MIOTOXINA-II DE Bothrops moojeni, UM EXEMPLO DE VERSATILIDADE FUNCIONAL DE UMA PROTEÍNA DO VENENO DE SERPENTES.

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA MIOTOXINA-II DE Bothrops moojeni, UM EXEMPLO DE VERSATILIDADE FUNCIONAL DE UMA PROTEÍNA DO VENENO DE SERPENTES. Matheus Godoy Pires Dissertação apresentada à Universidade Federal de Rondônia, como requisito para a obtenção do Título de Mestre em Biologia Experimental, tendo como Área de Concentração a Relação Patógeno - Hospedeiro. Porto Velho RO 2006

2 UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA MIOTOXINA-II DE Bothrops moojeni, UM EXEMPLO DE VERSATILIDADE FUNCIONAL DE UMA PROTEÍNA DO VENENO DE SERPENTES. Matheus Godoy Pires Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Guerino Stábeli Dissertação apresentada à Universidade Federal de Rondônia, como requisito para a obtenção de Título de Mestre em Biologia Experimental, tendo como Área de Concentração a Relação Patógeno - Hospedeiro. Porto Velho RO 2006

3 Pires, Matheus Godoy Miotoxina-II de Bothrops moojeni, um exemplo de versatilidade funcional de uma proteína do veneno de serpentes/matheus Godoy Pires. Porto Velho: UNIR, p. Orientador: Rodrigo Guerino Stábeli. Dissertação de Mestrado apresentada à Universidade Federal de Rondônia UNIR. 1. Miotoxina. 2. Fosfolipase. 3. Serpentes. 4. Bothrops moojeni. 5. Caracterização. 6. Bioquímica. I Título. CDD: CDU: Ficha catalográfica elaborada por Sandra de Fátima Virginio da Silva CRB-RO/298

4 "Biology is the study of complicated things that give the appearance of having been designed for a purpose." Richard Dawkins

5 Dedicatória A meus pais, Sr. Alceu Godoy Pires e Sra. Elaine Tadeu Perez Pires, por seu apoio incondicional; À minha mui amada companheira de todas as horas e ocasiões (mesmo naquelas nas quais imperam minhas idiossincrasias), Márcia Melo Medeiros; Ao Prof. Dr. Rodrigo Guerino Stábeli, pela cordialidade, presteza e amizade, e pela perseverança para enfiar a bioquímica na cabeça deste zoólogo.

6 Agradecimentos Em especial, ao Prof. Dr. Rodrigo Guerino Stábeli, pela eficiência em transmitir sua sapiência e técnica. À Márcia Melo Medeiros, pelo amor que a mim dedica, pela paciência com que suporta minha rabugice, e pelos momentos de distração que mantiveram lúcida a minha mente. Lúcia Guaraldo, minha ex-companheira, pelo incentivo que me deu para o regresso às atividades acadêmicas. À minha família, por resignar-se à distância por minha ausência. Aos meus colegas de laboratório, Ednaldo, Maria Goretty, Kayano, Carolina e Camila, pelo auxílio, companheirismo, amizade e solidariedade. Ao Tony, Alexandre e Luiz Herman, pela graça e descontração que dão ao ambiente laboratorial. Sem gente como vós, ninguém faria ciência com o prazer que temos. Ao Prof. Dr. Luiz Hildebrando Pereira da Silva, por sua presença inspiradora e pelo halo científico que emana. És ciência, Professor. Aos demais colegas de Instituto: administrativos, zeladores, faxineiras, pelo auxílio e por tornarem mais discreta a entropia colateral de minhas atividades. Sem vocês eu teria espalhado muitas mais manchas indeléveis e cacos de vidro. Aos demais colegas distantes, que contribuíram com os ensaios que eu não poderia ter efetuado aqui: Saulo F. Amui, Carolina D. Sant'Ana, Auro Nomizo; Marta C. Monteiro, Pedro R.T. Romão, Renata Guerra-Sá, Carlos A. Vieira, José R. Giglio, Marcos R.M. Fontes e Andreimar M. Soares. Ao CNPq, pelo auxílio financeiro para o desenvolvimento deste trabalho.

7 Sumário 1. Introdução O Veneno Ofídico Bothrops moojeni Hoge 1966 (caissaca) Implicações biológicas das fosfolipases A Objetivos Material e métodos Procedimento de purificação a partir do veneno total Aferição de massa Caracterização de estrutura secundária Modificações químicas Modificação dos resíduos Histidina por brometo 4-bromofenacil Modificação por acetilação dos resíduos Lisina Modificação dos resíduos Tirosina por fluoreto 2-nitrobenzenosulfonila Modificação dos resíduos Triptofano por cloreto o-nitrofenilsulfonila Tratamento da MjTX-II com brometo de cianogênio Atividade miotóxica Atividade edematogênica Disrupção de lipossomos Atividade citotóxica antitumoral Atividade microbicida Efeito citotóxico de MjTX-II sobre a viabilidade de Leishmania Efeito da MjTX-II sobre Schistosoma mansoni Inibição de atividade Clonagem de DNA complementar, seqüenciamento e análise da seqüência Análise da estrutura cristalina de MjTX-II Resultados Procedimento de purificação Controle de pureza da fração obtida Modificações químicas Modificação dos resíduos Histidina por brometo 4-bromofenacila Modificação por acetilação dos resíduos Lisina por acetilação com anidrido acético Modificação dos resíduos Tirosina por fluoreto 2-nitrobenzenosulfonila Modificação dos resíduos Triptofano por cloreto o-nitrofenilsulfonila Tratamento da MjTX-II com brometo de cianogênio Atividade miotóxica Atividade edematogênica Disrupção de lipossomos Atividade citotóxica antitumoral Atividade microbicida Efeito citotóxico de MjTX-II sobre a viabilidade de Leishmania Efeito da MjTX-II sobre Schistosoma mansoni Inibição de atividade Clonagem de DNA complementar, seqüenciamento e análise da seqüência Análise da estrutura cristalina de MjTX-II Discussão Conclusão Referências Bibliográficas... 47

8 Lista de Figuras Figura 1: Bothrops moojeni, adulto, fêmea. Foto do autor... 2 Figura 2: Distribução geográfica de Bothrops moojeni... 3 Figura 3: Perfis cromatográficos de Bothrops moojeni e Bothrops atrox... 4 Figura 4: Sítio catalítico usual de fosfolipase A 2 sobre glicerofosfolipídeo... 6 Figura 5: Perfil cromatográfico em troca iônica do veneno total de Bothrops moojeni Figura 6: Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS) de MjTX-II Figura 7: Perfil cromatográfico em fase reversa em C18 de MjTX-II Figura 8. Atividade miotóxica Figura 9. Edematogênese tempo-dependente Figura 10. Atividade sobre lipossomos Figura 11. Atividade antitumoral Figura 12. Atividade microbicida Figura 13. Atividade anti-leishmania Figura 14. Seqüências cdna e deduzida para aminoácidos de MjTX-II Figura 15. Alinhamento da sequência de aminoácidos de MjTX-II e outras toxinas FLA 2 -like Figura 16. Estrutura cristalina da MjTX-II... 37

9 Lista de Tabelas Tabela 1: Principais características das fosfolipases A Tabela 2: Resultados sobre Schistosoma mansoni Tabela 3. Efeitos biológicos das formas nativa e modificada de MjTX-II... 33

10 Resumo MjTX-II, uma fosfolipase A 2 homóloga do veneno de Bothrops moojeni, foi purificada utilizando-se um único passo cromatográfico em coluna CM-Sepharose- FF 9 x 190 mm, liofilizada, caracterizada funcional e estruturalmente. A caracterização incluiu: (i) caracterização funcional (ações antitumoral, antimicrobiana e antiparasitária); (ii) efeitos de modificações estruturais por 4-bromofenacil brometo (BPB), brometo de cianogênio (CNBr), anidrido acético e fluoreto 2- nitrobenzenosulfonila (NSBF); (iii) caracterização enzimática: inibição por heparina de baixo peso molecular e EDTA; e (iv) caracterização molecular: sequenciamento de cdna e predição de estrutura molecular. Os resultados demonstraram que a MjTX-II demonstrou atividade antimicrobiana por inibição de crescimento sobre Escherichia coli e Candida albicans, atividade antitumoral sobre tumor ascítico de Erlich (EAT), adenocarcinoma de mama humano (SK-BR-3), células T leucêmicas humanas (JURKAT) e efeitos antiparasitários sobre Schistosoma mansoni e Leishmania spp., o que faz da MjTX-II modelo promissor de biomolécula multifuncional, bem como outras fosfolipases A 2 Lys-49 homólogas multifuncionais ou mesmo seus derivados peptídicos. Este trabalho fornece indícios úteis sobre os determinantes estruturais da ação das fosfolipases A 2 Lys-49 homólogas e, em conjunto com estratégias complementares, dá suporte ao conceito de sítios bioativos distintos do sítio catalítico nas fosfolipases A 2 Lys-49 miotóxicas do veneno de serpentes.

11 Summary Pires, M. G. Bothrops moojeni myotoxin-ii, an example of function versatility of snake venom proteins pp. Dissertação de Mestrado Universidade Federal de Rondônia, Porto Velho. MjTX-II, a myotoxic phospholipase A 2 (PLA 2 ) homologue from Bothrops moojeni venom, was purified using a single-step CM-Sepharose-FF 9 x 190 mm chromatography procedure, liofilized, functionally and structurally characterized. The MjTX-II characterization included: (i) functional characterization (antitumoral, antimicrobial and antiparasitic effects); (ii) effects of structural modifications by 4- bromophenacyl bromide (BPB), cyanogen bromide (CNBr), acetic anhydride and 2- nitrobenzenesulphonyl fluoride (NBSF); (iii) enzymatic characterization: inhibition by low molecular weight heparin and EDTA; and (iv) molecular characterization: cdna sequence and molecular structure prediction. The results demonstrated that MjTX-II displayed antimicrobial activity by growth inhibition against Escherichia coli and Candida albicans, antitumoral activity against Erlich ascitic tumor (EAT), human breast adenocarcinoma (SK-BR-3) and human T leukemia cells (JURKAT) and antiparasitic effects against Schistosoma mansoni and Leishmania spp., which makes MjTX-II a promising molecular model of multifunctinal biolecule, as well as other multifunctional homologous Lys49-PLA 2 s or even derived peptides. This work provides useful insights into the structural determinants of the action of Lys49-PLA 2 homologues and, together with additional strategies, supports the concept of the presence of others bioactive sites distinct from the catalytic site in snake venom myotoxic PLA 2 s.

12 1 1. Introdução O Veneno Ofídico. O termo veneno é tipicamente aplicado às secreções simples ou complexas produzidas em glândulas especiais que causam efeitos deletérios e/ou letais quando aplicados em um organismo. Os venenos de serpentes podem apresentar amplas variações em sua composição. Foram descritas cerca de proteínas / peptídeos com diferentes estruturas e funções, ativos ou na forma de precursores inativos no veneno, além de outros componentes de origem não protéica como íons metálicos, carboidratos, nucleosídeos e aminas biológicas (Sarkar et Devi, 1968; Aird, 2002). A letalidade e sintomas decorrentes de acidentes ofídicos no homem, ou verificados experimentalmente em animais, refletem a composição dos venenos das diferentes espécies de serpentes. Vários dos mediadores bioquímicos e farmacológicos presentes nos venenos já foram isolados e caracterizados como sendo neurotoxinas, citotoxinas, lectinas, fatores de crescimento, desintegrinas, peptídios funcionais e enzimas. Dentre estes encontram-se proteases, fosfolipases, fosfodiesterases, fosfomonoesterases, 5'-nucleotidases, NAD-nucleotidases, colinesterases, aminotransferases, L-aminoácido oxidases, catalases, ATPases, hialuronidases, além de alguns inibidores enzimáticos (Russel, 1988; Ouyang et al., 1990; Tu, 1996; Soares et al., 2003). Entre as serpentes que ocorrem no Brasil, as de gênero Bothrops ( jararacas ) são responsáveis pela mais alta freqüência dentre os acidentes ofídicos, representando cerca de 90% da totalidade dos acidentes com serpentes. O

13 2 veneno botrópico induz choque, proteólise, coagulação sanguínea, promove a liberação de substâncias bioativas (histamina, bradicinina), induz hemorragia e necrose tissular (Vital Brazil, 1982) Bothrops moojeni Hoge 1966 (caissaca). Bothrops moojeni (Fig. 1), popularmete chamada de caissaca, é serpente Alethinophidia, Colubroidea, da família Viperidae, diagnosticada por sua dentição maxilar reduzida a um par de presas canaliculadas de grande mobilidade, associadas a glândulas de veneno (condição solenoglifodonte). Dentre os Viperidae, Bothrops moojeni é constituinte, dentre outras serpentes dos gêneros Agkistrodon, Atropoides, Bothriechis, Bothrops, Calloselasma, Crotalus, Deinagkistrodon, Hypnale, Lachesis, Ophryacus, Ovophis, Porthidium, Sistrurus, Trimeresurus e Tropidolaemus, da subfamília Crotalinae, cuja diagnose dá-se pela presença de órgãos sensoriais termorreceptores faciais, as fossetas loreais (Campbell et Brodie Jr., 1992; McDowell, 2001; Campbell et Lamar, 1989; 2004). Figura 1: Bothrops moojeni, adulto, fêmea. Foto do autor.

14 3 A distribuição geográfica de Bothrops moojeni abrange Argentina, Paraguai e Brasil, estando presente, no território nacional, nos estados do Paraná, São Paulo, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Mato Grosso, Goiás, Bahia, Tocantins, Piauí e Maranhão (Campbell et Lamar 1989), em áreas de savana tropical semi-árida ou sazonalmente seca Cerrado (Fig. 2). Bothrops moojeni é crotalíneo de grande porte, com um comprimento máximo registrado de 168 cm. Sua coloração dorsal varia, podendo apresentar-se acastanhada, marrom-acinzentada ou cinza-olivácea. O dorso da cabeça é, usualmente, mais escuro que o corpo (Campbell et Lamar, 2004). Figura 2: Distribução geográfica de Bothrops moojeni. Extraído de Campbell et Lamar, Bothrops moojeni é ainda exemplo de crotalíneo com variabilidade no padrão ornamental e merística que se sobrepõe consideravelmente com o de outras espécies do gênero Bothrops, de forma tal que ainda se torna necessário elucidar o

15 4 relacionamento entre B. moojeni e Bothrops atrox. É possível que B. moojeni simplesmente represente uma população mais meridional de B. atrox (Campbell et Lamar, 2004). Apesar desta possibilidade, ensaio cromatográfico comparativo desenvolvido pelo autor demonstra disparidade na composição do veneno entre B. moojeni e B. atrox (Fig. 3). lv Bothrops moojeni001:1_uv1_280nm lv Bothrops moojeni001:1_conc II Bothrops atrox001:1_uv1_280nm II Bothrops atrox001:1_conc mau 3000 a mau 3000 b ml ml Figura 3: Perfis cromatográficos (fase reversa) em C18, comparativo, entre venenos de Bothrops moojeni (a) e Bothrops atrox (b) Implicações biológicas das fosfolipases A 2. As miotoxinas fosfolipases A 2 homólogas são pequenas proteínas solúveis estáveis encontradas em uma ampla variedade de fluidos biológicos, tecidos e células, como líquido sinovial, exsudato inflamatório, macrófagos, plaquetas, pâncreas, baço, musculatura lisa, placenta, saliva e venenos de invertebrados, lagartos (Helodermatidae) e serpentes. São enzimas de particular interesse médicocientífico devido ao seu envolvimento em diversas manifestações inflamatórias humanas (Zuliani, 2001; Six et Dennis, 2000) A grosso modo, a ação catalítica das FLA 2 s consiste em promover a hidrólise das ligações ésteres do C2 dos fosfolipídios, liberando ácidos graxos livres e lisofosfolipídios (Fig. 4). Os produtos resultantes da hidrólise dos fosfolipídios podem

16 5 servir como substrato para a síntese de eicosanóides, implicados como mensageiros secundários ou precursores metabólicos em uma variedade de reações inflamatórias (Nelson et Cox, 2005, Zuliani, 2001). Fosfolipases A 2 Lys49 homólogas, assim denominadas por terem a substituição do usual resíduo Asp49 das FLA 2 resíduo fundamental para a atividade do sítio catalítico destas enzimas, que em conjunto com His48, Asp99 e Tyr52, participam da formação da rede de cargas tetraédrica funcional pelo resíduo Lys49, são geralmente encontradas em venenos de Viperidae, e esta substituição faz com que careçam de atividade catalítica mensurável (Lomonte et al.,2003). Apesar de desconhecida a razão da perda de atividade catalítica, uma hipótese apresentada por Watanabe et al. (2005), sugere que o resíduo Lys49 presente na fenda hidrofóbica perimetral do sítio catalítico capture definitivamente o ácido graxo substrato, obstruindo o sítio catalítico da molécula. Existem quatorze grupos de fosfolipases A 2 descritas da literatura, agrupados segundo sua origem biológica, estrutura primária e características bioquímicas (Six et Dennis, 2000; Murakami et Kudo, 2002; Fry et al., 2006) e denominados grupos I, II, III, IV,..., XIV (Murakami et al., 1995; Takayama et al., 1991; Dennis, 1994; Six et Dennis, 2000) (Tabela 1). Fosfolipases A 2 dos grupos I, II, III, V, IX, X, XI, XII, XIII e XIV são enzimas secretórias, de massa molecular variando entre cerca de a Da, Ca ++ -dependentes, encontradas em venenos de cnidários, moluscos, artrópodos (abelhas, escorpiões), serpentes, lagartos; em diversos fluidos e células de fungos, mamíferos, humanos e vegetais.

17 6 Fosfolipase A 2 Figura 4: Sítio catalítico usual (indicado pela seta) de uma fosfolipase do tipo A 2 sobre glicerofosfolipídeo. Modificado de Nelson et Cox (2005). Tabela 1: Principais características das fosfolipases A 2 agrupadas segundo a classificação de Six et Dennis (2000). Grupos Fontes Nomes alternativos*** Tamanho (kda)*** Dependência de Ca ++ *** I Serpentes (Elapidae, Hidrophiidae); sfla Dependente pâncreas de mamíferos* II Serpentes (Viperidae); fluido sinovial e sfla Dependente exsudato inflamatório; plaquetas e mastócitos humanos* III Cnidários, Artrópodos, Lagartos sfla Dependentes (Helodermatidae)** IV Citosol de plaquetas e monócitos, rim** cfla Pouco dependentes V Macrófagos de coração, pulmão de sfla 2 14 Dependentes mamíferos*** VI Linfócitos B humanos; músculo ifla Independente esquelético e coração humano*** VII/VIII Circulação de mamíferos e cérebro de PAF acetilhidrolase Independente bovinos*** IX Veneno de Conus magnus sfla 2 14 Dependente (molusco)*** X Leucócitos, fígado, timo e células sfla 2 14 Dependente endoteliais alveolares humanas*** XI Vegetais*** sfla 2 12,4 12,9 Dependente XII Coração, músculo esquelético, rins e pâncreas humanos* XIII/XIV Alguns parvovírus e fungo Streptomyces sp.* *Murakami et al., 1995; **Dennis, 1994; ***Six et Dennis, 2000 sfla Dependente sfla Dependente

18 7 Fosfolipases A 2 dos grupos VII e VIII são estruturalmente dem diferentes das enzimas acima, com massa molecular oscilando entre a Da, Ca ++ independentes e encontradas no sangue de mamíferos e cérebro de bovinos. Já fosfolipases A 2 grupos IV e VI são enzimas citosólicas encontradas em plaquetas, monócitos, linfócitos B, múculo esquelético, rim coração humanos, independentes ou pouco dependentes de Ca ++ e possuem massa molecular maior que as fosfolipases das classes acima, com cerca de a Da. Fosfolipases A 2 do veneno de serpentes tem sido classificadas como FLA 2 s das classes I e II, baseado em suas estruturas primárias e padrão de pontes dissulfeto (Balsinde et al., 1999; Six et Dennis, 2000; Soares et Giglio, 2000). De maneira complementar ao seu papel catalítico primário, as fosfolipases A 2 do veneno de serpentes demonstram outros efeitos farmacológicos e tóxicos, incluindo atividades mionecróticas, neurotóxicas, cardiotóxicas, hemolíticas, hemorrágicas, hipotensoras, anticoagulantes, edematogênica e inibitórias sobre a agregação plaquetária (Gutiérrez et Lomonte, 1997; Ownby, 1998; Ownby et al., 1999; Soares et al., 2004 a). Necrose muscular é uma conseqüência importante e séria de mordidas por serpentes do gênero Bothrops que podem levar à perda permanente de tecido ou função do membro afetado. A mionecrose pode ser devida a uma ação indireta como conseqüência da degeneração vascular e da isquemia causada pelas metaloproteases hemorrágicas ou por efeito direto de fosfolipases A 2 homólogas miotóxicas nas membranas celulares dos miócitos (Gutiérrez et Lomonte, 1997; Ownby, 1998; Ownby et al., 1999; Gutiérrez, 2002; Soares et al., 2004a). As miotoxinas homólogas I e II purificadas do veneno de Bothrops moojeni (MjTX-I e II) são fosfolipases A 2 Lys-49, já foram isoladas e caracterizadas (Lomonte

19 8 et al., 1990; Soares et al., 1998; 2000; 2004a). As estruturas espaciais nativas de MjTX-I e II e do complexo MjTX-II com ácido esteárico (um ácido graxo) foram recentemente elucidadas por cristalografia em raios-x (Marchi-Salvador et al., 2005a; de Azevedo et al., 1997; Watanabe et al., 2005). Para a caracterização funcional das enzimas fosfolipases, são efetuados usualmente numerosos ensaios. Dentre os de maior utilidade estão os estudos cinéticos, que traçam, com precisão, o comportamento, afinidade, velocidade catalítica e outros parâmetros comparativos da atividade enzimática, expondo a enzima a substratos naturais e artificiais, a inibidores de natureza diversa, e a dependência de cofatores enzimáticos é também cineticamente determinada a partir de ensaios comparativos de oferta e supressão de cofatores no ambiente de catálise in vitro. Os relacionamentos estrutura-função de diversas miotoxinas FLA 2 s homólogas do veneno de serpentes tem sido extensamente investigadas (Kini, 1997; 2003). Visando a elucidação do mecanismo de ação destas enzimas, diversas abordagens tem sido descritas, como modificações químicas de aminoácidos específicos (Soares e Giglio, 2003), mutagênese sítio-dirigida (Chioato et Ward, 2003), técnicas cristalográficas em raios-x (Murakami et Arni, 2003), ressonância magnética nuclear, espectrofluorimetria, formação de complexo com inibidores e substratos naturais e artificiais (Kini, 1997; Ward et al., 1998a; b). Estudos de clivagem e de modificação química sítio-dirigida (vide métodos), são particularmente úteis na determinação da ação de diferentes setores estruturais da molécula, elucidando quais partes estão particularmente envolvidas nos

20 9 mecanismos de ação ou mesmo na manutenção da integridade molecular e/ou estrutural da enzima. Além destas abordagens, estudos in vivo, tais como a edematogênese, indução de resposta imunológica, indução de hemorragia, inibição de parasitemia em organismo-modelo, exposição a organismos patogênicos (fungos, bactérias, dentre outros) e ex-vivo, como a mensuração de neurotoxidade sobre neurossomo murino, miotoxicidade sobre o músculo isolado, agregação plaquetária e/ou de eritrócitos ajudam a estabelecer com precisão os efeitos de uma toxina sobre organismos de resposta previsível. Ensaios farmacológicos, por fim, lançam luz sobre as promissoras capacidades e utilidades de uma biomolécula para a elaboração de novos fármacos, seja por sua utilização direta, ou como modelo para a síntese de compostos miméticos bioativos.

21 10 2. Objetivos. Caracterizar funcional e estruturalmente as atividades para-enzimáticas da toxina MjTX-II do veneno de Bothrops moojeni.

22 11 3. Material e métodos Procedimento de purificação a partir do veneno total. Veneno seco de Bothrops moojeni foi obtido de Bioagents Serpentarium (Batatais-SP), 50 mg deste foi ressuspenso em TRIS-HCl ph 8.0 e fracionado por cromatografia de troca iônica em coluna CM-Sepharose Fast Flow 9 x 190 mm equilibrada no mesmo tampão de ressuspensão do veneno. A cromatografia foi efetuada sob fluxo de 0,3 ml/min, com desenvolvimento de gradiente linear 0,05 a 0,6 M de NaCl, com volume total final sob gradiente de 10 V c (volumes de coluna), no mesmo tampão de equilíbrio em ph constante, numa adaptação do método descrito em Soares et al. (1998), utilizando-se aparelho HPLC Akta Basic (Amersham Biosciences), coletando-se frações de 1 ml. As frações correspondentes à eluição da MjTX-II foram reunidas, liofilizadas e estocadas a 4ºC para análises posteriores. A homogeneidade da fração foi demonstrada por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) (Fig. 6, vide resultados) e cromatografia em fase reversa (RP-HPLC) (Fig. 7, vide resultados) Aferição de massa. A massa molecular da MjTX-II foi determinada por espectrometria de massa por dessorção assistida por ionização a laser da matriz (MALDI). Para tanto, aproximadamente 30 mm de proteína liofilizada foi dissolvida em 50% (v/v) de acetonitrilo contendo 7% (m/v) de ácido sinapínico, sendo a sonda embebida nesta

23 12 solução, seca em jato de ar aquecido, e levada já com a proteína adsorvida à câmara de vácuo (Soares et al., 2000a; b; 2003) Caracterização de estrutura secundária. O espectro de dicroísmo circular em UV longo (190~250 nm) foi medido com aparelho JASCO 810, utilizando-se cubetas de 1mm de passo e concentrações de proteína de 250 mg/ml tanto para o estado nativo quanto com a fosfolipase modificada. Em todos os casos, um total de três espectros foram coletados, mensurados e corrigidos por subtração do ruído de fundo do tampão utilizado Modificações químicas Modificação dos resíduos Histidina por brometo 4-bromofenacil. A modificação dos resíduos de Histidina com brometo 4-bromofenacila (BPB) foi efetuada como descrito por Soares et al. (2000a; b; 2001a; b) utilizando-se tampão bicarbonato de amônia. Três miligramas de toxina pura foram dissolvidas em 1 ml de bicarbonato de amônio 0,1M contendo 0,7mM de EDTA (ph 8,0) e 150 ml de BPB (0,8mg/ml), e incubado por 24 horas a 25 o C. A proteína foi separada do reagente livre por cromatografia de exclusão por tamanho em Sephadex G-25 Fine, como descrito abaixo para o procedimento de acetilação e então liofilizada. A quantificação da proteína nas amostras dissolvidas foi obtida através da leitura em espectrofotômetro em 280 nm.

24 Modificação por acetilação dos resíduos Lisina. A modificação dos resíduos Lisina por acetilação com anidrido acético foi efetuado a uma taxa molar proteína/reagente de 1:50 (Soares et al., 2000a; b; 2001a; b), seguindo o método descrito por Díaz-Oreiro et Gutiérrez (1996). MjTX-II (3 mg) foi dissolvida em 1,5 ml de tampão bicarbonato de amônia 0,2 M ph 8.0 acrescido de 10 ml de anidrido acético e incubado por 1 hora a 25 o C. O ph foi ajustado novamente para 8,0 com NaOH após a adição do anidrido acético. Após 1 hora de incubação a 25ºC a proteína foi separada do reagente livre por cromatografia de exclusão por tamanho em coluna de Sephadex G-25 fine equilibrada com tampão acetato de amônio 0,05 M, ph 6,8 e então liofilizada. Proteína-controle foi submetida à cromatografia de exclusão por tamanho às mesmas condições utilizadas para a proteína tratada com anidrido acético Modificação dos resíduos Tirosina por fluoreto 2-nitrobenzenosulfonila. Os resíduos Tirosina foram modificados por tratamento com fluoreto 2- nitrobenzenosulfonila (NSBF) como descrito por Soons et al. (1986). 1 mmol de MjTX-II (9 mmoles de Tirosina) foi dissolvido em 14 ml de tampão Tris-HCl 0,1 M e incubado com 9 mmoles de NSBF por 20 horas a 25 o C, seguido da separação do reagente livre por cromatografia de exclusão por tamanho em Sephadex G-25 Fine, como descrito acima.

25 Modificação dos resíduos Triptofano por cloreto o-nitrofenilsulfonila. A modificação dos resíduos Triptofano foi efetuado como descrito por Takasaki et al. (1990). Nove miligramas de MjTX-II foram diluídas em 4 ml de solução de ácido acético a 50% contendo 1 mg de Cloreto de o-nitrofenilsulfonila (NPSC) e incubado por 1 hora a 25 o C. Coeficientes de extinção molar da toxina modificada e nativa foram utilizados para efetuar a reação. Em todos os casos, o reagente em excesso foi removido por ultrafiltração através de membrana Amicon YM-3 e lavado com água ou tampão bicarbonato de amônia 0,05M (ph 8,0), seguida de liofilização Tratamento da MjTX-II com brometo de cianogênio. Uma amostra de 15 mg de MjTX-II foi dissolvida em 0,45 ml de ácido fórmico a 70% (m/m) e uma concentração molar 50 vezes maior de brometo de cianogênio foi acrescentada sobre a amostra (Soares et al., 2000a; b; 2001a; b). A reação de clivagem foi obtida sob nitrogênio líquido por 24 horas à temperatura ambiente. Miotoxina integral (controle) e clivada foram aplicadas em coluna Sephadex G-25 (100x2 cm), previamente equilibrada e eluída com tampão bicarbonato de amônio 0,05M ph 8, Atividade miotóxica. Grupos de 5 camundongos Swiss machos (18-22g) foram inoculados no músculo gastrocnêmio direito com uma solução de MjTX-II em 50 µl PBS. Após 1, 3

26 15 e 6 horas, sangue foi coletado dos vasos da cauda em tubos heparinizados e centrifugados para separação do plasma. A quantidade de creatina-quinase (CK) foi então determinada utilizando-se 4 µl de plasma incubado por 3 minutos a 37 o C com 1 ml de reagente, de acordo com o protocolo cinético CK-UV do fabricante (Sigma Chem. Co.). A atividade foi expressa em U/I, uma unidade correspondendo à produção de um µmol de NADH por minuto (Soares et al., 2000a; b; 2001a; b) Atividade edematogênica. Grupos de 5 camundongos Swiss machos (18-22g) foram inoculados na região subplantar com doses crescentes de MjTX-II em 50 µl PBS. A cada intervalo de 0,5 h, o edema plantar foi medido com micrômetro de mola de baixa pressão (Mitutoyo Japão) (Soares et al., 2000a; b; 2001a; b). Valores t 0 foram então subtraídos e as diferenças expressas em médias ± desvio padrão Disrupção de lipossomos. Lipossomos negativamente carregados (fosfatidilcolina 63 µmoles; dicetilfosfato 18 µmoles e colesterol 9 µmoles) foram obtidos de Sigma Chem. Co. (Missouri, USA). O ensaio seguiu o procedimento de Soares et al. (2000a; b; 2001a; b) em microplacas, com incubação de 20 µl de suspensão de lipossomos contendo peroxidase com 20 µl de MjTX-II diluída em tampão fosfato-salina por 30 minutos a 37 o C ou 4 o C. Após a adição do substrato composto por ácido 5-aminosalicílico 2,5 mm e peróxido de hidrogênio 0,025 M, ph 6,0, a absorbância foi registrada em leitor de microplacas a 490 nm, e a liberação de peroxidase foi expressa em porcentagem,

27 16 considerando como 100% (controle positivo) a absorbância obtida pela incubação dos lipossomos com 20 µl de Triton X-100 (0,2% v/v ). Com fins de aferir a liberação espontânea de peroxidase, a absorbância dos lipossomos incubados apenas em tampão fosfato-salina foi subtraída de todos os valores obtidos Atividade citotóxica antitumoral. Linhagens de células tumorais humanas de câncer de mama (SK-BR-3) e leucemia aguda de células T (JURKAT) foram mantidas em meio RPMI 1640 temperado com 2mM de L-glutamina, 1,5 g/l de bicarbonato de sódio, 4,5 g/l de glicose, 10 mm de HEPES, 1,0mM de piruvato de sódio, 10% de soro fetal bovino, 100 unidades/ml de penicilina e 100 µg/ml de streptomicina. Todos os reagentes para cultivo celular foram obtidos de Gibco. Todas as culturas foram mantidas a 37 o C em 5% CO 2 em 95% de ar atmosférico com mais de 95% de umidade relativa. A atividade citotóxica sobre tumores das FLA 2 s foi ensaiada por cora em brometo 3-(4, 5 dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium (MTT) como descrito por Mosmann (1983). Células tumorais cultivadas em frascos próprios e mantidas em crescimento exponencial contínuo foram destacadas com 0,05% de tripsina; 0,02% EDTA em solução fosfato-salina tamponada livre de cálcio (PBS) e lavadas 3 vezes com meio RPMI a 1000 rpm por 15 minutos a 10 o C. As células foram então dispostas em placa de 96 poços a uma densidade de 1x10 5 células por poço. Após 24 horas de cultivo, o meio foi removido e meio fresco, com ou sem concentrações diferentes dos compostos indicados (FLA 2 ou metotrexato, 1-0,01 mg/ml), foi adicionado aos poços e incubado por 24 h (Roberto et al., 2004). O coeficiente de citotoxidade foi calculado como se segue:

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