Desenvolvimento de uma Ferramenta Web para análise automática de Cromatogramas

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1 Desenvolvimento de uma Ferramenta Web para análise automática de Cromatogramas Lariza Laura de Oliveira, Gisele Helena Barboni Miranda, Kelly Christiane Ynoue, Vitor Soares Pereira, Fernando Sequeira Sousa, Mariana Laureano de Souza, Luciano Ângelo de Souza Bernardes, Pablo Rodrigo Sanches, Silvana Giuliatti Departamento de Genética Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP) Universidade de São Paulo (USP), Brasil Resumo Neste trabalho, apresentaremos as principais características do desenvolvimento de uma ferramenta Web para análise automática de Cromatogramas. O aplicativo implementa um pipeline contendo as seguintes ferramentas: PHRED, PHD2FASTA, CROSSMATCH, CAP3 e BLAST. Em cada etapa é possível visualizar os resultados intermediários, como seqüências processadas, singlets, contigs, e alinhamento das seqüências. A ferramenta, denominada de sistema Gaia, armazena resultados em um banco de dados relacional, facilitando a recuperação de informações pelos usuários. A arquitetura clienteservidor utilizada possibilita maior portabilidade, uma vez que todo o processamento é realizado remotamente. Palavras-chave: Bioinformática, Análise de Cromatogramas, Alinhamento de Seqüências. Abstract This work presents the main development characteristics of a Web Tool for automatic analysis of Chromatograms. This tool implements a pipeline containing: PHRED, PHD2FASTA, CROSSMATCH, CAP3 e BLAST. In each stage it is possible to visualize the intermediate results, as sequence processing, singlets, contigs and sequence alignment. The tool, called Gaia, stores results in a relational database, facilitating the data restore by the users. The architecture client-server used makes greater possibility portability, once all the processing is carried through remotely. Key-words: Bioinformatics, Cromatogram Analysis, Sequence Alignment. Introdução A bioinformática lida, freqüentemente, com grande volume de informação, o que torna necessário o uso de técnicas computacionais que facilitem a manipulação e interpretação de dados [1]. Devido à popularização da Internet, diversos aplicativos desenvolvidos para bioinformática foram disponibilizados na Web. Uma grande facilidade desse tipo de aplicação é, geralmente, a independência da plataforma utilizada, sendo que o processamento é executado remotamente em servidores. O sistema Gaia, que será descrito nas próximas seções, tem o objetivo de facilitar o trabalho de pesquisadores da área de Bioinformática e Biologia Molecular na análise de dados oriundos de projetos de seqüenciamento de genes expressos, fornecendo uma ferramenta Web com uma interface amigável para manipulação e exibição dos resultados. O desenvolvimento do sistema ocorreu em parceria com profissionais do Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, que solicitaram a implementação da ferramenta. Desse modo, todo o desenvolvimento foi acompanhado pelos futuros usuários. O principal propósito do sistema é agregar um conjunto de ferramentas comumente empregadas na análise de Cromatogramas em um ambiente integrado, otimizando as tarefas diárias dos profissionais que necessitam desses aplicativos. Trabalhos Relacionados Em [2], são discutidas as etapas da implementação do sistema ASKGene, o qual é constituído por um pipeline semelhante ao deste trabalho. O pipeline apresentado é composto pelos seguintes aplicativos: PHRAP, PHRED, CROSSMATCH, CAP3 e BLAST. Em [3], também foi desenvolvido um pipeline semelhante, porém específico para a análise de expressão gênica do Trichophyton rubrum. Em [4], a utilização de Perl como linguagem de desenvolvimento de aplicativos para Bioinformática é ressaltada. Além disso, o trabalho apresenta a implementação de alguns pipelines para o problema de análise de ESTs (Expressed SequenceTags). Os artigos acima apresentados mostram que ferramentas semelhantes têm sido usadas com sucesso nos diversos problemas de

2 Bioinformática. Também, através dos artigos, é possível verificar que o presente trabalho utiliza ferramentas comumente empregadas pelos profissionais da área. Metodologia A seguir serão discutidas as técnicas utilizadas neste trabalho para implementar a ferramenta proposta. Pipeline A análise dos dados foi realizada através da implementação de um pipeline, composto pelos seguintes aplicativos: PHRED, PHD2FASTA, CROSSMATCH, CAP3 e BLAST. Inicialmente, são submetidos ao sistema, cromatogramas obtidos por meio do seqüenciador automático de DNA. São utilizados dois arquivos: o primeiro contém os cromatogramas compactados e o segundo um arquivo em formato FASTA contendo o vetor plasmidial utilizado. Os cromatogramas são então submetidos ao PHRED 1 [5], onde os sinais de fluorescência são mapeados em seqüências de bases e, ao final, são geradas seqüências no formato FASTA. Posteriormente, as seqüências FASTA geradas são agrupadas em um único arquivo através do PHD2FASTA [5]. Nesta fase, as regiões de maior qualidade são identificadas. As seqüências são, então, processadas e novos arquivos FASTA são gerados, contendo apenas a região de melhor qualidade (trimming). A seguir, as seqüências geradas são submetidas ao CROSSMATCH 2, que identifica as regiões pertencentes ao vetor, mascarando-as com X. Os arquivos FASTA são processados para retirada das regiões mascaradas. As seqüências processadas passam, agora, pelo CAP3 [6] que realiza a combinação (montagem) das seqüências, formando assim os singlets e contigs. Neste momento, têm-se as seqüências de genes expressos ainda sem anotação ou funções conhecidas. Com os singlets e contigs é feito o alinhamento, utilizando a ferramenta BLAST 3 [7], para realizar a comparação destas seqüências com o banco de proteínas não redundante do Genbank que se encontra instalado em um servidor local. O BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) consiste em um conjunto de programas de busca de similaridade criado para explorar todos os bancos de dados de seqüências disponíveis em relação à proteína e o DNA. Ele executa comparações de seqüências em pares, procurando regiões de similaridade local, ao invés de alinhamentos globais ótimos entre as seqüências inteiras. Uma pesquisa do BLAST em um banco de dados de seqüências resulta em uma lista de candidatos similares à seqüência submetida juntamente com os alinhamentos dos segmentos correspondentes. Ferramentas Auxiliares Para facilitar o processamento de arquivos, a linguagem escolhida para o desenvolvimento do sistema Web foi Perl, devido a sua grande aplicabilidade na área. As interfaces gráficas foram construídas em CGI (Common Gateway Interface) e HTML (HyperText Markup Language) para facilitar a integração com o pipeline implementado em Perl. O Sistema Gerenciador de Banco de Dados utilizado foi o MySQL 4 [8]. O modelo proposto está baseado na arquitetura cliente-servidor [9], no qual o servidor Web é responsável por todo o processamento e armazenamento de dados e os usuários são clientes utilizando seus navegadores. O servidor Web utilizado foi o Apache 5. Fluxo do Sistema Ao entrar no sistema o usuário deve fazer o upload de um arquivo compactado no formato zip contendo os cromatogramas, e um arquivo contendo o vetor de interesse utilizado na clonagem. As interfaces gráficas para visualização das etapas intermediárias do pipeline foram criadas. O usuário poderá ver as regiões de qualidade de todas as seqüências submetidas, assim como as regiões mascaradas com X, resultantes da atuação da ferramenta CROSSMATCH. Os resultados são exibidos no formato FASTA, facilitando o acesso aos mesmos. O banco de dados do sistema é responsável pelo armazenamento de todas as informações geradas por cada ferramenta durante a execução do pipeline. Também, armazena informações pessoais do pesquisador e de todos os projetos por ele criados. 1 Documentação disponível em: 2 Documentação crossmatch e phrap disponível em: 3 Documentação Blast disponível em: 4 MySQL: An open source database disponível em: 5 STRUTS, The Apache Struts Web Application Framework. Disponível em:

3 Figura 2. Interface gráfica de projeto, contendo as informações referentes a um projeto. A Figura 2 apresenta a interface gráfica de visualização de um determinado projeto. Pode-se observar que além de ter acesso aos arquivos de cromatogramas já submetidos, o pesquisador poderá também inserir novos arquivos. Também, é possível visualizar os resultados processados anteriormente, ou seja, a saídas das ferramentas executadas em projetos passados. Como por exemplo, as seqüências FASTA resultantes da execução e processamento das ferramentas intermediárias e a saída do BLAST. Figura 1. Interface inicial, contendo breve explicação sobre o pipeline. A Figura 1 apresenta uma das interfaces iniciais do sistema, onde o usuário pode encontrar uma breve descrição do pipeline executado. Como apoio ao usuário, o sistema implementado fornece as seguintes opções: um manual com a documentação completa do sistema e um guia de funcionamento do mesmo para nortear o usuário no processamento dos dados. Este manual está disponível em formato pdf para download no próprio site da ferramenta. Além disso, as questões mais freqüentes (FAQ's) foram elaboradas para atender às dúvidas dos usuários. Resultados A seguir, serão apresentadas algumas interfaces gráficas do sistema, juntamente com considerações sobre suas funcionalidades. Figura 3. Saída do CAP3: seqüências das quais foram retirados singlets e contigs, juntamente com suas posições. A Figura 3 mostra a saída do CAP3, onde é possível observar a montagem dos contigs, assim como conhecer as seqüências que os formam, juntamente com suas posições.

4 Figura 4. Sequências FASTA submetidas contendo a região de qualidade e a região que contém vetor. A Figura 4 apresenta as seqüências submetidas no formato FASTA. A região sem a presença de vetor foi marcada com a cor verde claro no plano de fundo, enquanto que a região de qualidade foi marcada com a fonte verde escuro. Ressalta-se também que a qualquer instante o usuário pode consultar a documentação do sistema, em caso de dúvidas. Também, é possível visualizar o tamanho de cada seqüência e das regiões de qualidade e sem presença de vetor. Figura 6. Singlets no formato FASTA. Nas Figuras 5 e 6 são mostradas as seqüências de singlets e contigs geradas pelo CAP3. Figura 7. Saída do BLAST. Na Figura 7, podemos observar a saída do BLAST para as seqüências de contigs. A visualização permite navegar facilmente entre as seqüências retornadas, facilitando o trabalho do usuário. Figura 5. Contigs no formato FASTA. Testes Realizados Segundo Pressman, teste é o processo de executar atividades com o objetivo de revelar a presença de defeitos; ou, falhando nesse objetivo, aumentar a confiança [10].

5 O sistema desenvolvido foi testado segundo a estratégia de teste caixa-preta [10]. Foram verificadas as saídas esperadas para possíveis padrões de entrada, com o objetivo de evidenciar inconsistências. A avaliação dos testes permite concluir que a ferramenta responde corretamente às inconsistências geradas, que simulam as interações usuário-sistema. Discussão e Conclusões O sistema Gaia constitui uma ferramenta útil para a atuação do profissional de bioinformática e biologia molecular, fornecendo um ambiente integrado para o estudo e processamento de dados oriundos de projetos de seqüenciamento de genes expressos. Desse modo, torna-se possível agilizar a utilização do conjunto de ferramentas utilizadas, uma vez que todas se encontram integradas no sistema. O sistema cumpre os requisitos propostos, fornecendo uma interface gráfica amigável e intuitiva ao usuário, utilizando formato padrão para a visualização de seqüências. Além disso, cabe ressaltar que novas alterações serão adicionadas e o sistema será aperfeiçoado de modo a atender a sugestões dos usuários, desse modo, haverá um refinamento dos requisitos inicialmente previstos. Agradecimentos Os autores agradecem a infraestrutura cedida pela Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP), para o desenvolvimento deste projeto. Referências [1] BALDI, P. & BRUNNAK, S. (1998). Bioinformatics: The Machine Learning Approach. Cambridge: MIT Press. [2] CARDIM, E. C.; REIS, WALLACE V. O.; CARELS, NICOLAS; FRIAS, D. ASKGene, a system for automate DNA processing. RECIIS - Electronic Journal in Communication, Information & Innovation in Health, v. 1, p. 100, [3] SANTANA, D. P. C.; SANCHES, P. R. ; MARTINEZ-ROSSI, N. M.. Pipeline Aplicado ao Processamento de Dados de Projetos de Sequenciamento de Genes expressos em Trichophyton rubrum. In: 14º Simpósio Internacional de Iniciação Científica da USP - SIICUSP, 2006, Ribeirão Preto. [4] VASCONCELOS, S. S. Uma investigação: ESTs podem ser usados para desenvolver marcadores moleculares baseados em introns?. Tese de Mestrado. Universidade Católica de Brasília, UCB-DF, Brasil. [5] EWING, B. & GREEN, P. Base-Calling of Automated Sequencer Traces using Phred. II. Error Probabilities, Genome Research, v. 8, p , [6] HUANG, X. & MADAN, A. CAP3: A DNA sequence assembly program. Genome Res, v. 9, p , [7] ALTSCHUL, S. F. et al. A basic local alignment search tool, Journal of Molecular Biology, v. 215, p , [8] ELMASRI, R. NAVATHE, S. B. Fundamentals of Database Systems. 3ª Edição Menlo Park: Addison-Wesley, p. [9] KUROSE, J. F. & ROSS, K. W. Redes de computadores e a Internet: Uma abordagem topdown. Trad. 3 ed., Addison Wesley, São Paulo, [10] PRESSMAN, R. Software Engineering: A practitioner s Approach. Sexta edição, McGraw- Hill, Contato Lariza Laura de Oliveira Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo Fone: (17)

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