ESTUDO DAS LESÕES GLOMERULARES ENCONTRADAS EM CÃES COM DOENÇA RENAL CRÔNICA

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CAMPUS BOTUCATU ESTUDO DAS LESÕES GLOMERULARES ENCONTRADAS EM CÃES COM DOENÇA RENAL CRÔNICA PAULA BILBAU SANT ANNA Botucatu - SP 2019

2 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CAMPUS BOTUCATU ESTUDO DAS LESÕES GLOMERULARES ENCONTRADAS EM CÃES COM DOENÇA RENAL CRÔNICA PAULA BILBAU SANT ANNA Dissertação apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista para obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária. Orientadora: Profa. Ass. Dra. Priscylla Tatiana C. Guimarães Okamoto Botucatu - SP 2019

3 ii Nome do autor: PAULA BILBAU SANT ANNA Título: Estudo das lesões glomerulares encontradas em cães com doença renal crônica COMISSÃO EXAMINADORA Profª. Ass. Drª. Priscylla Tatiana C. Guimarães Okamoto Presidente e Orientadora Departamento de Clínica Veterinária FMVZ UNESP Botucatu Prof. Dr. Leandro Zuccolotto Crivellenti Membro Universidade de Franca UNIFRAN - Franca Prof. Ass.Dr. Alessandre Hataka Membro Departamento de Clínica Veterinária FMVZ UNESP Botucatu Data da defesa: 25 de Abril de 2019

4 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSANGELA APARECIDA LOBO-CRB 8/7500 Sant'Anna, Paula Bilbau. Estudo das lesões glomerulares encontradas em cães com doença renal crônica / Paula Bilbau Sant'Anna. - Botucatu, 2019 Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Orientador: Priscylla Tatiana Chalfun Guimarães Okamoto Coorientador: Antonio Carlos Paes Capes: Insuficiência renal crônica. 2. Proteinúria. 3. Histopatologia veterinária. 4. Cães - Doenças. Palavras-chave: DRC; canino; glomerulopatia; histopatologia; proteinúria.

5 iii Dedico À minha mãe, minha tia e ao Fabricio, que me apoiam e incentivam na realização de todos meus sonhos.

6 iv AGRADECIMENTOS À minha mãe Alba Aurora Lopes Bilbau e à minha Tia Dalva Lopes Bilbau Picasso Prado que me incentivam e não medem esforços para que eu consiga realizar meus sonhos, e vivem junto comigo as alegrias, desafios e estresses sendo peças fundamentais para meu crescimento e minha vida. À minha avó Isabel Trujillano in memorian pelo amor incondicional. Ao meu namorado Fabricio da Silva Trindade pelos anos de amor e convívio, ajuda, incentivo e de fundamental contribuição para realização deste trabalho. À minha orientadora Priscylla Tatiana Chalfun Guimarães Okamoto pela oportunidade, paciência, convivência e contribuição para meu crescimento profissional. Ao colaborador Professor Dr. Alessandre Hataka pela paciência, ensinamentos, conselhos e parte fundamental deste projeto. Aos amigos Silvano e Maria Gabriela pela ajuda com a coleta de material e juntamente com Bárbara, Jéssica, Heloise, Gisele, Bruna e Ivaldo deixaram este período da minha vida mais alegre. Aos residentes dos setores de clínica médica e patologia animal pela oportunidade de podermos trabalhar juntos nos casos e contribuição com a coleta de material. Aos pacientes e seus proprietários, que tornaram esse experimento possível. À todos animais de estimação que tive ao longo da vida, em especial à Kelly e à Nix, que foram fundamentais para que eu escolhesse a medicina veterinária como profissão e seguir com a vontade de tornar a vida de cada paciente melhor.

7 v LISTA DE TABELAS TABELA 1 Escores de parâmetros avaliados nos glomérulos por microscopia de luz...44 TABELA 2 Escores de parâmetros clínicos e laboratoriais avaliados em 24 cães com DRC de acordo com a lesão glomerular predominante...45 TABELA 3 Escores de parâmetros clínicos e laboratoriais dos grupos lesão membranosa e outros que engloba amiloidose, atrofia glomerular, glomeruloesclerose e memmembranoproliferativa...46

8 vi LISTA DE FIGURAS FIGURAS Amiloidose glomerular, cão, aumento 400X.30 FIGURA 1 - O material que expande o mesângio é eosinofílico. Coloração por hematoxilina e eosina (HE).30 FIGURA 2 - O mesmo material aparece no tom rosa claro Coloração por ácido periódico de Schiff (PAS) FIGURA 3 - T O material aparece no tom azulado Coloração por tricrômico de Masson..30 FIGURA 4 - O material é congofílico. Coloração por vermelho Congo...30 FIGURA 5 - O material apresenta birrefringência verde. Coloração por vermelho Congo visto com luz polarizada 30 FIGURAS Atrofia glomerular, cão. Aumento de 200X. O espaço capsular encontra-se aumentado com presença de material amorfo em seu interior onde o tufo glomerular encontra-se atrofiado 30 FIGURA 6 - Coloração por hematoxilina e eosina (HE)..30 FIGURA 7 - Coloração por ácido periódico de Schiff (PAS) 30 FIGURA 8 - Coloração por tricrômico de Masson..30

9 vii FIGURAS Glomeruloesclerose, cão. Aumento de 400X. O tufo glomerular encontra-se de tamanho reduzido, hipocelular.30 FIGURA 9 - O tufo glomerular apresenta coloração eosinofílica. Coloração por hematoxilina e eosina (HE).30 FIGURA 10 - Coloração por ácido periódico de Schiff (PAS)...30 FIGURA 11 - Nota-se acentuado grau de fibrose pela tonalidade azulada. Coloração por tricrômico de Masson 30 FIGURAS Glomerulonefrite membranosa, cão. Aumento de 400X.32 FIGURA 12 - Coloração por hematoxilina e eosina (HE)..32 FIGURA 13 - Coloração por ácido periódico de Schiff (PAS).. 32 FIGURA 14 - Coloração por tricrômico de Masson 32 FIGURAS Glomerulonefrite membranoproliferativa, cão. Aumento de 400X. Há hipercelularidade mesangial e endocapilar. Os capilares apresentam compressão luminal devido a expansão mesangial, espessamento da membrana basal glomerular...32 FIGURA 15 - Coloração por hematoxilina e eosina (HE)..32 FIGURA 16 - Coloração por ácido periódico de Schiff (PAS)...32 FIGURA 17 - Coloração por tricrômico de Masson..32

10 viii LISTA DE ANEXOS ANEXO 1 Ficha de avaliação histopatológica renal...67

11 ix ABREVIAÇÕES DRC: Doença renal crônica HE: Hematoxilina e eosina IgA: imunoglobulina A IgG: Imunoglobulina G IgM: Imunoglobulina M NAG: N-acetil-β-D-glicosaminidas NGAL: Lipocalina associada à gelatinase neutrofílica nm: Nanômetros PAS: Ácido periódico de Schiff RPC: Razão proteína creatinina urinárias SDMA: Dimetilarginina simétrica SRA: Sistema renina-angiotensina

12 SUMÁRIO Página RESUMO:... 1 ABSTRACT... 2 CAPÍTULO I REVISÃO DE LITERATURA Introdução Revisão de literatura Doença renal crônica Fisiopatologia da alteração glomerular Pressão arterial Proteinúria Exame histopatológico Sinais clínicos e achados laboratoriais CAPÍTULO II - OBJETIVOS Objetivo Objetivo geral Objetivos específicos CAPÍTULO III - ARTIGOS CIENTÍFICOS CAPÍTULO IV - DISCUSSÃO GERAL CAPÍTULO V - CONCLUSÕES FINAIS CAPÍTULO VI - REFERÊNCIAS ANEXOS... 66

13 1 SANT ANNA, P. B. Estudo das lesões glomerulares encontradas em cães com doença renal crônica. Botucatu, p. Dissertação (Mestrado) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista (UNESP). RESUMO: A doença renal crônica (DRC) em cães apresenta grande morbidade e alta taxa de mortalidade, sendo considerada a alteração renal mais comum, tendo a nefropatia glomerular como a alteração de maior prevalência. Este estudo tem por objetivo avaliar a prevalência das alterações glomerulares em conjunto com avaliação da razão proteína creatinina urinárias (RPC), dos níveis séricos de albumina e creatinina e pressão arterial sistólica comparando os parâmetros clínicos e laboratoriais entre o grupo de animais com a lesão predominante e o grupo abrangendo os demais tipos de lesões glomerulares que foram encontrados. Foram utilizados 24 cães com doença renal crônica que morreram. As lesões glomerulares foram classificadas segundo Cianciolo et al. (2013) por meio da análise histopatológica de tecidos renais corados pelas técnicas histoquímicas de hematoxilina e eosina, tricrômico de Masson, ácido periódico de Schiff e vermelho Congo. Foram inclusos animais com exames de urina com sedimento inativo, RPC, creatinina e albumina sérica. Para análise estatística foram utilizados os últimos valores obtidos antes do óbito, não excedendo o limite de quatro semanas. Não foi observado diferenças entre RPC, albumina e creatinina séricas e pressão arterial sistólica entre os animais com alteração membranosa e o grupo contendo os demais tipos de lesão glomerular encontrados em cães com DRC. Na DRC, independentemente do tipo de lesão glomerular, os parâmetros clínicos e laboratoriais avaliados neste estudo foram semelhantes. A lesão glomerular predominante em cães com DRC, foi a do tipo membranosa, seguida de glomeruloesclerose, membranoproliferativa, atrofia glomerulocística e amiloidose. Palavras-chave: DRC, glomerulopatia, proteinúria, histopatologia, canino

14 2 SANT ANNA, P. B. Study of glomerular injuries observed in dogs with chronic kidney disease. Botucatu, p. Thesis dissertation (Master degree) School of Veterinary Medicine and Animal Science, Botucatu Campus, São Paulo State University (Unesp). ABSTRACT: Chronic Kidney Disease (CKD) is one of the most common kidney afflictions and presents high morbidity and high mortality rates in dogs, having glomerular nephropathy as its most prevalent alteration. This study aims at assessing glomerular alterations together with the evaluation of the urine protein-to-creatinine ratio (UPC), the serum levels of albumin and creatinine and the systolic arterial blood pressure, comparing the clinical and laboratory parameters between the group of animals with the predominant injury and the group containing the other glomerular alterations observed in dogs that eventually passed away. The glomerular injuries were classified according to Cianciolo et al. (2013) through the histopathological assay of renal tissue stained with Hematoxylin & Eosin, Masson s Trichrome, Periodic Acid Schiff and Congo Red). The animals were included in the study after undergoing examinations to determine the inactive urine sediment, the UPC and the serum levels of creatinine and albumin. The statistical analysis employed the last values obtained before the death of the animal, up to four weeks. No differences were observed for UPC, serum albumin, serum creatinine and systolic arterial blood pressure between the animals with membrane alterations and the group containing the other types of glomerular injuries observed in dogs with CKD. In cases of CKD, the clinical and laboratory parameters assessed in the study remained similar regardless of the type of glomerular injury, the most prevalent of which were membranous injuries, followed by glomerulosclerosis, membranoproliferative injuries, glomerulocystic atrophy and amyloidosis. Keywords: CKD, glomerulopathy, proteinuria, histopathology, canines

15 CAPÍTULO I REVISÃO DE LITERATURA

16 4 1. Introdução Alterações glomerulares em cães tem sido assunto de crescente importância na clínica de pequenos animais, no que diz respeito à forma de diagnóstico precoce e tratamento da doença renal, em especial a doença renal proteinúrica em cães (POLZIN; COWGILL, 2013). Tais lesões podem levar à perda de função, proteinúria e potencialmente à falência renal. Danos irreversíveis e progressivos ao glomérulo levam à perda de função do néfron (GRANT; FORRESTER, 2001; GRAUER, 2005), levando a diminuição da filtração glomerular resultando em azotemia (GRAUER, 2005). Doenças infecciosas como a borreliose na América do Norte e a Leishmaniose na região mediterrânea do continente europeu possivelmente estão associadas com as glomerulopatias, aumentando a percepção sobre a importância das alterações glomerulares e da proteinúria atuando como sentinelas nos casos de doenças infecciosas (POLZIN; COWGILL, 2013). No Brasil há associação de alterações glomerulares em cães com erliquiose (SILVA et al., 2015) e babesiose (CAVALCANTE et al., 2006). O Brasil é considerado endêmico em erliquiose monocítica canina (SANTOS et al., 2009) e leishmaniose visceral canina, sendo o país com mais relatos nas Américas (MAIA-ELKHOURY et al., 2008) a pesquisa de alterações associadas a estas doenças, como as glomerulopatias, pode representar uma população importante não apenas para a região pesquisada como para áreas outras áreas endêmicas em outros países. A glomerulopatia é considerada uma causa comum e importante de doença renal crônica (DRC) (GRAUER, 2005; VADEN, 2011). A prevalência de DRC em cães é estimada por volta de 1,5%. Destes, 50% apresentam alterações glomerulares como causador da DRC (POLZIN; COWGILL, 2013). Em estudo, MacDougall et al. (1986), notaram que 52% dos cães com DRC apresentaram alterações glomerulares. Apesar da real prevalência ser desconhecida, notou-se de 43% a 90% de incidência de lesões glomerulares em cães selecionados aleatoriamente (MACDOUGALL et al., 1986; MULLER- PEDDINGHAUS & TRAUTWEIN, 1977).

17 5 Lesões glomerulares tem papel importante na mortalidade de cães, podendo resultar em diferentes síndromes incluindo a doença renal crônica, injúria renal aguda, síndrome nefrótica ou proteinúria isolada (POLZIN; COWGILL, 2013). A nefropatia mais comumente encontrada nos cães é a glomerulonefrite (ARESU et al., 2008), principalmente por deposição de imunocomplexos e a amiloidose (GRAUER; DIBARTOLA, 2004). Em sua maioria as lesões glomerulares são consequências de diversos mecanismos patológicos que ocorrem secundariamente aos imunocomplexos formados no glomérulo ou lá depositados (GRANT; FORRESTER, 2001). Tais complexos podem ser identificados, por imunofluorescência, em locais como mesângio e membrana basal glomerular como depósitos granulares contendo imunoglobulinas e complemento (ARESU et al., 2008). Sua localização intraglomerular parece ser importante no processo de injúria ao glomérulo (GRAUER, 2005). Nos capilares glomerulares, a resposta inflamatória local, mediada por citocinas pró-inflamatórias (interleucinas 1β, 6 e 12), substâncias vasoativas (angiotensina II, tromboxano e endotelina 1), fatores de crescimento, proteínas da matriz extracelular e proteases, pode contribuir com o dano glomerular (GRAUER, 2005; JOHNSON, 1997), causando alterações morfológicas no glomérulo como proliferação de células e matriz mesangial e espessamento da membrana basal glomerular, podendo também progredir para glomeruloesclerose (GRANT; FORRESTER, 2001; GRAUER, 2005). Além disso, ocorre também a ativação do sistema complemento, agregação plaquetária, infiltrado leucocitário de polimorfonucleares, ativação do sistema de coagulação e deposição de fibrina, processos estes que também contribuem para o dano ao glomérulo (GRAUER et al., 1988).

18 6 2. Revisão de literatura 2.1. Doença renal crônica A doença renal crônica ocorre com maior frequência em animais mais velhos, porém pode acometer animais de qualquer idade. Tem por definição a presença de danos funcionais e/ou estruturais irreversíveis em um ou ambos os rins por ao menos três meses (BARTGES, 2012a). A cronicidade é baseada em achados laboratoriais, histórico, como por exemplo, poliúria e polidipsia, exame físico onde pode ser constatada perda de peso e massa muscular ou tamanho renal reduzido, ou ainda alterações em exames de imagem como rins pequenos e histopatológico com áreas de infarto renal ou fibrose (POLZIN, 2013; HOKAMP et al., 2016). Não necessariamente o comprometimento estrutural representa o grau de comprometimento funcional (BARTGES, 2012a). Segundo a International Renal Interest Society a DRC deve ser estagiada com base nos valores de creatinina sérica e mais recentemente também de dimetilarginina simétrica (SDMA) e subclassificada ainda com relação à magnitude da proteinúria por meio da razão proteína creatinina urinárias e na pressão arterial sistólica. (INTERNATIONAL RENAL INTEREST SOCIETY, 2017; POLZIN, 2013). Com a progressão das lesões renais, apesar da hipertrofia dos néfrons remanescentes visando manter a função renal normal, as capacidades excretoras e de concentração urinária acabam não sendo suficientes devido à redução da filtração glomerular, aumentando as concentrações plasmáticas de substâncias que deveriam ser eliminadas pela urina (POLZIN; OSBORNE, 1995). Neste momento, embora nem todos pacientes apresentem é comum encontrar uma gama de sinais clínicos como perda de peso e massa muscular, poliúria e polidipsia, hiporexia ou anorexia, vômitos, halitose, úlceras em cavidade oral e gastroenterite. Podem apresentar ainda azotemia com densidade urinária abaixo de 1,030, acidose metabólica, hiperfosfatemia,

19 7 anemia arregenerativa, hipocalemia (mais comum em gatos), hipoalbuminemia, dislipidemia, infecção bacteriana do trato urinário, hipertensão e proteinúria (BARTGES, 2012a) Fisiopatologia da alteração glomerular Em cães, a glomerulonefrite pode ser idiopática ou secundária a agentes infecciosos, neoplasia, doenças inflamatórias, doenças endócrinas e nefropatias familiais. A forma autoimune, onde anticorpos são dirigidos contra a membrana basal glomerular, não foi identificada nesta espécie, sendo assim, as causas secundárias inflamatórias ou infecciosas são as mais comumente associadas à deposição glomerular de imunocomplexos (GRANT; FORRESTER, 2001; GRAUER, 2005). Diversas alterações patológicas podem ocorrer nos glomérulos devido a lesões em outras partes do néfron, como doenças tubulointersticiais ou perda generalizada de néfrons, levando a alterações glomerulares secundárias independentemente do local inicial da lesão; isto ocorre na maior parte das doenças renais (BROWN et al., 2013). Das causas secundárias em cães podemos citar causas infecciosas, tais como dirofilariose, leishmaniose, doença de Lyme, endocardite bacteriana, piometra, erliquiose, piodermite crônica, infecção por adenovírus canino; neoplásicas, como leucemia linfocítica, carcinoma de células de transição, linfoma e adenocarcinoma broncogênico; doenças hereditárias em Doberman Pinscher, Boiadeiro Bernês, Beagle, Soft-coated Wheaten Terrier, Samoieda, Poodle Standard, Golden Retriever e Cocker Spaniel (GRANT; FORRESTER, 2001). Ainda dentre as causas secundárias podem ser incluídas causas inflamatórias, por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico, poliartrite, anemia hemolítica imuno-mediada, prostatite, pancreatite crônica; drogas, corticoesteróides experimentalmente e sulfadiazina (GRANT; FORRESTER, 2001). Cadelas com carcinoma mamário, assim como humanos, evoluem com proteinúria subclínica e lesões glomerulares (CRIVELLENTI et al., 2016). Em muitos casos não é possível precisar a causa da doença glomerular, bem como a origem do antígeno, e então esse tipo de lesão é denominada idiopática (COOK; COWGILL, 1996; GRAUER, 2005).

20 8 A glomerulonefrite pode ocorrer tanto em gatos como em cães, porém com maior frequência nos cães, acima de sete anos; nas raças afetadas por glomerulonefrite de origem familial, o início pode se dar em animais mais jovens (GRANT; FORRESTER, 2001). Também pode ser observada glomerulonefrite em casos que antigamente eram descritos como nefrite intersticial crônica (MACDOUGALL et al., 1986). As lesões às paredes dos capilares glomerulares alteram sua permeabilidade levando a perda de proteínas plasmáticas, permitindo que proteínas sejam perdidas na urina, especialmente albumina, resultando em proteinúria persistente (GRANT; FORRESTER, 2001; GRAUER, 2005) que associada a um sedimento urinário inativo, é a principal característica da glomerulonefrite (GRAUER, 2005). É comum o encontro de proteinúria de origem renal em cães com doença renal. A proteína pode ser perdida por meio de alterações glomerulares ou tubulares. Possivelmente sua importância no desenvolvimento da doença renal crônica seja subestimada, pois os cães acometidos são tardiamente identificados. A proteinúria em cães pode ser usada como marcador de glomerulonefrite (GRAUER, 2005). Uma pequena quantidade de proteínas pode estar presente na urina de cães normais (GRANT; FORRESTER, 2001). Valores até 0,2, segundo a International Renal Interest Society (IRIS) (2017), são considerados como animais normais ou não proteinúricos. A maior parte das doenças glomerulares em cães podem ser associadas a presença de imunocomplexos na parede dos capilares glomerulares, os quais podem ser depositados ou presos no glomérulo quando há excesso de antígeno ou quando a quantidade de antígeno e anticorpo no plasma é semelhante. Os imunocomplexos que se formam quando há grande quantidade de anticorpo são rapidamente removidos da circulação pelas células fagocíticas. Por outro lado, os imunocomplexos formados quando há um grande número de antígeno não se ligam rapidamente ao sistema complemento (GRAUER, 2005; GRAUER et al., 1988).

21 9 O imunocomplexo também pode ser formado in situ quando anticorpos circulantes reagem com antígenos glomerulares endógenos ou antígenos não glomerulares que se encontram depositados no capilar glomerular, devido às interações das cargas elétricas ou afinidade bioquímica (GRAUER, 2005; GRAUER et al., 1988). Quando a quantidade de anticorpos acompanha o excesso de antígenos no plasma, há tendência de formar imunocomplexos grandes, insolúveis e que podem ser removidos da circulação rapidamente por células fagocíticas, podendo ser depositados ou retidos no glomérulo (GRAUER, 2005). Formados os imunocomplexos, ocorre uma sequência de respostas, tais como ativação do sistema complemento, quimiotaxia de neutrófilos e macrófagos, agregação plaquetária, ativação da cascata de coagulação e polimerização de fibrina. Em resposta as imunoglobulinas, neutrófilos, macrófagos e células mesangiais produzem substâncias oxidantes e proteinases (GRAUER, 2005). Como resposta à injúria, há proliferação celular e espessamento na membrana basal no glomérulo atingido. Caso a agressão perdure, ocorre hialinização e esclerose glomerular (GRAUER, 2005). As proteínas plasmáticas que ultrapassaram o capilar glomerular acumulam-se no tufo glomerular, desta forma estimulando a proliferação de células e matriz mesangiais (JERUMS et al., 1997). Assim sendo, é frequente o encontro de depósitos de imunocomplexos nos glomérulos de cães, embora a maioria não apresente sinais evidentes de nefrite (ROUSE; LEWIS, 1975). Glomerulonefrite imunomediada crônica pode resultar em glomeruloesclerose (CIANCIOLO et al., 2016). Os néfrons remanescentes e ainda viáveis promovem a compensação em relação aos que foram perdidos, promovendo o aumento da taxa de filtração glomerular (GRAUER; DIBARTOLA, 2004). A resposta imunológica desempenha a função de proteção do organismo contra antígenos, porém consequentemente pode resultar em lesões teciduais. Quatro mecanismos são propostos na explicação da fisiopatologia da destruição de tecidos por ação imunológica; uma delas é a resposta do tipo III, onde os complexos formados por antígeno e anticorpo, associados ao

22 10 sistema complemento, provocam uma resposta inflamatória. Isto pode ocorrer na parede de vasos em qualquer órgão e é observada com frequência nos capilares glomerulares. Esta forma de glomerulonefrite, causada por imunocomplexos, é uma das causas mais comuns de lesão renal em humanos (ROUSE; LEWIS, 1975). É mais comum o remodelamento de membrana basal em resposta à presença de imunocomplexos (CIANCIOLO et al., 2016). Outros tipos de doenças glomerulares incluem anormalidades estruturais como a alteração do colágeno tipo IV em cães da raça Samoieda, hemodinâmica como hipertensão glomerular e deposição de amiloide glomerular nos casos de amiloidose (GRAUER, 2005). Secundariamente a injúria endotelial ou à interação antígeno-anticorpo, ocorre a ativação e agregação plaquetária. A colaboração da ação plaquetária para o dano ao glomérulo decorre da liberação de substâncias vasoativas e inflamatórias resultando na formação de tromboxanos e leucotrienos, além de facilitar a cascata de coagulação. Liberam também fatores de crescimento favorecendo a proliferação de células endoteliais vasculares (GRAUER, 2005). Quanto maior for o número de néfrons envolvidos, menor será a taxa de filtração glomerular. Nos glomérulos remanescentes ocorre um aumento individual na taxa de filtração visando compensar os que já foram perdidos. Nestes podem ocorrer hialinização e esclerose quando associados a hiperfiltração, hipertensão sistêmica e excesso de proteína (BRENNER et al., 1982). Isto não foi documentado no caso de cães com glomerulonefrite de ocorrência natural, porém hiperfiltração e proteinúria podem contribuir para uma perda progressiva de nefrons, independentemente da alteração imunomediada (GRAUER, 2005). A redução da massa renal causa hipertrofia compensatória à medida que aumenta a taxa de filtração glomerular nos néfrons remanescentes visando manter a homeostase, gerando uma mescla de glomérulos e túbulos hipertrofiados, assim como néfrons atróficos e afuncionais na DRC. Estes mecanismos de hipertrofia e hiperfunção levam a alterações adaptativas resultando em lesões secundárias (JENNETTE; SCHWARTS, 2007).

23 11 Alterações glomerulares podem afetar secundariamente outras partes do néfron, tendo em vista a arteríola eferente do glomérulo prover fluxo sanguíneo aos túbulos, aumentando a possibilidade das alterações tubulares e intersticiais. Geralmente em humanos a lesão glomerular é primária quando se encontra associada a alterações tubulares intersticiais e em vasos sanguíneos (JENNETTE; SCHWARTS, 2007). As células do túbulo proximal atuam na reabsorção das proteínas filtradas normalmente pelo glomérulo através do processo de endocitose. Nos animais com proteinúria, no túbulo proximal a atividade lisossomal encontra-se exacerbada, podendo romper-se gerando danos enzimáticos ao citoplasma (OLBRICHT et al., 1986). Sendo assim, as lesões glomerulares são importantes causas de doença renal crônica (GRAUER, 2005; VADEN, 2011), tendo aproximadamente 50% dos casos de DRC associadas a causas de origem glomerular (POLZIN; COWGILL, 2013). A elevada concentração de proteínas na urina é considerada fator de progressão em cães com DRC, e também fator de pior prognóstico (BARTGES, 2012a; POLZIN, 2013) Pressão arterial Por volta de 65 a 75% dos animais com DRC apresentam hipertensão arterial sistêmica e diversos fatores contribuem para sua ocorrência, tais como a ativação do sistema renina-angiotensina-aldosterona, aumento da vasopressina e aumento do tônus simpático (BARTGES, 2012). A pressão arterial sistêmica é determinada de forma indireta por meio de método Doppler ou oscilométrico (BROWN et al., 2007) e é indicado aferir em todos os pacientes diagnosticados com DRC, (BARTGES, 2012; INTERNATIONAL RENAL INTEREST SOCIETY, 2017) pelo fato do rim ser um órgão alvo para ocorrência de danos hipertensivos. Quando persistentemente elevada pode gerar aumento da proteinúria, declínio da função renal, aumento na frequência de crises urêmicas e aumento da mortalidade (VADEN; ELLIOTT, 2016).

24 Proteinúria A mensuração da proteinúria tem sido utilizada para cães nos últimos anos como marcador diagnóstico de doença renal crônica ou lesão renal progressiva (CORTADELLAS et al., 2014). A razão proteína creatinina urinárias (RPC) é uma forma de mensurar a persistência da proteinúria de origem renal, podendo ser um indicador da presença da DRC e um fator prognóstico ruim. Quando pouco elevado, não é possível diferenciar quanto à origem glomerular ou tubular (HOKAMP et al., 2016). O principal sinal da doença glomerular é a proteinúria (GRAUER, 2005; VADEN, 2011). Contudo é necessário excluir fatores extrarrenais fisiológicos e enfermidades através da anamnese, exame físico e análise do sedimento urinário (GRAUER; DIBARTOLA, 2004). Para a avaliação da proteinúria a urina deve ser coletada via cistocentese, visando exclusão de causas pós renais extraurinárias, avaliar a proteína sérica visando excluir causas pré-renais e posteriormente sedimento urinário buscando inflamação ou hemorragia (LEES et al., 2005). Apesar disso, não há diferença significativa entre a coleta de urina por cistocentese e por micção espontânea, sendo esta uma alternativa (BEATRICE et al., 2010). A proteinúria pode ser classificada quanto sua origem em pré renal onde proteínas normais que não estão livremente presentes no plasma, tais como hemoglobina e mioglobina, ou proteínas anormais por exemplo imunoglobulinas de cadeia leve, dentre elas a proteína de Bence-Jones, atravessam a parede do capilar glomerular com permeabilidade seletiva preservada; Além da origem renal, ainda dividida em funcional que ocorre devido a acontecimentos transitórios como exercício intenso e febre, ocorre uma resposta alterando a fisiologia renal, porém não há lesão presente; cessa quando a causa subjascente é sanada sendo geralmente leve e transitória; e patológica quando há lesões estruturais ou funcionais renais, a qual é subdividida em glomerular, quando há alteração na permeabilidade seletiva, sendo de qualquer magnitude porém persistente; tubular, onde as lesões comprometem a recuperação das proteínas pelos túbulos, sendo geralmente

25 13 de baixo e médio peso molecular, geralmente leve porém persistente; e intersticial, por alterações inflamatórias ou afecção local, como por exemplo nefrite intersticial aguda, ocorre exsudação de proteínas dos capilares peritubulares para o espaço urinário. Por último pode ser classificada como pós renal quando ocorre a entrada de proteínas na urina a partir da pelve renal em diante. Sendo subclassificada em urinária quando por processos hemorrágicos ou exsudativos da parede da pelve renal, ureter, bexiga e uretra, incluindo a uretra prostática nos casos de machos e extraurinária quando proteínas acabam entrando em contato com a urina via secreções, processos hemorrágicos ou exsudativos que estejam afetando o sistema genital (LEES et al., 2005). A proteinúria pode ser identificada por método semiquantitativo (fita reagente) ou quantitativo (razão proteína creatinina urinárias - RPC). Deve ser determinada sua origem, persistência e magnitude (CIANCIOLO et al., 2016). Sua persistência deve ser confirmada ao longo de duas ou mais semanas, repetindo a análise da RPC por pelo menos duas a três vezes neste período (POLZIN, 2013). Deve ser realizada uma média dos valores obtidos e esta deve ser utilizada para classificar os pacientes em proteinúrico, quando o resultado for maior a 0,5, limítrofe, quando o valor encontrado estiver entre 0,2 e 0,5 e não proteinúrico, quando os valores se encontram abaixo de 0,2 (INTERNATIONAL RENAL INTEREST SOCIETY, 2015). Valores de RPC a partir de 2,0 são regularmente encontrados em cães com doença glomerular, já valores inferiores a este podem estar presentes tanto em alterações glomerulares, como também tubulares (VADEN; ELLIOTT, 2016). Valores persistentemente superiores a 0,5 associados ao sedimento urinário inativo são indicativos de proteinúria renal e doença renal crônica (CORTADELLAS et al., 2014). A magnitude da proteinúria geralmente é um reflexo da gravidade da doença (BROWN et al., 2013). O uso da razão proteína creatinina urinárias visando uma estimativa da proteinúria favoreceu o diagnóstico de glomerulonefrite na medicina veterinária (HOKAMP et al., 2016).

26 14 O uso de novos biomarcadores para lesões renais pesquisados atualmente, tais como N-acetyl-b-D-glucosaminidase (NAG), proteína ligada ao retinol e NGAL (Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin) traz informações como a identificação de dano glomerular ou tubular, auxílio na distinção de categorias de doenças e fornecem prognóstico. No entanto, a creatinina sérica e RPC ainda apresentam aplicabilidade igual ou superior aos novos biomarcadores (HOKAMP et al., 2016) Exame histopatológico Podemos distinguir a maioria das formas da doença glomerular por meio de achados histopatológicos (ARESU et al., 2008). Em cães, a biópsia renal é considerada a técnica mais indicada para avaliação de doenças glomerulares (CIANCIOLO et al., 2016), tornando-se necessária para distinguir doenças com apresentações clínicas semelhantes, além de fornecer informações com relação à atividade e cronicidade, prognóstico e auxiliar na escolha da terapia ideal, podendo levar a eliminação da causa e resolução da doença (JENNETTE; SCHWARTS, 2007). O diagnóstico de doença glomerular é feito por meio da associação de microscopia de luz, imunofluorescência e microscopia eletrônica (ARESU et al., 2008; CIANCIOLO et al., 2013; CIANCIOLO et al., 2016). Comumente há necessidade da realização de imuno-histologia e/ou microscopia eletrônica para diagnósticos patológicos mais específicos (JENNETTE; SCHWARTS, 2007). A deposição dos imunocomplexos pode ser identificada em glomérulo, túbulos e vasos sanguíneos, porém pouco se sabe sobre seu valor prognóstico. As lesões por imunocomplexos se desenvolvem anteriormente às lesões histológicas. A detecção de IgG pode ser útil no diagnóstico de glomerulonefrite imunomediada e IgM em glomeruloesclerose segmentar focal (ARESU et al., 2008). A identificação da lesão primária é difícil pela possibilidade de mais de um local do néfron ser afetado pelo processo primário, além da intervenção dos processos secundários, progredindo para formas crônicas inespecíficas (JENNETTE; SCHWARTS, 2007). Torna-se fundamental por finalidades clínicas, a diferenciação entre glomerulonefrite de causa idiopática ou

27 15 secundária, haja vista o tratamento desta ser dependente da eliminação da causa. Na glomerulonefrite idiopática, não é encontrada doença adjacente e apenas os rins apresentam componente patológico. Nos casos onde há doença concomitante com alteração glomerular atribuída a esta doença, é denominada glomerulonefrite secundária (JENNETTE; SCHWARTS, 2007). Com base nas alterações encontradas na histologia e alterações ultraestruturais podem ser classificadas como amiloidose, glomerulonefrite imuno-mediada e não imunomediada (CIANCIOLO et al., 2013). Cianciolo et al., (2016), encontraram glomeruloesclerose segmentar focal em 29%, amiloidose em 13%, glomerulonefrite membranoproliferativa em 26% e membranosa em 26% dos casos de biópsia renal. Os cães com glomerulonefrite membranoproliferativa tiveram alterações clínicas e laboratoriais mais graves correlacionadas à doença. Características histopatológicas semelhantes podem ser resultado de lesões distintas. A avaliação histológica deve ser realizada utilizando as seguintes colorações: hematoxilina e eosina (HE), tricrômico de Masson, ácido periódico de Schiff (PAS), Prata metenamina de Jones e vermelho Congo (CIANCIOLO et al., 2016; JENNETTE; SCHWARTS, 2007). Vinte e cinco por cento dos casos submetidos à biópsia necessitam de microscopia eletrônica para que se chegue ao diagnóstico final. As colorações especiais também são importantes na identificação de lesão epitelial tubular aguda e para estimar fibrose e atrofia tubular, sendo estas importantes em humanos devido à boa correlação entre a extensão das lesões com a probabilidade de progressão da doença para doença renal crônica (CIANCIOLO et al., 2016). O encontro de remodelamento uniforme e proeminente, como espículas, cavitações, contorno duplo e irregular, da membrana basal glomerular em grande parte dos glomérulos é sugestivo de glomerulonefrite imunomediada. Visualização de espessamento uniforme da membrana basal glomerular sem evidência das demais alterações anteriormente citadas, não é suficiente para afirmar que a origem da lesão é de caráter imunomediado, pois esta forma também pode ser observada em casos de glomerulonefrite não imunomediada. Em casos agudos de proteinúria não há tempo suficiente para ocorrência de

28 16 alterações estruturais mais pronunciadas na membrana basal do glomérulo, sendo importante prosseguir com a avaliação por microscopia eletrônica e imunofluorescência (WALKER, 2009). A microscopia de luz nos permite avaliar a extensão das lesões e grau de cicatrização do tecido renal, porém não há achados que nos permitam excluir definitivamente a origem imunomediada. Esta exclusão só é possível através do não encontro de imunocomplexos pela microscopia eletrônica, imunofluorescência ou ambos (WALKER, 2009). Porém a microscopia de luz pode levar a um diagnóstico presuntivo devido à presença de remodelamento uniforme e proeminente da membrana basal em grande parte dos glomérulos; hipercelularidade endocapilar também pode ser considerado um achado sugestivo, assim como o aumento difuso e generalizado de células nucleadas (WALKER, 2009). Por sua vez, amiloidose requer a presença de material refringente verde na coloração vermelho congo quando visualizado em luz polarizada para seu diagnóstico definitivo. Lesões sugestivas de amiloidose incluem expansão das zonas mesangiais podendo ou não haver espessamento das paredes dos capilares por material eosinofílico em HE, rosa pálido em PAS o e laranja pálido em tricrômico de Masson. Apenas a coloração em HE não é confiável para completar o diagnóstico, devido ao fato de haver uma sobreposição significativa entre material amiloide e colágeno esclerótico. Para diagnóstico definitivo deve ser feita a coloração de vermelho Congo. Embora não seja necessário para completar o diagnóstico, caso seja realizada a microscopia eletrônica, pode ser encontrado material fibrilar de 9-11 nm de diâmetro em mesângio e membrana basal. A gravidade depende do grau de oclusão dos capilares glomerulares. Além disso, também pode ser encontrado material amiloide depositado em interstício, por vezes até em porções medulares, e paredes arterial/arteriolar (WALKER, 2009). Glomerulonefrite não mediada por imunocomplexos abrange um grupo de lesões glomerulares onde amiloide e imunocomplexos não foram identificados, sendo um diagnóstico de exclusão. Podem ser citados como

29 17 exemplos glomeruloesclerose segmentar focal a generalizada, anormalidades de membrana basal sem esclerose associada, lipidose glomerular e nefropatias congênitas ou de desenvolvimento as quais acometem os glomérulos. Seu diagnóstico definitivo depende de avaliação por microscopia eletrônica em imunofluorescência. É preferível realizar coloração por imunofluorescência à imuno-histoquímica devido à maior sensibilidade (WALKER, 2009). 2.6.Sinais clínicos e achados laboratoriais Os animais com doença glomerular podem ser assintomáticos, ou ter sinais inespecíficos, como perda de peso e letargia. Proteinúria pode ser um achado acidental em exames de rotina. Podem ainda apresentar sinais consistentes com doença renal crônica (poliúria, polidipsia, anorexia, vômito, halitose) (VADEN, 2011). Estudos recentes sugerem que, assim como em humanos, proteinúria persistente pode ser correlacionada a maior morbidade e mortalidade de causa renal ou por outras causas.o risco de desenvolvimento de sinais clínicos é maior à medida que a proteinúria aumenta (LEES et al., 2005). A proteinúria persistente pode gerar como consequências fisiopatológicas diminuição da pressão oncótica, hipercolesterolemia, hipertensão sistêmica, hipercoagulabilidade, perda muscular e consequentemente de peso (GRAUER, 2005). A síndrome nefrótica é incomum e dentre seus sinais estão ascite, edema periférico, tromboembolismo e hipertensão (VADEN, 2011). Síndrome nefrótica é caracterizada como a presença concomitante de hipoalbuminemia, proteinúria, hipercolesterolemia e acúmulo de líquido extracelular. Cães com esta síndrome apresentam concentrações séricas elevadas de colesterol, maior razão proteína creatinina urinárias, elevada pressão arterial sistólica e menor concentração sérica de albumina. São mais propensos a azotemia e tem menor tempo de sobrevida (KLOSTERMAN et al., 2011).

30 CAPÍTULO II - OBJETIVOS

31 19 1. Objetivo 1.1. Objetivo geral O objetivo desse trabalho é analisar as alterações glomerulares em cães doentes renais crônicos que vieram a óbito no Hospital Veterinário da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia UNESP campus de Botucatu Objetivos específicos Determinar prevalência e classificação de danos glomerulares por meio da histologia renal em cães com DRC de ocorrência natural; Comparar os valores de RPC, albumina sérica, creatinina e pressão arterial sistólica dos animais com lesões glomerulares membranosas com os demais tipos de lesões glomerulares.

32 CAPÍTULO III - ARTIGOS CIENTÍFICOS

33 21 ARTIGO CIENTÍFICO Normas da Revista: Journal of Veterinary Pathology Title: Comparison of urinary protein-to-creatinine ration, serum albumin, serum creatinine and systolic arterial blood pressure of glomerular injury cases in dogs with chronic kidney disease. Authors: 1) Paula Bilbau Sant Anna 1 2) Fabricio da Silva Trindade 2 3) Silvano Salgueiro Geraldes 1 4) Maria G. Picelli de Azevedo 1 5) Alessandre Hataka 1 6) Antonio C. Paes 3 7) Alessandra Melchert 1 8) Priscylla T. Chalfun Guimarães-Okamoto 1 1 Department of Veterinary Clinics, School of Veterinary Medicine and Animal Science, São Paulo State University - UNESP, São Paulo, Brazil. 2 Pathologist, São Caetano do Sul, Brazil 3 Department of Veterinary Hygiene and Public Health, School of Veterinary Medicine and Animal Science, São Paulo State University - UNESP, São Paulo, Brazil.

34 22 *Corresponding author: Priscylla Tatiana Chalfun Guimarães-Okamoto, PhD a - Department of Veterinary Clinics, School of Veterinary Medicine and Animal Science, Rubião Júnior District, , Botucatu, São Paulo, Brazil. (P.T.C. Guimarães-Okamoto) Abstract This study aims at assessing the prevalence of glomerular alterations in dogs with chronic kidney disease (CKD) and comparing the clinical and laboratory parameters. The tests conducted include a double-blind histopathological assay conducted by two pathologists, urine tests including inactive sediment, urinary protein-to-creatinine (UPC), serum albumin and serum creatinine, as well as measurement of the systolic arterial blood pressure. The prevalence of glomerular injuries was determined and the predominant injury was compared with a group comprised of the remaining injuries. The study included 24 dogs with CKD. The results revealed a predominance of membranous glomerular alterations 17/24 (70,83%), followed by glomerulosclerosis 3/24 (12,50%), membranoproliferative injuries 2/24, glomerulocystic atrophy 1/24 and glomerular amyloidosis 1/24. Amyloidosis presented the highest UPC while the membranoproliferative injury presented the lowest mean concentration of serum albumin. Higher values in the UPC did not correspond with lower mean serum albumin values. Glomerulosclerosis presented the highest mean systolic blood pressure and glomerular atrophy presented the highest creatinine values. When comparing membranous injuries with a group comprised of the remaining injuries, the UPC did not present significant differences between the groups.

35 23 Renal amyloidosis was included in the group with the lowest systolic arterial blood pressure values while membranoproliferative injury was included in the group with highest UPC. The group called others presented the highest creatinine value. Dogs with CKD may present several types of glomerular injuries with similar clinical and laboratory profiles. This study observed a predominance of membranous glomerular injuries, followed by membranoproliferative injuries, glomerulocystic atrophy and amyloidosis. Keywords: glomerulopathy; amyloidosis; glomerulocystic; glomerulus; dogs Chronic Kidney Disease affects dogs in all age groups, but is more frequent in older animals, causing irreversible functional and structural damage in the kidneys 1. Chronicity is determined though laboratory findings, physical examinations, alterations in imaging examinations or an histopathological assay verifying glomerular disease 2,3. The disease is classified in four stages based on serum creatinine and symmetric dimethylarginine (SDMA) according to the International Renal Interest Society (IRIS) guidelines, and subclassified based in the values for urinary protein-to-creatinine ration and systolic arterial blood pressure 2,4. Proteinuria acts as a sentinel of sorts in cases of infectious diseases associated with glomerulopathies, such as Lyme disease in North America and Leishmaniosis in the Mediterranean 9 and in Brazil, to which it is endemic, with several reports in the Americas 10. Glomerular alterations have also been observed in Brazil in dogs with ehrlichiosis 11, as both canine monocytic ehrlichiosis 12 and babesiosis 13 are endemic to the country. Further research regarding alterations caused by these diseases, such as glomerulopathies, may

36 24 represent an important population not only for the area, but for other endemic areas around the world. Systemic arterial hypertension occurs in 65 to 75% of the animals affected by CKD 14. The kidneys are considered one of the target organs for hypertension damage and once the hypertension is verified, it may lead to increased proteinuria, decreased kidney function, increased uremic crises and increased mortality 15. For dogs, kidney biopsy is the most indicated technique to assess glomerular diseases 16 since most forms of glomerular diseases can be differentiated through histopathological findings 17, which aids in choosing the ideal therapy for each case and resolving the disease 18. This study aims at assessing glomerular alterations in dogs with naturally-occurring chronic kidney disease, determining the prevalence of glomerular injuries and classifying them, in addition to assessing and comparing UPC, serum albumin, serum creatinine and systolic arterial blood pressure in order to verify possible differences in these parameters between animals with the predominant type of injury (membranous) and the group comprised of the remaining glomerular injuries observed. Materials and methods Animals and Experimental Design This study was approved by the Ethics Commission on Animal Use - CEUA - FMVZ - UNESP, Botucatu SP, Brazil, under protocol no. 0022/2017. The study included 24 dogs without breed, sex or age predilection, all of which were diagnosed with Stage 1 to 4 chronic kidney disease according to the

37 25 IRIS staging definitions (2017) and all of which died between January 2012 and December 2018 at the Veterinary Hospital at FMVZ UNESP, Botucatu, Brazil. A necropsy was conducted and representative fragments were collected from the kidneys at the Service of Veterinary Pathology of the School of Veterinary Medicine and Animal Science -UNESP, Botucatu, Brazil. Exclusion criteria for the study were possibility of active infection in the urinary tract (based on urine sediment or urine culture findings), hematuria (macroscopic or microscopic exceeding 100 erythrocytes per 40x magnification field) and pyuria (over 10 leukocytes per 40x magnification field) detected on the examinations conducted on the last four weeks before death 3. Histopathological Analysis The kidney fragments were fixed in 10% formalin solution for a period not exceeding 48 hours and then submitted to the routine histopathological process with washing, dehydration, diaphanization, impregnation, creation of paraffin blocks and microtomy 16. Afterwards, semi-serialized histological cuts were made with 12 µm intervals between each cut measuring 3 µm and 8 µm in thickness. The cuts were positioned in histological slides (2 to 3 cuts per slide), placed in an oven at 60 ºC to remove the paraffin and then stained through the following histochemical techniques: Hematoxylin & Eosin (HE), Masson s Trichrome, Periodic Acid Schiff (PAS) and Congo Red 16,19,20. The injuries were analyzed through optical microscopy in a double-blind test by two pathologists, both unaware of the correspondence between the slides analyzed and the values of the clinical and laboratory examinations, who should have reached the same diagnosis. In case of discordance, the slides

38 26 were reviewed and the diagnosis reached by consensus. The injuries were classified as per CIANCIOLO et al. (2016) as: 0 = absent; and 1= present. The interstitial and vascular glomerular regions were observed for each sample, and the glomerular tufts at the periphery of the glomerulus were evaluated for their shape. The distribution of glomerular injuries was classified as focused or diffuse, and the degree of involvement of the glomerulus was classified as segmental or global. Hypercellularity was classified as mesangial, endocapillary or both. The presence of synechia and hyalinosis of the basement membrane of the glomerulus. The histochemical stains were used to aid in the classification and grading of the glomerular injuries and, whenever possible, in the determination of the kidney disease, with Masson s Trichrome being used to determine the presence of conjunctive tissue in the kidneys, PAS used to identify the thickening of the glomerular capsule in glomerular diseases and Congo Red used to detect amyloid in the injured kidneys. Clinical and Laboratory Analysis In addition to the histopathological analysis, the study also assessed laboratory parameters (urine examination, serum creatinine and albumin, urinary protein-to-creatinine ration) and clinical parameters (systolic arterial blood pressure) to establish possible correlations with the histopathological results.

39 27 Statistical Analysis The groups were analyzed statistically and compared with each other by comparing the medians through Student s t-test, employing the Wilcoxon Mann-Whitney non-parametric test for independent samples. The results were then organized into tables. Results A total of twelve females and twelve males were evaluated, with a mean age of 9.3 ± 4.0 years, with three animals whose ages were not informed by the owners. Among the animals assessed there were 14 mixed-breeds, three Labrador Retrievers, one Beagle, one Schnauzer, one Dogo Argentino, one Shar-Pei, one Pitt Bull, one Chow Chow and one Poodle. The histopathological evaluation through optical microscopy revealed membranous injury in 17/24 (70.83%) of the cases, glomerulosclerosis in 3/24 (12.5%), membranoproliferative injuries in 2/ 24, glomerulocystic atrophy in 1/24 and amyloidosis in 1/24. The pathologists agreed in 21 cases, while three cases had to be reviewed for a consensus to be reached. Concordance between the diagnoses was also measured through the Kappa coefficient. The Kappa for diagnosis concordance was 0.732, which represents a strong concordance. Proteinuria (RPC > 0.5) was observed in 24/24 (100%) of the cases. Mean proteinuria was 3.35 ± 4.0, showing a high likelihood of glomerular disease. The serum albumin of the dogs included in the study presented a mean value of 2.16 ± 0.44 g/dl.

40 28 Regarding the CKD staging, 2/24 of the dogs were diagnosed with Stage I, 100% of which presented membranous injuries; 4/24 (16.67%) with Stage III, 100% of which presented membranous injuries; and 18/24 (75%) with Stage IV, of which 1/18 animal presented amyloidosis, 1/18 presented glomerular atrophy, 2/18 (11.11%) presented membranoproliferative injuries, 3/18 (16.66%) presented glomerulosclerosis, and the remaining 11/18 (61.11%) presented membranous injuries. One of the animals with Stage I CKD died due to trauma and the other due to oncological procedure. The mean creatinine value for the dogs in the study was 7.36 ± 4.08 mg/dl. About 8/24 (33.33%) of the dogs presented hypertension with values exceeding 140 mmhg 21, while 5/24 (20.83%) of the dogs had no data regarding blood pressure and the remaining 11/24 (45.84%) presented systolic blood pressure values within the reference for the species. The mean blood pressure for the animals evaluated was 144 ± mmhg 4 (Table 2). One Shar-Pei dog was diagnosed with amyloidosis (Figures 1-5), with the microscopic evaluation revealing a marked mesangial expansion colored in light pink in PAS and areas varying from blue to red in Masson s Trichrome. The Congo Red stain confirmed the presence of amyloid material near the glomeruli, presenting refringence when analyzed under polarized light. No hypercellularity was observed, only small synechiae in a few glomeruli, as was described by Cianciolo, et al., The interstitial region presented fibrosis, inflammation and calcification. In this case, the glomerulus was globally affected, with proteinaceous material in the tubules and glomerular capsular space. In addition, the same animal

41 29 presented severe proteinuria, normal arterial blood pressure and serum albumin levels slightly below the reference values for the species. One case of glomerular atrophy was also observed (Figures 6-8), presenting mesangial and capsular thickening and global involvement of the glomerulus, with areas of synechia and proteinaceous material in the dilated glomerular capsular space and tubules. The interstitial region presented fibrosis, inflammation and presence of cysts. This case of glomerular atrophy presented the highest serum creatinine value observed in this study. The systolic arterial blood pressure remained within the reference for the species, while the animal presented UPC of 2.6 and discrete hypoalbuminemia. Glomerulosclerosis (Figures 9-12) was the predominant injury in three dogs, with notable findings including the lower mean value for UPC and the higher systolic arterial blood pressure. Optical microscopy did not observe hypercellularity, with two cases presenting a thickening of the glomerular capsule with associated collagen, and one case presenting mesangial thickening. The involvement was segmental in one case and global in the remaining two. In all three cases there was proteinaceous material in the tubules, while only one presented proteinaceous material in the glomerular capsular space. In the interstitial region, all three presented fibrosis and inflammation, two presented cysts and calcification, and one presented crystals in the tubular region.

42 30 The most prevalent injury observed in this study was membranous glomerulonephritis (Figures 13-15), with low or no endocapillary hypercellularity, discrete to moderate mesangial hypercellularity and remodeling of the glomerular basement membrane.

43 31 In a little over half of the cases, there were synechiae and collagen associated with the glomerular capsule and tufts. Around eighty percent of the cases presented proteinaceous material in the tubules and glomerular capsular space. The interstitial region presented marked fibrosis and inflammation, with approximately half of the cases presenting crystals in the tubule and calcification areas, while around a third of the cases presented cysts. The group with membranous injuries presented the second highest mean arterial blood pressure at ± 31.0 mmhg, probably due to five animals in the group presenting systemic arterial hypertension. The mean serum albumin level was lower than in the other groups and the UPC presented a mean of 2.52 ± 1.42, which is, similar to the cases of atrophy, slightly higher than the cases of glomerulosclerosis and lower than the cases of membranoproliferative injuries and amyloidosis. The serum creatinine value was the lowest of all groups. The last group was classified as membranoproliferative glomerulonephritis (Figures 16-18), which is characterized by endocapillary hypercellularity, either by endothelial cells, leukocytes or interspersed mesangial cells. It is often accompanied by mesangial hypercellularity, and a global and diffuse alteration may invade or obliterate the lumen of the capillaries, which is exactly what happened in two cases assessed by this study. This group presented the lowest mean serum albumin value, the second highest mean UPC, the second highest mean serum creatinine value and no cases of high blood pressure.

44 32 The Membranous group, which had the highest number of animals, was compared with the Other group, which was comprised of the remaining injuries observed in the study due to the high variability and small sample size. The clinical and laboratory findings for both groups are both found in Table 3. No significant differences were observed between the membranous glomerular injuries and the remaining injuries and UPC did diverge between the groups. Animals with renal amyloidosis were among those with the lowest systolic arterial blood pressure and animals with membranoproliferative injuries were among those with highest UPC (Table 3).

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