Efeitos da criopreservação sobre a viabilidade espermática. Effects of the cryopreservation on the espermatic viability

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1 Efeitos da criopreservação sobre a viabilidade espermática 1,2 3 Adriana Trindade Soares e Maria Madalena Pessoa Guerra 1 Empresa Estadual de Pesquisa Agropecuária da Paraíba S.A. - Emepa, João Pessoa,PB, Brasil (adrianatsoares@hotmail.com) 2 Programa de Pós-Graduação em Ciência Veterinária da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Recife, PE, Brasil 3 Departamento de Medicina Veterinária da UFRPE, Recife, PE Resumo - Para que o espermatozóide seja considerado qualitativamente viável e potencialmente fértil é necessário que possua morfologia, atividade metabólica e membranas normais. A presença de membranas íntegras é pré-requisito para os eventos relacionados ao processo de fertilização, como a capacitação espermática, penetração nos revestimentos do ovócito, ligação à zona pelúcida e fusão com oolema. A redução da temperatura durante o processo de refrigeração e congelação do sêmen pode afetar a motilidade, a integridade de seus componentes estruturais e a capacidade respiratória do espermatozóide. O estresse osmótico e oxidativo causam danos às membranas plasmáticas e acrossomal, assim como contribuem para a antecipação da capacitação e da reação acrossomal, tanto no processo de refrigeração quanto no de congelação/descongelação, reduzindo a longevidade do espermatozóide. Esta revisão discute os efeitos do processo de congelação/descongelação sobre o espermatozóide, os métodos de avaliação dos danos causados às estruturas espermáticas e as medidas que podem minimizar os efeitos negativos da criopreservação através do conhecimento dos mecanismos de ação dos eventos que envolvem este processo. Palavras-chave: congelação, diluidor, crioprotetor, ROS, antioxidantes, sêmen Effects of the cryopreservation on the espermatic viability Abstract In order to the spermatozoids be considered qualitatively viable and potentially fertile it is necessary that they have normal morphology, metabolic activity and membranes. The presence of intact membranes is prerequisite to events related to fertilization process, such as sperm capacitation, penetration on the oocyte leyers, binding to pellucid zone and fusion with oolema. The temperature reduction during cooling and freezing process can affect motility, integrity of their structural components and respiratory capacity of sperm. The osmotic and oxidative stress produce damage on the plasmatic and acrosomic membranes, as well as they contribute to the early capacitation and acrosomic reaction, on the cooling and freezing/thawing process, reducing the sperm longevity. This review discuss the effects of freezing/ thawing process on the sperm, the evaluation methods of damage caused to sperm structures and forms that can minimize the negative effects of cryopreservation through acknowledgment of mechanisms that involve this process. Keywords: freezing, diluent, cryoprotector, ROS, antioxidants, semen Introdução A redução da fertilidade, associada à inseminação artificial (IA) com sêmen criopreservado, vem sendo atribuída aos processos ocorridos durante a congelação do sêmen, onde cerca de 10 a 50% dos espermatozóides de um ejaculado não resistem a este processo e morrem (Watson, 2000). Os procedimentos de congelação/descongelação do sêmen ocasionam danos celulares devido à mudança na temperatura, formação de cristais de gelo, injúrias oxidativas, alterações na membrana do espermatozóide, lesões no DNA, estresse osmótico, além da toxicidade dos crioprotetores (Ball & Vo, 2001). A célula espermática parece sensível ao estresse osmótico e à adição e remoção de crioprotetores (Watson, 2000; Ball & Vo, 2001). A refrigeração, quando efetuada de modo inadequado, causa choque térmico que induz a ocorrência de danos parcialmente irreversíveis ao espermatozóide, que se caracterizam por padrão anormal de movimento do espermatozóide (movimento circular ou retrógrado), perda rápida da motilidade, lesões no acrossoma, danos à membrana plasmática, redução da atividade metabólica e perda dos componentes intracelulares. Muitos desses danos são decorrentes de alterações da membrana à medida que os espermatozóides progridem para as mudanças de fase de transição e durante o processo de refrigeração (Graham, 1996). O fato de que a concentração de oxigênio nos fluidos ou células do sistema reprodutor feminino é reduzida, exceto no momento da ovulação, indica a relevância fisiológica do oxigênio e seus metabólitos nas funções espermáticas (De Lamirande et al., 1997). Assim, reduzidas concentrações de espécies reativas ao oxigênio (ROS) são necessárias para que o 53

2 espermatozóide adquira a capacidade fecundante (Baumber et al., 2003). No entanto, a geração de elevadas concentrações de ROS no sêmen pode afetar o metabolismo energético, a motilidade, a viabilidade e a integridade do DNA dos espermatozóides de várias espécies (Bilodeau et al., 2002). Atualmente, o reduzido conhecimento da ação de oxidantes e antioxidantes encontrados no sêmen dos animais domésticos talvez seja responsável pelos ineficientes resultados obtidos após os procedimentos de criopreservação em algumas espécies e posterior utilização em técnicas de reprodução assistida, como IA, fertilização in vitro. Sabe-se, no entanto, que uma variedade de mecanismos de defesa denominados de antioxidantes estão envolvidos nos sistemas biológicos e que o equilíbrio entre os benefícios e os riscos de ROS e antioxidantes, in vivo e in vitro, parece ser necessário para o funcionamento reprodutivo normal. Desta forma, estudos envolvendo a análise do estresse oxidativo originado durante a realização de alguns procedimentos laboratoriais poderá contribuir para uma possível intervenção terapêutica com antioxidantes que auxilie na otimização de biotécnicas reprodutivas (Guerra et al., 2004). Assim, a elaboração de protocolos de congelação deve considerar a quantificação de ROS geradas, assim como a identificação de substâncias que possam atuar na proteção das células espermáticas aos efeitos oxidativos ocorridos na criopreservação do sêmen (Valença & Guerra, 2007). Eventos físicos da criopreservação na célula espermática Durante o processo de criopreservação o sêmen deve ser refrigerado da temperatura corpórea à temperatura ambiente (37 a?20 ºC), sem ocasionar danos ao espermatozóide. Para isto é necessário diluir o sêmen em meio adequado. O estresse inicial se dá quando o espermatozóide é submetido á o temperatura de refrigeração a 5 C (Squires et al., 1999), devido à fase de transição da membrana plasmática do estado líquido cristalino para o estado de gel (Graham, 1996; Medeiros, 2002). O desafio celular durante a congelação e descongelação não é a capacidade da célula suportar temperatura muito baixa, mas de atravessar uma das fases o críticas do processo (de 15 a 60 C). As células normalmente resistem à redução da temperatura, entretanto não suportam a formação de cristais de gelo que determina a retirada de água do sistema, levando ao desequilíbrio osmótico com conseqüente desidratação celular (Holt, 2000). A formação de cristais de gelo se forma no espaço extracelular, criando um gradiente osmótico entre a solução intracelular inicialmente isotônica e a solução congelada extracelular que se encontra concentrada. Dependendo da velocidade de refrigeração, a água se move através da membrana e se une à fase congelada do meio extracelular ou irá congelar, formando gelo no interior da célula. Na maioria dos casos, as células submetidas à formação de cristais de gelo intracelular se tornam osmoticamente inativas ou lisadas devido à perda da integridade da membrana (Denvireddy et al., 2002). A célula espermática também é sensível aos efeitos tóxicos dos crioprotetores, o que torna inviável o uso de determinados componentes comumente utilizados para outras células (Watson, 2000). Durante o processo de criopreservação, a suspensão de espermatozóides atinge temperaturas abaixo do ponto de congelação do meio (super resfriamento), antes que haja a formação de cristais. Quando os cristais de gelo começam a se formar, ocorre aumento da temperatura, necessária à cristalização, o que pode ser deletério para o espermatozóide, sendo minimizado pelo uso de curvas adequadas de congelação (Squires, 1999). Quando o processo de congelação é muito lento ocorre a congelação da água extracelular com a conseqüente concentração de soluto, colocando a célula momentaneamente em um meio hipertônico e determinando perda rápida da água, o que leva à desidratação celular e ao aumento da concentração de soluto extracelular. Por outro lado, quando a célula é congelada rapidamente, não há perda de água, promovendo, com isso, a formação de cristais de gelo intracelular (Mazur, 1985). Sob a temperatura de 5 ºC, a água intra e extracelular permanece super refrigerada e não cristaliza. No entanto, entre as temperaturas de 5 e 10 ºC começam a se formar cristais de gelo no meio extracelular que permanece super refrigerado, ocorrendo troca de água para manter o equilíbrio entre o meio extracelular e o intracelular, ocasionando a desidratação celular. Neste momento, a curva de congelação deve ser lenta para evitar a congelação da água intracelular, e rápida o suficiente para evitar o contato da célula desidratada com o meio hiperosmótico. A desidratação severa promove desnaturação das macromoléculas e encolhimento excessivo da célula determinando colapso da membrana (Medeiros, 2002). A perda de água e a desidratação celular são eventos desejáveis, pois reduzem a probabilidade de formar grandes canais de gelo dentro da célula, o que ocasionaria danos às estruturas internas e/ou à membrana plasmática (Squires, 1999). O processo de descongelação depende de como o sêmen foi congelado. Espermatozóides congelados em curvas moderadas necessitam de curvas adequadas de descongelação. Neste caso, como o gelo extracelular descongela lentamente, diluirá lentamente o soluto das frações de água não congeladas, o que permite que a água se difunda lentamente para dentro da célula, diluindo o soluto intracelular até atingir a concentração inicial. Se o espermatozóide é descongelado rapidamente, o gelo derrete rapidamente, diluindo o soluto do meio e a água entrará muito rapidamente no espermatozóide, o qual se encontra altamente concentrado, danificando o espermatozóide (Graham, 1996). 54

3 É essencial que uma amostra de sêmen seja diluída corretamente de forma que contenha quantidade suficiente de diluidor para acomodar as células espermáticas em uma palheta de inseminação, de forma que uma taxa de fertilidade elevada possa ser alcançada usando o menor número de inseminações e de espermatozóides por inseminação. No entanto, isto deve ser corretamente mensurado com base no conhecimento da concentração espermática (Evans & Maxwell, 1987; Ritar et al., 1990). Segundo Chemineau et al. (1991), o tamanho da palheta deve determinar a altura sobre o nitrogênio líquido. Foi sugerido que as palhetas de 0,5 ml devem ser refrigeradas a 4 cm do nível de nitrogênio líquido durante 5 min. e, então, mergulhadas no nitrogênio líquido, enquanto as palhetas de 0,25 ml devem ser colocadas 16 cm acima do nível do nitrogênio líquido durante 2 min., baixar para 4 cm durante 3 min. e, então, mergulhá-las no nitrogênio líquido para posterior armazenamento. Congeladores programáveis são convenientes para a congelação de grandes quantidades de palhetas de sêmen, além de controlar a taxa de congelação. O benefício de muitos congeladores programáveis é que a curva de refrigeração pode ser programada, por exemplo, 4 a 5 ºC por 4 min., de -5 a -110 ºC por 25 min. e de -110 a -140 ºC por 35 min. e, somente então, as palhetas de sêmen são mergulhadas em nitrogênio líquido (Purdy, 2006). Mecanismo de ação Crioprotetores Os crioprotetores devem ser adicionados ao meio para que haja proteção ao espermatozóide durante a congelação/descongelação (Squires et al., 1999). Estas substâncias são importantes para evitar a formação de gelo intracelular, reduzir o estresse osmótico através da reposição de água necessária para manutenção do volume celular, interagir com íons e macromoléculas, reduzir o ponto de congelação da água, assim como servir como tampão ajustando as alterações do ph (Medeiros, 2002). Os sistemas tampões devem ser um dos constituintes dos diluidores, pois o metabolismo dos espermatozóides resulta em produção de catabólitos tóxicos que contribuem para o aumento do ácido lático no meio extracelular, tornando o meio ácido e reduzindo a longevidade e a fertilidade dos espermatozóides. O ph ótimo para os espermatozóides é próximo da neutralidade, portanto a maioria dos diluidores é tamponado com ph entre 6,9 e 7,1 (Oliveira, 2003). O mecanismo de ação dos crioprotetores não se encontra totalmente elucidado. Acredita-se que estes reduzam o ponto de congelação da solução, o qual é determinado como a temperatura onde ocorre a formação dos primeiros cristais de gelo. A estrutura molecular é um parâmetro importante para determinar a eficiência dos crioprotetores, uma vez que possuem afinidade pela água devido à presença de grupamentos amina e hidroxila em sua composição, os quais favorecem a formação de pontes de hidrogênio com as moléculas de água (Baudot et al., 2002). Estas ligações alteram a orientação das moléculas de água dos cristais de gelo, criando ambiente menos prejudicial às células (Dalimata, 1997). A sua ação interfere nas mudanças físicoquímicas que sofrem as células durante o processo criopreservação. Embora a concentração de crioprotetor seja elevada no meio, sua difusão é 30 a 60 vezes menor do que a da água (Graham, 1996). Por conseguinte, estas moléculas atravessam a membrana até atingir o equilíbrio numa velocidade menor do que a água, que ocasiona o enrugamento da célula devido à rápida saída de água para diluir a elevada concentração externa, e somente depois de um período é que o crioprotetor penetra e equilibra as concentrações intra e extracelulares. Nessas condições, a água retorna ao interior da célula até atingir o equilíbrio, que resulta na retomada do seu tamanho normal (Seidel, 1996). Embora imprescindíveis para a sobrevivência dos espermatozóides no processo de congelação, os crioprotetores possuem efeitos tóxicos para o espermatozóide, tornando algumas substâncias utilizadas na criopreservação de outros tipos celulares impróprias para a célula espermática (Watson, 2000). Em elevadas concentrações, os crioprotetores podem reduzir a capacidade fertilizante deste gameta devido à lesão por danos osmóticos (Graham, 1996). Crioprotetores intracelulares Os crioprotetores intracelulares ou permeantes atuam através de suas propriedades coligativas, reduzindo o ponto crioscópio intracelular. Desta forma, maior quantidade de água vai permanecer no estado liquido, quando submetida à baixas temperaturas, diminuindo a concentração intracelular de solutos e proporcionando, assim, um ambiente menos deletério à célula espermática durante a congelação (Watson, 1995). Vários crioprotetores já foram utilizados para criopreservação dos espermatozóides, como glicerol, dimetil sulfóxido, etileno glicol e propileno glicol, assim como as combinações deles. Todavia, o glicerol é utilizado o com maior freqüência, sendo sua adição executada a 37 C ou o 5 C, fracionada ou não (Leboeuf et al., 2000). Apesar de seu mecanismo de ação não se encontrar perfeitamente esclarecido, sabe-se que este crioprotetor penetra na membrana celular através de difusão passiva, permanecendo na membrana e no citoplasma, uma vez que, semelhante aos agentes não penetrantes, proporciona desidratação celular através do seu efeito osmótico, criando um meio hipertônico que induz a saída de água das células espermáticas. Além do seu efeito osmótico, o glicerol parece atuar diretamente na membrana plasmática, havendo evidências de que se liga aos fosfolipídeos da cabeça, reduzindo a fluidez da membrana, assim como interagindo com ligações protéicas e glicoprotéicas da membrana (Parks & Graham, 1992). Em 55

4 uma solução contendo glicerol, no momento em que ocorrer a congelação restará mais água descongelada do que naquela que não contenha glicerol, resultando no aumento do volume dos canais de solvente não congelado e na menor concentração de sais nesses canais (Baudot et al., 2002). O efeito tóxico do glicerol tem sido relatado por muitos autores, como desnaturação das proteínas, alteração nas interações de actina, nos eventos citoplasmáticos devido ao aumento da viscosidade pelo glicerol intracelular, na polimerização da tubulina, na associação de microtúbulos atuando diretamente na membrana plasmática, além de alterações no glicocálix e nas proteínas da superfície celular (Alvarenga et al., 2000b). Ao estudar o efeito de diferentes crioprotetores (glicerol, etileno glicol, dimetil formamida e dimetil sufóxido) em ejaculados de garanhões, Alvarenga et al. (2000b) demonstraram semelhança no efeito da adição de etilenoglicol e glicerol, apesar de relatarem que, quando utilizados em conjunto, possibilitam a redução da concentração de glicerol e, consequentemente, diminuem os danos causados pelo efeito tóxico. Da mesma forma, Alvarenga et al. (2000a) constataram equivalência nos resultados do uso destes crioprotetores (glicerol, etileno glicol, dimetil formamida e dimetil sufóxido), com exceção do dimetilsufóxido que determinou resultado inferior ao dos demais. Da mesma forma, Kotyagina (1963), citado por Melo (2003), utilizando sêmen de reprodutores eqüinos criopreservado com etileno glicol, associado a diluente contendo lactose ou gema de ovo, obtiveram gestação em três das cinco éguas do grupo testado. No entanto, Rombe et al. (1965), citado por Melo (2003), obtiveram 80% de prenhez após inseminar éguas com sêmen congelado utilizando glicerol e etileno glicol. O dimetil sufóxido também é muito usado como crioprotetor, uma vez que penetra rapidamente na membrana plasmática. Para que um soluto atue desta maneira, é necessário que seja solúvel à membrana, assim como em água. Este crioprotetor apresenta como inconveniente a capacidade de causar alterações na membrana, as quais danificam e inviabilizam as células, tornando os crioprotetores penetrantes geralmente tóxicos para as células (Wolfe & Bryant, 2001). Tanto isoladamente quanto em associação com o glicerol, o dimetil sufóxido aumenta a motilidade espermática pós-descongelação em amostras de sêmen bovino. Da mesma forma, a combinação destes crioprotetores para o sêmen canino tem sido efetuada com êxito (Melo, 2003). Em células espermáticas de peixe, o dimetil sufóxido é usado em concentrações acima de 12,5%. Na espécie eqüina, ao ser adicionado em concentrações entre 1 a 9% em diluente contendo lactose, gema de ovo ou citrato, combinado ou não com o glicerol, determina maior viabilidade espermática pós-descongelação. No entanto, quando utilizado na concentração de 5%, o dimetil sulfóxido proporciona efeito superior ao do uso isolado de glicerol. Em coelhos, bons resultados de motilidade espermática e de fertilidade têm sido alcançados com o uso de crioprotetores como o dimetil sufóxido, etileno glicol e amidas (Dalimata & Raham, 1997). Desta forma, a dimetil acetamida e o dimetil sufóxido tem sido uma alternativa na criopreservação de sêmen por não apresentar os efeitos tóxicos do glicerol (Blanco et al., 2000). Vários crioprotetores (glicerol, metanol, dimetil acetamida, dimetil sufóxido e propilenoglicol) têm sido utilizados na congelação de sêmen de peixe (Baunly et al., 1999). Em espermatozóides de aves e de truta, a dimetil acetamida apresentou resultados superiores aos obtidos com glicerol ou dimetil sufóxido, além da fertilidade e da viabilidade terem sido superiores àquelas comparadas com o glicerol e o dimetil sufóxido. A dimetil formamida e a metil formamida são crioprotetores que vem sendo utilizados com grande sucesso na congelação de sêmen eqüino. Todavia, seu uso para congelação de sêmen de garanhões com boa congelabilidade não proporciona aumento da motilidade, mas resultados semelhantes aos do glicerol. Assim, a utilização desses agentes em amostras de sêmen de garanhões com baixa resistência ao processo de criopreservação manifesta melhores resultados quando comparados aos do glicerol (Gomes et al., 2002). Ressalta-se, no entanto, que o uso combinado de crioprotetores confere maior proteção do que o uso isolado (Dalimata & Graham, 1997). Oliveira (2003) observou que a associação do crioprotetor etileno glicol (5%) ao meio diluidor lactose-gema apresentou melhores resultados na maioria dos testes de viabilidade in vitro de espermatozóides de cães, em comparação com o dimetil formamida-lactose e etileno glicol-tris (tris-hidroximetil aminometano), um agente emulsificante e solúvel em água. Todavia, este crioprotetor possui a desvantagem de ser um tampão pouco eficiente ao ser utilizado em meio com ph neutro (7,0) (Molina et al., 1994). Crioprotetores extracelulares Algumas substâncias, como lipídeos, proteínas e macromoléculas, são eficientes na proteção da célula espermática durante o processo de congelação, sem que para isso necessitem penetrar no seu interior. Estas substâncias podem ser encontradas na gema de ovo, no leite, em alguns açúcares e na albumina sérica bovina. A gema de ovo contém lecitina (fosfatidilcolina) que parece proteger a membrana celular por restituir os fosfolipídeos perdidos pelos espermatozóides durante o choque térmico (Watson, 1995). As lipoproteínas de baixa densidade (LDL) aderem à membrana celular durante o processo de criopreservação, preservando a membrana espermática (Moussa et al., 2002), atuando na superfície da membrana plasmática, restaurando a perda de fosfolipídeos e, aparentemente, induzindo alteração transitória de sua composição, o que previne a ruptura da membrana plasmática (Farstard, 1996). Os fosfolipídeos que compõe a fração LDL da gema de ovo protegem os espermatozóides durante o processo de refrigeração (5 ºC). Assim, o uso de fosfatidilserina 56

5 purificada tem demonstrado proteger as células espermáticas de bodes e touros contra o choque térmico (Wilhelm et al., 1996). Lipossomas que compõe o colesterol e a fosfatidilserina protegem os espermatozóides de bovinos e de garanhões dos danos causados pelo processo de congelação, possivelmente por prevenir alterações deletérias durante a criopreservação. A prevenção conferida pelos lipídeos aos danos causados pelo choque térmico parece estar relacionada à quelação do +2 íon Ca do meio, evitando sua entrada no espermatozóide. É possível que os lipossomas interajam com o cálcio e outros componentes do meio de congelação que afetam a tonicidade ou a fração da água não congelada durante a criopreservação. Os diluentes usados na criopreservação de sêmen eqüino possuem entre 2 a 20 % de gema de ovo. Os espermatozóides bovinos não sobrevivem ao congelamento e a descongelação sem a presença de gema de ovo, apesar de possuírem o glicerol na composição do meio diluidor (Wilhelm et al., 1996). Os açúcares atuam através da pressão osmótica na desidratação celular, reduzindo a água passível de ser congelada no interior da célula, de modo a reduzir a injúria causada pela cristalização de gelo (Aisen, 2002). Além de atuarem como crioprotetores, o açúcar atua como substrato energético para o espermatozóide durante o período de incubação (Yildiz et al., 2000), conferindo proteção à membrana plasmática durante a congelação/descongelação através de interações diretas com a membrana, as quais envolvem ligações de hidrogênio dos grupos hidroxil dos açúcares com os grupos fosfatos localizados na cabeça dos fosfolipídeos. Por restaurarem o porcentual de água ao redor dos grupos das cabeças dos fosfolipídeos, os açúcares podem prevenir os danos causados pela desidratação extrema que pode ocorrer com a congelação. Geralmente os dissacarídeos (sacarose e trealose) são mais efetivos em estabilizar a bicamada da membrana do que os monossacarídeos (De Leeuw, 1993), mantendo sua capacidade de transporte de cálcio, inibição da fusão de membranas e manutenção de lipídeos numa fase fluida na ausência de água (Anchordoguy et al., 1987; Crowe et al., 1987). A rafinose tem sido o açúcar mais utilizado na criopreservação de sêmen de ratos, visando promover a hipertonicidade necessária à desidratação da célula antes da congelação (Storey et al., 1998). A trealose confere proteção através do efeito osmótico e das interações específicas com os fosfolipídeos de membrana. Além disso, atua na reposição de água da interface membrana-solução e na interação direta com os grupos polares dos fosfolipídeos, durante as fases de desidratação e congelação, reduzindo as interações de van der Waals entre as cadeias de hidrocarbonetos (Aisen, 2002) e resultando na estabilização da membrana (Storey et al., 1998). O uso de metil celulose, em associação com acetamida e trealose, elevou o porcentual de células móveis após a congelação de sêmen de coelhos, quando comparado ao uso isolado da acetamida. O porcentual de espermatozóides vivos com o acrossoma intacto também foi maior ao se utilizar diluente contendo metil celulose e trealose, quando comparado ao efeito da acetamida, o que demonstra que a combinação de crioprotetores confere maior proteção à célula espermática, do que o uso isolado de agentes penetrantes, provavelmente por potencializar os efeitos dos crioprotetores associados (Dalimata & Graham, 1997). O leite é utilizado para diluir e armazenar o sêmen in natura ou refrigerado. Assim, Kundu et al. (2001) obtiveram excelente resultado pós-descongelação ao utilizarem diluente à base de leite, glicose e glicerol na criopreservação de sêmen eqüino. Alguns aminoácidos como glutamina, histidina e glicina betaína tem sido utilizados na criopreservação de sêmen de ovinos, garanhões e humanos. Gonzalez et al. (1999) obtiveram sucesso ao utilizar os diluidores à base de glicina-gema ou glicina-gema-leite na criopreservação de sêmen ovino, enquanto Dourado et al. (2007) observaram melhores resultados, in vitro, após criopreservarem sêmen caprino utilizando diluente à base de tris, quando comparado ao leite, embora essa melhoria não foi refletida nos resultados de fertilidade após inseminação intra-cervical (52,4% x 42,9%), com doses inseminantes criopreservadas em meio contendo leite e tris, respectivamente. Ação das ROS sobre a célula espermática As ROS atuam diretamente na fertilidade do macho, uma vez que são responsáveis por processos como hiperativação, capacitação e reação acrossômica dos espermatozóides, bem como da fertilização. Durante a passagem na cauda do epidídimo, os espermatozóides são encontrados em estado imóvel, caracterizados por baixa concentração intracelular de camp e cálcio, bem como suprimida sua capacidade de produzir ROS (White & Aitken, 1989). Essa condição é revertida durante os estágios iniciais da capacitação, onde se constata aumento na concentração de cálcio intracelular e camp, tendo início a produção de ROS, e, em conseqüência, os espermatozóides desenvolvem a forma altamente vigorosa de motilidade conhecida como hiperativação. Por outro lado, as ROS também podem causar severos danos aos espermatozóides quando os seus mecanismos de defesa estão limitados. Assim, o espermatozóide está continuamente susceptível a danos, uma vez que a produção controlada de ROS é de vital importância para a sua função normal, enquanto que a superprodução e/ou defesas antioxidantes inadequadas determinam estresse oxidativo, reduzindo a capacidade fertilizante destas células (Aitken, 1995). A peroxidação dos lipídios (LPO) parece ser uma causa particularmente importante de disfunção espermática. Os lipídios da membrana espermática são ricos em ácidos graxos poliinsaturados (AGPI), os quais, em concentração elevada, determinam fluidez da membrana possibilitando 57

6 que o espermatozóide participe dos eventos de fusão de membranas durante a fertilização. Assim, espermatozóides com LPO apresentam redução da fluidez da membrana e da sua capacidade de fertilização (Aitken, 1995). Sob condições oxidativas extremas, todos os componentes celulares (lipídeos, proteínas, ácidos nucléicos e açúcares) são potenciais alvos para estresse oxidativo, cuja extensão dos danos depende não somente da natureza e da quantidade de ROS, mas também do momento e da duração de exposição, associado a fatores extracelulares como temperatura e ambiente, que podem resultar em morte celular (Sharma et al., 1999). Durante o processo de criopreservação, a célula espermática sofre lesões de acrossoma que diminuem a sua viabilidade, devido à manipulação, exposição ao oxigênio e vários outros procedimentos que podem aumentar a produção de ROS. Os sistemas de defesa antioxidantes do espermatozóide e do plasma seminal desempenham papel importante na viabilidade espermática. No entanto, em condições naturais de acasalamentos, o espermatozóide é exposto, principalmente à condições anaeróbicas, reduzindo assim os potenciais danos causados pelas ROS. Porém, quando manipulado para uso na IA, o sêmen é exposto ao oxigênio, assim como vários procedimentos laboratoriais durante o seu processamento podem elevar a produção de ROS, bem como a redução das defesas antioxidantes. A lavagem das amostras de sêmen, por exemplo, retira a proteção antioxidante fornecida pelo plasma seminal. Todos esses fatores podem contribuir para aumentar a ocorrência de danos oxidativos aos espermatozóides observados no sêmen manipulado (Maia, 2003). Segundo Aitken (1995), a capacidade biossintética do espermatozóide é limitada, tornando difícil para ele substituir qualquer molécula que tenha sido danificada. Além disso, as enzimas antioxidantes podem estar concentradas na peça intermediária, deixando menos protegida grande parte da membrana que recobre a cabeça e a cauda espermática. Por isso, o plasma seminal é particularmente importante na proteção do espermatozóide contra os danos causados pelas ROS geradas pelo próprio espermatozóide e pelos fagócitos presentes no ejaculado. Adição de substâncias antioxidantes aos meios diluidores As propriedades antioxidantes dos diluentes usados rotineiramente para criopreservação do sêmen são pouco conhecidas e os efeitos da produção excessiva de ROS nesses diluentes também não são bem caracterizados. No entanto, esse conhecimento é fundamental para que se possa entender como a motilidade espermática é afetada ao se utilizar determinado diluidor após a ocorrência de estresse oxidativo resultante da criopreservação, auxiliando na formulação de diluidores de acordo com as suas propriedades antioxidantes. Com o objetivo de reduzir danos oxidativos causados pela elevada concentração de ROS, algumas pesquisas têm sido realizadas com a utilização de substâncias antioxidantes em amostras de sêmen de pequenos ruminantes (Maxwell & Stojanov, 1996; Sinhá et al., 1996). Para combater o estresse oxidativo e a lipoperoxidação, o espermatozóide conta com um sistema antioxidante constituído da glutationa reduzida (GSH), glutationa peroxidase (GSH-Px), catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD), ácido ascórbico e -tocoferol (Aitken, 1995). Extracelularmente, os espermatozóides são protegidos pelo plasma seminal, que contém vários redutores de ROS (enzimáticos e não enzimáticos), como ácido ascórbico, ácido úrico, albumina e outras proteínas, catalase, SOD, glutationa e outros tióis, taurina, hipotaurina e vitamina E (Zini et al., 2000). Sinhá et al. (1996) observaram aumento no porcentual de motilidade espermática, pós-congelação, após adicionar 5 µm de glutationa ao sêmen caprino. Existem relatos referentes a ejaculados que apresentaram elevados índices de viabilidade espermática, tanto antes quanto após a congelação, os quais possuíam elevada atividade de antioxidantes enzimáticos, como SOD e glutationa peroxidase dependente de selênio (GSP-Pe-Se), assim como de antioxidantes não enzimáticos, como glutationa reduzida e vitamina E. A elaboração de protocolos de congelação deve considerar a quantificação de ROS geradas e a identificação das substâncias que possam atuar na proteção das células espermáticas aos efeitos oxidativos ocorridos na criopreservação do sêmen (Valença & Guerra, 2007). A vitamina E (-tocoferol e seus derivados), predominante antioxidante lipossolúvel animal, protege as células de radicais de oxigênio, in vivo e in vitro, e acredita-se ser o inibidor primário de ROS encontradas em pequenas quantidades nas membranas celulares de mamíferos e no plasma seminal (Sikka, 2004), protegendo as células de estresse oxidativo (Kagan et al., 1992). A vitamina C também atua sinergicamente com a vitamina E, através da geração de tocoferol a partir de radicais tocoferoxil, produto da interação de tocoferol e ROS (Buettner, 1993). Sarlos et al. (2002), trabalhando com sêmen de carneiro, avaliaram o efeito dos antioxidantes Acetato de -tocoferol, Glutationa peroxidade, Aromex (antioxidante sintético), resveratrol (3,4',5-trihidroxiestilbeno) e resveratrol + vitamina E e resveratrol + aromex, na motilidade e na integridade das membranas espermáticas. Esses autores observaram que a adição de antioxidantes prolonga o período de conservação do sêmen, melhora a motilidade dos espermatozóides e reduz o grau de danos celulares. No entanto, ressalta-se que os efeitos da vitamina E podem variar com a dose utilizada, uma vez que, de acordo com a quantidade de radicais hidroxilas a serem inativados, a vitamina E pode apresentar efeito antioxidante ou estimular a oxidação (Cao & Cutler, 1997, citados por Valença & Guerra, 2007). 58

7 Sánchez-Partida et al. (1997), ao avaliarem o efeito de compostos epididimais (taurina, hipotaurina e inositol) e antioxidantes (carnosina e ácido ascórbico) na motilidade e na fertilidade dos espermatozóides, observaram que apenas a taurina exerceu efeito positivo na motilidade espermática, tanto na presença quanto na ausência de glicerol. No entanto, apesar da melhora na motilidade espermática, a fertilidade do sêmen congelado na presença de taurina (50 mm) não diferiu daquela observada no sêmen congelado sem taurina. Isso indica que outros fatores além da motilidade estão envolvidos na capacidade fertilizante e na função dos espermatozóides criopreservados. Maia (2006) constatou que a suplementação do diluidor com os antioxidantes Trolox-C ou catalase, individualmente, teve efeito benéfico na manutenção da integridade das membranas plasmática e acrossomal de espermatozóides ovinos, avaliado com Iodeto de Propídeo (PI) e aglutinina derivada do Pisum sativum conjugada com a fluoresceína isotiocianato (FICT-PSA), em relação ao controle (TRIS). O porcentual de espermatozóides viáveis com acrossomo intacto foi maior no diluidor aditivado de catalase, sendo que o Trolox-C também exerceu efeito semelhante ao da catalase, embora em proporção inferior. O mesmo autor quantificou a geração de ROS no sêmen ovino criopreservado no diluidor Tris-gema aditivado de TrolOx-C e catalase, onde observou que a geração de O (Radical 2 Superóxido), H O (Peróxido de Hidrogênio) e OH (Radical 2 2 Hidroxila) foi detectada no sêmen congelado/descongelado em todos os diluidores e que, em situação de estresse oxidativo induzido pela adição de ferro, H O ou sistema 2 2 gerador de O ao meio de incubação, os antioxidantes foram 2 eficazes em remover o excesso de ROS e manter o equilíbrio do sistema. O tempo de refrigeração das doses diluídas de sêmen suíno, assim como a adição de antioxidantes aos ejaculados diluídos têm sido evidenciados como procedimentos que podem auxiliar na tolerância das células espermáticas à criopreservação, em virtude de muitos trabalhos terem relatado que a injúria causada pelos agentes oxidantes são maiores após a congelação. Entretanto, poucos trabalhos realizados nesta área demonstram resultados contraditórios relacionados aos diferentes índices de susceptibilidade à peroxidação lipídica entre as diversas espécies, associado aos tipos de antioxidantes utilizados e à composição do plasma seminal (Valença & Guerra, 2007). Não há consenso na literatura quanto ao efeito preventivo das substâncias antioxidantes adicionadas ao diluente, uma vez que alguns estudos relatam efeitos positivos da adição dessas substâncias, enquanto outros não observaram nenhum benefício. A divergência nos resultados observada dentro da mesma espécie certamente deve-se a variações na idade e na raça dos animais utilizados, na composição do diluente, na forma de conservação do sêmen, nas doses e combinações dos antioxidantes, entre outros. A padronização dos ensaios utilizados para cada espécie certamente possibilitará maior uniformidade dos resultados obtidos e a recomendação de quais antioxidantes e em que concentrações devem ser utilizadas visando à prevenção de danos oxidativos causados pelas ROS aos espermatozóides Avaliação do sêmen criopreservado Testes in vitro são freqüentemente realizados para determinação da qualidade do sêmen a ser utilizado em IA ou em procedimentos de biotecnologia de embriões, devido à relação existente entre qualidade do material seminal e fertilidade (Bicudo et al., 2007). Normalmente as avaliações laboratoriais realizadas com o objetivo de estimar o potencial de fertilidade de uma partida de sêmen são: motilidade espermática (%); vigor (1-5); concentração espermática (milhões/dose); anormalidades espermáticas (%) e teste de termo-resistência (lento ou rápido). Estas avaliações vêm sendo utilizadas desde a década de 80, com base nas técnicas e padrões mínimos exigidos pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal para avaliação do sêmen, in natura ou criopreservado (Arruda et al., 1992). Usualmente, a motilidade espermática é estimada de forma subjetiva, sendo analisada sob microscopia óptica, com uma gota de sêmen entre lâmina e lamínula, estimandose sua porcentagem visualmente, em uma avaliação que depende da habilidade do técnico. No entanto, as anormalidades espermáticas são avaliadas em esfregaços corados ou câmara úmida, onde são estimados os porcentuais de células patológicas. Entretanto, estudos relatam que este tipo de análise manual é impreciso, em virtude da natureza subjetiva dos testes usados, da variabilidade entre técnicos e das diferenças na implementação de padrões para a avaliação (Arruda et al., 2007). Na tentativa de diminuir esta imprecisão, uma grande diversidade de biotécnicas vem sendo desenvolvida para avaliação seminal, das quais se pode citar sistemas de avaliação computadorizada das características seminais (CASA), uso de sondas fluorescentes para a avaliação de estruturas espermáticas por microscopia de epifluorescência ou sistema de citometria de fluxo, técnicas de sexagem espermática, avaliação de proteínas do plasma seminal, entre outras (Arruda et al., 2007). Programas computadorizados para a avaliação espermática podem ser mais objetivos e imprimir maior repetibilidade às avaliações do que a habilidade humana em identificar padrões de motilidade ou de anormalidade espermáticas (Arruda et al., 2003). A avaliação da cinética de um grande número de espermatozóides pode ser determinada em análise do movimento espermático monitorada por computador, no qual cada trajetória da cabeça do espermatozóide é registrada, reconstituída e mensurada. Ainda, o sistema computadorizado (CASA) proporciona a oportunidade de avaliar múltiplas características espermáticas em uma única amostra de 59

8 sêmen, com alta repetibilidade (Mortimer & Maxwell, 2004). O poder de análise deste tipo de teste é dado pela avaliação precisa e acurada dos espermatozóides com alto grau de objetividade, podendo assim aperfeiçoar o processo de avaliação seminal dos animais domésticos (Verstegen et al., 2002). Todavia, ainda não está bem claro qual característica do movimento espermático determinado pela CASA é capaz de predizer a fertilidade ou a taxa de fertilização (Ferreira et al., 1997). Avanços recentes na tecnologia de coloração têm fornecido novos meios de se avaliar a capacidade funcional de espermatozóides em várias espécies. Vale ressaltar que as técnicas que usam corantes em esfregaços de sêmen podem induzir danos às estruturas espermáticas durante sua confecção, o que não acontece em preparações úmidas. As preparações úmidas são as mais simples e fidedignas para o estudo do acrossoma, bem como de outras estruturas espermáticas, sendo mais recomendado o tampão fosfato associado à baixa concentração de glutaraldeído (Barth & Oko, 1989, citado por Bicudo et al., 2007). As sondas fluorescentes monitoram a funcionalidade ou a integridade das estruturas dos espermatozóides, as quais possuem a capacidade de se ligar a pontos específicos das células, permitindo diagnóstico mais fácil e direto, na dependência de suas características físicas (Celeghini et al., 2007). A combinação de vários corantes fluorescentes possibilita a avaliação de diversas estruturas simultaneamente, além de distinguir células espermáticas viáveis e não viáveis. A associação das sondas Iodeto de Propídeo, aglutinina derivada do Pisum sativum conjugada com a fluoresceína isotiocianato (FICT-PSA), e Mito Tracker Grenn FM tem sido utilizada para avaliar simultaneamente a integridade das membranas plasmáticas e acrosomal e função mitocondrial em espermatozóides bovinos (Celeghini et al., 2007). Em ovinos, têm-se usado o Diacetato de Carboxifluoresceina (CFDA), o PI e o Hoechst (Bicudo et al., 2007). Como indicadores de danos ao acrossoma, lecitinas marcadas, particularmente FICT-PSA, podem ser empregadas na avaliação do sêmen ovino com o objetivo de distinguir células espermáticas com acrossomas reagidos daquelas com acrossomas intactos (Azevedo, 2006). Harrison & Vickers (1990) relacionaram a coloração da peça intermediária por CFDA à integridade das mitocôndrias em ovinos. A função mitocondrial pode ser avaliada usando-se o I o d e t o d e 5, 5 ', 6, 6 ' t e t r a c l o r o 1, 1, 3, 3 ' tetraetilbenzimidazolilcarbocianina (JC-1), que permite classificar os espermatozóides que apresentem elevado e reduzido potencial de membrana mitocondrial. Para a avaliação do status de capacitação espermática em ovinos, a técnica de fluorescência empregando-se clorotetraciclina (CTC) apresenta a vantagem de permitir não apenas a distinção entre células com acrossomas intactos e reagidos, mas também diferenciar aquelas com acrossomas intactos em duas categorias funcionalmente diferentes, capacitadas e não capacitadas (Azevedo, 2006). Embora o uso de sondas fluorescentes por microscopia seja um método eficaz para a avaliação espermática, o número de espermatozóides avaliados normalmente não excede 200. Desta forma, a citometria de fluxo surge como uma técnica vantajosa em relação às formas clássicas para avaliação da célula espermática, uma vez que este sistema automatizado tem a capacidade de examinar espermatozóides em menos de um minuto, permitindo maior exatidão nos resultados. Porém, apesar de cientistas procurarem intensamente desenvolver técnicas laboratoriais que predizem com exatidão a fertilidade do sêmen, nenhum teste laboratorial isolado pode estimar seu potencial de fertilização (Arruda et al., 2004) Considerações finais Os danos que ocorrem durante o processo de congelação sobre a célula espermática não podem ser combatidos isoladamente, em virtude da diversidade de fatores envolvidos neste processo. Desta forma, é de fundamental importância o desenvolvimento de pesquisas que permitam a elaboração de protocolos que minimizem estes efeitos, bem como a elaboração e padronização de métodos eficazes de análise da viabilidade da célula espermática submetida ao processo de criopreservação para incrementar os índices de fertilidade nos programas de inseminação artificial. Referências AISEN, E.G.; MEDINA, V.H.; VENTURINO, A. Cryopreservation and post-thawed fertility of ram semen frozen in different trehalose concentration. Theriogenology, v. 57, p , AITKEN, R.J. Free radicals, lipid peroxidation and sperm function. Reproduction, Fertility and Development, v. 7, p , ALVARENGA, M.A.; KEITH, S.L.; GRAHAM, J.K.; LANDIM- ALVARENGA, F.C.; SQUIRES, E.L. Alternative cryoprotectors for freezing stallion spermatozoa. In: INTERNATIONAL CONGRESS ON ANIMAL REPRODUCTION, 14, 2000, Stockholm, Proceedings. Stockholm, 2000, p.157. ALVARENGA, M.A.; LANDIM-ALVARENGA, F.C.; MOREIRA, R.M.; CESARINO, M.M. Acrossomal ultrastructure of stallion spermatozoa cryopreserved with ethylene glycol using two packaging systems. Equine Veterinary Journal, v. 32, n. 6, p , 2000b. ANCHORDOGUY, T.J.; RUDOLPH, A.S.; CARPENTER, J.F.; CROWE, J.H. Modes of interaction of cryoprotectants with membrane phospholipides during freezing. Cryobiology, v. 24, p , ARRUDA, P.R.; ANDRADE, A.F.C.; CELEGHINI, E.C.C.; ZAFFALON, G.; TARRAGÓ, O.F.B. Avaliação de sêmen fresco e congelado. In: SIMPÓSIO BRASILEIRO DE REPRODUÇÃO 60

9 ASSISTIDA EM CAPRINOS E OVINOS, 1, 2007, Gravatá, PE. Anais. Gravatá, PE: Rebanho Caroatá e Caroatá Genética, Cd-Room. ARRUDA, R.P.; BALL, B.A.; GRAVANCE, C.G.; LIU, I.K.M. Determinação da integridade da membrana plasmática e acrossomo de espermatozóides de garanhões pela técnica de citometria de fluxo. Acta Science Veterinariae, v. 31 (Suplemento), p , ARRUDA, R.P.; BARNABE, V.H.; ALENCAR, M.M.; BARNABE, R.C. Avaliação de sêmen congelado de bovinos. Provas lente e rápida de termo-resistência: efeitos sobre a fertilidade. Brasilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v. 29, n. 1, p , ARRUDA, R.P.; CELEGNINI, E.C.C.; ANDRADE, A.F.C.; GARCIA, A.R.; NASCIMENTO, J.; RAPHAEL, C.F. SOUSA, L.W.O. Importância da qualidade do sêmen em programas de IATF e TETF. Biotecnologia da Reprodução em bovinos. SIMPÓSIO INTERNACIONAL DE REPRODUÇÃO ANIMAL APLICADA. 1. Anais. p AZEVEDO, H.C. Integridade e funcionalidade dos espermatozóides ovinos submetidos à criopreservação após a incorporação de colesterol, desmosterol, ácido oléico-linoleico e à-lactoalbumina. 2006, 195p. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista - UNESP, Botucatu, BALL, B.A.; VO, A. Osmotic tolerance of equine spermatozoa and the effects of soluble cryoprotectant on equine sperm motility, viability and mitochondrial membrane potential. Journal of Andrology, v. 22, p , BAUDOT, A.; CAULA, C.; DUARTE, M.L.; FAUSTO, R Thermal study of simple aminoalcohol solution, Cryobiology, v. 44, p , BAULNY, B.O.; LABBE, C.; MAISSE, G. Membrane integrity mitochondrial activity, ATP content, and motility of the European Catfish (Silurus glanis) testicular spermatozoa after freezing with different cryoprotectants. Cryobiology, v. 39, p , BAUBER, J.; SABEUR, K.; VO, A.; BALL, B.A. Reactive oxygen species promote tyrosine phosphorylation and capacitation in equine spermatozoa. Theriogenology, v. 60, p , BICUDO, S.D.; AZEVEDO, H.C.; MAIA, S.M.; GREEN, R.E.; RODELLO, L.; MEIRA, C. Avanços na criopreservação do sêmen ovino visando sua aplicação em programas de inseminação artificial e em biotecnologias com embriões. Acta Scientiae Veterinariae, v. 35 (Supl. 3): s787-s798, BILODEAU, J.F.; BLANCHETTE, S.; CORNER, N.; SIRAD, M- A. Reactive oxygen species-mediated loss of bovine sperm motility in egg yolk Tris extender: protection by pyruvate, metal chelators and bovine liver or oviductal fluid catalase. Theriogenology, v. 57, p , BLANCO, J.M.; GEE, G.; WILDT, D.E.; DONOGHUE, A.M. Species variation in osmotic cryoprotectant and cooling rate tolerance in poultry, eagle, and peregrine falcon spermatozoa. Biology of Reproduction, v. 63, p , BUETTNER, G.R. The pecking order of free radicals and antioxidants, lipid peroxidation, -tocopherol and ascorbate. Archives of Biochemistry and Biophysic, v.300, p , CELEGHINI, E.C.C.; ARRUDA, R.P.; ANDRADE, A.F.C.; NASCIMENTO, J.; RAPHAEL, C.F. Practical techniques for bovine sperm simultaneous fluorimetric assessment of plasma, acrosomal and mitochondrial membranes. Reproduction in Domestic Animals, v. 42, p , CHEMINEAU, P.; CAGNIE, Y.; GUERIN, Y.; ORGEUR, P.; VALLET, J.C. Training manual on artificial insemination in sheep and goats. FAO Reproduction and Health Paper. Food and Agriculture Organization of the United Nations, p , CROWE, J.H.; CROWE, L.M.; CARPENTER, J.F.; AURELLWISTROM, C. Stabilization of dry phospholipid bilayers and proteins by sugars. Biochemistry Journal, v. 242, p.1-10, DALIMATA, A.M.; GRAHAM, J.K. Cryopreservation of rabbit spermatozoa using acetamide in combination with trehalose and methyl celulose. Theriogenology, v. 48, p , DE LAMIRANDE, E.; JIANG, H.; ZINE, A.; KODAMA, H.; GAGNON, C. Reactive oxygen species and sperm physiology. Reviews Reproduction, v. 2, p , DE LEEUW, F.E.; De LEEUW, A.M.; DEN DAAS, J.H.G.; COLENBRANDER, B.; VERKLEIJ, A.J. Effects of various cryoprotective agents and membrane-stabilizing compuond on bull sperm membrane integrity after cooling and freezing. Cryobiology, v. 30, p , DENVIREDDY, R.V.; SWALUND, D.J.; OLIN, T.; VINCENT, W.; TROEDSON, M.H.T.; BISCHOF, J.C.; ROBERTS, K.P. Cryopreservation of equine sperm: optimal cooling rates in the presence and absence of cryoprotective agents determined used differencial scanning calorimetry. Biology of Reproduction, v. 66, p , DORADO, J; RODRIGUEZ, I.M.; HIDALGO, A. Cryopreservation of goat spermatozoa: comparison of two freezing extenders based on post-thaw sperm quality and fertility rates after artificial insemination. Theriogenology, v. 15, p , EVANS, G.; MAXWELL, W.M.C. Salamon's Artificial Insemination of Sheep and Goats. Wellington:Butterworths, p. FARSTARD, W. Semen cryopreservation in dogs and foxes. Animal Reproduction Science, v. 42, p , FERREIRA, J.C.P.; NEVES NETO, J.R.; PAPA, F.O. Avaliação computadorizada das características espermáticas de garanhões com fertilidade comprovada. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v. 21, n. 3, p ,

10 GOMES, G.M.; JACOB, J.C.F.; MEDEIROS, A.S.L.; PAPA, F.O., ALVARENGA, M.A. Improvement of stallion spermatozoa for the Mangalarga Marchador breed. Theriogenology, v. 58, p , GONZALEZ, C. I. M.; OBA, E.; BICUDO, S. D. Avaliação do sêmen ovino (Ovis aries) congelados em palhetas e pellets com diferentes meios diluidores. Revista Brasileira de Reprodução Animal. Belo Horizonte, v. 23. p , GRAHAM, J.K. Cryopreservation of stallion spermatozoa. Veterinary Clinics of North America: Equine Practice, v. 12, p , GUERRA, M.M.P.; EVANS, G.; MAXWELL, W.E.C. Papel de oxidantes e antioxidantes na andrologia (Revisão de literatura). Revista Brasileira de Reprodução Animal, v. 28, p , HARRISON, R.A.P.; VICKERS, S.E. Use of fluorescent probes to assess membrane integrity in mammalian spermatozoa. Journal of Reproduction and Fertility, v. 88, n. 1, p , HOLT, W.V. Basic aspects of frozen storage of semen. Animal Reproduction Science, v. 1/3, p. 3-22, KAGAN, V.E.; SERBINOVA, E.A.; FORTE, T.; SCITA, G. Recycling of vitamin E in low density lipoproteins. Journal of Lipid Research, v. 33, p , KUNDU, C.N.; DAS, K.; MAJUMDER, G.C. Effect of amino acid on goat cauda epididymal sperm cryopreservation using chemically defined model system. Cryobiology, v. 41, p , LEBOEUF, B.; RESTALL, B.; SALAMON, S. Production and storage of goat semen for artificial insemination. Animal Reproduction Science, v. 62, p , MAIA, M. S. Espécies reativas do metabolismo do oxigênio, antioxidantes e função espermática p. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP Botucatu, MAIA, M.S. Viabilidade espermática e geração de metabólitos reativos do oxigênio (ROS) no sêmen ovino criopreservado em diluidor aditivado de lauril sulfato de sódio (OEP), trolox-c e catalase. 2006, 147p. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista UNESP, Botucatu, MAXWELL, W.M.C.; STOJANOV, T. Liquid storage of ram semen in the absence or presence of some antioxidants. Reproduction and Fertility Development, v. 8, p , MAZUR, P. Basic concepts in freezing cell. In: Deep freezing of boar semen, 1985, Uppsala. Proceedings. Uppsala, 1985, p MEDEIROS, C.M.O.; FORELL, F.; OLIVEIRA, A.T.D.; RODRIGUES, J.L. Current status of sperm cryopreservation: why isn't it better? Theriogenology, v. 57, p , MELO, M.C. Ação dos crioprotetores na biotecnologia de sêmen congelado. Seminário apresentado à disciplina de Seminários I da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista UNESP, Botucatu, p. MOLINA, F.C.; EVANS, G.; MAXWELL, W.M.C. In vitro evaluation of zwitterions buffers in diluents for freezing ram spermatozoa. Reproduction Nutrition Development, v.34, p , MORTIMER, S.T.; MAXWELL, W.M.C. Effect of medium on kinematics of frozen-thawed ram spermatozoa. Reproduction, v. 127, p , MOUSSA, M.; MARTINET, V.; TRIMECHE, A.; TAINTURIER, D.; ANTON, M. Low density lipoproteins extracted from hen egg yolk by na easy method: cryoprotective effect on frozen thawed bull semen. Theriogenology, v. 57, p , OLIVEIRA, E.C.S. Efeito de diferentes diluidores sobre a criopreservação do sêmen canino. 2003, 61p. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais UFMG, Belo Horizonte, PARKS, E.J.; GRAHAM, J.K. Effects of cryopreservation procedures on sperm membrans. Theriogenology, v. 38, p , PURDY, P.H. A review on goat sperm cryopreservation. Small Ruminant Research, v. 63, p , RITAR, A.J.; BALL, P.D.; O'MAY, P.J. Examination of methods for the deep freezing of goat semen. Reproduction, Fertility and Development, v. 2, p , SÁNCHEZ-PARTIDA, L.G.; SETCHELL, B.P.; MAXWELL, W.M.C. Epididymal compounds and antioxidants in diluents for the frozen storage of ram spermatozoa. Reproduction, Fertility and Development, v. 9, p , SARLOS, P.; MOLNÁR, A.; KÓKAI, M.; GABOR, G.Y.; RÁTKY, J. Comparative evaluation of the effect of antioxidants in the conservation of ram semen. Acta Veterinaria Hungarica, v. 50, n. 2, p , SEIDEL, G.E. Principles of cryopreservation of mammalian embryos. In: THECNIQUES FOR FREEZING MAMMALIAN EMBRYOS, 1996, Fort Collins. Proceedings. Fort Collins: Colorado State University, p SHARMA, R.K.; PASQUALOTTO, F.F.; NELSON, D.R. et al. The reactive oxygen species-total antioxidant capacity score is a new measure of oxidative stress to predict male infertility. Human Reproduction, v. 14, p , SIKKA, S.C. Role of oxidative stress and antioxidants in andrology and assisted reproductive technology. Journal of Andrology, v. 25, p. 5-18, SINHA, M.P.; SINHA, A.K.; SING, B.K.; PRASAD, R.L. The effect of glutathione on motility, enzyme leakage and fertility of 62

11 frozen goat semen. Animal Reproduction Science, v. 41, p , SQUIRES, E.L.; PICKETT, B.W.; GRAHAM, J.K.; VANDERWALL, D.K.; McCUE, P.M.; BRUEMMER, J. Cooled and frozen Stallion Semen. Fort Collins: Colorado State University. 1999, 80 p. (Animal Reproduction and Biotechnology Laboratory, Bulletim, N. 9). STOREY, B.T.; NOILES, E.E.; THOMPSON, K.A. Comparison of glycerol, other polyols, trehalose and raffinose to provide defined cryoprotectant medium for mouse spermatozoa cryopreservation. Cryobiology, v. 37, p , VALENÇA, R.M.B.; GUERRA, M.M.P. Espécies Reativas ao Oxigênio (ROS) e a utilização de antioxidantes na criopreservação do sêmen suíno. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v. 31, n. 1, p , VERSTEGEN, J.; IGUER-OUADA, M.; OCLIN, K. Computer assisted sêmen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology, v. 57, p , WATSON, P.F. Recent developments and concepts in the cryopreservation of their post-thawing function. Reproduction, Fertility and Development, v. 7, p , WATSON, P.F. The causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Animal Reproduction Sciece, v.60/61, p , WHITE, D.R.; AITKEN, R.J. Relationship between calcium, cyclie AMP, ATP and intracellular ph and the capacity of hamster spermatozoa to express hyperactivated motility. Gamete Research, v. 22, p , WILHELM, K.M.; GRAHAM, J.K.; SQUIRES, E.L. Effects of phosphatidylserine and cholesterol lipossomes on the viability, motility and acrossomal integrity of stallion spermatozoa prior and after cryopreservation. Cryobiology, v. 33, p , WOLFE, J.; BRYANT, G. Celular cryobiology: thermodinamic and mechanical effects. International Journal of Refrigeration, v. 24, p , YILDIZ, C.; KAYA, A.; AKSOY, M.; TEKELI, T. Influence of sugar supplementation of the extender on motility, viability and acrossomal integrity of dog spermatozoa during freezing. Theriogenology, v. 54, p , WILHELM, K.M.; GRAHAM, J.K.; SQUIRES, E.L. Effects of phosphatidylserine and cholesterol lipossomes on the viability, motility and acrossomal integrity of stallion spermatozoa prior and after cryopreservation. Cryobiology, v.33, p , ZINI, A.; GARRELS, K.; PHANG, D. Antioxidant activity in the semen of fertile and infertile men. Urology, v. 55, n. 6, p , Recebido em 19 de maio de 2008 e aprovado em 3 de dezembro de