EUKIRA ENILDE MONZANI PADRONIZAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO DE FIBRA EM ALIMENTOS VOLUMOSOS

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1 Universidade Camilo Castelo Branco Pós-Graduação em Produção Animal, Campus Descalvado EUKIRA ENILDE MONZANI PADRONIZAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO DE FIBRA EM ALIMENTOS VOLUMOSOS PADRONIZATION OF ANALYTICAL METHOD OF ROUGHAGES DESCALVADO, SP 2013

2 ii Eukira Enilde Monzani PADRONIZAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO DE FIBRA EM ALIMENTOS VOLUMOSOS Orientadora: Profa. Dra. Liandra Maria Abaker Bertipaglia Co- Orientador: Prof. Dr. Gabriel Mauricio Peruca de Melo Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Produção Animal da Universidade Camilo Castelo Branco, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Produção Animal. Descalvado, SP 2013

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5 v Dedico Dedico o presente trabalho aos meus pais, Izoldino Laurindo Monzani (no coração) e Maria Aparecida Guellero Monzani que foram a principal razão de todo meu esforço. Às minhas irmãs, sobrinhas e ao meu namorado pela compreensão, apoio e paciência. E a minha pequena Andora por sempre estar presente em minha vida.

6 vi AGRADECIMENTOS A Deus por tornar tudo possível, e me auxiliar a sempre ter força e garra para seguir em frente. A meus pais, Izoldino e Maria por serem meu alicerce acreditando sempre em minha capacidade, me apoiando e incentivando a alcançar meus objetivos. Por tudo que me proporcionaram; tudo que sou devo a eles. A Profª Drª Liandra Maria Abaker Bertipaglia, pela orientação na elaboração e condução deste experimento e, principalmente, pela confiança e todo o auxílio dedicado. Ao Profº Dr Gabriel Mauricio Peruca de Melo, meu co-orientador, pela fundamental colaboração neste trabalho, pelo apoio, confiança e dedicação profissional. Ao Profº Dr Vando Edésio Soares, pela imensa colaboração e apoio para a conclusão deste trabalho. As minhas irmãs Eloelene, Evanilda, Edilene e Emilene; e minhas sobrinhas Laís e Letícia por toda a paciência e compreensão em todos os momentos. Ao meu namorado Marco Antonio Mota Junior pelo apoio nos momentos difíceis, pelo carinho, respeito e paciência e por tornar minha vida cada dia mais feliz. A minha pequena Andora pelas ausências, falta de tempo, e compreensão. A todos aqueles que direta ou indiretamente estiveram presentes me auxiliando em mais uma conquista em minha vida.

7 vii PADRONIZAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO DE FIBRA EM ALIMENTOS VOLUMOSOS RESUMO O experimento foi realizado no laboratório de Biogeoquímica e Nutrição Animal, da UNICASTELO, campus Descalvado a fim de avaliar a eficiência do micro método de análise de fibra em detergente neutro (FDN), fibra em detergente ácido (FDA) e lignina, utilizando saquinhos de tecido TNT, em duas espessuras de trama e, comparando-o com o método de determinação de fibra de Van Soest (1963b). Utilizou-se 4 amostras de volumosos (silagem de milho, alfafa, bagaço de cana, feno tifton). O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado, com quatro tratamentos, a saber: método convencional de refluxo (Van Soest), método sequencial com autoclave utilizando cadinhos filtrantes, método sequencial com autoclave utilizando saquinhos de TNT de trama fina, método sequencial com autoclave utilizando saquinhos de TNT de trama grossa; três repetições por tratamento. Os dados foram analisados em esquema de análise de parcelas subdivididas (três vezes no tempo). Diante dos resultados obtidos, observou-se que em cada alimento usado na avaliação dos métodos, houve resultados distintos para cada um dos parâmetros (FDN, FDA, lignina, hemicelulose, celulose). Na silagem de milho, para a FDN, o método de refluxo mostrou resultados significativamente inferiores aos demais métodos; da mesma forma para FDA, hemicelulose e celulose. Para alfafa, os resultados nos três períodos experimentais dificulta o julgamento dos métodos, com exceção da FDA e celulose que apresentou menores valores (P<0,05) no método refluxo. Para o bagaço de cana, os resultados médios de lignina e celulose foram inferiores no método refluxo. Os demais parâmetros apresentaram valores diferentes em cada período experimental. De acordo com os dados obtidos, conclui-se que os resultados dos parâmetros obtidos por meio do método TNTgrosso, que é alternativo ao Refluxo e Autoclave-cadinho estão numericamente muito próximos e, considerando ser um método mais economicamente viável e sustentável na rotina laboratorial de análises de alimentos, recomenda-se a adoção. Palavras-chave: Autoclave, FDA, FDN, lignina, TNT

8 viii PADRONIZATION OF ANALYTICAL METHOD OF FIBER IN ROUGHAGES. ABSTRACT The experiment was conducted in the Laboratory of Biogeochemical and Animal Nutrition, of Unicastelo, campus Descalvado to evaluate the efficiency of the microanalysis method neutral detergent fiber (NDF), acid detergent fiber (ADF) and lignin, using bags nonwovens in two thicknesses of weft and comparing it with the methods of Van Soest detergent. It was used 4 samples of bulky (corn silage, alfalfa, cane bagasse, tifton hay). The experiment was conducted in a randomized design with four treatments, namely: conventional reflux method (Van Soest), sequential method with autoclave using crucibles filtering, sequential method with autoclave using bags TNT thin weft, sequential method with autoclave using bags TNT thin weft, three repetitions for treatment. The data were analyzed by analysis scheme split plots (three times in time). Based on the results, it was observed that in each sample used in the evaluation of the methods, there were different results for each of the parameters (NDF, ADF, lignin, hemicellulose, cellulose). In Corn Silage for the NDF, the result of the reflux method showed significantly lower than the other methods; similarly to FDA, hemicellulose and cellulose. For alfalfa, the results in the three experimental periods hampers the trial of the methods, except the FDA and cellulose had lower (P <0.05) in reflux method. For Cane Bagasse, the average results of Lignin and cellulose were lower in the reflux method. The parameters showed different values in each experimental period. According to the obtained data, it is concluded that the results of the parameters obtained through TNT-coarse method that is alternative to the reflux and autoclave-crucible are "numerically" very close and, considering it more economically viable and sustainable methods in routine laboratory of food analysis, we recommend the adoption. Key-words: Autoclave, ADF, NDF, Lignin, TNT

9 ix LISTA DE FIGURAS Figura 1: Seção transversal de lâmina foliar de Brachiaria decumbens Figura 2: (A) saquinho de TNT confeccionado manualmente; (B) máquina seladora usada para vedar os saquinhos de tecido TNT Figura 3: Saquinhos de TNT selados. trama fina (A) e trama grossa (B) Figura 4: Béquer de vidro de 500 ml com saquinhos já imersos no detergente neutro, e fechados com papel filme Figura 5: Saquinhos de TNT pós digestão com detergente neutro e colocados em prato de vidro para serem secos à estufa Figura 6: Saquinhos de TNT acondicionados individualmente em frascos de plástico com adição de ácido sulfúrico 72% Figura 7: (A) Cadinhos filtrantes acondicionados em frascos plásticos, com adição da solução de detergente e tampados para serem levados à autoclave (B) autoclave.. 41 Figura 8: Cadinhos filtrantes imersos em ácido sulfúrico 72% acondicionados em frascos de plástico Figura 9: Resíduo da digestão em detergente, contido no cadinho filtrante, submetido à filtração sob vácuo Figura 10: Béqueres com amostra e solução de detergente em ebulição, sob refluxo, no aparelho de digestão... 43

10 x LISTA DE TABELAS Tabela 1: Resumo dos tecidos das plantas e suas digestibilidades relativas Tabela 2: Principais métodos, usos e limitações, de análises de fibra utilizadas em forrageiras Tabela 3: Classificação das frações das forragens utilizando o método de Van Soest Tabela 4: Desvios padrões e os coeficientes de variação em diferentes análises, estabelecidos como medida de precisão Tabela 5: Teores médios de fibra em detergente neutro (FDN), fibra em detergente ácido (FDA), lignina, hemicelulose e celulose, e desvio padrão da silagem de milho obtidos pelas diferentes metodologias de determinação da fibra Tabela 6: Teores médios de fibra em detergente neutro (FDN), fibra em detergente ácido (FDA), lignina, hemicelulose e celulose, e desvio padrão da alfafa obtidos pelas diferentes metodologias de determinação da fibra Tabela 7: Teores médios de fibra em detergente neutro (FDN), fibra em detergente ácido (FDA), lignina, hemicelulose e celulose, e desvio padrão do bagaço de cana obtidos pelas diferentes metodologias de determinação da fibra Tabela 8: Teores médios de fibra em detergente neutro (FDN), fibra em detergente ácido (FDA), lignina, hemicelulose e celulose, e desvio padrão do feno tifton obtidos pelas diferentes metodologias de determinação da fibra... 58

11 xi LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS % porcentagem µm..... micrograma AOAC... Association of Official Analytical Chemists atm.... atmosfera cm..... centímetro cm centímetro quadrado CTAB... Brometo de cetil trimetilamônio ENN... Extrativo não nitrogenado FB..... Fibra Bruta FBT... Filter bag technique FDA... Fibra em detergente ácido FDN... Fibra em detergente neutro FDNi... Fibra em detergente neutro indigestível g gramas m metro quadrado ml..... mililitro mm.... milímetro MM.... Matéria mineral MS..... Matéria seca N Nitrogênio NNP... Nitrogênio Não Protéico NRC... National Research Council ºC Grau Célsio PB..... Proteína Bruta ph..... Potencial hidrogeniônico PVC... Policloreto de vinil SAS... Statistical analysis system TNT... Tecido não tecido

12 xii SUMÁRIO RESUMO... vii ABSTRACT... viii LISTA DE FIGURAS... ix LISTA DE TABELAS... x LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS... xi 1. INTRODUÇÃO OBJETIVO GERAL Objetivos especificos REVISÃO DA LITERATURA Caracteristicas da parede celular Métodos de análise da fração fibrosa Fibra Bruta Fibra em detergente neutro Fibra em detergente ácido Lignina Causas de variação nas análises da fibra em detergente Estudos realizados com outras metodologias para determinação da fração fibrosa MATERIAL E MÉTODOS Local do experimento Amostras utilizadas Preparo das amostras Tratamentos Delinemento experimental e análise estatística Métodos de análise Micro método sequencial em autoclave com saquinhos de TNT (trama fina e grossa) Micro método sequencial em autoclave com cadinhos filtrantes Método de análise padrão (convencional) segundo Van Soest (1967) Análise de Fibra em detergente neutro Análise de Fibra em detergente ácido RESULTADOS E DISCUSSÃO Considerações Finais CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 64

13 13 1. INTRODUÇÃO O ponto de partida para entender os processos fisiológicos nos animais é o estudo de composição química de alimentos. Esses processos fisiológicos são responsáveis por transformar compostos complexos até a formação de produtos de origem animal, especialmente em função de disponibilidade de energia (Berchielli et al.,2001). Quando se trata de nutrição de ruminantes, um dos principais conceitos utilizados é o da fibra devido ao fato da forragem conter quantidade expressiva deste nutriente e representar a base da sua alimentação. Na alimentação de ruminantes, fibra refere-se à parede celular de plantas forrageiras (VAN SOEST, 1994). A fibra, como alimento, fornece energia; além de representar até 60% da MS consumida pelos animais. Pelo fato de apresentarem boa estimação de componentes totais da parede celular e de suas frações indigestíveis, a AOAC (1980) aceitou oficialmente as técnicas desenvolvidas por Van Soest (1963b, 1967) e por Van Soest e Wine (1967, 1968), também conhecidas como sistema detergente, o qual se obtém a fibra em detergente neutro (FDN) e fibra em detergente ácido (FDA) (Ferreira, 1994). Essas metodologias foram amplamente aceitas. Porém ao passar dos anos, comprovou-se que essas técnicas originais não eram tão eficazes para alguns alimentos como cereais ricos em amido e subprodutos agroindustriais ricos em tanino, pectina, complexos tanino-proteína e produtos de Maillard; surgindo então, necessidade de fazer modificações em alguma etapa do método analítico de acordo com a amostra a ser analisada (Van Soest et al., 1991). Segundo Mertens (1992), o surgimento do sistema detergente tornou possível um avanço significativo na caracterização nutricional dos alimentos. Ultimamente, a técnica de sistema detergente é o método mais utilizado para determinar fibra e constituintes da parede celular. Para realização deste método, utiliza-se 1 g de amostra para 100 ml de solução detergente; e equipamento específico. Há outros métodos para avaliar FDN e FDA, entre eles há o método convencional (Van Soest, 1967) e o método Filter Bag Technique da Ankom (FBT), segundo Ankom (2012).

14 14 Pelo fato da necessidade de manutenção de equipamentos utilizados, alto custo de reagentes, além de ser necessário muito tempo para realizar as análises; busca-se métodos alternativos com baixo custo, porém que forneçam resultados fidedignos ao método original. Holechek; Vavra (1982), Shultz et al. (2003), Shultz e Shultz (2003) citam um micro método para determinar os constituintes da parede celular, tendo a fonte de aquecimento como o único fator que diferencia; utilizando-se bloco de digestão ou banho Maria. Segundo Lima (2003), os nutricionistas não analisam mais a fibra pelo método de fibra bruta, e sim pelo método de fibra em detergente neutro (FDN) e fibra em detergente ácido (FDA). Isso se deu pelo fato do resultado analítico do método de fibra bruta, consistirem de celulose, com poucas quantidades de lignina e hemicelulose. Sendo assim, iniciou-se a utilização do método FDN e FDA para expressar a concentração de fibras dos alimentos e, no balanceamento de dietas para ruminantes. Diante deste contexto e, pelo fato de não encontrar informações na literatura consultada a cerca de dados sobre análises com micro métodos, procurou-se, com o presente trabalho, gerar informações a respeito da análise da fibra do sistema detergente, por meio de micro método, analisando-se o tecido não tecido na análise.

15 15 2. OBJETIVO GERAL O presente estudo teve o objetivo de avaliar a eficiência de um micro método de análise de fibra em detergente neutro (FDN), fibra em detergente ácido (FDA) e lignina, que utiliza saquinhos de TNT, em duas espessuras de trama do tecido, comparando-os com métodos já avaliados e tradicionais. 2.1 Objetivos específicos De modo específico, pretendeu-se: Verificar se o micro método é viável e eficiente, comparado aos métodos já avaliados e tradicionaisl (Sistema de detergente, Van Soest), uma vez que o custo será menor.

16 16 3. REVISÃO DA LITERATURA Os ruminantes utilizam os mecanismos simbióticos para aproveitar os nutrientes presentes na parede celular, pois, mamíferos em geral, não produzem enzimas que hidrolisam predominantemente os polissacarídeos presentes na parede celular, os quais necessitam de microrganismos do trato gastrintestinal para serem fermentados (VAN SOEST, 1994). O mesmo autor ressalta que a quantidade de fibra e suas frações compreendem os fatores que afetam a ingestão e o desempenho dos ruminantes, principalmente pela baixa digestibilidade, de tal forma que o volume físico ocupado no rúmen comprometerá a ingestão e o desempenho do animal Características da parede celular É importante saber como é organizada a parede celular, assim como a relação entre seus componentes para compreender e saber usar os diversos métodos analíticos existentes para a quantificação da fibra (BOLWELL, 2000). A parede celular é um complexo de estruturas laminares que se divide em três zonas distintas: lamela média, parede celular primária e parede celular secundária. A parede celular primária é constituída de vários polissacarídios, incluindo a celulose, com interligação polissacarídica e ramificações de cadeias ricas em xilose, denominadas xiloglicanas; as quais são responsáveis pela manutenção da organização espacial das microfibrilas de celulose. São encontradas em maior quantidade na parede celular das gramíneas do que das leguminosas (BOLWELL, 2000). A parede celular da planta é um compartimento dinâmico que sofre modificações no decorrer do período de vida da célula. Durante a divisão celular da célula, surge a parede celular primária, e durante a expansão celular, sua área superficial rapidamente aumenta. Pode-se caracterizar a parede celular como uma composição altamente organizada de muitos e diferentes polissacarídios, proteínas, substâncias aromáticas, água e minerais (CARPITA; MCCANN, 2000). Segundo Iiyama et al. (1993), o início do desenvolvimento da célula vegetal se dá pelo crescimento do tamanho celular, e a parede celular é mencionada como

17 17 parede primária sendo capaz de se alongar devido aos polímeros da parede que não estão interligados. Os polissacarídios, polímeros de açúcar, são os principais componentes da parede celular e constituem a sua principal base estrutural. Todos os açúcares da parede celular são aldoses. A celulose apresenta-se na forma de microfibrilas arranjadas paralelamente uma a outra. É o polissacarídio mais abundante nas plantas, contabilizando cerca de 15 a 30% da matéria seca de todas as paredes celulares primárias e também de grande percentagem das paredes secundárias (GIBEAUT; CARPITA, 1994). A hemicelulose são glicanas ligadas às microfibrilas que compõe a celulose através de pontes de hidrogênio. A hemicelulose representa amplamente todo material extraído da parede celular através de solução ácida (JARVIS, 1984). Entre as células adjacentes, existe região denominada de lamela média, que é formada na interface das paredes primárias das células em formação e é composta por substâncias péctidas. Durante a divisão celular, forma-se a lamela média que cresce coordenadamente durante a expansão celular (CROTEAU et al., 2000). O crescimento celular, que é caracterizado por um aumento irreversível do seu volume, pode ocorrer devido à expansão (aumento do tamanho celular em duas ou três dimensões) ou pela elongação (expansão restrita a uma dimensão). De modo geral, a expansão celular envolve significativas alterações na massa e na composição da parede celular (COSGROVE, 1997). A deposição de novos materiais e o crescimento da maioria das células de uma planta ocorrem uniformemente ao longo da expansão da parede celular (TAIZ, 1984). Quando a planta pára de crescer começa o processo de maturação ou diferenciação e, com isso, a deposição da parede secundária e a lignificação (Figura 1). A transição da síntese da parede primária para a secundária é marcada pela interrupção de deposição de pectina e intenso aumento na síntese e deposição de celulose/hemicelulose e lignina (CARPITA; MACCANN, 2000). Segundo Bauer et al. (2008), os resultados da análise químico-bromatológica e da reação positiva com a safranina (cor avermelhada) (Figura 1) demonstram as correlações negativas, entre esses tecidos e a digestibilidade, evidenciando o caráter de barreira desses tecidos no processo de digestão. Além disso, as proporções de xilema e esclerênquima guardaram correlações positivas com os

18 18 componentes da parede celular (fibra em detergente neutro, fibra em detergente ácido, celulose e lignina) Figura 01: Seção transversal de lamina foliar de Brachiaria decumbens. Abreviações: FV-feixe vascular; CB-célula buliforme; EP- epiderme; XIL-xilema; CBF-célula da bainha do feixe; F-floema; ESC-esclerênquima; MÊS-mesófilo. Coloração avermelhada indica sítios de lignina. Escala em micrometros (µm). Fonte: Bauer et al., 2008 A cutinização e a lignificação da epiderme, apesar de oferecerem resistência física à planta, comprometem a colonização das partículas pelos microrganismos que ficam dependentes de lesões na epiderme e das passagens representadas pelos estômatos (BAUER et al., 2008). Segundo Showalter (1993), toda arquitetura da parede celular da planta é definida após a lignificação. A parede primária é definida como a estrutura que participa na expansão da célula. A célula toma sua forma definitiva quando pára de crescer e, nesse ponto, começa a ocorrer depósitos de paredes secundárias iniciais, e, na maturidade, apresentam cerca de 98% de celulose na sua constituição. A parede celular secundária pode conter outros polissacarídios não celulósicos (hemicelulose), pectina, proteínas estruturais e substâncias aromáticas como a lignina. Esta seção consiste de três camadas distintas, que são distinguidas em função das diferenças na orientação de suas microfibrilas de celulose. A celulose e os polissacarídios não celulósicos da parede secundária são qualitativamente distintos da parede primária. As principais diferenças são os componentes da hemicelulose da parede secundária, que são compostos primariamente por xilanas e mananas (BIDLACK et al., 1992).

19 19 De acordo com os mesmos autores, a distinção da parede celular secundária é a incorporação de lignina, que é um sistema de compostos aromáticos denominados fenilpropanóides. A síntese de lignina se inicia quando começa a deposição da parede secundária. Os fenilpropanóides, álcoois hidroxicinamoil, p- coumaril, coniferil e o álcool sinaptil representam todo sistema lignina. O álcool coniferil, que predomina nas espécies arbóreas; álcool sinapil e álcool coumaril são os três álcoois aromáticos que compreendem a lignina. Na biossíntese da lignina o p-coumaril é transportado do citosol para a parede da célula. Observou-se, por meio de microscopia eletrônica a biossíntese da lignina iniciando-se na lamela média. Assim, nestes locais da parede celular formamse domínios específicos que se estendem às outras camadas da parede celular, em direção à membrana plasmática (CROTEAU et al., 2000). De acordo com Jung; Allen (1995) o processo de lignificação inicia-se da região da parede primária para a parede secundária, mas a deposição de lignina acontece sempre após a deposição dos polissacarídios da parede secundária. O resultado desse padrão de desenvolvimento ou padrão de deposição da lignina é que os polissacarídeos depositados mais recentemente na parede secundária não são lignificados e a região da lamela média e parede primária é intensamente lignificada. Isso pode explicar porque os microrganismos degradam a parede celular do lúmen da célula para fora e, porque a lamela média e parede celular nunca são completamente digeridas. CROTEAU et al. (2000) ressaltam que a lignina atua como um cimento intercelular, conferindo impermeabilidade à água, promovendo uma barreira ao ingresso de patógenos. A composição da lignina depositada varia de acordo com a espécie, tipo de célula e estágio de desenvolvimento do tecido. Esta diferenciação se dá em função da partição diferencial de carbono entre os polissacarídios da parede celular e da lignina. Segundo Van Soest (1994), para se diferenciar o tipo de lignina em forrageiras usa-se o termo lignina core, referindo-se ao polímero fenilpropanóide depositado na parede celular, pela polimerização dos álcoois precursores coniferil, sinapil e p-coumaril e lignina não core envolvendo os ácidos fenólicos (p-cumárico e ferúlico), depositados na parede celular durante a sua formação.

20 20 A interação entre a lignina e os carboidratos, o tipo de lignina presente e a sua quantidade são fatores críticos e exercem grande influência na digestibilidade da forragem pelos animais (JUNG; DEETZ, 1993). Segundo Ralph et al. (1994), pode-se dizer que as gramíneas apresentam deposição de grandes quantidades de p-coumárico, como de lignina durante estágios mais avançados da lignificação. Segundo Hartley (1972), há correlações negativas entre as concentrações desse ácido e a digestibilidade de forrageiras. A limitação da digestão em razão da lignificação da parede celular pode ocorrer devido três possíveis mecanismos, sendo eles, o efeito tóxico da lignina sobre os microrganismos do rúmen; o impedimento físico devido à ligação ligninapolissacarídio, limitando o acesso de enzimas fibrolíticas; e, devido à hidrofobicidade causada pela lignina ocorre limitação da ação de enzimas hidrofílicas (JUNG; DEETZ, 1993). Em função da concentração da parede celular, da composição e a digestibilidade dos diferentes tecidos da planta diferirem radicalmente, a análise da fração fibrosa pode gerar informações a respeito da composição média da parede celular do alimento considerado (JUNG, 1997). Sendo assim, a concentração maior de fibra está no caule, em relação à lâmina foliar, na maioria das espécies de plantas. Por exemplo, a quantidade de FDN das folhas da alfafa no estádio de florescimento é cerca de 25% e do caule é de 40-55%. No mesmo estádio de maturidade, gramíneas C3 (Festuca arundinacea Schreb) apresentam 50% de FDN nas folhas e 70% nos caules e as gramíneas C4 (bermudagrass (Cynodon dactylon (L.) Pers), são caracterizadas por conterem aproximadamente 70% de FDN nas folhas e 85% nos caules (BUXTON et al., 1995). Segundo Jung; Allen (1995), embora todas as paredes celulares das plantas apresentem uma arquitetura básica similar, existem diferenças importantes entre os grupos taxonômicos de forrageiras. As folhas das leguminosas contêm muito menos parede celular que as gramíneas e, as leguminosas não apresentam o aumento na concentração da parede celular com a maturidade, como acontece nas folhas das gramíneas. De acordo com Buxton; Russel (1988) a parede celular das leguminosas é rica em pectina e tem quantidades relativamente maiores de celulose, como de xilana. O conteúdo de lignina nas leguminosas é maior que nas gramíneas, embora

21 21 a magnitude dessa diferença se dá quando se utiliza o método da lignina em detergente ácido. As leguminosas, de modo geral, são mais digestíveis que as gramíneas, não porque suas fibras são mais digestíveis, e sim porque contêm menos fibra e, portanto maior proporção de conteúdo celular. A diferença entre a digestibilidade das folhas e dos caules é menor em gramíneas do que nas leguminosas, sendo que, nos caules a digestibilidade declina mais rapidamente do que nas lâminas foliares, de acordo com a maturidade da planta (ALBRECHT et al., 1987). Nas folhas das gramíneas a lignificação ocorre na parte estrutural das folhas (nervuras centrais e laterais), promovendo desta maneira, um mecanismo de suporte, o que leva a uma alta concentração de fibra nas folhas, sendo duas vezes maior que nas leguminosas e menos digestível por esta razão (BUXTON; REDFEARN, 1997). De acordo com esses autores, nota-se diferentes tipos celulares das plantas em função da disponibilidade dos nutrientes (Tabela 1).

22 22 Tabela 1: Resumo dos tecidos das plantas e suas digestibilidades relativas Tecidos Funções Digestibilidade Características Mesófilo Contém cloroplasto Alta Parede delgada, sem lignina. Parênquima Metabólica Moderada a alta Nos veios das folhas de gramíneas e leguminosas. Colênquima Estrutural Moderada a alta Nos veios das folhas de gramíneas e leguminosas. Parede Parênquima da bainha Contém cloroplasto Moderada a alta grossa, sem lignina. Ao redor do tecido vascular nas folhas de C4. Parede grossa e lignificada. Fibra do floema Estrutural Moderada Caule e pecíolos de leguminosas, geralmente não são lignificados. Epiderme Derme Baixa a alta Parede espessa, lignificada, com cutícula e cera. Tecido vascular Vascular Nenhuma a Compreende xilema e moderada floema. Principal contribuição da fração indigestível. Esclerênquima Estrutural Nenhuma a baixa Parede espessa e lignificada Adaptado de BUXTON e REDFEARN (1997). O esclerênquima, o tecido vascular, o parênquima do caule e a epiderme do caule contêm componentes estruturais substancialmente indigestíveis devido à lignificação, por isso, são digeridos muito vagarosamente no rúmen. As folhas de gramíneas C3 são mais digestíveis que as gramíneas C4, pois têm mais células do mesófilo. Nas espécies C3, as células do mesófilo, floema, epiderme e parênquima são totalmente degradáveis, ao contrário das células da epiderme e parênquima das gramíneas C4, que podem ser degradadas lentamente ou parcialmente degradadas. A diferença na concentração de fibra nas C4, comparada com a C3, é maior devido a maior quantidade de tecido vascular e células do parênquima (BUXTON; REDFEARN, 1997). Dados apresentados por Wilson; Mertens (1995) identificaram cinco características de limitações estruturais na digestão da fibra de gramíneas e, demonstram que as características das células são importantes quando se refere à

23 23 digestão da fibra. Primeiramente, observou-se que a degradação microbiana pode proceder apenas no interior (sentido parede secundária a lamela média) da parede celular espessa e lignificada, pois a lamela média lignificada e a parede primária são indigestíveis. Na sequência, as partículas passam rapidamente pelo rúmen; Posteriormente, o acesso à célula não é imediato, pois partículas de fibra não são totalmente expostas à mastigação; Sendo assim, a digestão da parede espessa do parênquima e células do esclerênquima é limitada pela baixa relação entre a área superficial e volume celular. Os compostos carboidratos-ácidos fenólicos podem ser tóxicos (em nível celular) às bactérias que degradam a fibra. Sendo assim, de acordo com Jung (1997), medidas mais sofisticadas da composição da parede celular são cada vez mais prevalentes nos estudos de pesquisa e, o principal objetivo destas pesquisas é o desenvolvimento da informação acerca da composição química, histológica e estrutural das plantas forrageiras, além do uso de métodos analíticos adequados para estes fins. Deste modo, o outro objetivo que vem se destacando nos estudos de pesquisa vem a ser a relação de todas estas informações analíticas e mecanismos de degradação ruminal aplicados à nutrição dos animais domésticos Métodos de análise da fração fibrosa Segundo Mertens (1997) a definição de fibra é meramente nutricional e está vinculada ao método analítico empregado na sua determinação. Na química, a fibra é um composto e não uma entidade química distinta, e, assim, a composição química da fibra é dependente da sua fonte e da metodologia usada na sua determinação laboratorial. Na determinação laboratorial da fibra, o método deve estar adequado ao uso do seu resultado, ou seja, adequando aos princípios biológicos e bioquímicos a que se destina, seja aplicados aos monogástricos ou ruminantes. Além disso, deve ser fiel à acurácia analítica, repetibilidade, praticidade e economia (MACEDO JÚNIOR et al., 2007). De acordo com os mesmos autores, embora o método ideal deva ter uma correlação nutricional, não, necessariamente, tem composição química uniforme, mas deve fornecer informações úteis aos nutricionistas de ruminantes quanto ao

24 24 comportamento da fibra no trato digestivo dos animais, velocidades e extensão da degradação e produtos finais de sua degradação. Berchielli et al. (2006) ressaltam que o objetivo prático da avaliação de alimentos é aperfeiçoar a sua eficiência de utilização, oferecendo assim uma resposta mais confiável em relação à produção animal e proporcionando retorno financeiro mais adequado ao produtor. Diante deste contexto, segundo Bertipaglia (2005), o princípio básico da análise de fibra é a determinação da concentração de fibra em uma dada amostra de um alimento e, a escolha do método analítico irá depender do objetivo do pesquisador ou do laboratório com quem se trabalha. De acordo com Jung (1997) apud Bertipaglia (2005), os principais métodos utilizados para a análise de fibra em forrageiras estão listados na Tabela 2. Tabela 2: Principais métodos, usos e limitações, de análises de fibra utilizadas em forrageiras Método de análise Fração avaliada Limitação do método Fibra bruta (FB) Porção da parede celular, Remoção de com recuperação polissacarídeos não completa da celulose. celulósicos e lignina. Fibra em detergente Fração incompletamente Remoção quase completa neutro (FDN) digestível, com da pectina. A remoção da recuperação completa da proteína e do amido pode parede celular. ser um problema. Fibra em detergente ácido Porção da parede celular, Uma porção significativa (FDA) com recuperação da lignina é solubilizada. completa da celulose. Fibra dietética Recuperação completa de polímeros da parede celular. Pode ser difícil a remoção da proteína e do amido. Crampton-Maynard Celulose Contaminação com pequena quantidade de xilana. FDA (menos lignina ácida Celulose Limitações do método detergente LAD) FDA e LAD. FDN (menos FDA) Hemicelulose Limitações do método FDA e FDN. Lignina ácida detergente Lignina Com o método FDA (LAD) solubiliza-se lignina, especialmente em gramíneas. Lignina Klason Lignina Possível contaminação por proteína e carboidrato. Adaptado de Jung (1997), apud Bertipaglia (2005).

25 Fibra Bruta O método da Fibra Bruta (FB) é o mais antigo e ainda utilizado, pois representa um método oficial de análise de alimentos (AOAC), além da facilidade de condução. A concentração da FB é determinado pelo sistema de análise proximal ou Weende. Foi padronizado por Henneberg; Stohmann (1864) e nomeado com o lugar onde eles trabalharam: The Agronomy Research Station of Weende. De acordo com Bertipaglia (2005), a FB é um método gravimétrico, sendo que dentro de um esquema analítico, uma amostra de aproximadamente 3 g é submetida ao refluxo sequencial, durante 30 minutos, com 200 ml de uma solução ácida (ácido sulfúrico 1,25%) e básica (hidróxido de sódio 1,25%), respectivamente. A princípio, o álcali era usado para remover carboidratos puros, a extração ácida para separar a fibra dos componentes que não fossem carboidratos, sendo a celulose parcialmente hidrolisada e toda hemicelulose é dissolvida. O resíduo orgânico resultante representa uma porção indigestível do alimento (fibra bruta), composto principalmente de celulose, polissacarídios não celulósicos e lignina. Segundo Van Soest (1994), a marcha analítica da FB subestima muito o conteúdo total da parede celular da amostra de alimento e, apenas recupera uma porção de polissacarídios da parede celular e a lignina. Giger-Reverdin (1995) pontuou uma série de limitações do método, como por exemplo, 1) substâncias da parede celular são arbitrariamente divididas em duas partes: fibra bruta e extrato livre de nitrogênio (extrativo não nitrogenado ENN), que contém amido, entre outros polissacarídios, e açúcar solúvel; 2) a fibra bruta compreende a celulose, cutina e suberina; 3) alguma porção da lignina é dissolvida durante a hidrólise e é contabilizada no ENN; 4) a porção indigestível do ENN deve ser de fato, parte da lignina Fibra em detergente neutro A técnica do sistema de detergentes foi descrita originalmente por Van Soest e Wine (1967) cuja técnica era alternativa ao Método de Weende que não diferenciava os componentes da parede celular o suficiente para gerar informações a respeito de diferentes forrageiras com maturidades diferentes. A partir de então, outras sucessivas publicações (GOERING; VAN SOEST, 1970; ROBERTSON; VAN

26 26 SOEST, 1981; VAN SOEST et al., 1991; MERTENS, 2002; MERTENS, 2003) trataram de adequação da técnica original. O método da quantificação da FDN, desenvolvido por Van Soest usa a extração química, com a amostra em refluxo em solução de detergente neutro, seguida pela determinação gravimétrica do resíduo da fibra (VAN SOEST; WINE, 1967). Segundo Van Soest (1994), a FDN é considerada a entidade que representa a fibra em um alimento para ruminantes, porém não é um método oficial da AOAC, com a problemática de subestimar a concentração da parede celular, pois há solubilização da pectina. Na nutrição de ruminantes, a FDN pode ser correlacionada negativamente com a ingestão de matéria seca. Em outras palavras, quanto maior o conteúdo de FDN na forragem, menor será o consumo voluntário do animal (VAN SOEST, 1994). A FDN aumenta com a idade (maturidade) da planta. De acordo com Van Soest (1965) e Mertens (1994), a fração da FDN de forrageiras de baixo a moderado valor de digestibilidade foi correlacionada com a ingestão da forragem. Casler; Hatfield (2006) ressaltam que a FDN é considerada entidade laboratorial mais simples e melhor para predizer o consumo voluntário de ruminantes e, a tendência é de usá-la como critério na seleção de plantas em programas de melhoramento genético. Neste sentido, a redução da concentração de FDN leva ao aumento da digestibilidade da matéria seca, mas não altera a digestibilidade da fração FDN. Observam que plantas com baixa concentração de FDN não apresentam alteração na composição da parede celular, no entanto, apresentam maior susceptibilidade à solubilização em solução de detergente, sugerindo, então, que a parede celular destas plantas são menos estruturadas como àquelas com alta FDN. De acordo com Jaurena et al. (2012), a fração insolúvel em detergente neutro (FDN) reflete, principalmente, a concentração de celulose, hemicelulose e lignina da amostra. No entanto, apresenta quantidades distintas de proteína e fração mineral. Para Jarrige (1981) e Carré; Brillouet (1986) a concentração de proteína é altamente variável, entre 3 a 15% em volumosos e 1 a 20% em concentrados. A remoção total do nitrogênio da parede celular é muito difícil devido às ligações covalentes, sendo proposto o tratamento da amostra com enzimas

27 27 proteolíticas. Se houver o envolvimento da proteína com tanino, ou compostos de Maillard, as enzimas também podem ser utilizadas (PRESTON, 1979) Fibra em detergente ácido Ao contrário do que foi documentado a cerca da FDN, a FDA é obtida por um método de análise aprovado pela AOAC, que utiliza solução de detergente ácido (brometo de cetiltrimetilamônio ou CTAB, adicionado ao ácido sulfúrico 1N) na amostra em refluxo, seguida pela determinação gravimétrica do resíduo. Segundo os princípios metodológicos, a fibra em detergente ácido refere-se ao resíduo orgânico da hidrólise do ácido sulfúrico normal (VAN SOEST; ROBERTSON, 1980). Segundo Segura et al. (2007), o método da FDA foi publicado em 1963 (VAN SOEST 1963a; VAN SOEST 1963b) sendo as primeiras publicações que realmente descreviam o sistema detergente de análise. A FDA rapidamente substituiu a fibra bruta (FB) do sistema Weende, pois foi caracterizada como método mais simples e resultava em valores analíticos similares. De acordo com os mesmos autores, o procedimento para a FDA foi aprovado pela Association of Official Analytical Chemist (AOAC) e tão logo, padronizado nos laboratórios de análises químicas. A FDA compreende as frações de celulose, principalmente, e lignina. Por não conter a hemicelulose, tornou-se um método menos interessante para se avaliar a fração fibrosa estrutural total e, assim, em 1968, o método da FDN foi publicado, e a FDA foi pouco a pouco sendo deixada para caracterizar a fibra e, sim, correlacionada com a digestibilidade dos alimentos. Hoje em dia, o método de determinação da FDA é mais usado como uma das etapas para se determinar a lignina da amostra (SEGURA et al., 2007). A FDA, que se trata de uma porção da fibra, além de incluir a celulose e a lignina da parede celular, apresenta quantidades variáveis de xilana e outros componentes (VAN SOEST, 1963b). O detergente ácido tem duas funções importantes na amostra, sendo uma delas a extração dos lipídios quando não estão presentes na amostra em altas concentrações (VAN SOEST, 1963a) e o outro, originar o resíduo (FDA) com menor conteúdo de proteína contaminante quanto possível, entre outros contaminantes (pentosanas, nitrogênio, partículas de solo, hemicelulose), como demonstrado por vários pesquisadores (JARRIGE, 1980;

28 28 AERTS et al., 1978; THEANDER; AMAN, 1980; BITTNER; STREET, 1983; GIGER- REVERDIN, 1995). Da mesma forma, o conteúdo da FDN pode ser superestimado pela contaminação de partículas de solo, em 47% e a FDA em 61% (AERTS et al., 1978), sendo mais solúveis em detergente ácido que em detergente neutro. Do mesmo modo, a maioria das gramíneas apresenta quantidades significativas de sílica. Quanto à contaminação por proteína, deve-se à formação do complexo proteína-carboidrato, também formado com lignina (artefatos de lignina), que podem ser formados em forragens mal conservadas ou no preparo da amostra em estufa (VAN SOEST, 1965) e proteína-tanino (VAN SOEST et al., 1987). A contaminação de nitrogênio na FDA, em termos nutricionais, não está disponível para o animal (VAN SOEST; SNIFFEN, 1984). A contaminação por hemicelulose pode ser resultado das ligações covalentes entre hemicelulose e lignina, ou também das pontes de hidrogênio entre xilanas e microfibrilas de celulose GIGER-REVERDIN (1995). De acordo com Giger (1985), a obtenção do resíduo em detergente ácido em sequência à obtenção do resíduo em detergente neutro, pode gerar um resultado subestimado, pois o sulfito de sódio solubiliza parte da lignina, e a solução de detergente neutro dissolve a maior parte da pectina e sílica endógena. Segundo Bailey; Ulyatt (1970), a análise sequencial de FDA, deve ser realizada a partir do resíduo da FDN, sem o uso do sulfito de sódio. De acordo com Van Soest et al. (1991), a FDA não é uma fração da fibra válida para ser usada como indicativo da digestibilidade. Esta afirmação pode ser explicada uma vez que, quanto maior o conteúdo de FDA na forragem, menor será a digestibilidade no animal, devido à característica física de insolubilidade em detergente ácido (SCHROEDER, 2004). Em função da característica física de insolubilidade, o controle físico da digestão interage negativamente com a ingestão voluntária da forragem pelo ruminante e, desta forma, torna-se fator crítico do desempenho ponderal do animal. A concentração da parede celular está negativamente relacionada com o consumo de dietas ricas em forragem, pois contribui para o enchimento do rúmen (ruminal fill), que é associado à fração indigestível da parede celular. A concentração da fração indigestível da parede celular e a sua taxa de passagem são parâmetros críticos na determinação do enchimento do rúmen (JUNG; ALLEN, 1995).

29 29 Segundo os mesmos autores, os benefícios econômicos da redução da concentração da parede celular e o aumento da digestibilidade são significativos. Devido à alta concentração da parede celular e à sua digestibilidade o melhoramento de espécies de gramíneas em função da diminuição na concentração da parede celular ao invés da sua digestibilidade é muito desejável. Segundo Bertipaglia (2005), de modo geral, o método de Van Soest classifica as frações da forragem de acordo com a sua disponibilidade (Tabela 3). Tabela 3: Classificação das frações das forrageiras utilizando o método de Van Soest Fração Componentes Disponibilidade Nutricional Ruminantes Não-Ruminantes Conteúdo celular Açúcar,amido, Completa Completa pectina Carboidratos Completa Completa solúveis Proteína, NNP Alta Alta Lipídios Alta Alta Outros solúveis Alta Alta Parede celular Hemicelulose Parcial Baixa (FDN) Celulose Parcial Baixa Proteína aquecida Indigestível Indigestível Lignina Indigestível Indigestível Sílica Indigestível Indigestível Adaptado de VAN SOEST (1967) Lignina A conformação estrutural específica das plantas é consequência da produção dos ácidos fenólicos e da lignina que são depositados na parede celular de acordo com a maturidade da planta. A lignina é o elemento chave que limita a digestibilidade da parede celular, no entanto a lignina, para exercer seu efeito depende da presença das ligações (pontes) entre os polissacarídeos da parede celular com ela mesma e com o ácido ferúlico. A composição da lignina e ácido p-cumárico associados à parede celular afeta menos a sua digestibilidade do que a presença destas pontes (JUNG; ALLEN, 1995). De acordo com Buxton et al. (1996), a concentração de lignina está fortemente relacionada à porção indigestível da matéria seca de forragens. Segundo Buxton; Redfearn (1997), a lignina tem sido identificada como fator primário responsável pela limitação da digestibilidade da fibra, mas a utilização da fibra é

30 30 também limitada pela composição química e seu nível organizacional na parede celular. A lignina é a estrutura química que interfere na degradação microbiana dos polissacarídeos da fração fibrosa devido a sua ação física, pois forma uma barreira ao acesso dos microrganismos aos polissacarídeos. Por isso conferiu-se uma importância às pontes ou ligações entre a lignina e os polissacarídeos, intermediadas pelas ligações com o ácido ferúlico, implicando como fator inibitório adicional da digestão da fibra, principalmente de gramíneas (JUNG; ALLEN 1995). Quanto à quantificação da lignina de uma amostra, segundo Jung et al., (1999), existem vários métodos para a sua determinação uma vez que a lignina está associada negativamente à digestibilidade, sendo que a principal dificuldade do estudo do papel da lignina na digestibilidade da parede celular tem sido o desconhecimento da estrutura molecular definitiva e a concentração total de lignina, que ainda são empíricos. De acordo com Kirk; Obst (1988), o método da lignina de Klason é mais antigo para a sua determinação e trata-se do resíduo remanescente após hidrólise ácida. Este é o método de análise padrão para madeira, porém o seu uso para forrageira é questionado devido a possível contaminação com proteína (VAN SOEST, 1967). Segundo Lowry et al. (1994), a lignina obtida do resíduo da amostra em detergente ácido é o método alternativo para a lignina Klason e é o mais utilizado na nutrição de ruminantes. Porém, a lignina em detergente ácido é um método que subestima a concentração de lignina, pois a hidrólise ácida no procedimento da FDA pode solubilizar uma porção da lignina. Segundo Hatfield et al. (1994), o método da lignina Klason estima a concentração de lignina em forrageiras de 2-5 vezes maior que o método da lignina em detergente ácido, que não está significativamente contaminado por carboidratos e proteínas e é similar à composição molecular da fibra em detergente ácido. Jung et al. (1999) determinaram que o método da lignina Klason apresentou maior acurácia que a lignina detergente ácido, resultado este obtido em função da análise de comparação da energia bruta da forragem com o valor da energia bruta calculada da análise da composição da forragem. Na lignina em detergente ácido, estimada do valor calculado de energia bruta, foi de 68-84% da energia bruta da forragem e para a lignina Klason o valor foi de 85-97%. Segundo os autores, isso

31 31 indica que a estimativa da lignina Klason é substancialmente maior que a lignina ácida e que não superestima a lignina, pois a energia bruta recuperada foi próxima a 100%. O método da lignina em detergente ácido pode mensurar a cutina como sendo lignina e essa condição pode superestimar a sua concentração; as amostras de lignina em detergente ácido podem ser contaminadas com artefatos de Maillard, sendo que parte da lignina pode ser solubilizada pela solução de ácido sulfúrico 72%, de acordo com Rebole et al. (1989). Outro método para se estimar a lignina é o do permanganato, porém, também apresenta inconvenientes como: não trata uniformemente as partículas de diferentes tamanhos; a celulose pode ser parcialmente solubilizada se for empregada uma quantidade excessiva de permanganato; a hemicelulose e certos tecidos do mesófilo podem ser oxidados, segundo Fukushima et al. (1999). De acordo com Jung et al. (1997), o valor estimado com acurácia para a concentração de lignina de uma forrageira para se calcular uma dieta para um animal, é de extrema importância, uma vez que a lignina não apresenta nenhum valor de energia digestível para os animais e, se a concentração de lignina é subestimada, é errôneo assumir a perda de matéria orgânica como carboidrato e outros nutrientes do alimento Causas de variação nas análises da fibra em detergente Segundo Jaurena et al. (2012), está se tornando comum o aparecimento de erros e interpretações inadequadas dos resultados de análise química dos alimentos, em publicações técnicas e científicas, assim como em teses e dissertações de pósgraduação, além de publicações apresentadas em reuniões técnicas. Sendo assim, este fato leva à consideração da necessidade, mais uma vez, da padronização, pelo menos, das terminologias usadas nos métodos analíticos de alimentos para animais de produção. Os resultados da avaliação de alimentos estão sujeitos à variação, como qualquer outro sistema de medidas. No entanto, a variabilidade na composição e valor nutritivo dos alimentos (intrínseco) usados nos sistemas de formulação de dietas da produção animal é tão vasto e, complementa-se com os fatores extrínsecos (por exemplo, amostragem, procedimento analítico, qualidade dos

32 32 reagentes, desempenho dos analistas e, comunicação dos resultados), aumentando a variabilidade dos resultados analíticos (GIZZI; GIVENS, 2004). De acordo com Hall (2007), cabe destacar que a preponderância, dentro do campo da avaliação nutricional de alimentos, dos métodos de natureza empírica (onde o método define o que se mede, por exemplo, a fibra em detergente neutro, fibra bruta, carboidratos solúveis) contribui para a falta de reprodutibilidade dos resultados, uma vez que qualquer fonte de alteração gera resultados distintos. Bertipaglia (2005) ressalta que devido ao fato da fibra ser definida de acordo com o método usado para isolá-la, deveria estar claro que qualquer modificação do método original ou semelhante, tem o potencial de originar um conceito novo para fibra, e que pode não ser comparável ou compatível com o conceito já firmado. Qualquer modificação de método para se determinar a fibra, para ser aceitável, deve ser avaliada com amostras de alimentos que representem cada classe de ingrediente de uma dieta. Além disso, outros fatores podem alterar o valor da fibra em uma análise (MERTENS, 1992). Segundo Mertens (1992) deve-se observar os protocolos e as condições na análise de fibra em detergente que influenciam o resultado da análise, a saber: Subamostragem e segregação, pois todo processo que originar produto com segregação de partículas deve ser sub-amostrado para que se obtenha amostra verdadeira; Secagem das amostras: compostos insolúveis de proteínas e carboidratos produzidos mediante altas temperaturas serão considerados como artefatos da fibra e lignina no sistema de detergente. Sendo assim, recomenda-se usar 50ºC durante a secagem, e nunca expor a temperaturas superiores a 60-65ºC; Moagem das amostras: uma vez que o método da fibra em detergente basease na solubilização dos compostos não fibrosos da amostra, é esperado que uma eficiente extração deva ser maior, tanto quanto maior a área de superfície para a penetração do detergente. O contrário também é verdadeiro, ou seja, partículas muito pequenas podem ser lavadas e serem perdidas na filtragem do resíduo da amostra. Recomenda-se moagem com moinho tipo Wiley, dotado de peneira com abertura de malha de 1 mm; Padronização de reagentes: na análise da FDA, que utiliza ácido sulfúrico 1N, essa normalidade do ácido deve ser precisa, podendo variar de 0,99 a 1,01 N. Na análise da FDN, a solução de detergente neutro deve ser padronizada a um ph de 6,9 a 7,1;

33 33 Quantidade de amostra: a proporção de amostra e solução de detergente deve ser padronizada. O procedimento padrão para FDA recomenda uso de 1,0 g de amostra e 100 ml de solução de detergente ácido, enquanto para FDN usa-se 0,5 g de amostra e 50 ml de solução de detergente neutro, devendo-se então manter a mesma proporção amostra:solução; Pré-tratamento da amostra antes do refluxo: não é recomendado. A exposição da amostra por tempo prolongado degrada os componentes da fibra; Variação no tempo de refluxo e temperatura: sabe-se que a extração da fibra em detergente é dependente do tempo e da temperatura e que o aumento desses fatores resultará na diminuição do resíduo recuperado; Tratamento do resíduo com água quente e acetona: o erro mais comum na análise da fibra é a incompleta lavagem do resíduo de fibra para remover o detergente e os componentes solúveis da amostra. Esse resíduo deve ser enxaguado com ml de água quente (95-100ºC) por no mínimo 2 minutos para que se remova todo resíduo de detergente e os compostos solúveis presentes nas partículas da amostra. A acetona é usada para remover lipídios residuais (gorduras e ceras) das amostras. Geralmente, usa-se 30 ml de acetona, durante 5 minutos; Filtragem: usar sistema de vácuo mínimo para que não ocorra perda de partícula pela placa filtrante do cadinho. O cadinho adequado também tem fundamental importância na eficiência do processo, sendo recomendado o uso de cadinho de Gooch de 50 ml, com porosidade grossa; Secagem e pesagem dos cadinhos com o resíduo: As amostras devem permanecer na estufa em temperatura de ºC, até atingirem peso constante, o que normalmente leva 8 horas. Para Undersander et al. (1993) e Galyean (1997), existem, respectivamente, valores de desvios padrões e dos coeficientes de variação, ao realizar determinações em duplicatas, que devem ser aceitos na validação dos valores analíticos (Tabela 4). Se não forem atendidos, ou, se os valores obtidos forem superiores, será necessário estabelecer novas determinações laboratoriais.

34 34 Tabela 4: Desvios padrões e os coeficientes de variação em diferentes análises, estabelecidos como medida de precisão Análise Desvio padrão Coeficiente de Variação (%) Matéria seca ±0,10 0,5 Matéria mineral ±0,10 2,0 Proteína bruta ±0,10 (PB 10%) 2,0 ±0,20 (PB 20%) Fibra em detergente neutro ±0,35 (FDN 40%) 3,0 ±0,60 (FDN 70%) Fibra em detergente ácido ±0,20 (FDA 20%) 3,0 ±0,35 (FDA 40%) Extrato etéreo ±0,10 4,0 Nitrogênio insolúvel em detergente ±0,20 a ±0, ácido Valores entre parênteses indicam teor nos alimentos. Adaptado de BERTIPAGLIA (2005) Estudos realizados com outras metodologias para determinação da fração fibrosa Bortolassi et al. (2000) realizaram experimento para comparar o método convencional e Filter Bag Technique da Ankon (FBT filtro F57) na determinação de fibra em detergente neutro e fibra em detergente ácido. O método FBT mostrouse eficaz para determinação de FDN e FDA para a maioria dos alimentos utilizados no experimento. Na análise de FDN e FDA na FBT, utilizou-se 1800 ml de solução detergente para cada 24 amostras. Usou-se 0,5g de amostra em cada filtro de F57, sendo este posteriormente lacrado a quente (BORTOLASSI et al., 2000). Observou-se que o FBT pode ser reutilizado até seis vezes para alimentos como silagem de milho e farelo de canola. A análise de FDN do milho, no método de FBT, não é recomendada pela gelatinização do amido dentro do filtro, o que provavelmente causa entupimento da malha, superestimando o teor de FDN deste alimento (BORTOLASSI et al., 2000). A FBT mostrou maior concordância com resultados de FDA do NRC (1989) que o método convencional. E os resultados de FDN mesmo com reutilização dos filtros, mostrou que alguns alimentos possuem boa proximidade com valor de FDN proposto pelo NRC (1989) (BORTOLASSI et al., 2000).

35 35 Para os alimentos que não apresentaram diferenças (p>0,05) entre os tratamentos, a FBT apresenta a vantagem de possibilitar a realização das análises mais rapidamente, pois suporta 24 amostras por vez, ocupa pouco espaço físico dentro do laboratório, diminui em até 50% o custo com mão-de-obra, além de estar passando pelo processo de aprovação desde 1996 pela AOAC (Ankom, 2012). O método FBT mostrou-se eficaz para determinação de FDN e FDA para a maioria dos alimentos (BORTOLASSI et al., 2000). Embora a aplicação do F57 para avaliação do teor de fibra em alimentos apresente perspectivas favoráveis (BERCHIELLI et al., 2001), o custo associado a esse material pode inviabilizar sua aplicação rotineira em análise de alimentos. Têmse buscado alternativas a este material na utilização do sistema Ankom de análise de fibra, entre essas, o tecido não-tecido (TNT), com gramatura 100 g/m 2 (CASALI, et al., 2009). Casali et al. (2009) realizaram experimento para estimar teores de componentes fibrosos em alimentos para ruminantes, em sacos de diferentes tecidos. Os tecidos utilizados foram náilon (50 µm), F57 (Ankon ) e tecido-nãotecido (TNT 100 g/m 2 ). Este experimento teve como objetivo observar a integridade física pós-incubação ruminal e pós-extração com detergente, avaliar as perdas de partículas e as estimativas dos teores de FDNi de alguns alimentos para ruminantes obtidas em procedimentos in situ utilizando-se sacos confeccionados com os tecidos náilon (50 µm), F57 (Ankon ) e tecido-não-tecido (TNT 100 g/m 2 ) (CASALI et al., 2009). Foram utilizadas seis repetições de cada alimento para cada material. Estes sacos foram acondicionados com amostra de diferentes alimentos no rúmen e, posteriormente foram retirados, lavados com água corrente até o total clareamento, e tratados com detergente neutro. Os sacos de TNT e F57 obtiveram teores de FDN superior ao obtido com náilon para alguns alimentos (CASALI et al., 2009). Nunes et al. (2005), compararam teores de FDN e FDA em amostras de alimentos obtidas por intermédio de sacos e TNT e F57, e não observaram diferenças entre os tecidos. Isso indica a possibilidade do uso do TNT como material alternativo para análise de fibra (CASALI et al., 2009).

36 36 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. Local do experimento O experimento foi realizado no Laboratório de Nutrição Animal e Biogeoquímica da Universidade Camilo Castelo Branco, UNICASTELO, campus de Descalvado-SP Amostras Utilizadas Na avaliação e padronização do micro método, foram utilizadas amostras dos alimentos: silagem de milho, bagaço de cana, feno tifton e alfafa emurchecida. A escolha destes alimentos visou propiciar a avaliação de volumosos por serem ingredientes de referente uso com maior disponibilidade, na grande parte utilizados em confinamentos Preparo das Amostras As amostras foram provenientes de propriedades rurais do município de Descalvado. As amostras foram secas em estufa com circulação forçada de ar, à temperatura de 55º C, por 72 horas, e posteriormente, processadas em moinho tipo Willey (Modelo Thomas) primeiramente em peneiras com malha de 1,0 mm e posteriormente em peneiras de malha de 0,5 mm; procedimento recomendado por NFTA (1992). Parte da amostra que ficava no moinho após o processamento, era colocado juntamente com a amostra que tinha passado pelas peneiras. As determinações de matéria seca (MS) e matéria mineral (MM) foram realizadas de acordo com a AOAC (1990). Dos constituintes da fração de carboidrato fibroso foram determinados os teores de fibra em detergente neutro (FDN) e fibra em detergente ácido (FDA) segundo Van Soest (1967) e, a lignina utilizando-se ácido sulfúrico 72%, conforme Goering; Van Soest (1970).

37 Tratamentos As amostras de alimentos foram testadas em quatro tratamentos, com três repetições em cada tratamento. Os tratamentos utilizados foram: 1. Método convencional (refluxo) utilizado na determinação dos constituintes da parede celular, FDN, FDA e lignina, segundo metodologia de Van Soest (1967); 2. Método Sequencial com autoclave: usando cadinhos filtrantes; 3. Método Sequencial com autoclave: usando saquinhos de TNT de trama fina; 4. Método Sequencial com autoclave: usando saquinhos de TNT de trama grossa Delineamento experimental e análise estatística O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado, com quatro tratamentos, três repetições por tratamento, em esquema de análise de parcelas subdivididas (três vezes no tempo). Os dados foram processados e analisados no programa Statistical Analysis System (SAS), versão 9.0 (2002). Quando a análise de variância foi significativa, as médias foram comparadas pelo teste Tukey (5% de significância) Métodos de Análise Micro método sequencial em autoclave com saquinhos de TNT (trama fina e grossa) Os saquinhos foram confeccionados manualmente, selados com máquina seladora (Figura 2), deixando apenas uma abertura para introduzir a amostra a ser analisada. Posteriormente, foram numerados com o auxílio de lápis (grafite preto).

38 38 B A Figura 2: (A) saquinho de TNT confeccionado manualmente; (B) máquina seladora usada para vedar os saquinhos de tecido TNT. Foi realizada a pesagem para anotação do peso vazio (tara) dos saquinhos, e posteriormente, a pesagem de 0,5 g de amostra e acondicionada no interior do saquinho. O acondicionamento das amostras seguiu a relação de 0,5 g de MS por 25 cm2 de superfície interna do saquinho de TNT. Foram confeccionados três saquinhos de tecido de trama fina e três saquinhos de tecido de trama grossa para cada alimento avaliado, e repetida a análise três vezes no tempo no laboratório, resultando em seis saquinhos para cada alimento, para cada tempo. Foram confeccionados três saquinhos de tecido de trama fina e três saquinhos de tecido de trama grossa, os quais ficaram vazios (sem amostra) para teste da durabilidade e desgaste do tecido durante o procedimento analítico. A seguir, os saquinhos foram selados para que a amostra permanecesse dentro do saquinho durante todo o processo (Figura 3). A B Figura 3: Saquinhos de TNT, selados. Trama fina (A) e trama grossa (B).

39 39 Os saquinhos foram colocados em Béquer de vidro de 500 ml, com 102 ml de detergente neutro. Em cada Béquer foram colocados os seis saquinhos com as amostras de cada alimento (três de trama fina e três de trama grossa). Os Béqueres foram vedados com filme plástico PVC perfurado e preso com um elástico (Figura 4). Figura 4: Béquer de vidro de 500 ml com saquinhos já imersos no detergente neutro, e fechados com papel filme. Todos os béqueres foram levados à autoclave na temperatura de 121ºC e pressão de 1 atm, por 30 minutos. Após esse período de incubação na autoclave, os saquinhos foram lavados com água fervida (80ºC 110ºC) para poder eliminar o resíduo de detergente presente na amostra. Utilizou-se água fervida (80ºC 110ºC) para lavar as amostras, pois assim a eliminação do resíduo é mais facilitada do que se tivesse utilizado água fria. Em seguida, os saquinhos foram dispostos em prato de vidro e levados à estufa a 105ºC por 8 horas (Figura 5). Após esse período, permaneceram em dessecador para atingirem a temperatura ambiente. Foram pesados, e sequencialmente, submetidos ao processo anterior, mas, incubados em autoclave com a solução de detergente ácido.

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