Aulas práticas. Biologia Molecular Licenciatura Bioquímica. Trabalho 1. Extracção de DNA genómico de Drosophila melanogaster Semana: 6 8 de Março

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1 Aulas práticas Biologia Molecular Licenciatura Bioquímica Trabalho 1. Extracção de DNA genómico de Drosophila melanogaster Semana: 6 8 de Março Trabalho 2. Extracção de DNA plasmídico de Escherichia coli Semana: de Março Trabalho 3. Análise electroforética de DNA digerido com enzimas de restrição Semana: de Março Trabalho 4. Elaboração do mapa de restrição de um plasmídeo recombinante Semana: 3 5 de Abril Trabalho 5. PCR - Polimerase Chain Reaction Semana: de Abril Trabalho 6. Transformação de Escherichia coli com DNA plasmídico Semana: de Abril Trabalho 7. Sequenciação de DNA Semana: de Maio Trabalho 8. Clonagem de cdna γ-tub (Parte I) Semana: de Maio Trabalho 9. Clonagem de cdna γ-tub (Parte II) Semana: 5-7 de Junho 1

2 BIOLOGIA MOLECULAR I Protocolos Experimentais Cláudio Sunkel Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar Universidade do Porto 20012/2013 2

3 Precauções a ter nos trabalhos de Biologia Molecular Segurança pessoal Agentes químicos - Grande parte dos reagentes utilizados em Biologia Molecular são carcinogénicos, mutagénicos, tóxicos, inflamáveis ou altamente reactivos. Deve-se sempre consultar as indicações disponibilizadas pelos fabricantes ou através da internet: Radiações - Muitos trabalhos com ácidos nucleicos envolvem a utilização de nucleotides marcados radioactivamente, nomeadamente com 32 P. Agentes Biológicos O modelo biológico com que se trabalha pode ser patogénico. Materiais biológicos como anticorpos, hormonas e células podem conter agentes patogénicos e a manipulação de plasmídeos bacterianos pode levar a problemas de disseminação de resistência a antibióticos. Electricidade Uma das técnicas mais utilizadas na manipulação e análise de ácidos nucleicos e proteínas é a electroforese em que se empregam elevadas voltagens. Protecção do material em análise DNA e RNA É degradado por DNases (ou RNases) e é desnaturado reversivelmente com o aumento da temperatura. Proteínas São degradadas por proteases e desnaturadas irreversivelmente com o aumento da temperatura e, por vezes reversivelmente, com alterações de ph e agentes 3

4 químicos que promovam oxidação. Há inibidores químicos de RNAases e proteases disponíveis comercialmente que são de ampla utilização. Reagentes Devem ser de elevado grau de pureza (suitable for molecular biology), de modo a se encontrarem isentos de proteases, DNases e RNases. No entanto, estão sempre sujeitos a contaminação após abertura das embalagens por spatulas, poeiras, etc. Material de vidro A autoclavagem desnatura irreversivelmente as DNAases e as proteases. As RNases são apenas desnaturadas reversivelmente. Para as desnaturar de um modo irreversível, deve-se empregar calor seco prolongado: 180º C, durante ~12h. Material de plástico descartável Este material é isento de DNAases, RNAases e protease, sendo também sujeito a contaminações após a abertura das respectivas embalagens 4

5 AULA 1 Extracção de DNA genómico de Drosophila melanogaster O procedimento básico de qualquer protocolo de extracção de DNA envolve lise celular, com libertação de todo o material intracelular e purificação do DNA. O processo de rompimento das células é a parte do protocolo que mais varia se compararmos os diferentes métodos de extracção de diferentes materiais biológicos: bactérias, leveduras, células vegetais, células animais, etc. Com a lise celular, todos os compostos intracelulares são libertadas para a solução: proteínas, lípidos, polissacarídeos, ácidos nucleicos, moléculas orgânicas de baixo peso molecular e iões. Nos protocolos vulgarmente utilizados para a purificação de DNA genómico, a lise celular é geralmente promovida por rompimento mecânico ou se necessário por acção enzimática que cataliza a degradação da parede celular. Em ambos os casos, é frequente empregar-se um detergente para completar a lise. Assim, a purificação do DNA consistirá em libertar o DNA de todos os compostos referidos, o que é feito usualmente por precipitações diferenciais e acção de enzimas especificas como proteases e RNAases. Nas precipitações diferenciais, recorre-se geralmente a extracções repetidas com fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1, v/v/v), em que o fenol e o clorofórmio desnaturam as proteínas, ficando estas solubilizadas na fase orgânica enquanto os ácidos nucleicos permanecem na fase aquosa. Os passos posteriores de purificação baseiam-se na insolubilidade do DNA em etanol na presença de concentrações relativamente elevadas de catiões monovalentes. Em solução vão permanecer solutos orgânicos e resíduos de fenol e clorofórmio. Posteriormente, é utilizado etanol a 70%, no qual se dissolvem a maioria dos catiões, resultando DNA praticamente puro no precipitado. O DNA genómico extraído por estes processos pode ser usado para a construção de bancos genómicos, para análise de Southern blot, como molde para amplificação in vitro por PCR, entre outras aplicações moleculares possíveis. O DNA deve ser guardado solubilizado a 70 C (ou 20 C). No entanto, a congelação e descongelação sucessivas provoca quebras nas cadeias de DNA. Como tal, para armazenamento por longos períodos, o DNA deverá ser guardado em alíquotas. Se o armazenamento for por um curto período de tempo, é guardado a 4 C. Regra geral, o DNA é dissolvido, para 5

6 armazenamento, em tampão TE (ph 8,0) em que o EDTA previne a degradação do DNA por acção queladora de metais pesados e catiões que promovem a quebra das ligações fosfodiéster por acção das DNAases. 1. Extração de DNA genómico de Drosophila melanogaster Este trabalho tem por objectivo a continuação do isolamento de DNA genómico de Drosophila melanogaster, e a verificação das consequências da acção de tratamentos físicos sobre a integridade do DNA isolado. Foram recolhidas cerca de 200 moscas adultas, e homogeneizadas em 5 ml de tampão de lise previamente arrefecido em gelo. Tampão de lise: mm Tris-HCl (ph, 8.0) - 50 mm NaCl - 50 mm EDTA (ph, 8.0) - 1 % SDS - 0,15 mm espermina - 0,15 M espermidina O homogeneizado foi depois centrifugado a 1000 rpm, durante 1 minuto. O sobrenadante, correspondendo à suspensão de núcleos foi posteriormente transferido para um tubo Falcon. Adicionou-se 50 µl de solução de proteinase K (a 10 mg/ml) à suspensão de núcleos e procedeu-se à incubação a 37 ºC, durante 2 horas. O trabalho experimental a ser realizado compreenderá o isolamento de DNA genómico das moscas a partir da fracção de núcleos isolados e ressuspendida em 500 µl. 1. Adicionar 500 µl de solução de fenol equilibrado em tampão TE (10 mm Tris- HCl ph, 8.0; 1 mm EDTA ph, 8.0) à suspensão de núcleos. Agitar cuidadosamente por inversão do tubo. Centrifugar a 5000 rpm, durante 2 minutos e transferir a fase aquosa (correspondente à fase superior) para um novo tubo. 6

7 2. Adicionar 500 µl da mistura fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1, v/v/v) e agitar cuidadosamente por inversão do tubo. Proceder a uma nova centrifugação a 5000 rpm durante 2 minutos. A fase aquosa é novamente transferida para um novo tubo. 3. Adicionar 500 µl da solução de clorofórmio, repetindo-se a mistura da preparação por inversão dos tubos. Proceder a uma nova centrifugação a 5000 rpm durante 2 minutos. A fase aquosa é novamente transferida para um novo tubo. 4. Adicionar à fase aquosa 100 µl de solução de NaCl (1 M) e 900 µl de etanol absoluto frio, misturar bem e centrifugar a rpm durante 10 minutos a 4ºC. 5. Remover cuidadosamente o sobrenadante com uma micropipeta Adicionar ao DNA precipitado 500 µl de uma solução de lavagem de etanol 70% (frio) e centrifugar a rpm durante 2 minutos a 4ºC. 6. Remover cuidadosamente o sobrenadante como no passo 5, tentando eliminar todas as gotas de etanol que tenham ficado aderentes às paredes do microtubo. Deixar o microtubo aberto durante 5 minutos na estufa a 37ºC para secar completamente o sedimento. 7. Dissolver o sedimento em 50 µl de tampão TE. 8. Guardar a -20ºC. Determinação da concentração e grau de pureza do DNA O método mais usado para a determinação da concentração DNA é o método espectrofotométrico. Baseia-se na absorção de radiação ultravioleta, por parte dos ácidos núcleicos. A quantidade de radiação ultravioleta absorvida é directamente proporcional à quantidade de DNA na amostra. Assim, a leitura de absorvância a 260 nm é proporcional à quantidade de ácidos nucleicos, sendo a seguinte a proporcionalidade: Absorvância Equivalência ~50 µg/ml dsdna 260 nm ~37 µg/ml ssdna ~40 µg/ml ssrna 7

8 Para a determinação do grau de pureza a leitura da absorvância é feita a 280 nm que é proporcional à quantidade de proteínas e fenol presentes na amostra. O grau de pureza é calculado através da relação A260/A280 que deverá ser entre 1,8 e 2,2 para amostras consideradas puras. Para valores inferiores a 1,8, considera-se a amostra contaminada com proteínas e fenol. No entanto, por vezes a quantidade de DNA não é suficiente para ser determinada espectrofotometricamente (< 250 ng/ml), ou o DNA pode se encontrar intensamente contaminado com outras substâncias que absorvem no comprimento de onda ultravioleta (RNA por exemplo), impedindo uma correcta análise da amostra. Uma maneira rápida de estimar a quantidade de DNA em tais amostras é utilizar a fluorescência, induzida pela radiação ultravioleta, emitida pelo brometo de etídeo intercalado na cadeia de ácidos nucleicos. Como a quantidade de fluorescência é proporcional à massa total de DNA, a quantidade de ácidos nucleicos na amostra pode ser facilmente estimada por comparação da fluorescência da amostra com aquela de uma série de padrões. Um dos padrões que se pode utilizar é o DNA de λ clivado com HindIII, que produz uma gama de fragmentos com várias dimensões, correspondendo cada banda a uma concentração de DNA bem definida. 2. Determinação da concentração e grau de pureza do DNA por espectrofotometria 1. Ligar o espectrofotómetro e regular para 260 nm. 2. Fazer o zero da absorvância com 1 ml de água ultra-pura numa cuvette de quartzo. 3. Na mesma cuvette adicionar 695 µl de água ultra-pura e 5 µl da amostra de DNA (diluição de 140 ). Tapar a cuvette com parafilm e inverter várias vezes. 4. Fazer a leitura da absorvância a 260nm. 5. Repetir o procedimento e fazer a leitura a 280nm. 6. Calcular a concentração de DNA e o grau de pureza da amostra. 8

9 AULA 2 (continuação da aula anterior) Verificação da acção de tratamentos físicos sobre a integridade do DNA genómico Cada um dos grupos procederá às condições abaixo indicadas: 1. Retirar 10 µl da amostra de DNA genómico para um tubo eppendorf para posteriormente correr em gel. 2. Retirar 10 µl da amostra de DNA genómico para um tubo eppendorf e vortexar vigorosamente durante 2 minutos. Colocar em gelo. 3. Retirar 10 µl da amostra de DNA genómico para um tubo eppendorf e aquecer em água em ebulição, durante 10 minutos e depois arrefecer em gelo. 4. Retirar 10 µl da amostra de DNA genómico para um tubo eppendorf e sujeitar a múltiplas passagens através da ponta de uma pipeta e depois conservar em gelo. AULA 2 Extracção de DNA plasmídico de Escherichia coli Para além do seu DNA genómico (com cerca de 4 milhões de pares de bases) muitas bactérias possuem grandes quantidades de pequenas moléculas de DNA denominadas plasmídeos, as quais podem chegar a conter vários milhares de pares de bases. Estas moléculas de DNA, hoje em dia extremamente manipuladas pelo homem, revelaram-se bastante úteis em Engenharia Genética por permitirem numerosas aplicações moleculares. Algumas destas aplicações irão ser evidenciadas no decorrer das aulas práticas. Os plasmídeos bacterianos são moléculas de DNA extracromossómico, circulares de cadeia dupla e replicação autónoma. Nos habitats naturais, os plasmídeos são frequentes podendo conter genes que conferem aos seus hospedeiros características (fenótipos) que poderão constituir vantagem selectiva. Destes fenótipos, contam-se a resistência a antibióticos, a resistência a metais pesados, produção de enzimas de restrição, produção de toxinas, produção de aminoácidos raros e a produção ou catabolismo de moléculas orgânicas complexas. Muitos plasmídeos possuem ainda a capacidade de transferir o seu DNA para outros hospedeiros que 9

10 poderão ser de estirpes diferentes e, até de espécies diferentes por um processo denominado conjugação bacteriana na qual está envolvido um gene: mob. Na replicação dos plasmídeos estão envolvidos vários genes que poderão ser exclusivamente do genoma do hospedeiro ou então, deste e do próprio plasmídeo. Apesar da replicação ser independente da replicação do cromossoma bacteriano, depende sempre de enzimas e proteínas codificadas pelo hospedeiro para a sua replicação. O local de origem de replicação (ori) juntamente com os elementos de controlo cis constituem o replicon ou replicador. Para replicadores diferentes o mecanismo de replicação é diferente, podendo envolver mais ou menos genes (e consequentemente mais ou menos enzimas) do hospedeiro. Uma consequência do tipo de replicador do plasmídeo constitui uma propriedade extremamente importante: o número de cópias por célula. Plasmídeos cujo mecanismo de replicação não depende grandemente de proteínas codificadas exclusivamente pelo genoma são ditos multicópia (mais de 20 cópias). Por outro lado, os plasmídeos em que a replicação está fortemente dependente de proteínas do hospedeiro, apresenta um baixo número de cópias por célula (menos de 20 cópias). Tal deve-se ao facto da sua replicação estar dependente de da síntese de factores de replicação pelo hospedeiro (que apenas ocorre no inicio da divisão celular) e de proteínas iniciadoras da replicação. Os plasmídeos são também caracterizados pelas marcas selectivas que exibem. As marcas selectivas são fenótipos conferidos por alelos dominantes plasmídicos que permitem distinguir células portadoras desse plasmídeo das não portadoras, através de testes simples em que se tenta evidenciar esse fenótipo. As marcas selectivas mais comuns em plasmídeos bacterianos são as de resistência a antibióticos. Assim, células portadoras destes plasmídeos são resistentes a um determinado antibiótico, enquanto que as que não o possuem mantêm a susceptibilidade. Por exemplo, no caso frequente da ampicilina, o gene plasmídico que lhe confere a resistência codifica uma β-lactamase que cataliza a degradação do anel β-lactâmico característico das penicilinas. As células portadoras deste plasmídeo são capazes de formar colónias em meios de cultura contendo ampicilina, enquanto que as células que não o possuem perdem a viabilidade nesses meios. Aos plasmídeos de ocorrência natural, foram feitas alterações para melhorar as suas qualidades para as várias aplicações na Biologia Molecular, entre as quais a clonagem e expressão de genes. Assim foram criados os chamados vectores plasmídicos de clonagem e os vectores plasmídicos de expressão. Por manipulação das marcas 10

11 selectivas, dos replicadores e de sequências sem função aparente, foram criados novos plasmídeos com marcas selectivas convenientes, com maior número de cópias e mais pequenos em tamanho. Por outro lado foram introduzidas novas sequências (reconhecidas por enzimas de restrição) de modo a aumentar o número de locais de clonagem (locais de clonagem múltipla) e no caso dos vectores de expressão foram introduzidos promotores de expressão fortes a montante do local de clonagem. Deste modo, para serem úteis em Biologia Molecular, os plasmídeos devem possuir: (i) uma origem de replicação, estando esta, se possível, sob controlo relaxado, permitindo a replicação autónoma independente do cromossoma bacteriano, originando várias cópias de plasmídeo por célula. (ii) locais de corte único para enzimas de restrição de classe II, permitindo linearizar o plasmídeo, introduzir no local de corte o fragmento de DNA estranho de interesse, e recircularizar a molécula resultante. (iii) genes responsáveis por resistência a antibióticos, permitindo assim seleccionar facilmente as células portadoras do plasmídeo. (iv) locais de corte único referidos em (ii) dentro de um ou mais dos genes referidos em (iii), permitindo a selecção de células contendo o plasmídeo recombinante, uma vez que o gene fica inactivo pela inserção. O primeiro passo na utilização deste tipo de vectores é, obviamente, o seu isolamento da bactéria hospedeira. Este trabalho tem como objectivo a preparação em pequena escala, para uso de rotina, do plasmídeo psk-polo de E. coli. A estratégia de purificação de plasmídeos, a partir de uma cultura bacteriana, é muito semelhante à estratégia utilizada na preparação de DNA genómico. No entanto, na preparação de plasmídeos é necessário separar o DNA plasmídico da enorme quantidade de DNA cromossomal, que também está presente nas células bacterianas. Devido à sua dimensão e às formas conformacionais que pode adquirir, particularmente a forma circular fechada - denominada cccdna (covalently-closed-circular DNA), o DNA plasmídico pode ser facilmente separado do DNA cromossómico. Quando a lise bacteriana é efectuada em condições cuidadosamente controladas, a maioria do DNA cromossómico é sedimentado com os resíduos celulares através de uma centrifugação, deixando o DNA plasmídico em solução. Alternativamente, o DNA cromossómico pode ser desnaturado a ph básico (Birnboim & Doly, 1979) ou por 11

12 fervura rápida (Holmes & Quigley, 1981), originando cadeias simples de DNA. Após a neutralização, ou o arrefecimento, a desnaturação do cccdna plasmídico é facilmente reversível, não acontecendo o mesmo com o DNA cromossómico, o que vai permitir a sua fácil separação. Em qualquer dos casos, para uma purificação completa, é necessária uma desproteinização da solução, assim como de outros passos suplementares de purificação. Neste trabalho, será seguido para isolamento de DNA plasmídico: o procedimento de minipreparação de DNA por fervura rápida, vulgarmente denominado miniprep,o qual é correntemente utilizado no isolamento de pequenas quantidades de DNA parcialmente purificado (1-5 µg). 1. Extracção de DNA plasmídico de Escherichia coli (miniprep) 1 Inoculação da estirpe de E. coli (contendo o plasmídeo a purificar) em 10 ml de meio LB contendo o antibiótico apropriado na concentração desejada. 2 Incubar a 37ºC durante a noite sob agitação. 3 Colocar 1,5 ml de cultura num tubo Eppendorf e centrifugar as células a durante 3 minutos à velocidade máxima numa microcentrifuga. Aspirar o sobrenadante com uma micropipeta. 4 Adicionar mais 1.5 ml da cultura bacteriana ao sedimento obtido e repetir o passo 1. 5 Adicionar 200 μl de tampão STET e ressuspender o sedimento com uma micropipeta ou vortex. 6 Adicionar 4 μl de lisozima (a 50 mg/ml) e incubar à temperatura ambiente durante 5 minutos. 7 Incubar a 95ºC durante 1 minuto. 8 Centrifugar o lisado celular durante 10 minutos à velocidade máxima na microcentrifuga. 9 Descartar o sedimento e adicionar 200 μl de isopropanol ao sobrenadante e vortexar. 10 Centrifugar à velocidade máxima durante 10 minutos. 11 Aspirar o sobrenadante com uma micropipeta e deixar secar o sedimento (DNA plasmídico) ao ar durante 30 minutos ou na estufa a 37ºC durante 10 minutos. 12

13 12 Ressuspender o DNA em 30 μl da água ultra-pura. 13 Verificar o estado da preparação plasmídica por electroforese em gel de agarose 1%. Aplicar 5 μl da amostra misturados com 5 μl de tampão de aplicação. Aplicar também em gel de agarose a amostra de DNA genómico isolada na aula anterior. Electroforese de DNA em gel de agarose A electroforese de DNA consiste na separação de diferentes fragmentos de DNA de acordo com as suas diferentes mobilidades num campo eléctrico. A electroforese pode ser analítica, tendo por objectivo a análise de determinada amostra de DNA por identificação de fragmentos constituintes, quantificação e determinação do peso molecular. Este método pode também ser utilizado como um método preparativo para separar e purificar fragmentos de DNA específicos. As bandas de DNA podem ser directamente visualizadas no gel de agarose através da coloração com brometo de etídio, permitindo a detecção, no mínimo, de 1 ng. Num campo eléctrico, definido pela diferença de potencial em Volts e pela distância entre os etéctrodos em centímetros (V/cm), as moléculas de DNA migram para o eléctrodo positivo (ânodo) devido às cargas negativas dos grupos fosfato. Esta migração é retardada pelo atrito das moléculas com o suporte da electroforese. Sendo a relação carga/massa igual para os diferentes fragmentos de DNA, o parâmetro principal a condicionar a migração do DNA é a dimensão dos fragmentos. A mobilidade dos diferentes fragmentos varia de forma inversamente proporcional ao logaritmo decimal do peso molecular (numero de pares de bases), dado o maior atrito com a matriz com o aumento do número de pares de bases. A conformação do DNA é igualmente um parâmetro importante a ter em conta na migração do DNA. Consideram-se três conformações do DNA: forma I é o DNA circular fechado (cccdna, covalently closed circular DNA ); forma II é o DNA circular com uma quebra numa ligação fosfodiéster ( nicked ); forma III é o DNA linear em cadeia dupla (dsdna, double stranded DNA ). Duma maneira geral, sob condições normais, cccdna migra mais rapidamente do que os fragmentos do mesmo tamanho de dsdna porque a conformação circular tem menor raio hidrodinâmico devido aos super enrolamentos. Na forma II, os enrolamentos 13

14 desaparecem devido à quebra de uma ligação fosfodiéster o que faz com que seja a forma mais lenta de migração dado apresentar o maior raio hidrodinâmico. A distância de migração dos vários fragmentos depende também da voltagem aplicada e da concentração de agarose empregue. Pelas mesmas razões da influência do peso molecular na mobilidade, o aumento da concentração da agarose leva a um retardamento da migração electroforética. A concentração de agarose a usar deve ser adaptada à gama de tamanhos de fragmentos que se pretende resolver. Para a visualização do DNA após a corrida, usa-se brometo de etídeo como corante especifico do DNA por ter a capacidade de se intercalar entre pares de bases. Sob radiação ultra-violeta, o brometo de etídeo emite fluorescência, surgindo corado apenas o DNA. 2. Preparação de gel de agarose 1% para separação electroforética do DNA genómico isolado. 1. Pesar 0,4g de agarose para um matraz e adicionar 40 ml de tampão 1xTAE. 2. Num forno micro-ondas, aquecer 30 segundos o tampão e a agarose até esta se dissolver totalmente. 3. Depois de arrefecer a solução de agarose, adicionar 1µl de solução de brometo de etídeo (10 mg/ml). 4. A solução de agarose ainda fundida é vertida sobre um molde, utilizando-se um pente para a formação dos poços, onde serão colocadas as amostras de DNA. O gel é deixado arrefecer para que solidifique. 5. Cuidadosamente remover o pente e colocar o gel na tina de electroforese submergido em tampão 1xTAE. 6. Após colocação do tabuleiro na tina de electroforese, cobrir o gel com tampão de electroforese, 1 a 2 mm acima da superfície do gel. 7. À amostra de DNA, misturar o tampão de aplicação (Azul bromofenol 0,25% (p/v); Glicerol 0,30% (p/v)) numa relação de 5µl de tampão por cada 10 µl de amostra. 8. Aplicar cuidadosamente as amostras e o marcador de pesos moleculares nos respectivos poços. 9. Quando todas as amostras tiverem sido aplicadas, colocar a tampa da tina e conectar os cabos à fonte de alimentação. 14

15 Visualização 10. As electroforeses são realizadas a voltagem constante, do eléctrodo negativo para o positivo. 11. No final da electroforese, retirar o gel da tina de electroforese, drenar o excesso de tampão e vizualizar num transiluminador de U.V. 12. Tomando como referência a distância (mm) percorrida pelos fragmentos de DNA padrão, cujas dimensões são conhecidas (pb), construír em papel semilogarítmico, um gráfico do log dos fragmentos do DNA padrão vs. a mobilidade no gel dos fragmentos. 13. Tomando a distância percorrida pelo DNA amostra e aplicando esse valor no gráfico determinar as dimensões dos fragmentos do DNA da amostra. Alternativamente, utilizando a equação da recta da calibração, determinar as dimensões dos fragmentos.! O fenol é um forte oxidante. Evitar inalar e contacto com a pele. Colocar os resíduos de fenol e o material com que tenha entrado em recipientes próprios.! O brometo de etídeo é um agente mutagénico potente, usar sempre luvas e colocar em recipiente próprio todo o material que tenha entrado em contacto com este corante! As radiações U.V. são extremamente perigosas, particularmente para os olhos, provocando lesões na retina. Evitar qualquer exposição dos olhos a estas radiações. 15

16 AULA 3 Análise electroforética de DNA digerido com enzimas de restrição Os rápidos avanços da investigação cientifica, em particular da Biologia Molecular, que tiveram lugar nas duas ultimas décadas foram possíveis em grande parte, devido à capacidade de isolar determinados segmentos de interesse de DNA procariótico e eucariótico. A clonagem de genes requer que as moléculas de DNA sejam cortadas de um modo muito preciso e reprodutível. Através da utilização das enzimas de restrição esse objectivo é facilmente conseguido, pois possuem a capacidade de ligação específica a determinados locais de DNA de cadeia dupla (sequência de reconhecimento) e sua posterior clivagem, no interior dessa sequência ou adjacente a ela. De acordo com as características de corte, as endonucleases de restrição são classificadas em três tipos. As enzimas do tipo I e III, para além da acção nucleásica, têm acção modificadora (metilação) no mesmo domínio de reconhecimento da proteína. Apesar destas enzimas reconhecerem sequencias especificas de DNA, a actividade nucleásica ocorre de modo aleatório na proximidade da sequencia de reconhecimento e é dependente de ATP. Acresce que as enzimas do tipo III apenas efectuam metilação numa das cadeias. Por estas razões, as enzimas do tipo I e III não são frequentemente usadas em investigação de rotina em Biologia Molecular. As endonucleases de restrição de tipo II são sistemas binários em que uma das subunidades tem acção nucleásica e a outra de metilação. Ambas as acções são efectuadas em locais específicos dentro da sequência reconhecida. A maior parte das enzimas de restrição do tipo II, reconhecem sequências com 4 8 pares de bases com simetria palindrómica. A enzima EcoRI (produzida por Escherichia coli) reconhece a sequência GAATTC, enquanto AluI (produzida por Arthrobacter luteus) corta em AGCT. Como há especificidade para o local de corte, estas enzimas podem ser usadas para a degradação de moléculas de DNA com obtenção de fragmentos de menor tamanho, cujas extremidades são conhecidas em termos de sequência nucleotídica. As sequências das extremidades e o tamanho dos fragmentos obtidos variam de acordo com a enzima de restrição usada. Dada a possibilidade de manipulação em locais específicos do DNA, as enzimas de restrição constituem nos dias de hoje, ferramentas básicas em Biologia Molecular. Duma maneira geral, são usadas para o estabelecimento de mapas de restrição de 16

17 fragmentos de DNA cuja sequência é desconhecida, fragmentação de DNA genómico para separação electroforética e posterior análise, criação de fragmentos de DNA para subclonagem num vector apropriado e a criação de sondas marcadas para análises por southern e northern. Existem três tipos de extremidade resultantes do corte consoante o modo de corte da cadeia dupla. Enzimas de restrição que cortam exactamente no meio da sequência do palindroma (Sma I) originam extremidades sem nenhuma das duas cadeias protuberante ( blunt ends ). Outras enzimas cortam na extremidade 5 do palindroma reconhecido originando extremidades protuberantes 5 de 2-4 bases na forma de cadeia simples (EcoRI) denominadas por extremidades 5 coesivas ( 5 sticky-ends ). Outras enzimas cortam na extremidade 3 do palindroma originando extremidades protuberantes 3 de 2-4 bases na forma de cadeia simples (KpnI) denominadas por extremidades 3 coesivas ( 3 sticky-ends ). Como estas enzimas de restrição são, na sua maioria, específicas em relação à sequência de reconhecimento e corte, duas moléculas de DNA diferentes que foram digeridas com a mesma enzima, por exemplo BamHI, possuirão extremidades 5 iguais que podem assim emparelhar utilizando as bases que ficaram em cadeia simples, numa 17

18 reacção catalisada por uma DNA Ligase. O resultado da ligação destas duas cadeias será uma molécula recombinante. Dois factores são essenciais para a eficiência de corte das endonucleases de restrição: pureza do DNA e o tampão de digestão. As impurezas habituais presentes em amostras de DNA (proteínas, fenol, clorofórmio, EDTA, SDS e a elevada concentração de sais) podem inibir por completo determinadas enzimas de restrição. A influência de todos estes factores varia de enzima para enzima, pelo que se devem ter em conta quando se verifica ausência de actividade, assegurando-se que as condições de reacção foram as ideais. Os componentes essenciais dos tampões de digestão são: tampão Tris (ph ), iões de magnésio, cloro, sódio, e potássio; um agente redutor como ditioeritriol, ditiotreitol ou 2-mercaptoetanol. Embora haja especificidade da actividade em relação a todos estes factores, o mais importante é a concentração de iões (força iónica). Assim, dividem-se as enzimas em três gupos: as que requerem elevada força iónica, média força iónica e baixa força iónica. Esta propriedade é particularmente importante para digestões com várias enzimas de restrição em que é impossível a digestão simultânea com enzimas que requerem forças iónicas diferentes. Nestes casos, as digestões devem 18

19 ser feitas em separado, começando pela enzima de menor força iónica, desnaturar a enzima por calor, ajustar a concentração de sais e proceder à segunda digestão. As consequências do uso de condições não ideais em digestões com enzimas de restrição são a ausência de actividade ou o fenómeno de star activity em que a enzima perde a especificidade para a sequência de reconhecimento, passando a fazer cortes não só nos locais específicos mas também noutros locais. Um factor que pode ser importante em alguns casos é o grau de metilação do DNA. A produção de enzimas de restrição é um mecanismo de defesa das bactérias contra a infecção por DNA exógeno. Para precaver a acção contra o próprio DNA, estas enzimas de restrição promovem a metilação de nucleótidos, ficando então a sequência de reconhecimento imune à sua acção. Assim, quando se trabalha com DNA plasmídico proveniente de estirpes bacterianas com uma elevada capacidade de metilação, deve-se ter em atenção, também, a sensibilidade da enzima a usar para a metilação dos nucleótidos da sequência de reconhecimento. A estratégia mais usada é o uso de estirpes bacterianas manipuladas geneticamente para a perda dessa capacidade. A acrescentar aos cuidados a ter nas condições de digestão, as enzimas de restrição são extremamente instáveis e de elevado preço. Assim, devem-se cumprir normas rigorosas para evitar desperdícios e perdas de actividade. Normas de utilização das enzimas de restrição a) As enzimas de restrição são extremamente caras e susceptíveis de contaminação. Colocar as enzimas SEMPRE NO GELO (ou no Stratacooler). Após cada utilização colocá-las novamente a -20 C. b) Não contaminar as enzimas entre si ou com o DNA: para isso utilizar sempre tips novas e esterilizadas todas as vezes que retirar enzima do recipiente onde se encontra. c) 1 unidade de enzima de restrição define-se como a quantidade necessária para a digestão completa de 1µg de DNA, durante 1 h, nas condições recomendadas de tamponamento do meio e de temperatura. d) Quando é pretendida a análise imediata em gel dos produtos digeridos, são utilizados pequenos volumes de reacção. Para digestões de grandes quantidades de DNA, ou nos casos em que a enzima se encontra muito diluída, esta não pode contribuir 19

20 com mais de 10% do total do volume da reacção, pois o glicerol em que esta se encontra armazenada pode inibir a sua actividade. 1. Digestão de DNA plasmídico com enzimas de restrição 1. Pipetar para um tubo eppendorf, usando pontas de pipeta diferentes e limpas, por esta ordem: 15µl de H 2 O destilada e esterilizada 2µl de 5 tampão de enzima de restrição 2µl de DNA plasmídico 1µl de enzima de restrição (EcoRI, HindIII) Misturar cuidadosamente batendo levemente com o dedo no fundo do tubo. 2. Incubar a 37 ºC durante 1 hora 3. Preparar um gel 1% de agarose (40 ml) 4. Preparar as amostras para carregar o gel em três tubos eppendorf: 5 µl de marcador de peso molecular (λ Bioline) 5 µl de DNA não digerido + 5 µl de tampão de aplicação 20 µl de DNA digerido + 5 µl de tampão de aplicação 5. Carregar o gel com as três amostras 6. Correr o gel a 100V até a frente do gel chegar a cerca de dois terços do gel. 7. Visualizar o DNA num transiluminador de U.V. 5µl HyperLadder/lane, 1% agarose 20

21 AULA 4 Elaboração do mapa de restrição de um plasmídeo recombinante O isolamento de genes envolve, normalmente, o rastreio de bancos de DNA genómico clonados em vectores apropriados. Uma vez que estes fragmentos de DNA são quase sempre, demasiado grandes para poderem ser manuseados directamente, é de interesse obter fragmentos de menores dimensão que permitam o seu estudo e manipulação posteriores. As utilização de enzimas de restrição que cortam o DNA em sequências especificas permite a construção de mapas físicos ao longo da molécula de DNA, por originarem fragmentos menores em que o peso molecular é determinado em gel de agarose e a sequencia nucleótidica das extremidades é conhecida (corresponde à sequencia de reconhecimento da enzima de restrição utilizada na reacção). A construção de mapas de restrição detalhados possibilita a escolha da fragmentos de DNA de menores dimensões que podem ser subclonados para trabalhos posteriores. Os mapas de restrição para além de permitirem a localização física do local de corte de várias enzimas ao longo do DNA são igualmente úteis na identificação de fragmentos de DNA homólogos entre outras potenciais aplicações. Neste trabalho pretende-se a elaboração do mapa de restrição de um plasmídeo recombinante que contém um gene que codifica para uma subunidade da enzima NADH desidrogenase da cadeia respiratória. Dois fragmentos de DNA (L e R) foram inseridos no plasmídeo pgem-3. Elaborar para cada uma das moléculas recombinantes o mapa de restrição com base na análise do peso molecular dos fragmentos obtidos após digestão de cada plasmídeo recombinante com as enzimas de restrição SalI, HindIII, PstI, XhoI, PvuII, SacI e BamHI. 21

22 PCR Polimerase Chain Reaction Trabalho 5 Instituto de Ciências Bioquímicas Abel Salazar Universidade do Porto 2006/

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25 AULA 5 PCR Polimerase Chain Reaction A reacção de polimerase em cadeia (PCR) é um método rápido que permite a amplificação in vitro de um segmento especifico de DNA ou RNA. Tal como a clonagem molecular, a técnica de PCR permitiu a concretização de ensaios e trabalhos moleculares que até então seriam impossíveis. O numero de aplicações do PCR parece ser infinito, estando ainda em crescimento. Incluem a clonagem directa a partir de DNA genómico ou cdna, mutagenese in vitro e engenharia genética do DNA; fingerprinting de amostras forenses; ensaios para a determinação da presença de agentes infecciosos, diagnostico pré-natal de doenças genéticas, análise de variações de sequencias alelicas, análise da estrutura de transcritos de RNA, footprinting genómico, e sequenciação directa de DNA genómico e cdna. A base teórica da reacção de PCR para a amplificação de um dado segmento de DNA encontra-se representada na figura. Neste processo é explorada a actividade 25

26 catalítica de uma DNA polimerase e envolve dois iniciadores oligonucleotídicos (primers), que flanqueiam o fragmento de DNA a ser amplificado (sequência alvo), e sucessivos ciclos de aquecimento e arrefecimento. Cada ciclo da reacção envolve desnaturação de DNA de cadeia dupla (promovida por aquecimento), hibridação dos primers às suas sequências complementares e extensão destes com a referida DNA polimerase. Nucleótidos são adicionados às extremidades 3' dos primers, de acordo com o molde de DNA alvo. Cada segmento de DNA sintetizado de novo, cuja extremidade 5' não é mais do que o primer, torna-se uma nova sequência alvo para um novo ciclo, o que resulta numa amplificação exponencial do DNA alvo original. O primeiro ciclo resulta na síntese de novas cadeias de tamanho indeterminado, que tal como as cadeias moldes, vão hibridar com os primers. No entanto estes produtos são apenas acumulados aritmeticamente com os subsequentes ciclos de desnaturação, hibridação e extensão, pelo que pouco contribuem para o produto final da reacção de PCR. Após uma série de hibridações de primers, extensões e dissociações dos produtos formados, o comprimento das cadeias de DNA amplificadas será fixo, porque as suas extremidades serão definidas pelas extremidades 5' dos primers oligonucleotídicos. Apesar de ser necessária a optimização de muitas variáveis para a execução correcta de uma reacção de PCR, o parâmetro mais critico é normalmente o correcto desenho dos primers a usar na reacção. A escolha correcta dos primers dita frequentemente o sucesso ou insucesso da amplificação. Deste modo, o desenho atento e cuidado dos primers a usar pode poupar tempo valioso de investigação e simultaneamente reduzir os custos do trabalho. A maior parte das regras para o desenho de primers são empíricas sem garantia de sucesso. No entanto, o seu cumprimento irá aumentar significativamente a probabilidade de um PCR com sucesso. Vários parâmetros devem ser tomados em consideração para garantir uma correcta hibridação dos primers. O primeiro destes é a escolha de primers que possuam uma sequência única na região a ser amplificada. A sequência do primer deve complementar correctamente a sequência de bases da cadeia molde. O segundo parâmetro a ser considerado é a inclusão de um resíduo G ou C na terminação 3 do primer. O G-C clamp que se forma ajuda a uma correcta hibridação na terminação 3 (devido às fortes pontes de hidrogénio entre os pares de bases G/C) e eficiente extensão da nova cadeia. No entanto, a presença de mais de três G ou C seguidos na terminação 3 deve ser evitada. Os primers devem ser desenhados sem qualquer homologia entre eles de modo a impedir a hipótese de emparelhamento entre ambos. Minimizar a formação de 26

27 híbridos parciais entre os pares de primers é essencial uma vez que estes dimeros serão sintetizados preferencialmente em relação a qualquer outro produto de PCR desejado. Auto-complementaridade entre sequencias (com mais de 4 bases) contíguas no primer é indesejada de modo a evitar a formação de estruturas secundárias no primer (hairpins). A composição de bases do primer é um importante parâmetro a ser considerado. De um modo geral os primers deverão possuir entre 17 a 25 nucleótidos e um conteúdo em G/C entre 45 e 55%. É igualmente importante possuir pares de primers com temperaturas de hibridação (T m ) semelhantes. A temperatura de hibridação depende directamente da dimensão e composição do primer e pode ser calculada pela expressão: T m = (nº G+C 4ºC) + (nº A+T 2ºC) A T m calculada para ambos os primers da reacção não deverá diferir em mais de 5 ºC. Em Drosophila melanogaster, o gene polo, codifica uma proteína cinase 27

28 necessária para a correcta progressão da mitose celular. Neste trabalho, a partir da sequência de cdna fornecida, os alunos terão de desenhar primers destinados à amplificação por PCR do gene polo. Recorrendo à reacção de PCR a partir de DNA genómico e de cdna os alunos terão de inferir sobre a presença de regiões intrónicas na sequencia do gene. 1. Procedimento experimental A Desenho dos primers 1. Desenhar os primers oligonucleotídeos 9R1 (sense primer) e 9R2IC (antisense primer) obedecendo ás regras para a correcta escolha de primers 2. Calcular a temperatura de hibridação dos primers.(t m ) de acordo com a formula fornecida. Para o primer sense considerar a sequência: 5 AGCTATGCTATGCTATGCTAGCCAGTCAGCTGAACGTG 3 Para o primer antisense considerar a sequência: 5 TCTAATTCCAAGCCAATTGCCAAAAAGGAACCG 3 B Amplificação por PCR 1. Preparar as misturas de reacção num tubo de PCR de acordo com a seguite composição para um volume de reacção final de 50 µl: cdna 1 ng, DNA genómico 5 ng Primers: 0,1 μm 9R1 0,1 μm 9R2IC dntps : 200 μm Tampão de reacção 1 Taq DNA polimerase: 0,25 U Perfazer o volume com H 2 O ultrapura estéril. Nota: Adicionar todos os componentes da mistura, excepto a Taq polimerase. Misturar suavemente e centrifugar. Só então aplicar a Taq polimerase, que deverá ser misturada muito suavemente com a ponta da pipeta. 28

29 Quadro resumo das quantidades a usar: Mistura de reação Volume (ul) Volume (ul) cdna 1 - gdna - 1 Tampão da reação 5x 5 5 Primer1 1 1 Primer dntps 8 8 Mgcl2 6 6 dh2o x x Taq polimerase 0,25 0,25 Volume total da reação Colocar os vários tubos no suporte do amplificador termocíclico e efectuar um programa com 40 ciclos e com a seguinte sequência de temperaturas: Desnaturação Hibridação Extensão após o último ciclo: 94 C -15 segundos 50 C - 30 segundos 72 C - 1 minuto 72 C - 10 minutos 3. Retirar os tubos do termo-amplificador e colocá-los a 4 C. 4. Efectuar uma electroforese em gel de agarose 1 %. Registar os resultados 29

30 AULA 6 Transformação de Escherichia coli com DNA plasmídico Transformação é o processo de introdução de DNA em células. Esta técnica foi inicialmente explorada em estudos clássicos de genética. Com o avanço da engenharia genética, a transformação de bactérias com plasmídeos recombinantes tornou-se uma técnica básica de extrema importância para a amplificação de fragmentos de DNA específicos. A primeira descrição de trasnformação de E. coli data de 1970 quando Mandel e Higa demonstraram que células de E. coli tratadas com soluções geladas de cloreto de cálcio e depois brevemente aquecidas, podiam importar para o seu interior DNA do bacteriófago λ. Embora nunca se tenha conseguido compreender o mecanismo de transformação, está bem estabelecido que a exposição de células de E. coli a catiões na presença de baixas temperaturas induz um estado de competência em que as células são capazes de importar DNA exógeno. Através da experimentação empírica, o processo de transformação foi modificado para melhorar a eficiência e reprodutibilidade de modo a adaptar esta técnica à rotina da Biologia Molecular. Assim, foram feitas modificações no tempo de exposição das células ao cálcio; foram usados outros catiões como o rubídio, manganês e potássio, e a adição de outros compostos como o dimetilsulfóxido, ditiotreiol ou cobalto de hexamina. Muitas das alterações introduzidas levaram a uma melhoria da eficiência embora, por vezes, sem se conseguir explicar as razões, sendo frequente a adopção de protocolos diferentes de acordo com o laboratório e também de acordo com o experimentador. Neste trabalho, é efectuado o processo químico de transformação mais usado-a técnica clássica que utiliza cloreto de cálcio para a preparação de células competentes. Neste método as células são cultivadas até meio da fase exponencial, lavadas e concentradas com uma solução de cloreto de cálcio. O DNA é adicionado à suspensão e depois as células são sujeitas a um choque térmico. Após breve incubação em meio não selectivo, são espalhadas em placa com meio selectivo. A eficiência da transformação é calculada em função do nº de transformantes por µg de DNA. Na transformação com o método do cloreto de cálcio podem ser obtidas eficiências superiores a 10 8 transformantes/µg DNA. No entanto, em rotina laboratorial é de esperar obter valores na ordem dos transformantes/µg DNA. Para obter uma boa eficiência do processo de transformação vários factores são essenciais: colheita das células na fase exponencial de 30

31 crescimento; manutenção das células no gelo; contacto prolongado das células com cloreto de cálcio e o uso de reagentes de máxima pureza e limpeza do material. Se qualquer destes parâmetros não for cumprido, a eficiência da transformação pode ser drasticamente reduzida. Imediatamente a seguir à transformação por choque térmico, é adicionado meio não selectivo às células e procede-se a uma breve incubação (30-60 min a 37 ºC) para que ocorra expressão do gene plasmídico de resistência ao antibiótico, de modo a haver suficiente proteína sintetizada para conferir resistência no momento em que as células forem plaqueadas no meio selectivo. No caso frequente de selecção de transformantes resistentes à ampicilina, o gene plasmídico que confere a resistência codifica a enzima β-lactamase responsável pela degradação do antibiótico. Depois de sintetizada, esta enzima é segregada para o exterior celular, formando-se uma zona em redor das colónias transformantes com menor concentração de antibiótico. Assim, em placas com incubação muito prolongada, pode ocorrer o surgimento de colónias satélite, identificáveis por serem muito pequenas comparativamente às colónias de transformantes, e que são resultantes do crescimento de células não transformadas, mas que deste modo são viáveis no meio selectivo. Foram construídos dois plasmídeos diferentes a utilizar neste trabalho, de forma a exemplificar os tipos de vectores usados e como seleccionar células transformadas com plasmídeos recombinantes. O plasmídeo clássico pbr322 na sua forma original possui genes responsáveis pela resistência à tetraciclina e ampicilina. Este plasmídeo foi modificado dando origem ao plasmídeo pbr322-cat, o qual tem inserido o gene CAT (codifica a enzima bacteriana Clornfenicol acetil transferase) no local do gene que codifica a resistência à tetraciclina que fica assim inactivo. O segundo plasmídeo, pembl9, pertence a uma nova geração de vectores onde a inserção de fragmentos de DNA se dá num polylinker localizado na extremidade 5 do gene que codifica a enzima β-galactosidase. O plasmídeo contem também todos os elementos do promotor necessários à indução da expressão desta enzima nas bactérias transformadas com este plasmídeo quando expostas à lactose, o seu indutor natural. Quando as células transformadas com este plasmídeo são cultivadas em meio MacConkey/Lactose/Ampicilina, a lactose induz a expressão da β-galactosidase, permitindo a sua metabolização com produção de substâncias acídicas que vão alterar o ph do meio em torno da colónia. Esta alteração de ph é identificada por um indicador 31

32 (neutral red) no agar de MacConkey, produzindo colónias vermelhas. No meio Mac/Lac/Amp, colónias de bactérias com plasmídeos contendo um fragmento exógeno inserido no polylinker, e que portanto não possuem actividade β-gal, adquirem uma cor amarela. O plasmídeo pembl-cat foi construído pela inserção, nos locais BamHI e HindIII, do gene CAT. A clonagem deste gene no polylinker permite estudar a indução da sua expressão em resposta à presença de lactose no meio. A correcta indução do CAT permite que as células portadoras deste gene sejam resistentes ao cloranfenicol quando crescidas na presença de lactose. Material: Escherichia coli JM101 Plasmídeos: - pembl9 - pmebl9-cat - pbr322 - pbr322-cat Meios de Cultura: - LB - LA - Mac/Lac Placas de cultura: - LA/Amp - LA/Amp/Tet - Mac/Lac/Cloranfenicol 32

33 1. Preparação de células competentes 1. Inocular 50 ml de LB com a estirpe apropriada de E. coli e incubar a 37 ºC com agitação durante a noite. 2. Inocular 200 ml de LB, previamente aquecido a 37 ºC, com 2 ml da cultura anterior e incubar a 37 ºC com agitação, até DO 600 de 0,2-0, Colocar a cultura em tubos pré-arrefecidos e deixar no gelo durante 15 minutos. 4. Centrifugar a 3000 rpm durante 15 minutos, a 4ºC. 5. Cuidadosamente decantar o sobrenadante e ressuspender lentamente o sedimento em 20 ml de uma solução 100 mm CaCl 2 (previamente arrefecida). Incubar no gelo durante 20 minutos. 6. Centrifugar novamente a 3000 rpm durante 15 minutos, a 4ºC. 7. Ressuspender as células em 0.5 ml de solução 100 mm CaCl 2 (a 4 ºC). Incubar em gelo durante 4-24 horas. Nota: A eficiência de transformação aumenta consideravelmente durante a incubação em gelo até 24 horas. Após este período, as células perdem rapidamente a sua competência. Para manter as células competentes durante mais tempo, adiciona-se glicerol (concentração final 10% v/v) às células competentes e congela-se a mistura a - 70ºC. 2. Transformação 1. Descongelar uma alíquota de células E. coli JM101 competentes em gelo. 2. Alíquotar 5 µl de solução de DNA plasmídico em quatro microtubos identificados com o nome do plasmídeo. Manter os tubos em gelo. 3. A cada microtubo, adicionar 50 µl de células competentes (microtubo não identificado) e misturar com movimentos circulares com a ponta da pipeta. Tubo nº Plasmídeo 1 pembl9 2 pembl9-cat 3 pbr322 4 pbr322-cat 5 Nenhum (tubo contendo apenas células) 33

34 4. Incubar em gelo durante 20 minutos. 5. Provocar um choque térmico às células, colocando o microtubo num banho a 42 ºC durante 2 minutos. 6. Colocar novamente em gelo, durante 2 minutos. 7. Adicionar 200 µl de meio LB e incubar a 37 ºC durante 30 minutos com agitação. 8. Plaquear as células de acordo com a seguinte tabela: Tubo nº Volume (µl) Meio de cultura Mac/Lac/Amp 125 LA/Amp Mac/Lac/Amp 125 LA/Amp LA/Amp/Tet 125 LA/Amp LA/Amp/Tet 125 LA/Amp LA/Amp 9. Incubar as placas de petri a 37 ºC durante a noite. 10. Tomar nota do número e cor das colónias crescidas em cada uma das placas com meio Mac/Lac 34

35 11. Para induzir a expressão do gene CAT e testar a resistência das células ao cloranfenicol, transferir, com palitos esterelizados, 10 colónias individuais (das placas crescidas no meio inicial fornecidas) para novos meios de acordo com a seguinte tabela: Plasmídeo Meio inicial Novo meio pembl9 LA/Amp Mac/Lac/Clo pembl9-cat LA/Amp Mac/Lac/Clo pbr322-cat LA/Amp Mac/Lac/Clo 12. Incubar as placas a 37ºC durante a noite e verificar o crescimento das colónias nos diferentes meios. 13. Determine as eficiências de transformação para os 4 plasmídeos. Observe as diferenças nos vários meios em que as 4 estirpes foram plaqueadas. Verifique se há ou não indução da expressão do gene CAT em meio com lactose. 35