus produtos no organismo do hospedeiro nem sempre é possível Detectar antígenos, anticorpos ou imunocomplexos relacionados com a existência da infecção parasitária. Solução em alguns casos - métodos imunológicos Simplicidade e rapidez de execução Possibilidade de automação Baixo custo operacional Diagnóstico diferencial Padronização dos testes imunológicos - amostras de referência, positivas e negativas. Adequada escolha dessas amostras é importante para a definição da referência (padrão ouro) Inquéritos epidemiológicos 9

10 Dificuldade de padronização: Memória imunológica Pacientes com a doença Pacientes curados Pacientes que tiveram contato com o parasito mas não foram infectados Pacientes vacinados Frequente semelhança entre os antígenos constituintes dos parasitos ELISA enzimaimunoensaio Visualizar a formação do complexo imune através da atividade enzimática (peroxidade, fosfatase) Análise visual ou sistemas de detecção fotométrica Dot-Elisa Realizado em tira de nitrocelulose Western Blot Aplicado a proteínas - estas são separadas usando eletroforese em gel de poliacrilamida, na presença do detergente SDS. Imunofluorescência Formação de imunocomplexos visíveis através da ligação com anticorpos ligados com substâncias fluorescentes (isotiocianato de fluoresceína e rodamina B) Imunofluorescência direta pesquisa de antígenos Imunofluorescência indireta pesquisa de antígenos e anticorpos, amplifica sinal. Leitura: microscópio de fluorescência 10