AUTOR: GIRLEY FRANCISCO MACHADO DE ASSIS

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E BIOLÓGICAS NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS NUPEB PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS AVALIAÇÃO LABORATORIAL E CLÍNICA DE INDIVÍDUOS CHAGÁSICOS TRATADOS COM BENZONIDAZOL E NÃO TRATADOS RESIDENTES NO MUNICÍPIO DE BERILO, VALE DO JEQUITINHONHA, MG. AUTOR: GIRLEY FRANCISCO MACHADO DE ASSIS ORIENTADORA: Profa. Dra. Marta de Lana CO-ORIENTADORA: Profa. Dra. Rosália Morais Torres Ouro Preto

2 S237a Assis, Girley Francisco Machado de Avaliação laboratorial e clínica de indivíduos chagásicos tratados com benzonidazol e não tratados residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, Brasil [manuscrito] / Girley Francisco Machado de Assis xvii, 128 f.: il., color; grafs.; tabs.; mapas. Orientadora: Profª. Drª. Marta de Lana. Co-orientadora: Profª. Drª. Rosália Morais Torres. Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas. Área de concentração: Imunobiologia de Protozoários. 1. Trypanosoma Cruzi - Teses. 2. Chagas, Doença de - Teses. 3. Quimioterapia - Teses. 4. Benzonidazol - Teses. I. Universidade Federal de Catalogação: sisbin@sisbin.ufop.br

3 Girley Francisco Machado de Assis AVALIAÇÃO LABORATORIAL E CLÍNICA DE INDIVÍDUOS CHAGÁSICOS TRATADOS COM BENZONIDAZOL E NÃO TRATADOS RESIDENTES NO MUNICÍPIO DE BERILO, VALE DO JEQUITINHONHA, MG. Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Biológicas do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para obtenção do Título de Doutor em Ciências Biológicas, área de concentração Imunobiologia de Protozoários. Universidade Federal de Ouro Preto Ouro Preto II

4 Girley Francisco Machado de Assis AVALIAÇÃO LABORATORIAL E CLÍNICA DE INDIVÍDUOS CHAGÁSICOS TRATADOS COM BENZONIDAZOL E NÃO TRATADOS RESIDENTES NO MUNICÍPIO DE BERILO, VALE DO JEQUITINHONHA, MG. COLABORADORES: PEDRO ALBAJAR VIÑAS Departamento de Controle de Doenças Tropicais Negligenciadas, Organização Mundial de Saúde JOÃO CARLOS PINTO DIAS Centro de Pesquisas René Rachou, FIOCRUZ, MG. OLINDO ASSIS MARTINS FILHO Centro de Pesquisas René Rachou, FIOCRUZ, MG. MARIA TEREZINHA BAHIA Laboratório de doença de Chagas, NUPEB, UFOP. GEORGE LUIS LINS MACHADO COELHO Laboratório de doenças Parasitárias, UFOP. Universidade Federal de Ouro Preto Ouro Preto 2011 III

5 Dedicatórias Dedico este trabalho aos meus queridos pais (Geraldo e Vilma), aos meus irmãos (Girlaine, Géferson, Geomar e George), ao meu avô (José Antônio) e a minha noiva Fernanda que sempre apoiaram as minhas decisões. Sem a compreensão de vocês com certeza este caminho percorrido seria muito mais tortuoso... Girley Francisco Machado de Assis IV

6 Dedicatórias É bem melhor arriscar coisas grandiosas, Alcançar triunfos e glórias, mesmo expondo-se à derrota, Do que formar filas com os pobres de espírito Quem nem gozam muito e nem sofrem muito, Porque vivem nessa penumbra cinzenta Que não conhece vitória nem derrota. Teodore Roosevelt Vale que vale cantar Vale que vale viver Vale do Jequitinhonha Vale eu amo você. (Mark Gladston in memorium) V

7 Agradecimentos À Profa Marta de Lana exemplo de dedicação, compromisso e otimismo. Muito obrigado pelos ensinamentos científicos e de vida, pois estes 10 anos de convivência foram muito gratificantes para a minha formação. Obrigado pelo incentivo, apoio permanente, pelo carinho, pela compreensão e pela confiança em mim depositada durante todos estes anos. À Profa Rosália Morais Torres grande companheira e amiga em diversas excursões a Berilo. Dona de um coração gigantesco e apaixonada com o que faz. Muito obrigado por acreditar neste projeto e pelas infinitas conversas e apoio essencial para a conclusão deste trabalho. Ao Dr. Pedro Albajar-Viñas pela dedicação e apoio incondicional prestado ao Projeto de Berilo. Muito obrigado pelos ensinamentos que com certeza levarei por toda a minha vida. Ao Dr. João Carlos Pinto Dias pelo apoio, pelos exemplos de simplicidade, grandiosidade e profissionalismo. Ao Dr. Olindo Assis Martins Filho pelas brilhantes idéias e por abrir as portas do seu laboratório quando sempre precisamos. À Profa Maria Terezinha Bahia pela boa convivência nestes 10 anos, pelas conversas e apoio sempre que necessário. Ao Prof. George Luis Lins Machado Coelho pela grande contribuição no desenho dos estudos e análises dos dados. Ao Prof. Evandro Marques de Menezes Machado pelas conversas, atenção, apoio e ensinamentos. Exemplo de tranqüilidade e sabedoria. Ao Prof. André Talvani pela amizade, convivência e boas idéias compartilhadas. Ao grande amigo Flávio Andrade que sempre apoiou os projetos envolvendo o Vale do Jequitinhonha. VI

8 Agradecimentos A todos os companheiros do setor de transporte da UFOP que sempre apoiaram nossas infinitas viagens não medindo esforços, em especial ao Rogélio, José Roberto, José Raimundo, Seu Paulo, Marcinho e Zezinho. Ao padre José Nuno pela garra, dedicação, apoio e atenção. Pessoa fundamental para a manutenção dos projetos e exemplo de luta em pró dos pacientes chagásicos deste município. Ao atual prefeito (Lázaro) e o secretário de saúde (Fábio) que receberam o projeto de braços abertos, apoiando todas as nossas iniciativas. A todos os agentes municipais de saúde que sempre contribuíram para o bom funcionamento do serviço. Sem a ajuda de vocês não teríamos chegado até aqui. A todas as pessoas de Berilo que contribuíram de diversas maneiras para o bom andamento do projeto, em especial a Elizabeth (pousada) e Nenem (restaurante). A todos os funcionários da secretaria municipal de saúde, hospital municipal e equipes do PSF que sempre nos ajudaram no agendamento dos pacientes. A todos os amigos do Laboratório de doença de Chagas, Laboratório de Imunopatologia, Laboratório de doenças Parasitárias e Laboratório de Biomarcadores, CPqRR, FIOCRUZ, BH. VII

9 Agradecimentos AGRADECIMENTO ESPECIAL Ao grande e eterno amigo Cláudio Waldete (in memoriam), vulgo Ioiô, que me recebeu em Berilo de braços abertos, apoiando todas as nossas iniciativas. Saudades eternas... VIII

10 Resumo Um dos maiores desafios na doença de Chagas é avaliar o impacto do tratamento etiológico nos parâmetros clínicos e laboratoriais dos pacientes tratados. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a efetividade do benzonidazol na evolução clínica dos pacientes chagásicos tratados e não tratados, residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG. A primeira parte deste trabalho teve como propósito avaliar 94 pacientes chagásicos tratados há mais de 10 anos, utilizando sorologia convencional (ELISA, IFI e HAI), sorologia alternativa (rec-elisa e FC-ALTA) e métodos parasitológicos (HC e PCR). A sorologia convencional permitiu categorizar os pacientes em três grupos: tratados não curados (TNC), tratados em avaliação (TEA) e tratados curados (TC), segundo o critério clássico de cura (negativação de dois testes sorológicos negativos) ou critério mais rigoroso (negativação de três testes sorológicos negativos). O critério clássico revelou 78,7% dos pacientes TNC, 8,5% TEA e 12,8% TC. Já o critério mais rigoroso revelou 63,8% dos pacientes TNC, 28,7% TEA e 7,4% TC. As associações de dois testes da sorologia convencional (ELISA+IFI, ELISA+HAI e IFI+HAI) foram avaliadas e demonstraram resultados semelhantes entre associações de ELISA+IFI e IFI+HAI com o critério mais rigoroso. A rec-elisa e a FC-ALTA apresentaram resultados mais consistentes com o critério de cura mais rigoroso, mas cada teste revelou isoladamente um paciente negativo não revelado pela sorologia convencional. A HC revelou falha terapêutica em 17% (16/94) dos pacientes, todos categorizados como TNC por ambos os critérios. A PCR apresentou resultados negativos consistentes com os demais métodos sorológicos e parasitológicos empregados como critério de cura. A avaliação clínica revelou no grupo TC maior percentual de forma indeterminada, ausência de forma digestiva e menor percentual de forma cardíaca. A segunda parte deste trabalho avaliou comparativamente os resultados da efetividade terapêutica e evolução clínica de 29 dos 94 pacientes tratados na fase crônica da infecção, utilizando o critério de cura atual. Não foi observada cura parasitológica e nem mesmo queda sorológica em nenhum paciente em todos os períodos pós-tratamento. A HC revelou falha terapêutica em 10,3% (3/29) dos pacientes e a PCR apresentou um percentual de positividade de 58,6% (17/29). A avaliação clínica destes pacientes, treze anos pós-tratamento, revelou uma evolução progressiva em 27,6% (8/29) dos pacientes. O índice de evolução clínica dos pacientes tratados na forma indeterminada foi quatro vezes menor se comparado com aqueles que apresentavam alguma alteração cardíaca ou digestiva antes do tratamento. Na terceira parte deste trabalho foram avaliados os aspectos laboratoriais e clínicos de 58 pacientes chagásicos dos quais 29 foram tratados com benzonidazol há 13 anos e 29 não tratados. A HC apresentou maior percentual de positividade entre os não tratados quando comparados com os tratados (27,6% x 6,9%). Foi observada uma queda sorológica significativa no grupo tratado quando comparado com o não tratado, sendo esta mais elevada nos pacientes tratados na forma indeterminada. Os pacientes tratados apresentaram menor percentual de evolução clínica quando comparados com os não tratados (27,6% x 65,5%) e os tratados na forma indeterminada apresentaram menor índice de evolução quando comparados com os não tratados (1,3% x 4.3%). Em conjunto, estes resultados revelam um baixo percentual de cura parasitológica em pacientes chagásicos tratados na fase crônica da infecção, mas um melhor prognóstico da doença foi observado em pacientes tratados na forma indeterminada quando comparados com o grupo não tratados. IX

11 Abstract One of the biggest challenge in Chagas disease is to assess the impact of the etiological treatment in laboratorial and clinical parameters in treated patients. Thus, the goal of this work was to evaluate the benznidazol efficacy and the clinical evolution of treated and not treated patients from Berilo municipality, MG, Brazil. In the first part of this work 94 chagasic patients treated at least 10 years before were evaluated by conventional serology (ELISA, IIF and IHA), alternative serology (rec-elisa and FC- ALTA) and parasitological methods (HC e PCR). Taking into account the conventional serology, patients were categorized in three groups: TNC (treated not cured), TUE (treated under evaluation) and TC (treated cured) following the classic cure criteria (negativation of two serological tests) or the more rigorous criteria (negativation of three serological tests). The classic criteria revealed 78.8% of TNC patients, 8.5% of TUE and 12.8% of TC. The more rigorous criteria revealed 63.8% of TNC patients, 28.7% of TUE and 7,4% TC. The results of the associations of the conventional serological tests (ELISA+IIF, ELISA+IHA and IIF+IHA) revealed similar results between ELISA+IIF and IIF+IHA with the more rigorous criteria. The rec-elisa and FC-ALTA showed results more consistent with the more rigorous cure criteria, but each test alone showed a negative patient not detected by the conventional serology. The HC revealed therapeutic failure in 17% (16/94) of the patients categorized as TNC by both criteria. The PCR showed negative results consistent with the other serological and parasitological tests employed as cure criteria. The clinical evaluation revealed in TC group higher percentage of indeterminate form of the disease, absence of digestive form and lower percentage of cardiac form. In the second part of this work it was evaluated comparatively the results of therapeutic efficacy and clinical evolution of 29 out of 94 treated patients assessed before treatment, nine and 13 years after treatment using the current cure criteria. It was not observed parasitological cure and even signficant serological decrease in any patient at all periods after treatment. The HC revealed therapeutic failure in 10.3% (3/29) of the patients and the PCR showed a percentage of positivity of 58.6% (17/29). The clinical evaluation of these patients, 13 years after treatment, revealed a progressive evolution in 27.6% (8/29). The index of clinical evolution of patients treated in the indeterminated clinical form of the disease was four times lower if compared with patients that were with cardiac and/or digestive form before treatment. In the third part of this work it was evaluated the laboratorial and clinical parameters of 58 chagasic patients, 29 treated 13 years before and 29 not treated. The HC showed higher percentage of positivity in not treated patients when compared to treated patients (27.6% x 6.9%). It was observed a significant decrease of the serological titles in treated patients when compared with not treated. Treated patients showed significant lower percentage of clinical evolution when compared with not treated patients (27.6% x 65.5%), while patients treated in the indeterminated form of the disease showed the significant lower índex of evolution when compared with the not treated (1.3% x 4.3%). Togheter these results reveal a low percentage of parasitological cure in chagasic patients treated in the chronic phase of the infection, but a better prognosis of the disease was observed in patients, treated in the indeterminate form of the disease when compared with the not treated group. X

12 Lista de Tabelas Tabela I - Distribuição dos pacientes chagásicos tratados há mais de 10 anos residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, segundo o critério clássico de cura (dois testes sorológicos negativos) ou o critério de três testes sorológicos negativos Tabela II - Idade, sexo, forma clínica ( ) e resultado dos métodos de hemocultura e PCR dos pacientes chagásicos tratados com benzonidazol há 13 anos, residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG XI

13 Lista de Figuras Figura 1 - Divisão das mesorregiões e localização do município de Berilo no Estado de Minas Gerais Figura 2 - Distribuição dos pacientes chagásicos tratados com benzonidazol, há mais de 10 anos, residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, segundo a idade antes do tratamento e tempo pós-tratamento Figura 3 - Reatividade na sorologia convencional (ELISA, IFI e HAI) dos 94 pacientes chagásicos tratados com benzonidazol há mais de 10 anos, residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG Figura 4 - Representação individual da reatividade dos soros de pacientes chagásicos tratados com benzonidazol há mais de 10 anos, categorizados pelo critério clássico de cura e três testes sorológicos negativos versus rec-elisa e FC-ALTA. TNC= tratado não curado, TEA= tratado em avaliação e TC= tratado curado Figura 5 - Distribuição dos pacientes chagásicos considerados tratados curados (TC) segundo o critério clássico de cura e o critério mais rigoroso (três testes negativos) frente aos resultados da sorologia alternativa Figura 6 - Percentuais de resultados positivos para a técnica de hemocultura e PCR realizada em amostras de sangue coletadas dos pacientes chagásicos tratados com benzonidazol há mais 10 anos, categorizados segundo o critério de cura clássico e o critério de três testes sorológicos negativos Figura 7 - Percentuais de positividade da técnica de PCR em amostras dos pacientes chagásicos tratados com benzonidazol há mais de 10 anos residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG Figura 8 - Positividade da técnica de PCR em amostras dos pacientes chagásicos tratados com benzonidazol há mais de 10 anos, residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG. Eletroforese em gel de poliacrilamida a 6% XII

14 Lista de Figuras Figura 9 - Percentuais das formas clínicas encontradas nos pacientes chagásicos tratados há mais de 10 anos, residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG Figura 10 - Percentuais de formas clínicas dos pacientes chagásico tratados com benzonidazol há pelo menos 10 anos, categorizados em tratados não curados (TNC), tratados em avaliação (TEA) e tratados curados (TC) segundo o critério mais rigoroso (três testes sorológicos negativos) Figura 11 - Distribuição dos pacientes chagásicos tratados e tratados curados (TC) pelo critério cura de três testes sorológicos negativos por faixa etária quando tratados (A) e por tempo pós-tratamento (B) Figura 12 - Resultados das técnicas de hemocultura e PCR realizadas em pacientes chagásicos tratados com benzonidazol há pelo menos 10 anos, residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG. POS= positivo NEG= negativo Figura 13 - Absorbância de soros dos pacientes chagásicos obtidos antes do tratamento (AT 1997), nove anos (PT 2006) e treze anos (PT 2010) póstratamento avaliados pelo teste de ELISA in house (diluição do soro 1:80) Figura 14 - Percentuais de evolução clínica geral (A, B e C) e anual (D, E e F) dos pacientes chagásicos tratados com benzonidazol avaliados nos períodos de , e Figura 15 - Percentuais de positividade da técnica de hemocultura e PCR entre os pacientes chagásicos tratados (CHt) e não tratados (CHnt) residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG Figura 16 - Absorbância dos soros dos pacientes chagásicos antes do tratamento e de seus respectivos controle e treze anos depois avaliados pelo teste de ELISA (A) e estratificados segundo a forma clínica (B) Figura 17 - Percentual de evolução clínica geral e por formas clínicas dos pacientes chagásicos tratados (CHt) e não tratados (CHnt) após 13 anos ( ) XIII

15 Lista de Abreviaturas AT Antes do tratamento BRD Bloqueio de ramo direito BZ Benzonidazol CARD/DIG Forma cardíaca ou digestiva CCC Cardiopatia Chagásica Crônica datp 2 - Desoxinucleotídeo de Adenosina-5 -trifosfato DCh doença de Chagas dctp 2 - Desoxinucleotídeo de Citocina-5 -trifosfato dgtp 2 - Desoxinucleotídeo de Guanina-5 -trifosfato DNA Ácido desoxirribonucléico dntp s 2 - Desoxinucleotídeos-5 -trifosfato DO Densidade Óptica dttp 2 - Desoxinucleotídeo de Timina-5 -trifosfato ECG Eletrocardiograma ELISA Enzime-linked immunosorbent assay FC Forma cardiaca FC-ALTA Anti-live trypomastigotes antibody by flow-cytometry FD Forma digestiva FI Forma indeterminada FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz FM Forma mista HAI Hemaglutinação indireta HC Hemocultura ICT - Índice Cardiotorácico IFI Imunofluorescência indireta IgG Imunoglobulina G kda quilodalton LAFEPE Laboratório Farmacêutico do Estado de Pernambuco LIT Liver infusion triptose LMCo Lise mediada pelo complemento MS Ministério da Saúde XIV

16 Lista de Abreviaturas NFX Nifurtimox OMS Organização Mundial de Saúde PBS Phosphate buffer solution PCR Reação em cadeia da polimerase PPFP Percentual de parasitos fluorescentes positivos PT Pós-tratamento Rec-ELISA ELISA recombinante Rx Raio-X SFB Soro fetal bovino SNA Sistema Nervoso Autônomo TC Tratados curados TEA Tratados em avaliação TNC Tratados não curados UFMG Universidade Federal de Minas Gerais UFOP Universidade Federal de Ouro Preto WHO World Health Organization µl microlitro XV

17 Índice 1 - INTRODUÇÃO Aspectos gerais da infecção pelo Trypanosoma cruzi Aspectos clínicos da infecção pelo Trypanosoma cruzi Diagnóstico da infecção pelo Trypanosoma cruzi Testes sorológicos Tratamento etiológico da infecção pelo Trypanosoma cruzi Critérios de cura na doença de Chagas Doença de Chagas no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos Específicos CASUÍSTICA E MÉTODOS Características da área de estudo População em estudo Avaliação laboratorial Métodos parasitológicos Testes sorológicos convencionais Testes sorológicos alternativos Critério de cura Avaliação Clínica Avaliação Clínica casuística completa Avaliação Clínica casuística parcial Avaliações dos pacientes nove e treze anos após tratamento etiológico Análise Estatística RESULTADOS Avaliação da efetividade terapêutica (casuística completa) Dados epidemiológicos XVI

18 Índice Avaliação laboratorial Idade quando tratado e tempo pós-tratamento versus cura Efetividade terapêutica e evolução clínica (coorte descritiva de pacientes tratados) Avaliação laboratorial Avaliação clínica Estudo de intervenção Avaliação laboratorial Avaliação clínica DISCUSSÃO Avaliação da efetividade terapêutica (casuística completa) Efetividade terapêutica e evolução clínica em parte da casuística: coorte descritiva de pacientes tratados (n=29) Estudo de intervenção: parte da casuística CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS Anexo I Anexo II Anexo III Anexo IV XVII

19 1 - INTRODUÇÃO

20 Introdução 1.1 Aspectos gerais da infecção pelo Trypanosoma cruzi A Tripanossomíase Americana resulta da infecção de várias espécies de mamíferos pelo protozoário Trypanosoma cruzi (CHAGAS, 1909) que pertence à família Trypanosomatidae (ordem Kinetoplastida). O nome doença de Chagas (DCh) para a doença humana homenageia seu descobridor, o médico e cientista brasileiro Carlos Ribeiro Justiniano das Chagas, que entre 1907 e 1909, trabalhava no controle de um surto de malária no município de Lassance, em Minas Gerais, durante a construção da estrada de ferro Central do Brasil. Chagas percebeu que muitas pessoas daquela região apresentavam uma doença até então desconhecida e descobriu seu agente etiológico, o vetor, os reservatórios silvestres descrevendo ainda os efeitos da doença no organismo humano (CHAGAS, 1909; 1911). Já em 1911 ele antecipava as conseqüências sociais da doença e conclamava as autoridades para que considerassem a endemia como um problema do Estado. Após cem anos de sua descoberta, a doença de Chagas ainda constitui um dos sérios problemas de saúde pública da América Latina. A infecção humana apresenta ampla distribuição no continente americano, sendo conhecida a existência de vetores da doença desde o sul dos Estados Unidos até Argentina (MILES et al., 2004). A doença ocorre em toda a América Latina, mas as manifestações clínicas e características epidemiológicas variam de uma região endêmica para outra, assim como as taxas de prevalência, a linhagem do parasita, os vetores e os hospedeiros. Após a implementação de programas de controle em vários países, a Organização Mundial da Saúde (OMS) estima uma prevalência de infecção pelo T. cruzi em 10 milhões de pessoas distribuídas em 21 países (WHO, 2010). A grande importância desta doença está relacionada à sua elevada prevalência e extensa distribuição geográfica, somadas à alta letalidade observada em algumas das formas clínicas da doença (SCHMUÑIS, 1997; UCHÔA et al., 2002). Estimativas do Banco Mundial nos dão uma idéia da importância social das distintas doenças infecciosas na América Latina em termos de anos de vida útil perdidos, colocando a doença de Chagas no quarto lugar, depois das enfermidades respiratórias agudas, das diarréias e da AIDS (WORLD BANK, 1993). 2

21 Introdução Um marco de considerável relevância foi assumido pelos ministros de saúde dos países do Cone Sul (Argentina, Bolívia, Brasil, Chile, Paraguai e Uruguai) reunidos em Brasília, em julho de 1991, onde aprovaram a Iniciativa Internacional de Controle da DCh. Esta iniciativa apresentava como objetivos a eliminação da infestação domiciliar por Triatoma infestans e interrupção de transmissão de T. cruzi por via transfusional (SCHOFIELD & DIAS, 1999; MONCAYO, 1999). Este exemplo foi seguido pelos países do Pacto Andino (Colômbia, Equador, Peru e Venezuela) e da América Central (El Salvador, Guatemala, Honduras e Nicarágua) a partir de 1997 (WHO, 1997; MONCAYO, 1999). A extensão desta iniciativa para outras áreas foi acompanhada de adaptações frente a realidades epidemiológicas locais (MONCAYO, 2003). Vale ressaltar que a Iniciativa dos países do Cone Sul das Américas não deve ser entendida como o marco inicial de todo o controle da DCh na sub-região, pois vários países já tinham um programa de controle antes mesmo da iniciativa. A transmissão da doença de Chagas por vetores domiciliados e/ou transfusão sanguínea foi interrompida no Uruguai em 1997, no Chile em 1999 e no Brasil em No Brasil, 80% da área endêmica está sob vigilância epidemiológica, com taxas de infestação domiciliar por triatomíneos inferior a 5%. Da mesma forma, é observada uma forte redução da infecção entre doadores de sangue (MORAES-SOUZA, 1999; MONCAYO e SILVEIRA, 2009), nos casos de transmissão congênita (GONTIJO et al., 2009) e entre escolares (7-14 anos) como demonstrado pelo nosso grupo em trabalhos realizados nos municípios de Berilo e José Gonçalves de Minas (BORGES et al., 2006) e em outras regiões do país (SILVEIRA & VINHÃES, 1999) Aspectos clínicos da infecção pelo Trypanosoma cruzi Carlos Chagas definiu duas fases evolutivas na doença: aguda e crônica e fez a observação sobre o evidente contraste entre a elevada prevalência de casos crônicos frente à pequena incidência de casos agudos (CHAGAS, 1911). A fase aguda da doença de Chagas compreende os fenômenos clínicos que se estabelecem nos primeiros meses de infecção (dois a quatro) e, do ponto de vista laboratorial, caracteriza-se pela demonstração do parasito no sangue por meio de 3

22 Introdução exame direto (LARANJA, 1953). O sinal de porta de entrada é geralmente uma lesão inflamatória da pele com uma formação cutânea ligeiramente saliente, arredondada, com alguns centímetros de diâmetro, eritematosa, dura, quente e circundada por edema elástico, assemelhando-se a um furúnculo que não chega à supuração, denominada chagoma de inoculação (MAZZA e FREIRE, 1940). Quando a porta de entrada se dá na região ocular, forma-se o sinal de Romaña (ROMAÑA, 1935) caracterizado por edema bipalpebral unilateral, elástico e indolor, de início geralmente brusco e coloração róseo-violácea das pálpebras. Depois que Romaña descreveu o sinal que leva o seu nome, individualizando-o, conceituando-o e realçando seu valor diagnóstico, difundiu-se mais o reconhecimento de casos agudos. A fase aguda da doença é inaparente ou oligossintomática na grande maioria dos casos, com manifestações clínicas diversas tais como: febre, edema, hipertrofia dos linfonodos, hepatomegalia, esplenomegalia e insuficiência cardíaca. Casos graves são, geralmente, associados às crianças menores de dois anos de idade, com quadro de morbi-mortalidade mais intenso, representado por miocardite e meningoencefalite aguda (BRENER, 1992) e morte entre 1 a 45% dos casos (DIAS, 1984). O prognóstico da fase aguda da doença de Chagas depende da idade do paciente, bem como do tipo e da intensidade das manifestações. Após a fase aguda, o indivíduo evolui naturalmente para a fase crônica, caracterizada pela dificuldade de detecção do parasito no sangue periférico, desaparecimento das manifestações clínicas, desaparecimento progressivo de IgM e elevação dos anticorpos específicos da classe IgG. A fase crônica da doença de Chagas é caracterizada pela baixa parasitemia ou parasitemia subpatente e parasitismo tissular escasso, não sendo possível detectar o T. cruzi através de métodos parasitológicos diretos. O diagnóstico é baseado mais usualmente na detecção de anticorpos da classe IgG contra T. cruzi no soro de indivíduos chagásicos principalmente através de métodos sorológicos convencionais, tais como: enzyme linked immunossorbent assay (ELISA), hemaglutinação indireta (HAI) e imunofluorescência indireta (IFI). Esta fase está subdividida em três formas clínicas: indeterminada, cardíaca e digestiva (PRATA, 1990). A maioria dos indivíduos (50-70%) desenvolve a forma indeterminada da doença crônica, caracterizada por um 4

23 Introdução longo período assintomático que pode durar por toda a vida. Entretanto, mesmo após um longo período assintomático, 25% dos indivíduos podem desenvolver a forma cardíaca da doença de Chagas, 6% a forma digestiva e 3% podem sofrer envolvimento do sistema nervoso periférico (COURA 1983, 1985; PEREIRA 1985; MONCAYO, 1999). A maioria dos casos agudos não tratados evolui para a forma clínica indeterminada, assintomática. De acordo com os critérios estabelecidos na I Reunião de Pesquisa Aplicada em doença de Chagas (1984), esta fase é caracterizada pela positividade sorológica e/ou parasitológica para T. cruzi, ausência de sintomas e/ou sinais da moléstia, eletrocardiograma convencional normal e estudos radiológicos do coração, esôfago e cólon normais. Na maioria das vezes, os indivíduos chagásicos portadores desta forma clínica da doença desconhecem a presença da infecção e apresentam bom prognóstico a médio e longo prazo, mas devem ser acompanhados regularmente (MACÊDO, 1997). Embora apresentem bom prognóstico, sabe-se que cerca de 2 5% desses pacientes evoluem anualmente para a forma cardíaca e/ou digestiva (MACÊDO, 1980; MANZULLO et al., 1982; DIAS, 1989; CASTRO et al., 1994). Entretanto, quando exames propedêuticos mais aprimorados, como a monitorização eletrocardiográfica contínua com o sistema Holter, teste ergométrico e ecocardiograma são executados, uma parcela de indivíduos nesta forma da doença apresentará alguma alteração (RASSI et al., 1992; DIAS, 1996). A forma cardíaca, por sua vez, é responsável pela maioria dos óbitos decorrentes da infecção chagásica, sendo considerada a forma clínica mais grave da infecção pelo T. cruzi. Em áreas endêmicas, a maioria dos casos de cardiopatia é atribuída à tripanosomíase. Chagas em 1922, já descrevia a cardiopatia chagásica crônica (CCC) como uma característica especifica da Tripanossomíase Americana. Em colaboração com VILLELA descreveu as alterações cardíacas essenciais e as principais manifestações clínicas desta forma da doença (CHAGAS e VILLELA, 1922). A cardiopatia chagásica crônica é caracterizada, do ponto de vista anatomopatológico, por áreas de fibrose substituindo a massa muscular cardíaca e ocasionando a interrupção das fibras do coração, destruição do sistema nervoso autônomo (SNA) simpático e parassimpático e pela presença de um exsudato 5

24 Introdução inflamatório ativo. A hipertrofia, dilatação e alteração da arquitetura do músculo cardíaco induzem ao aumento do tamanho do coração caracterizado pela cardiomegalia. Em casos avançados de cardiomegalia, fenômenos tromboembólicos e sinais de congestão passiva são os principais achados patológicos. O aneurisma cardíaco apical é um achado freqüente e bastante característico da cardiopatia chagásica crônica (WHO, 2002). Nas fases iniciais da cardiopatia chagásica crônica são detectadas alterações discretas e inespecíficas no ECG. Apesar de não haver um padrão eletrocardiográfico exclusivo da doença de Chagas, algumas alterações eletrocardiográficas têm sido mais associadas à cardiopatia chagásica, como o bloqueio de ramo direito isolado ou associado ao bloqueio da divisão ântero-superior do ramo esquerdo. Embora haja alguma diferença regional, as alterações eletrocardiográficas consideradas como mais freqüentes na cardiopatia chagásica são, em ordem decrescente: extra-sístoles ventriculares isoladas ou repetitivas; alterações primárias da repolarização ventricular, que pode simular cardiopatia isquêmica; zonas eletricamente inativas; bloqueios atrioventriculares; bloqueio de ramo esquerdo por disfunção sinusal e taquiarritmia supraventricular (GASCON et al., 2006; XAVIER et al., 2006). Em casos mais avançados da cardiopatia, tais alterações, além de serem mais graves podem se sobrepor, constituindo um conjunto de anormalidades. Radiografias de tórax são relevantes no manejo dos pacientes nessa forma, pois permitem uma categorização mais precisa através da análise do tamanho do coração e da circulação pulmonar. Em fases mais avançadas da cardiopatia chagásica, observa-se aumento acentuado da silhueta cardíaca, identificado através da observação do cálculo do índice cardiotorácico (ICT). As radiografias que apresentam sinais de hipertensão venocapilar, crescimento de cavidades ou um ICT superior a 0,5 são consideradas alteradas. Na cardiopatia chagásica crônica, a disfunção sistólica global do ventrículo esquerdo apresenta-se como um importante fator prognóstico. Uma classificação para insuficiência cardíaca considerando a função sistólica do ventrículo esquerdo obtida através de ecocardiografia foi adotada para identificação de subgrupos de cardiopatas chagásicos crônicos. Essa normatização colabora para o manejo do paciente em nível prognóstico e terapêutico (Consenso Brasileiro em doença de Chagas, 2005). 6

25 Introdução A partir da criação do Centro de Estudos da Moléstia de Chagas em Bambuí, em 1943, vários pesquisadores se dedicaram a mostrar a importância social da cardiopatia chagásica crônica (CCC). Importantes estudos clínico-epidemiológicos para avaliação da morbidade e a evolução da doença foram realizados no Brasil e em outros países do Cone Sul. Merece destaque o inquérito eletrocardiográfico realizado no Brasil com o objetivo de avaliar a prevalência da CCC, realizado por MACÊDO et al. (1982). Dados preliminares deste estudo permitiram estimar uma prevalência de alterações eletrocardiográficas entre os soropositivos de 37,4%. Foi possível também verificar uma maior prevalência de alterações eletrocardiográficas nos Estados de Minas Gerais, Bahia, Goiás e Piauí. Em outros estados como Rio Grande do Sul, não foram encontradas diferenças entre as freqüências de alterações eletrocardiográficas entre indivíduos chagásicos e não chagásicos. DIAS (1982) reexaminando após 27 anos, pacientes com quadros agudos conhecidos verificou uma associação significativa entre os quadros agudos clinicamente mais graves e a presença de ECG alterados. Entre outros achados, o autor chama a atenção para o caráter precoce e progressivo do bloqueio de ramo direito (BRD), que surge, em média 15 anos após a infecção, mas algumas vezes já está presente depois do primeiro ano da fase aguda. A forma digestiva se expressa por anormalidades esofágicas e intestinais que caracterizam o megaesôfago e o megacólon chagásicos (REZENDE, 1997). As alterações do trato digestivo resultam principalmente do comprometimento do sistema nervoso entérico, em particular do plexo mientérico de Auerbach. As células nervosas desse plexo sofrem fenômenos degenerativos em meio ao processo inflamatório encontrado em suas vizinhanças e seu número se reduz acentuadamente (ANDRADE & ANDRADE, 1966; TAFURI & BRENER, 1967). O mecanismo de destruição neuronal não é bem conhecido, porém admite-se que esteja ligado à imunidade celular (TEIXEIRA et al., 1980; SANTOS & HUDSON, 1981). A desnervação ocorre de maneira irregular e em intensidade variável, em função de fatores ligados ao parasito e ao hospedeiro ainda não completamente elucidados. No caso das formas digestivas, admite-se que a cepa do parasito seja o fator mais importante na gênese das diferenças regionais da DCh (DIAS, 2000). 7

26 Introdução Vale a pena ressaltar que certa proporção de chagásicos crônicos apresenta a forma mista da doença que corresponde à associação da forma cardíaca e digestiva (REZENDE, 1997). Não se admite, atualmente, que exista a forma crônica nervosa da doença devido à ausência de evidências de um substrato anátomo-patológico que a justifique. Esta forma foi admitida naqueles indivíduos que apresentavam manifestações neurológicas diversas e, eventualmente, déficit mental, alterações que foram atribuídas a seqüelas da meningoencefalite da fase aguda (VIEIRA, 1966; QUEIROZ, 1973). HOFF et al. (1978) mostraram que a presença de T. cruzi pode ser detectada no líquido cefalorraquidiano na maioria dos pacientes com a forma aguda da doença de Chagas, mesmo na ausência de sinais clínicos de meningoencefalite. Esta invasão do sistema nervoso pelo T. cruzi pode ser, portanto, muito freqüente e silenciosa, restando saber mais e melhor sobre as suas seqüelas, e se de fato existem Diagnóstico da infecção pelo Trypanosoma cruzi O diagnóstico da infecção pelo T. cruzi deve ser apoiado na epidemiologia e clínica e confirmado, quanto à etiologia, pelo diagnóstico laboratorial. Este oferece importantes subsídios, desde que realizado com técnicas apropriadas, reagentes adequados e seguindo as boas práticas de laboratório. O diagnóstico laboratorial pode ser realizado por meio da busca do parasito ou de anticorpos produzidos contra o parasito. Além disto, os exames são direcionados em função da fase da infecção. Embora o diagnóstico laboratorial seja efetuado habitualmente usando-se sangue venoso, outros líquidos orgânicos podem ser utilizados para a investigação parasitológica durante a fase aguda, ou sorológica, tais como: líquor, urina, líquido pericárdico, etc. Outro suporte muito utilizado para coleta de material orgânico em grandes inquéritos sorológicos é o papel de filtro. Para todo método laboratorial é necessário conhecer sua especificidade e sensibilidade. A especificidade indica a capacidade do teste em detectar a população não infectada. Sendo assim, um teste extremamente específico será capaz de detectar todos os pacientes não infectados. A sensibilidade indica a capacidade do teste em detectar todos os indivíduos infectados. Desta maneira, um teste pouco sensível deixará de detectar alguns indivíduos 8

27 Introdução portadores da infecção. Para melhorar a sensibilidade e especificidade podemos utilizar de algumas estratégias, como empregar mais de um teste, repetir coleta de material, variar os valores de ponto de corte (cut-off), utilizar antígenos recombinantes e peptídeos sintéticos. Para isto, é necessário conhecer o objetivo do diagnóstico laboratorial para que as intervenções e/ou ajustes sejam bem conduzidas. Em relação aos métodos utilizados no diagnóstico da infecção pelo T. cruzi, os parasitológicos são de extrema especificidade (100%), pois o agente etiológico é direta ou indiretamente demonstrado. No entanto, esses testes apresentam baixa sensibilidade na fase crônica. Já os métodos sorológicos apresentam alta sensibilidade (95-100%) com a desvantagem de menor especificidade (92-98%), revelando assim a probabilidade e não a certeza do diagnóstico, já que temos as eventuais reações cruzadas, principalmente com Leishmania. O diagnóstico parasitológico na fase aguda da doença de Chagas é facilmente realizado pela comprovação direta das formas tripomastigotas do T. cruzi em amostras de sangue examinado entre lâmina e lamínula. Devido à grande quantidade de parasitos circulantes nesta fase da doença, podemos utilizar diversos métodos diretos para a observação, tais como: exame a fresco, esfregaço sanguíneo, gota espessa, micro-hematócrito e técnica de concentração de Strout. Na fase crônica, devido à baixa parasitemia, os parasitos podem ser detectados utilizando métodos parasitológicos indiretos, tais como: hemocultura (HC), xenodiagnóstico e reação em cadeia da polimerase (PCR). Estes métodos não estão disponíveis em laboratórios de análises clínicas comuns, pois são métodos extremamente laboriosos, demorados, requerem equipamentos sofisticados e apresentam altos custos, sendo realizados apenas em centros de pesquisas. Apesar de serem extremamente específicos, os métodos parasitológicos apresentam baixa sensibilidade principalmente nos pacientes que se encontram na fase crônica da infecção (CHIARI et al., 1989; GALVÃO et al., 1993). A técnica de hemocultura é utilizada desde a década de 50, com resultados inicialmente inferiores aos obtidos com o xenodiagnóstico (PIFANO, 1954; CHIARI e BRENER, 1966). O interesse em sua utilização foi retomado no Brasil após o trabalho de ALBUQUERQUE et al. (1972), que encontraram positividade de 97,4% em 38 chagásicos na fase crônica, por meio de seis coletas de sangue de cada paciente. 9

28 Introdução Estes resultados estimularam outros pesquisadores como MOURÃO & MELLO (1975) que encontraram positividade de 45% e CHIARI & DIAS (1975) que encontraram positividade de 43,7%. O sucesso alcançado foi devido a modificações na técnica, como a retirada de plasma contendo anticorpos, coleta de maior volume (30mL) e o processamento a 4 C (CHIARI et al., 1989; LUZ et al., 1994). Vários autores têm demonstrado também que quando a hemocultura é repetida duas ou três vezes no mesmo paciente, coletas seriadas, os resultados em termos de positividade aumentam de maneira considerável (CHIARI et al., 1989; LUZ et al., 1994; CASTRO et al., 2002). O xenodiagnóstico foi descrito inicialmente por BRUMPT em 1914, sofrendo modificações sucessivas visando otimizar os resultados (SCHENONE et al., 1968; CERISOLA et al., 1974). Consiste basicamente na alimentação de ninfas do triatomíneo, livres de infecção, com sangue do paciente. Caso o parasito esteja presente, o mesmo multiplicará no tubo digestivo do triatomíneo sendo eliminado nas fezes e urina das ninfas examinadas 30 e 60 dias após o repasto sanguíneo. Pode ser natural, quando os triatomíneos são alimentados diretamente na pele do paciente, ou artificial, quando os triatomíneos são alimentados com o sangue coletado do paciente, mantido com anticoagulante até o momento do repasto. O xenodiagnóstico artificial tem sido cada vez mais empregado, com resultados equiparáveis ou melhores que o xenodiagnóstico natural (SANTOS et al., 1995; PINEDA et al., 1998; SILVA et al., 1998), sendo muito utilizado em caso de pacientes hospitalizados (onde não podemos entrar com triatomíneos), no caso em que indivíduos hiperalérgicos apresentem reações adversas e/ou recusa por parte dos mesmos. A positividade do xenodiagnóstico em pacientes chagásicos tem apresentado cifras em torno de 13 até 58.5%, com exame único, e depende da região, da quantidade de ninfas utilizadas e da espécie do triatomíneo aplicado (CERISOLA et al., 1974; BORGES e COURA, 1987). Outros autores têm demonstrado que quando este exame tem sido repetido, empregando uma série de aplicações, a taxa de positividade aumenta consideravelmente (COURA et al., 1991; CASTRO et al., 1993). Os trabalhos pioneiros utilizando o princípio de replicação de um fragmento do DNA foram introduzidos por SAIKI et al. (1985), MULLIS et al. (1986) e MULLIS & FALOONA, Nos anos 90, a técnica de PCR foi introduzida como método de 10

29 Introdução diagnóstico devido à sua grande capacidade em detectar quantidades ínfimas de DNA (MOSER et al., 1989; ÁVILA et al., 1991, 1993; RUSSOMANDO et al., 1992; BRITTO et al., 1993; WINCKER et al. 1994; GOMES et al., 1998; CAMPOS et al., 2002). A aplicação da hibridização para detecção de DNA, amplificado pela PCR no sangue, tem demonstrado aumento na sensibilidade da técnica (SILBER et al., 1997; GOMES et al., 1998). O seu emprego como diagnóstico alternativo tem contribuído, por exemplo, na elucidação de casos com sorologia convencional discordante e controle pós-terapêutico (BRITTO et al., 1995; SILVEIRA et al. 2000, SOLARI et al. 2001, GALVÃO et al. 2003; SCHIJMAN et al., 2003; ZULANTAY et al., 2004; BRITTO, 2009). Atualmente, a técnica de PCR tem sido recomendada como complementar para o diagnóstico da infecção pelo T. cruzi devido à sua maior sensibilidade em relação aos métodos parasitológicos convencionais (MS, 2005). Assim como os métodos parasitológicos indiretos, xenodiagnóstico e hemocultura, os resultados obtidos pela técnica de PCR são bastante variáveis. Estudos realizados por diferentes autores têm demonstrado variações de 45 a 100% na sensibilidade da PCR em sangue de pacientes chagásicos crônicos quando comparados aos testes sorológicos (ÁVILA et al., 1993; WINCKER et al., 1994; GOMES et al., 1998). Essas diferenças parecem depender dos iniciadores utilizados, do volume de sangue coletado, da origem geográfica dos indivíduos estudados, da faixa etária, dos níveis parasitêmicos, do método de extração de DNA utilizado e também de características genéticas das cepas do parasito (CASTRO et al., 2002). Recentemente foi realizado um Workshop & Simposium em Buenos Aires, Argentina, patrocinado pela WHO-TDR e com a presença de diversos pesquisadores da América Latina e Europa, com o objetivo de padronizar e validar o uso da reação em cadeia da polimerase para detecção da infecção pelo Trypanosoma cruzi em amostra de sangue (TDR/WHO, 2008, SCHIJMAN et al., 2011). O diagnóstico na fase crônica da DCh é realizado freqüentemente após suspeita clínica e/ou evidências epidemiológicas e confirmado pela presença de anticorpos anti- Trypanosoma cruzi presentes no soro. Estes anticorpos podem ser detectados por técnicas da sorologia convencional, como ELISA, HAI e IFI, e por técnicas de sorologia não convencional como lise mediada pelo complemento (LMCo), reação de 11

30 Introdução imunofluorescência por citometria de fluxo (FC-ALTA) pesquisando os anticorpos análogos ao anticorpos líticos e denominados anticorpos anti-tripomastigota vivo (MATINS-FILHO et al., 1995). Nos dias atuais, a maioria dos pacientes se encontra na fase crônica da infecção, onde a parasitemia é muito baixa, sendo assim os métodos sorológicos são os de primeira escolha para o diagnóstico da infecção pelo T. cruzi, sendo os mais econômicos, rápidos e eficazes. Mesmo na ausência do agente etiológico, após tratamento, os anticorpos específicos se encontram em concentrações elevadas durante vários meses ou anos em função do tempo de infecção do paciente. Por outro lado, temos a existência de reações cruzadas, pelas quais um estímulo antigênico similar, embora não idêntico, pode gerar anticorpos que sejam detectados por diferentes métodos utilizados proporcionando assim resultados falsos positivos. Esta situação pode ser observada em infecções concomitantes ou exclusivas com parasitos similares antigenicamente, como são as leishmanias e outros tripanosomatídeos. Diante do exposto, podemos perceber que embora a sorologia seja o método de escolha para o diagnóstico laboratorial, ela apresenta algumas limitações, inerentes à sua própria natureza. Para assegurar o melhor desempenho dos testes sorológicos, a WHO (1991) preconiza a utilização de duas técnicas sorológicas de princípios diferentes para estabelecer o diagnóstico da infecção por T. cruzi Testes sorológicos ENGVALL & PERLMANN (1972) foram os responsáveis pela introdução do ensaio de ELISA como testes imunoenzimáticos para a detecção de anticorpos, cabendo a VOLLER et al. (1975) a sua aplicação e padronização para o diagnóstico da infecção pelo T. cruzi. Segundo CAMARGO (1987), uma das vantagens do ELISA é a de que o resultado é expressão da capacidade de ligação dos anticorpos de uma forma direta, e não por titulação como a obtida por hemaglutinação e imunofluorescência indireta que pesquisam em até que diluição a reação é observada. A intensidade de cor 12

31 Introdução revelada através da leitura em espectrofotômetro indica a concentração de anticorpos existentes na amostra de soro avaliada. O desempenho de diferentes conjuntos diagnósticos existentes no mercado para o teste imunoenzimático foi objeto de avaliação, obtendo-se sensibilidade de 97,7 a 100% e especificidade de 93,3 a 100% (ASTORGA et al., 1990; OELEMANN et al., 1998; CABALLERO et al., 2007). O antígeno mais utilizado na sensibilização de placas é proveniente de extrato bruto de formas epimastigotas de cepa Y (mantidas em meio LIT), porém outros antígenos recombinantes, peptídeos sintéticos e antígenos semi-purificados estão sendo empregados atualmente revelando bons resultados de sensibilidade e especificidade (MENDES et al., 1997; UMEZAWA et al., 1999; FERREIRA et al., 2001; SILVEIRA et al., 2001; UMEZAWA et al., 2004) O teste de IFI é utilizado universalmente para o diagnóstico sorológico de diversas doenças infecciosas desde Permite, com o auxílio de microscópio com luz ultravioleta e o conjugado de anticorpo anti-igg humano com isotiocianato de fluoresceína para as diferentes doenças, com variação apenas do antígeno a ser utilizado (FIFE & MUSCHEL, 1959). Este teste foi estabelecido para o diagnóstico da doença de Chagas a partir dos trabalhos de padronização da técnica realizados por CAMARGO (1966). A IFI requer maior número de passos que o teste de HAI, assim como mais reagentes, aumentando as possibilidades de erros técnicos. A leitura é subjetiva, como no teste de HAI, sendo extremamente importante o equipamento de leitura, que deve estar bem ajustado. A grande vantagem é a extrema sensibilidade que o teste apresenta, proporcionando assim a visualização de títulos elevados de anticorpos nos soros da população infectada. O teste de HAI foi introduzido para o diagnóstico da doença de Chagas em 1962 (CERISOLA et al., 1962) e tem sido amplamente utilizado na América Latina (KNIERIM et al., 1966; NEAL et al., 1970). No Brasil foi padronizado por CAMARGO et al. (1971) e sua ampla utilização se deve à facilidade de execução, rapidez de leitura (1 a 2h) e de não necessitar de equipamentos adicionais. Outra vantagem deste teste é a sua simplicidade de execução, que consiste em dois passos: a diluição dos soros e a introdução do antígeno, o que contribui para evitar erros técnicos. Existem múltiplas 13

32 Introdução variedades descritas de HAI, utilizando hemácias de diferentes espécies (humana, de aves, de carneiro, etc), assim como métodos de sensibilização e origem dos antígenos. No Brasil, o antígeno que tem sido comumente empregado é feito com a cepa Y, enquanto que na Argentina, com a cepa Tulahuen. Outra vantagem deste teste é a sua simplicidade de execução. Este teste aproxima-se do ideal devido à facilidade de execução, mas apresenta como limitação a sensibilidade, algo menor que a dos outros testes, motivo pelo qual sempre deve ser acompanhado de uma segunda prova, de maior sensibilidade, como o teste IFI ou ELISA. Alguns trabalhos demonstram a dualidade de anticorpos em pacientes chagásicos crônicos infectados por T. cruzi (KRETTLI & BRENER, 1976; 1982). Os soros desses pacientes reconhecem epítopos de tripomastigotas vivos, sendo estes anticorpos protetores, denominados também de anticorpos funcionais ou líticos. Eles são identificados pelo teste de lise mediada pelo complemento (LMCo) que simula o mecanismo de resposta imune humoral fundamental no controle da parasitemia no indivíduo chagásico crônico. Os outros anticorpos não são protetores, não aderem aos epítopos da membrana dos tripomastigotas vivos, sendo somente detectados pela sorologia convencional. Com estas peculiaridades, foi possível estabelecer um critério de cura para animais ou pacientes baseado na pesquisa de anticorpos líticos pelo teste de LMCo (KRETTLI & BRENER, 1982). O teste de LMCo consiste em incubar tripomastigotas do T. cruzi vivos (sanguíneos obtidos de animais imunossuprimidos ou de cultura celular) com o soroteste diluído e soro fresco humano normal como fonte de complemento. A suspensão dos tripomastigotas e diluída a 1:2 e 1:4, e o número de parasitas móveis é contado em câmara de Neubauer ao microscópio na objetiva de 40X. Testes com lises promovidas pelo complemento maiores que em 20% dos parasitos são considerados como positivos. Esta modalidade de teste contribui ainda para o diagnóstico sorológico em casos de sorologia discordante e no controle de cura pós-terapêutica específica. Entretanto as dificuldades oriundas do teste, tais como a manipulação de tripomastigotas vivo, a utilização de Complemento, a dificuldade de sua leitura feita em câmara de Neubauer e a dificuldade de sua reprodutibilidade impediram a utilização 14

33 Introdução generalizada e rotineira deste método como ferramenta para o diagnóstico e controle de cura. MARTINS-FILHO et al., (1995) introduziram a imunofluorescência indireta através da citometria de fluxo na tentativa de substituir a LMCo principalmente devido ao fato da LMCo ser uma técnica muito trabalhosa, que oferece risco ao operador e de leitura subjetiva. A citometria de fluxo é menos trabalhosa, apresenta maior sensibilidade, praticidade e maior segurança na leitura, além de não necessitar da adição de Complemento para a execução da técnica. Esta técnica foi em seguida validada em relação à técnica de LMCo em um estudo duplo-cego com 94 amostras de soro codificadas de pacientes chagásicos não tratados, tratados em diferentes fases da DCh (aguda, subaguda e crônica) classificados como tratados curados, tratados não curados e tratados sob avaliação. Os resultados obtidos mostraram alta sensibilidade para detecção de anticorpos anti-tripomastigota vivo pela citometria de fluxo (MARTINS-FILHO et al., 2002), confirmando os dados de MARTINS-FILHO et al. (1995) que sugerem o uso desta técnica principalmente no monitoramento da eficácia do tratamento. A citometria de fluxo é uma técnica de análise automatizada através da qual uma única partícula pode ser caracterizada física e bioquimicamente em meio líquido. A caracterização inclui tamanho, granulosidade (ou complexidade interna) e intensidade da fluorescência. Todos esses parâmetros podem ser detectados simultaneamente, medidos, armazenados e analisados no computador sendo visualizados na forma de um fluorograma. Esse método apresenta uma grande versatilidade, uma vez que permite o desenvolvimento de estudos que empregam tanto formas tripomastigotas vivas quanto formas epimastigotas fixadas (CORDEIRO et al., 2001; VITELLI-AVELAR, 2007). A introdução da citometria de fluxo como um método sensível para a detecção de anticorpos trouxe uma nova perspectiva não só para os estudos da doença de Chagas (CORDEIRO, 2000), mas também para os estudos de diversas doenças parasitárias como leishmaniose (ROCHA, 2005), babesiose (BITTAR, 2002), erliquiose canina (MOREIRA, 2005) e doenças causadas por vírus (MARTINS, 2004; SILVA, 2005). Atualmente a citometria de fluxo tem sido muito utilizada na determinação da relação das células CD4+/CD8+ em pacientes HIV positivos. 15

34 Introdução Tratamento etiológico da infecção pelo Trypanosoma cruzi Pouco progresso tem sido obtido no tratamento das pessoas infectadas pelo T. cruzi embora a incidência de novas infecções tenha diminuído em todo o continente Sul Americano (URBINA, 2001, MONCAYO, 2003). Apesar do grande esforço das autoridades sanitárias em conter a transmissão da doença de Chagas por via vetorial (com o uso de inseticidas de ação residual, que promoveram uma drástica diminuição na densidade triatomínica) e por via transfusional (DIAS, 1994), existe ainda um grande número de indivíduos infectados, principalmente na América Latina, que necessitam de diagnóstico, manejo clínico adequado e eventualmente tratamento etiológico (LUQUETTI, 1997; BLANCO et al., 2000). O tratamento etiológico da doença de Chagas já ultrapassou a fase experimental e a sua aplicação clínica permitiu ao médico diante do paciente com doença de Chagas, assumir uma nova atitude, abandonando a prática de mero espectador de um fenômeno sabidamente conhecido, a evolução natural da doença, para tentar modificar esta evolução mediante o uso de um quimioterápico ativo (CANÇADO, 1997). No entanto, o problema ainda não está resolvido. Existem sérias dificuldades a vencer, a começar pela alta toxicidade dos medicamentos ativos e a incerteza ainda reinante na apreciação do grau de eficiência terapêutica na fase crônica da doença. Os primeiros compostos empregados para o tratamento da doença de Chagas não apresentaram resultados efetivos contra o parasito, como os compostos de arsênico, tártaro emético e cloreto de mercúrio, empregados experimentalmente por MAYER & ROCHA LIMA (1912,1914). A primeira tentativa de tratamento etiológico em humano foi realizada por SALVADOR MAZZA (1937) utilizando um derivado quinolínico (Bayer 7602). Outros compostos como os derivados de bismuto (STEIN, 1933) e bisquinaldinas (JENSCH, 1937) foram testados em camundongos, mas não apresentaram efeitos tripanosomicida. Após a Segunda Guerra Mundial ( ), uma série de drogas foi testada em animais e em pacientes chagásicos, tais como alguns antimaláricos, arsenobenzólicos, iodeto de sódio, violeta genciana, anti-histamínicos, anfotericina B, 16

35 Introdução vários antibióticos e alguns nitrofuranos (BRENER, 1968; CANÇADO, 1968), mas nenhum composto se revelou eficaz. BRENER (1968) realizou uma avaliação experimental criteriosa de várias drogas in vivo e in vitro contra T. cruzi, registrando 27 compostos e mais de 30 antibióticos (ensaiados entre 1912 e 1962) que foram inativos. Dentre os compostos, alguns apresentavam um efeito supressor na parasitemia e na letalidade da doença, mas não proporcionavam cura parasitológica. Segundo BRENER (1984), os requisitos mais importantes para uma droga ideal para a quimioterapia da DCh são: capacidade para induzir cura parasitológica em ambas as fases (aguda e crônica) da doença, atividade oral em dose única ou em poucas doses, ausência de efeitos colaterais significantes, viável para tratamento ambulatorial com monitoramento mínimo e baixa probabilidade de desenvolvimento de parasitas resistentes. Atualmente apenas duas classes de compostos apresentam eficácia comprovada na quimioterapia da doença de Chagas: nitrofuranos e nitroimidazólicos. Em 1972, o laboratório Bayer anunciou a síntese de um nitrofurano (1,1-dioxido da tetraidro-3-metil-4[(5-nitrofurfurilideno)amino]-2h-1,4-tiazina) conhecido como nifurtimox. O mecanismo de ação do nifurtimox é mediado por radicais livres que são gerados pela droga, tais como ânions superóxidos e peróxidos de hidrogênio (DOCAMPO & STOPPANI, 1979). Este medicamento foi amplamente utilizado no tratamento da infecção pelo T. cruzi proporcionando bons resultados principalmente quando administrado na fase aguda da infecção (BLANCO et al., 2000; BAHIA- OLIVEIRA et al., 2000; SCHIJMAN et al., 2003). Os trabalhos pioneiros de GRUNBERG et al. (1968) demonstraram a atividade quimioterápica contra o T. cruzi do derivado 2-nitroimidazólico (N-benzil-2-nitro-1- imidazolacetamida) conhecido como benzonidazol. Este fármaco, produzido a princípio pela Hoffman La Roche sob a denominação de Rochagan, foi introduzido na Argentina e no Brasil em 1978, sendo atualmente o único fármaco disponível no Brasil para o tratamento da infecção pelo T. cruzi. O mecanismo de ação do benzonidazol consiste na diminuição da síntese de proteínas, redução de incorporação dos precursores de RNA e diminuição da incorporação de timidina em DNA, resultando assim em uma diminuição na biossíntese de macromoléculas (POLAK & RICHLE, 17

36 Introdução 1978). Este composto tem sido empregado no tratamento específico de pacientes chagásicos na fase aguda, promovendo curas parasitológicas de 50-70% (BRENER et al., 1993). Resultados significativamente inferiores são encontrados na fase crônica da doença. Ambos os fármacos apresentados estão longe de ser o medicamento ideal devido aos efeitos colaterais observados em alguns pacientes, tais como anorexia, vômito, dermatite por hipersensibilidade, polineuropatia periférica e depressão da medula óssea. O tratamento da doença de Chagas humana com o Benzonidazol (BZ) e o Nifurtimox (NFX) fornece resultados distintos tanto na fase aguda como crônica, principalmente em indivíduos chagásicos de áreas geográficas distintas. Um dos fatores que contribui para este fato é a cepa do parasito (FILARDI & BRENER, 1987). Geralmente cepas do Rio Grande do Sul, Argentina e Chile apresentam elevada susceptibilidade à droga (COURA & CASTRO, 2002). É sabido que nestas regiões, há um predomínio de T. cruzi II (TIBAYRENC & AYALA, 1988), especialmente do clone maior 32 ou T. cruzi 2b (BRISSE et al, 2000) ou T. cruzi II (Satellite Meeting, 2009), que se mostrou mais sensível a drogas tanto in vitro (REVOLLO et al., 1998) quanto in vivo (TOLEDO et al., 2003). Embora haja divergência quanto às percentagens de cura no tratamento etiológico da doença de Chagas, há consenso sobre a sua utilidade salvo em condições onde é contra-indicado tais como na gestação, insuficiência hepática e renal grave e em idosos. A comprovação de cura, especialmente na fase crônica, depende de fatores como o tempo de seguimento e os exames laboratoriais utilizados. Nos últimos anos, uma grande variedade de drogas tem sido investigada com o propósito de desenvolver uma quimioterapia segura, eficaz e específica para DCh. Estudos recentes levando em conta aspectos bioquímicos básicos do T. cruzi têm permitido a identificação de novos alvos para a quimioterapia que inclui inibidores da síntese de purinas (Allopurinol), inibidores da síntese de ergosterol (cetoconazol, itraconazol, miconazol, fluconazol, econazol, etc.) e outros derivados azólicos (ravuconazol, albaconazol, pozaconazol, fexinidazol, etc) (BAHIA et al., 2005). 18

37 Introdução Segundo o Consenso Brasileiro (2005), na fase aguda o tratamento deve ser realizado em todos os casos e o mais rápido possível após confirmação diagnóstica, independentemente da via de transmissão (oral, congênita, transfusional ou acidental). Vale ressaltar ainda que a doença de Chagas aguda é de notificação compulsória.tanto o BZ como o NFX, apresentam alta eficácia na fase aguda da infecção, revelando índices de cura que variam de 40% a 76% (ANDRADE et al. 1992; BAHIA-OLIVEIRA et al. 2000; CANÇADO, 2002, SHIKANAI YASUDA, 1990). De acordo com CANÇADO (2002), a negativação da sorologia nesta fase da infecção, ocorre entre 11 a 12 meses em 50% dos indivíduos chagásicos e que 14 meses póstratamento todos os indivíduos chagásicos já são soronegativos. BAHIA-OLIVEIRA et al. (2000) avaliando 25 indivíduos tratados na fase aguda da infecção, seguidos clinicamente por anos, encontraram 40% de cura e 28% de pacientes dissociados. Não foi observado nenhum sintoma clinico nem alteração cardíaca no grupo considerado curado e apenas dois pacientes considerados dissociados apresentaram alterações cardíacas leves enquanto 50% dos pacientes não curados apresentaram alterações cardíacas mais graves. Os autores sugerem também neste estudo que a persistência de células T reconhecendo antígenos de T. cruzi não seria suficiente para desencadear patologias cardíacas, reforçando assim a hipótese que a presença do parasita pode ser essencial para o desenvolvimento de miocardiopatia chagásica. Esses dados reforçam mais ainda a importância do diagnóstico precoce e do tratamento etiológico nesta fase da infecção. Na doença de Chagas congênita, o tratamento precoce do recém-nascido com BZ ou NFX tem eficácia terapêutica que varia de 66% a 100% dos casos (RUSSOMANDO et al., 1998; BLANCO et al., 2000; SCHIJMAN et al., 2003). Na última década, verificou-se que o BZ e o NFX têm apresentado altas taxas de cura que variam de 62% a 87% em infecções crônicas recentes tanto no Brasil como em outros países (ANDRADE et al., 1996; ANDRADE et al., 2004; SOSA-ESTANI, 1998; SILVEIRA et al., 2000; STREIGER et al. 2004). A maior limitação ao uso das drogas tripanosomicidas é a baixa atividade antiparasitária na fase crônica tardia da doença, especialmente no Brasil (COURA e CASTRO, 2002; GUEDES et al. 2006) cujas razões ainda não são bem conhecidas. Os 19

38 Introdução índices de cura alcançados pelos diversos autores variam de 0% a 19.1% (FERREIRA, 1990; VIOTTI et al., 1994; SUASNÁBAR et al., 2000; LAURIA-PIRES et al., 2000; BRAGA et al., 2000; GALLERANO & SOSA, 2001; BRITTO et al. 2001; CANÇADO, 2002; FABBRO et al., 2007; FERNANDES et al., 2009). Por outro lado tem sido verificado por alguns autores que indivíduos chagásicos tratados na fase crônica da infecção, embora não parasitologicamente curados, apresentam uma redução significativa no surgimento de alterações eletrocardiográficas (SUASNÁBAR et al., 2000; VIOTTI et al., 1994; ZULANTAY et al., 2005) e evolução clínica mais lenta (SEGURA et al., 1994, VIOTTI et al., 2006, SOSA-ESTANI & SEGURA, 2006) com reversão da fibrose em modelo murino (ANDRADE et al. 1991). Outros trabalhos vêm demonstrando o efeito benéfico do tratamento etiológico da doença de Chagas, proporcionando assim cura parasitológica ou retardo na evolução da doença (FRAGATA-FILHO et al., 1995; COURA et al., 1997; FABRO et al., 2000; LANA et al., 2009). Embora haja divergências quanto às percentagens de cura no tratamento etiológico da doença de Chagas há certo consenso sobre a sua utilidade em certas circunstâncias, tais como: fase da doença, idade do paciente e condições associadas. A comprovação de cura, especialmente na fase crônica, depende de fatores como o tempo de seguimento e os exames utilizados. Por estas razões, o Consenso Brasileiro em doença de Chagas recomenda o tratamento a todo paciente soropositivo que se encontra na fase aguda, infecção congênita e fase crônica recente. Nos casos de fase crônica tardia ou de maior duração, o tratamento está indicado na forma indeterminada e nas formas cardíacas e digestivas leves. O tratamento está indicado também em casos de transplantes, infecção acidental e em pacientes imunodeprimidos caso haja reativação Critérios de cura na doença de Chagas Para avaliar a resposta à quimioterapia específica da DCh duas categorias de testes laboratoriais estão disponíveis, incluindo métodos parasitológicos e testes sorológicos. Os métodos parasitológicos são baseados na demonstração do parasita 20

39 Introdução por hemocultura, xenodiagnóstico, inoculação em animais de laboratório ou métodos moleculares (PCR). Os testes sorológicos avaliam a presença de anticorpos específicos detectados por métodos imunológicos e são divididos em sorológicos convencionais (ELISA, HAI e IFI) e não convencionais (LMCo e FC-ALTA). Os anticorpos líticos podem mediar à lise das formas tripomastigotas do T. cruzi, além de neutralizar estas formas evolutivas, impedindo assim, a infecção de novas células (KRETTLI & BRENER, 1976; 1982). Além disso, também são responsáveis pela citotoxicidade celular dependente de anticorpo, visto que apenas anticorpos líticos são capazes de mediar esta resposta (LIMA-MARTINS et al., 1985). Estes achados sugerem um papel protetor para estas imunoglobulinas na resistência do hospedeiro contra o T. cruzi (KRETTLI & BRENER, 1982). Esta hipótese foi corroborada em um estudo mais recente, desenvolvido por CORDEIRO et al. (2001), no qual os níveis destes anticorpos eram maiores nos pacientes que apresentavam a forma indeterminada, sendo baixos nos indivíduos portadores da forma cardíaca. Os anticorpos da sorologia convencional não apresentam esta função protetora (KRETTLI & BRENER, 1982), sendo amplamente utilizados para o diagnóstico sorológico da infecção pelo T. cruzi. A detecção destes anticorpos após tratamento etiológico gera discordâncias sobre a efetividade do tratamento. Isso ocorre porque o critério de cura atualmente estabelecido refere que a cura só é confirmada após negativação sorológica, porém a sorologia convencional pode permanecer reagente até mesmo por décadas pós-tratamento (CANÇADO, 1999; MS, 2005). A definição de cura em doença de Chagas é polêmica. Segundo CANÇADO (1963), o indivíduo curado deve necessariamente apresentar testes sorológicos convencionais e parasitológicos persistentemente negativos. Já KRETTLI & BRENER (1982) consideram que a ausência de anticorpos líticos no soro de pacientes tratados é indicativa de cura, mesmo na presença de testes sorológicos convencionais positivos (GALVÃO et al., 1993). O controle de cura desde o início preconizou a utilização da hemocultura e xenodiagnóstico como métodos parasitológicos de primeira escolha. Hoje, além destes métodos temos métodos parasitológicos moleculares (PCR) que muito tem contribuído no monitoramento pós-terapêutico de pacientes chagásicos (RUSSOMANDO et 21

40 Introdução al.,1998; SILVEIRA et al., 2000; SOLARI et al., 2001; BRITTO et al., 2001; GALVÃO et al., 2003). A persistência da positividade da sorologia na grande maioria dos pacientes tratados na fase crônica tem levado alguns autores a considerá-la como memória imunológica com a manutenção de anticorpos na ausência do T. cruzi. ANDRADE et al. (1988) demonstraram através de imunoeletromicroscopia que antígenos parasitários retidos nas células dendríticas do baço podem ser responsáveis por esta memória imunológica, sendo assim capaz de manter o organismo em processo de estimulação antigênica constante. Várias outras hipóteses são aventadas para explicar o porquê da permanência dos títulos positivos da sorologia convencional por longos anos, sendo descrita a possibilidade da existência de reações cruzadas entre antígenos do T. cruzi e moléculas do hospedeiro. Células cardíacas, células do endotélio cardíaco, células neuronais, neurônios do cerebelo, neurônios cerebrais e laminina; todos podem apresentar reação cruzada com Ags de T. cruzi (ANDRADE et al., 1991; BRENER, 1992). ANDRADE et al. (1991) demonstraram a presença de antígenos parasitários presentes nas células dendríticas de camundongos e que outros microorganismos (bactérias, protozoários) intestinais ou pulmonares induzem sorologia convencional positiva (GAZZINELLI et al., 1993). No entanto, considerando a abordagem precedente, o critério de cura para a quimioterapia da DCh ainda está em discussão e é motivo de muitas controvérsias. A positividade dos métodos parasitológicos (hemocultura e xenodiagnóstico) indica persistência de parasitas circulantes e permanência da infecção, caracterizando assim a falha terapêutica. Estes métodos são laboriosos, consomem muito tempo, proporcionam desconforto ao paciente e apresentam baixa sensibilidade quando comparados com os dados de PCR que detecta pequenas quantidades de DNA do T. cruzi presente em amostra de sangue. Sendo assim a PCR vem sendo utilizada para detectar precocemente falha terapêutica em vários estudos (SILVEIRA et al. 2000, SOLARI et al. 2001, BRITTO et al., 2001; GALVÃO et al. 2003), necessitando entretanto de maiores estudos prospectivos para elucidarem seu real papel como critério de cura (BRITTO, 2009) 22

41 Introdução Segundo CANÇADO (2002) e de acordo com o Consenso Brasileiro em doença de Chagas (2005), a negativação da sorologia convencional tem sido considerado o único método tradutor de cura associado também a métodos parasitológicos persistentemente negativos. Não fica claro em nenhuma destas publicações quais testes da sorologia convencional devem ser utilizados (ELISA + IFI ou ELISA + HAI ou IFI + HAI) o que torna controverso a interpretação dos resultados de diferentes estudos Doença de Chagas no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG. Os primeiros trabalhos de combate à doença de Chagas no Vale do Jequitinhonha, no qual o município de Berilo está inserido, foram realizados em 1960 pelo Departamento Nacional de Endemias Rurais (DENERu). No inquérito sorológico nacional ( ), o município de Berilo apresentou uma prevalência para a infecção pelo T. cruzi de 35,5% (CAMARGO, 1984) confirmada em inquérito sorológico posterior coordenado por DIAS et al., (1985). No levantamento triatomínico realizado em 1982, constatou-se um índice de infestação das unidades domiciliares de 6% e um índice de infecção dos triatomíneos pelo T. cruzi de 10%. Neste momento, a principal espécie vetora capturada foi Panstrongylus megistus seguida de Triatoma infestans, Triatoma sordida, Panstrongylus geniculatus, Triatoma vitticeps e Triatoma pseudomaculata. AGUILAR (1988) avaliando os aspectos relacionados à morbidade da doença de Chagas em um grupo de pacientes chagásicos e não chagásicos residente no município revelou que a mortalidade entre os soropositivos era de 1,9% ao ano, a letalidade da cardiopatia era de 2,6% ao ano, a morte súbita foi mais freqüente do que a morte por insuficiência cardíaca e constatou uma taxa de evolução progressiva de 2,8% ao ano nos pacientes chagásicos. Um inquérito sorológico realizado entre janeiro e julho de 1997 revelou prevalência geral para a infecção pelo T. cruzi de 18%, sendo de 50% entre os maiores de 30 anos. A percentagem de soropositividade entre os menores de 10 anos examinados foi de 0,17%, sugerindo que a transmissão vetorial estava controlada nesta área (MONTOYA et al., 2003). Em outro estudo pareado entre soropositivos e 23

42 Introdução soronegativos para a infecção pelo T. cruzi, uma prevalência de alterações eletrocardiográficas de 55,7% entre os pacientes com DCh e 13,7% nos indivíduos do grupo controle, demonstrando assim a alta prevalência de cardiopatia entre os indivíduos com a infecção pelo T. cruzi (MONTOYA, 1998). Com o intuito de avaliar a vigilância epidemiológica implantada no município em 1997, BORGES et al. (2006) realizaram um estudo amostral em escolares de 7 14 anos residentes no município (área rural e urbana) onde foi encontrado seis escolares soropositivos, revelando uma prevalência de 0.4%. Com estes resultados os autores concluíram que a transmissão vetorial estava interrompida neste município ou caso aconteça esteja ocorrendo em níveis baixíssimos. Oito anos após a implantação da vigilância epidemiológica foi realizada uma pesquisa integral no município buscando avaliar o impacto do programa de controle instalado desde Neste estudo, unidades domiciliares e anexos foram vistoriados e 391 triatomíneos (280 Panstrongylus megistus e 111 Triatoma pseudomaculata) capturados. Nenhum exemplar de triatomíneo apresentava infecção por T. cruzi. Naquele momento, foram avaliados os índices entomológicos que demonstraram resultados condizentes com a fase de vigilância epidemiológica no qual o município se encontrava (MACHADO-DE-ASSIS et al. 2009). Foi constatada também pela primeira vez no Estado de Minas Gerais a domiciliação pela espécie T. pseudomaculata, o que demonstra a importância que esta espécie vetorial vem adquirindo na região e indica a necessidade de atualização e aperfeiçoamento da vigilância epidemiológica (MACHADO-DE-ASSIS et al., 2007). LANA et al. (2009) avaliando clínica e laboratorialmente 28 indivíduos tratados com BZ há nove anos, residentes no município de Berilo constataram utilizando testes sorológicos convencionais, não convencionais e parasitológicos que os indivíduos não obtiveram cura parasitológica. No entanto verificou-se também que os indivíduos tratados na forma indeterminada da doença apresentaram uma evolução clínica mais lenta quando comparados com aqueles que apresentavam alguma alteração cardíaca ou digestiva inicialmente, o que sugere que o tratamento da fase crônica da doença traz benefícios para o paciente, pelo menos quando este é tratado na fase crônica 24

43 Introdução assintomática conforme recomendação do Consenso Brasileiro (2005) sobre o tratamento etiológico da doença. Ao longo dos últimos nove anos de trabalho de nossa equipe no referido município foram detectados cerca de 800 pacientes com o diagnóstico confirmado para a infecção pelo T. cruzi. Muitos destes pacientes foram tratados etiologicamente nos últimos anos por diversos médicos que trabalharam no município. Boa parte deles nunca foi reavaliada, em nenhum outro momento, levando em consideração os métodos específicos relacionados ao monitoramento de cura parasitológica e os aspectos envolvendo a evolução clínica da doença. 25

44 Justificativa Diante da existência de um grande número de pacientes chagásicos residentes no município de Berilo, tratados etiologicamente com benzonidazol e nunca avaliados pós-tratamento com os métodos atuais preconizados para o monitoramento de cura parasitológica e/ou efetividade terapêutica, este trabalho se justifica ao realizar avaliações laboratoriais e clínicas em pacientes tratados com benzonidazol há mais de 10 anos, no sentido de verificar a efetividade terapêutica e aspectos clínicos por eles apresentados. Outra abordagem deste projeto foi avaliar em parte da casuística estudada a evolução dos aspectos laboratoriais (testes sorológicos e parasitológicos) e clínicos dos pacientes chagásicos tratados comparados aos respectivos controles não tratados. 26

45 2 - OBJETIVOS

46 Objetivos 2.1 Objetivo geral Avaliar a efetividade terapêutica e a evolução clínica dos pacientes chagásicos tratados com benzonidazol e não tratados residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, através do desenvolvimento de três estudos epidemiológicos. 2.2 Objetivos Específicos Avaliar por métodos laboratoriais a efetividade terapêutica empregando: - Testes sorológicos convencionais (ELISA, IFI e HAI) isolados e em associações, - Testes sorológicos alternativos (rec-elisa e FC-ALTA) isolados e em associações, - Métodos parasitológicos (hemocultura e PCR), Avaliar e comparar a evolução dos parâmetros laboratoriais e clínicos em diferentes períodos pós-tratamento (antes do tratamento, nove e treze anos póstratamento) Comparar os dados laboratoriais e clínicos dos pacientes chagásicos tratados com benzonidazol e não tratados após 13 anos. 28

47 Delineamento dos Estudos Estudo Descritivo 29

48 Delineamento dos Estudos Estudo Longitudinal 30

49 Delineamento dos Estudos Estudo de Intervenção 31

50 3 - CASUÍSTICA E MÉTODOS

51 Casuística e Métodos 3.1 Características da área de estudo O município de Berilo está situado no Estado de Minas Gerais, na mesorregião do Vale do Jequitinhonha a uma distância de 660 quilômetros de Belo Horizonte (Figura 1). Está inserido no domínio do cerrado a 16 o S e 42 o W e uma altitude de 401m. Com uma área territorial de 581,5 km 2 e uma população de aproximadamente habitantes, destes 23,4% estão na área urbana e 76,6% na área rural, distribuídos em um distrito (Lelivéldia) e 35 comunidades (IBGE, 2007). Apresentando topografia bastante acidentada, sendo constituído por vales estreitos e regiões bastante onduladas, onde os níveis altimétricos variam de 400 a 800m. Limitase com os municípios de José Gonçalves de Minas, Francisco Badaró, Virgem da Lapa, Chapada do Norte, Cristália e Grão Mogol. O clima é tropical, megatérmico e sub-úmido do tipo seco, com uma temperatura média anual de 24ºC. O volume anual de chuvas é normalmente inferior às taxas de demanda ambiental de água. A estação chuvosa é curta e muito concentrada em alguns poucos meses, o que provoca prolongados períodos de seca. A vegetação é composta de cerrados, capoeiras e chapadas, tendo ao norte plantações de eucaliptos. A principal atividade econômica de Berilo é a agricultura familiar de subsistência, não dispõe de nenhum beneficiamento ou processamento de matéria-prima, necessitando, portanto, de ser abastecido de produtos industrializados. O clima é desfavorável para a agricultura e pecuária em propriedades rurais que na sua imensa maioria são pequenas (menores que 100 hectares). A falta de investimento e apoio aos pequenos proprietários não garante a subsistência da população, acarretando uma migração sazonal intensa (SILVA et al. 1990). 33

52 Casuística e Métodos Figura 1 - Divisão das mesorregiões e localização do município de Berilo no Estado de Minas Gerais. 3.2 População em estudo A primeira parte deste trabalho constitui um estudo descritivo de 94 pacientes chagásicos tratados com BZ há pelo menos 10 anos, residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, avaliados quanto à efetividade terapêutica e classificados segundo a forma clínica. Todos os indivíduos foram submetidos ao tratamento etiológico utilizando o benzonidazol (Rochagan ) seguindo todas as recomendações preconizadas pelo Ministério da Saúde. Durante o tratamento os indivíduos foram acompanhados pelos médicos locais e/ou médicos lotados na regional de saúde de Diamantina e Teófilo Otoni. A confirmação do tratamento foi realizada consultando os prontuários médicos (arquivados no posto de saúde municipal) e em entrevista com os próprios indivíduos. Foram excluídos da casuística os indivíduos que não comprovaram o tratamento através de receituários e/ou anotações consistentes nos prontuários médicos, aqueles que não realizaram o tratamento completo (mínimo de 50 dias de tratamento) e outros que não completaram a avaliação clínica e laboratorial proposta neste estudo. A segunda parte deste trabalho constitui um estudo longitudinal (coorte descritiva de pacientes tratados) de um grupo de pacientes (n=29) incluídos nos 94 acima mencionados, diagnosticados, tratados e acompanhados pelo Dr. Roberto Montoya durante a sua permanência no referido município quando ainda realizava sua tese de doutorado vinculado ao programa de pós-graduação do Instituto Oswaldo Cruz, 34

53 Casuística e Métodos FIOCRUZ, RJ. Estes pacientes foram submetidos a exames laboratoriais e clínicos antes do tratamento o que permitiu avaliá-los quanto à evolução laboratorial e clínica em estudos realizados por nosso grupo de pesquisa em 2006 (nove anos póstratamento) e agora no presente estudo (13 anos pós-tratamento). A terceira parte deste trabalho constitui um estudo de intervenção onde os 29 pacientes tratados com BZ, mencionados no estudo anterior, foram pareados por sexo, idade, forma clínica e procedência. Este pareamento foi realizado utilizando pacientes diagnosticados na mesma época e não tratados, sendo, portanto um estudo pareado retrospectivo. Todos os participantes dos três estudos foram informados sobre os objetivos do projeto e confirmaram sua participação assinando o termo de consentimento livre e esclarecido, processo 07/2002 (Anexo I) aprovado pelo Conselho de Ética em Pesquisa em seres humanos do Instituto René Rachou, FIOCRUZ, Belo Horizonte, MG. 3.3 Avaliação laboratorial A participação dos voluntários neste estudo consistiu na doação de sangue venoso coletado através do sistema a vácuo (vacuntainer, BD) para a realização dos testes sorológicos e exames parasitológicos. Um volume de 40mL de sangue foi coletado de cada paciente, sendo 30mL de sangue heparinizado para a técnica de hemocultura, 5mL de sangue sem anticoagulante para PCR e 5mL para obtenção de soro utilizado nas avaliações sorológicas convencionais (ELISA, IFI e HAI,) e não convencionais ou alternativas (anticorpos anti-tripomastigotas vivos por citometria de fluxo (FC-ALTA) e ELISA recombinante (rec-elisa). Para obtenção do soro as amostras foram centrifugadas a 3.000rpm por 10 minutos e o sobrenadante coletado e armazenado em tubos eppendorf. Estes tubos foram imediatamente conservados a temperatura de -20 o C e encaminhados ao laboratório de doença de Chagas da Universidade Federal de Ouro Preto onde foram realizadas as diversas metodologias. Durante o período do estudo foram feitas duas coletas de sangue venoso (2007 e 2010) em cada indivíduo para a realização de todas avaliações propostas. 35

54 Casuística e Métodos Métodos parasitológicos Hemocultura A técnica de hemocultura foi realizada segundo CHIARI et al., (1989) com algumas modificações. A técnica consistiu na obtenção de um volume de 30 ml de sangue/60 kg peso corporal do paciente, coletado em tubo estéril contendo heparina (Vacuntainer BD) e processado em câmara asséptica. O processamento do sangue foi realizado imediatamente após coleta, fazendo-se inicialmente uma centrifugação a rpm por 10 minutos. Em seguida, o plasma foi desprezado e a camada de célula foi lavada com igual volume de meio LIT. Após nova centrifugação, nas mesmas condições anteriores, o meio de cultura (LIT) foi desprezado e a camada de leucócitos foi retirada cuidadosamente e transferida para um tubo falcon de 15mL contendo 3mL de meio LIT. A papa de hemácia foi distribuída em 2 tubos falcon de 15mL contendo 5mL de meio LIT. Os tubos de cultura foram incubados em estufa B.O.D a 28 o C, homogeneizados a cada 2 dias e uma gota do sedimento foi analisada ao microscópio óptico, objetiva de 40X, após 30, 60, 90 e 120 dias à procura de formas evolutivas de T. cruzi. O resultado da técnica de hemocultura levou em consideração o resultado obtido nas duas coletas realizadas, sendo considerado positivo quando a presença de T. cruzi foi verificada em qualquer uma das coletas e negativo quando em ambas as coletas não se constataram a presença de T. cruzi Reação em cadeia da polimerase (PCR) Para a realização da técnica foram obtidos 5mL de sangue total de cada indivíduo. O sangue foi coletado em tubo estéril sem anticoagulante (Vacuntainer BD) e rapidamente adicionado a um igual volume de solução de cloridrato de guanidina (Guanidina-HCl) 6M/ácido etilenodietildinitritotetracético (EDTA) 0,2M/pH= 8,0 como descrito por ÁVILA et al., (1991). As amostras foram mantidas à temperatura ambiente durante sete dias e em seguida fervida a 100 C durante 15 minutos para a clivagem do DNA (BRITTO et al., 1993). Uma alíquota de 200 µl do lisado foi submetida à extração 36

55 Casuística e Métodos do DNA utilizando o kit Wizard Genomic DNA Purification kit (Cat #A1125 Lot #262870) Promega seguindo todas as recomendações do fabricante. A PCR foi processada de acordo com o protocolo de GOMES et al., (1998) modificada. A mistura reacional foi preparada contendo 10mM cloridrato de hidroximetilaminometano (Tris-HCl)/pH 9,0, 0,1% de Triton X-100 (Tampão PCR 10x, Invitrogen São Paulo, SP, Brasil), 75mM de cloreto de potássio (KCl - Tampão PCR 10x, Invitrogen, São Paulo, SP, Brasil), 3,5mM cloreto de magnésio (MgCl2 Invitrogen, São Paulo, SP, Brasil), 0,2mM de cada desoxinucleotídeo (datp, dctp, dgtp, dttp Sigma, St. Louis, MO, EUA ), 0,5U de Taq Platinum DNA polimerase (Invitrogen, São Paulo, SP, Brasil), 10pmoles de cada iniciador #121 (AAATAATGTACGGGTGAGATGCATGA) e #122 (GGTTCGATTGGGGTTGGTGTAATATA) (Invitrogen, São Paulo, SP, Brasil) descritos por STURM et al. (1989) e modificado por WINCKER et al. (1994). A reação de PCR foi realizada com 9,0µL da mistura reacional + 2,0µL da solução de DNA extraído do sangue totalizando um volume final de 11µL. A amplificação foi processada em um termociclador PTC-150 (MJ Research, Ramsey, MA, EUA) nas seguintes condições: uma etapa inicial de desnaturação do DNA a 95 C por 5min, seguida de 35 ciclos de amplificação constituído de um passo de desnaturação a 95ºC por 1min, um de anelamento a 65 C por 1min e um de extensão a 72 C por 1 minuto finalizando com uma etapa de extensão a 72ºC por 10min. O DNA amplificado foi visualizado por eletroforese em gel de poliacrilamida a 6% e revelado utilizando a coloração pela prata (SANTOS et al., 1993). Controles positivos, negativos e de reagentes foram incluídos em cada um dos ensaios realizados. Todas as amostras com resultados negativos foram reavaliadas utilizando os primers PCO3 (ACA CAA ACT GTG TTC ACT AGC) e PCO4 (CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC) da beta-globina humana como controle da amplificação da reação. 37

56 Casuística e Métodos Testes sorológicos convencionais ELISA (enzime-linked immunosorbent assay) A reação de ELISA foi realizada segundo a metodologia padronizada em nosso Laboratório de Doença de Chagas do NUPEB/UFOP (ELISA in-house), empregando antígeno proveniente de formas epimastigotas da cepa Y do T. cruzi mantidas em meio LIT. Os flagelados foram isolados na fase exponencial de crescimento, tratados com solução de NaOH 0,15M, em banho de gelo por 18 horas e o ph neutralizado com HCl 0,15M (VÍTOR & CHIARI, 1987). O antígeno obtido foi dosado pelo método de LOWRY (1951) e depois conservado em congelador a -20ºC até o uso. O teste de ELISA foi realizado segundo a metodologia de VOLLER et al. (1975) com amostras dos soros na diluição correspondente a 1:80, antígeno na concentração de 2,5µg/mL e conjugado anti-igg humana (Sigma, St. Louis, MO, EUA), marcado com peroxidase na diluição 1:7.500 conforme padronização prévia. Para a realização da reação foram utilizadas microplacas de poliestireno de 96 poços de fundo chato, sensibilizadas com 100µL/poço de antígeno diluído em tampão carbonato ph 9,6 e incubadas over-night em geladeira. Após a incubação, o excesso de solução antigênica foi desprezado e as placas lavadas quatro vezes com solução de lavagem (PBS-Tween 0,05%). Em seguida, as placas foram bloqueadas com 100µL/poços de PBS com soro fetal bovino (SFB) e incubadas em estufa por 30 minutos a 37ºC. Na seqüência as placas foram novamente lavadas quatro vezes com solução de lavagem. Na etapa subseqüente, as placas foram incubadas com 100µL/poços de soro diluído 1:80 durante 45 minutos a 37ºC. Em seguida as placas foram lavadas quatro vezes com solução de lavagem e incubadas por mais 45 minutos a 37ºC com 100µL/poços do conjugado anti-igg humano e diluído em PBS-Tween 0,05%. Após incubação as placas foram lavadas novamente quatro vezes. A seguir foi adicionado às placas, 100µL/poços de solução de substrato (3mg de Orto-fenileno-diamino [OPD] + 3µL de H 2 O 2 vol ml de tampão citrato-fosfato). Estas placas foram incubadas a 37ºC por 15 minutos. A reação foi interrompida com a adição de 32µL/poços de H 2 SO 4 2,5M. 38

57 Casuística e Métodos A leitura da reação foi realizada em leitor de ELISA (Bio-Rad Model 680 microplate manager 5.2.1) com filtro de 490nm. O ponto de corte (cut-off) foi determinado utilizando a média das absorbâncias de 10 soros padrões não reativos + 2 desvios padrão. A região considerada de zona cinza foi determinada e compreende o valor do cut-off ± 10%. O indivíduo que apresentava absorbância acima do cut-off +10% foi considerado positivo e abaixo do cut-off 10% foi considerado negativo. O cut-off foi determinado para cada placa conforme descrição previamente e todas as amostras testadas em duplicata, sendo o valor final da absorbância a média da leitura das duplicatas Reação de imunofluorescência indireta (IFI) A reação foi realizada empregando antígeno de T. cruzi obtido por cultivo em meio LIT, sob a forma de epimastigota, produzido pela biolab-mérieux (IMUNOCRUZI ). Para a realização da reação foram utilizadas lâminas de microscopia para fluorescência contendo 12 poços que foram sensibilizados com 10µL/círculo de suspensão antigênica. A secagem das lâminas foi feita à temperatura ambiente. Depois foram colocados nas lâminas 20µL de soro de cada paciente na diluição 1:40. Em seguida as lâminas foram incubadas em câmara úmida a 37ºC por 30 minutos. A seguir as lâminas foram lavadas duas vezes com tampão PBS, cinco minutos cada, por imersão e uma vez com água destilada e posteriormente secada a 37ºC por 5 minutos. Em seguida foram adicionados 20µL do conjugado anti-igg humano marcado com fluoresceína (FLUOLINE G ) na diluição de 1:100. As lâminas foram incubadas a 37ºC por 30 minutos, depois foram lavadas duas vezes com tampão PBS e uma vez com água destilada e, em seguida secadas a 37ºC por 5 minutos. As lâminas foram montadas com glicerina tamponada e lamínulas, e a leitura foi realizada ao microscópio de imunofluorescência. Foram consideradas positivas as amostras de soro que apresentaram fluorescência na diluição igual ou superior a 1:40. Em cada lâmina foi adicionado um controle positivo e um negativo. 39

58 Casuística e Métodos Reação de hemaglutinação indireta (HAI) Esta reação foi realizada utilizando o Kit Hemacruzi (biomérieux) e seguindo rigorosamente as recomendações do fabricante. Resumidamente, a reação consiste na diluição das amostras de soro em diluente apropriado (PBS 0,01 M ph 7,2) utilizando placas de poliestireno de 96 poços com fundo em U. Em seguida, os soros diluídos foram transferidos para uma placa de fundo em V e adicionado o antígeno, constituído de hemácias de carneiro sensibilizadas com antígeno de T. cruzi. A seguir as placas foram mantidas em repouso à temperatura ambiente por uma hora até realização da leitura. Todas as amostras foram testadas na diluição 1:20 e as amostras positivas e duvidosas nesta diluição foram testadas novamente na diluição de 1:40. Quando a amostra apresentava um resultado positivo ou duvidoso da diluição 1:20 e positivo na diluição 1:40 era considerada reativa. E quando apresentava resultado negativo na diluição 1:40 era considerada não reativa. A leitura é visual e foi feita de acordo com a imagem obtida em cada poço comparando-se com os soros controles reativos e não reativos. Quando foi visualizada imagem puntiforme sedimentada no fundo do poço de dimensão menor que o soro controle, a reação foi considerada não reativa. Quando foi observada a formação de um tapete de hemácias de dimensão igual ou superior ao soro controle não-reativo, a reação foi considerada reativa Testes sorológicos alternativos ELISA recombinante O teste ELISA recombinante foi realizado utilizando o kit comercial Chagastest- Wienner (ELISA recombinant v.3.0). Os soros dos pacientes foram diluídos com PBS- Tween 20 (0,05%) + 1% de soro fetal bovina na proporção de 1:20. Em seguida 200µL de cada amostra diluída foi adicionado à placa contendo os antígenos de T. cruzi fixados. As placas foram incubadas a 37 C por 30 minutos. Na seqüência foram lavadas e incubadas novamente a 37 C por 25 minutos com 50µL/poço do anti-igg humano conjugado com peroxidase na diluição de 1: Após lavagens sucessivas foi adicionado às placas 100µL/poço de solução reveladora e as mesmas incubadas a 40

59 Casuística e Métodos 25 C por 25 minutos. Em seguida foi adicionado às placas 50µL/weel de solução para finalizar a reação (stopper) e as mesmas foram lidas em espectrofotômetro (Bio-rad, Model 680) à 450nm. Controles positivos e negativos foram incluídos em paralelo. O valor do cut-off foi calculado utilizando a média das absorbâncias dos controles negativos mais 0,3 DO, A zona cinza ou de indeterminação foi definida como sendo aquela que compreende o valor do cut-off ±10% Reação de imunofluorescência indireta por citometria de fluxo (FC-ALTA) A pesquisa de anticorpos anti-tripomastigotas vivos por meio da citometria de fluxo foi realizada em amostras de soro segundo a metodologia de MARTINS-FILHO et al., (1995) adaptada para microplacas por Cordeiro et al., (2001). Como antígeno foi utilizado à cepa CL do T. cruzi, mantida no Laboratório de Biomarcadores de Diagnóstico e Monitoração (LBDM/CPqRR/FIOCRUZ). As formas tripomastigotas de cultura de tecido foram obtidas a partir do sobrenadante de culturas de células LLC- MK2 infectadas com T. cruzi da cepa CL. Os parasitos foram separados por centrifugação diferencial. Para a obtenção da massa de parasitos, a suspensão de células foi centrifugada a temperatura ambiente, 200rpm por 10 min. Posteriormente, os tubos foram mantidos a 33ºC por 30 minutos para que as formas flageladas pudessem se deslocar do sedimento para o sobrenadante. O sobrenadante foi coletado e centrifugado a 4ºC, rpm por 10 minutos. Os parasitos foram lavados em PBS- 10% SBF, três vezes, por centrifugação nas condições anteriores. As preparações de tripomastigotas apresentando contaminação com formas amastigotas superior a 5% foram descartadas. A suspensão de parasitos foi então quantificada em câmara de Neubauer e ajustada para o ensaio de imunofluorescência por citometria de fluxo na concentração de 5 x 10 6 parasitos/ml. Em placas de 96 poços com fundo em U, 50µL do soro diluído em PBS-3% SFB (1:128 / 1:256 e 1:512) foram incubados a 37ºC por 30 minutos e ao abrigo de luz, na presença de 50µL da suspensão de parasitos (5 x 10 5 parasitas/ml/poço). Após a incubação, os parasitos foram lavados duas vezes com PBS-3% SFB, por centrifugação (2.200rpm, 10mim, 18ºC) e o sobrenadante desprezado. Para análise de 41

60 Casuística e Métodos IgG total, os parasitos foram novamente incubados (na mesma condição anterior) na presença de 50µL de anticorpo anti-igg humano marcado com isotiocianato de fluoresceína FITC (Sigma) diluídos em PBS-3% SFB. Os parasitos foram novamente lavados duas vezes com PBS-3% SBF (2.200rpm, 10mim, 18ºC) e o sobrenadante desprezado. Após a incubação os parasitos foram novamente lavados duas vezes e fixados com 200µL de solução fixadora para citometria - MFF (Para 10mL; 5mL de Paraformaldeído 20X e 5mL de Cacodilato 20X e o ph ajustado para 7,2). As amostras foram mantidas durante pelo menos 30 minutos, a 4ºC e ao abrigo de luz até o momento da leitura no citômetro de fluxo (FACScan-Becton Dickson, San Jose, CA, EUA), empregando-se o software Cell Quest. As leituras das amostras foram realizadas num período máximo de 24 horas após a fixação dos parasitos. Para cada ensaio de imunofluorescência por citometria de fluxo foi feito um controle interno da reação (controle do conjugado) onde os parasitos foram incubados na ausência de soro humano, porém na presença de anticorpo secundário, para monitorar ligações inespecíficas. Em todos os testes foram incluídas amostras controles de soros positivo e negativo para a doença de Chagas. As amostras de soro foram consideradas negativas quanto a porcentagem de parasitos fluorescentes positivos (PPFP) foi menor que 20% e positivas, quando a PPFP foi maior que 20%. 3.4 Critério de cura Para avaliar a efetividade terapêutica aplicou-se o critério clássico de cura (soronegativação de dois testes sorológicos convencionais) e um critério mais rigoroso que preconiza a soronegativação dos três testes da sorologia convencional (ELISA, IFI e HAI). Com os critérios estabelecidos acima foi possível classificar os pacientes em tratados não curados (TNC), tratados em avaliação (TEA) e tratados curados (TC). Em seguida os grupos categorizados pela sorologia convencional foram analisados frente aos resultados da sorologia alternativa (rec-elisa e FC-ALTA), HC e PCR. Os pacientes que apresentaram hemocultura positiva foram considerados como apresentadores de falha terapêutica ou tratados não curados (TNC), 42

61 Casuística e Métodos independentemente de outros resultados. Os pacientes que apresentaram dois ou três testes sorológicos convencionais e hemocultura negativos foram considerados tratados curados (TC) segundo os critérios anteriormente mencionados e aqueles que apresentaram resultados sorológicos discordantes foram considerados tratados em avaliação (TEA). 3.5 Avaliação Clínica Avaliação Clínica casuística completa Na primeira parte deste estudo adotou-se a classificação clínica preconizada pelo Consenso Brasileiro em doença de Chagas (forma indeterminada, forma cardíaca, forma digestiva e forma mista), sendo os pacientes classificados segundo a forma clínica apresentada em A classificação da forma clínica da doença de Chagas apresentada pelos pacientes em estudo foi realizada de maneira independente e cega (triplo cego) por três pesquisadores distintos, com larga experiência no assunto, após análise sistemática do eletrocardiograma basal, da radiografia do tórax e do estudo radiológico contrastado do esôfago e do intestino. A forma clínica foi determinada pela concordância entre dois observadores. Na análise do esôfago e cólon foram adotados critérios descritos por REZENDE, Avaliação Clínica casuística parcial Este critério foi utilizado para classificar os pacientes que compõem a segunda e terceira parte deste trabalho. Nesta avaliação clínica foram seguidos os mesmos Protocolos utilizados pelo pesquisador Roberto Montoya em seu trabalho em campo, antes de iniciar o tratamento específico dos pacientes selecionados para estudo, em Os dados desse Protocolo foram comparados com as avaliações clínicas realizadas nove e treze anos pós-tratamento pela equipe médica do nosso Grupo de Pesquisa. A avaliação dos pacientes foi feita mediante cuidadoso preenchimento de ficha clínico-epidemiológica 43

62 Casuística e Métodos (Anexo II) na qual constam anamnese, exame físico, laudo de radiografia do tórax em PA e laudo de eletrocardiograma de repouso (ECG). A definição do estado funcional cardíaco baseou-se em informações clínicas contidas no Protocolo utilizado por MONTOYA et al. (1998) utilizando-se como referência os critérios preconizados pela New York Heart Association (NYHA) (Anexo III) Estudo eletrocardiográfico O estudo eletrocardiográfico dos pacientes foi realizado mediante obtenção de dois traçados eletrocardiográficos em repouso, com registro das doze derivações clássicas. Os traçados eletrocardiográficos foram avaliados segundo critérios propostos por MAGUIRE et al. (1983), adaptando-se a terminologia e a classificação das arritmias para os critérios atualmente aceitos e reconhecidos pela Sociedade Brasileira de Cardiologia (PASTORE et al., 2009). A normalidade do registro eletrocardiográfico foi definida de acordo com os critérios de MAGUIRE et al. (1983) e as recomendações constantes nesta última diretriz. Os resultados foram utilizados para classificar os indivíduos antes do tratamento e nas avaliações de nove e treze anos pós-tratamento. Foram consideradas mais sugestivas de cardiopatia chagásica crônica as seguintes alterações eletrocardiográficas: (1) bloqueios atrioventriculares (BAV), (2) bloqueio completo do ramo direito (BCRD), (3) bloqueio da divisão ântero-superior do ramo esquerdo (BDAS), (4) extrassístoles ventriculares complexas (EVC) e (5) zonas eletricamente inativas (ZEI) Grau de comprometimento miocárdico O grau de comprometimento miocárdico foi estabelecido com base em critérios clínicos e eletrocardiográficos segundo classificação adotada por peritos da OMS/OPS (OMS/OPS, 1974), na qual foram definidos os seguintes graus: 44

63 Casuística e Métodos Grau I: infecção chagásica sem indicações clínicas, radiológicas e eletrocardiográficas de lesão cardíaca. Grau II: infecção chagásica com sintomatologia cardíaca moderada ou nula, radiologia normal ou indicação de hipertrofia cardíaca leve com alterações eletrocardiográficas do tipo extrassístoles ventriculares, bloqueio incompleto ou completo do ramo direito do feixe de Hiss, bloqueio atrioventricular (exceto BAVT), bloqueio incompleto ou completo do ramo esquerdo do feixe de His e alterações da repolarização ventricular; Grau III: infecção chagásica com sintomatologia evidente, hipertrofia cardíaca moderada e alterações eletrocardiográficas do tipo bloqueio completo do ramo direito do feixe de His com desvio do eixo elétrico para a esquerda; zonas eletricamente inativas; bloqueio atrioventricular total (BAVT), fibrilação ou flutter atriais; Grau IV: infecção chagásica com sintomatologia muito pronunciada, com insuficiência cardíaca. O estudo radiológico revela cardiomegalia extrema e o eletrocardiograma indica alterações graves e múltiplas (arritmias complexas e graves ou extensas zonas eletricamente inativas) Estudo radiológico do tórax Em todos os pacientes foi realizado RX do tórax com medição sistemática do índice cardiotorácico (ICT) para determinar a presença e o grau de cardiomegalia. (KABALA & WILDE, 1987). O índice cárdiotorácico é definido como o quociente entre a medida do maior diâmetro transverso cardíaco e a medida do maior diâmetro transverso torácico. Tendo por base esse índice, foi considerada cardiomegalia grau I quando o ICT se situava entre 0,5 e 0,6; grau II quando o ICT estava entre 0,6 e 0,7; grau III para as maiores de 0,7. Em pacientes que apresentaram alguma sintomatologia digestiva foi realizado radiografia de tórax oblíqua anterior direita contrastada com sulfato de bário para determinar o grau de alteração esofágica de acordo a metodologia de REZENDE et al. (1960) conforme descrito resumidamente abaixo: Grupo I: Esôfago de calibre aparentemente normal ao exame radiológico, trânsito lento e pequena retenção de contraste; 45

64 Casuística e Métodos Grupo II: Esôfagos com pequeno a moderado aumento de calibre, apreciável retenção de contraste. Observam-se com freqüência ondas terciárias, associadas ou não à hipertonia do esôfago inferior; Grupo III: Esôfagos com grande aumento de calibre, hipotonia do esôfago inferior, atividade contrátil reduzida ou inaparente e grande retenção de contraste; Grupo IV: Dolicomegaesôfagos. Esôfagos com grande capacidade de retenção, atônicos, alongados, dobrando-se sobre a cúpula diafragmática Classificação das formas clínicas Os pacientes foram classificados pelos clínicos responsáveis nas seguintes formas clínicas: indeterminada, cardíaca, digestiva e mista. Os pacientes que apresentaram forma cardíaca foram classificados em cardíaca leve (Graus I e II), moderada (Grau III) e grave (Grau IV). A forma digestiva foi classificada em grupo I, II, III e IV, seguindo os critérios de REZENDE et al. (1960), descritos acima Avaliações dos pacientes nove e treze anos após tratamento etiológico Os aspectos evolutivos da doença de Chagas nos pacientes avaliados nove e treze anos após tratamento etiológico foram analisados segundo critérios utilizados por COURA et al., (1985) e BORGES-PEREIRA et al., (1985). Segundo esses autores, considera-se: a) Inalterada: ausência de mudança da forma clínica ou grau de comprometimento cardíaco e/ou esofágico. b) Progressiva: mudança da forma clínica de menor para maior nível de gravidade ou mudança de comprometimento cardíaco e/ou esofágico de um grau inferior para outro superior. c) Regressiva: mudança da forma clínica de maior para menor nível de gravidade ou mudança de comprometimento cardíaco e/ou esofágico de um grau superior para um grau inferior. 46

65 Casuística e Métodos d) Para o óbito: através de informações obtidas através do cartório ou de familiares, buscaram-se as causas e tipos de morte. 3.6 Análise Estatística Todas as análises foram realizadas no programa estatístico Prism 5 for Windows (versão 5.01) com nível de significância de 0,05. O teste não paramétrico do qui-quadrado (χ 2 ) foi utilizado para comparar as proporções de positividade da técnica de hemocultura e PCR entre o grupo tratado e não tratado e os percentuais de pacientes categorizados como TNC, TEA e TC segundo o critério clássico de cura, critério mais rigoroso e as associações de dois testes da sorologia convencional O teste exato de Fisher s foi empregado para avaliar as proporções de evolução clínica geral e por formas clínicas nos diferentes períodos em análise ( ). Esse teste foi aplicado também na avaliação da proporção das diversas formas clínicas encontradas nos grupos categorizados pela sorologia convencional e na avaliação da evolução clínica geral e por forma clínica entre os pacientes tratados e não tratados O teste Kruskal-Wallis foi empregado para a análise da absorbância dos soros dos pacientes coletados antes do tratamento (AT-1997), nove (PT-2006) e treze anos pós-tratamento (PT-2010). O teste de Wilcoxon foi utilizado para comparar a reatividade dos soros dos pacientes chagásicos tratados e não tratados, antes do tratamento e treze anos póstratamento específico para a doença de Chagas. 47

66 4 - RESULTADOS

67 Resultados 4.1 Avaliação da efetividade terapêutica (casuística completa) Dados epidemiológicos A amostra em estudo foi constituída de 94 indivíduos que foram tratados com BZ há pelo menos 10 anos. Quanto ao gênero, 57,4% (54/94) era composta pelo sexo feminino e 42,6% (40/94) pelo masculino. A idade antes do tratamento variou de 2 a 60 anos, sendo a média de 32,9 anos e o desvio padrão de 10,9 anos. A faixa etária de anos compreendeu 71,2% (67/94) da amostra estudada (Figura 2). O tempo póstratamento variou de 10 a 36 anos, sendo a média igual a 16,8 anos e desvio padrão 6,9 anos. Mais da metade da amostra (59,6%) apresentou tempo pós-tratamento entre anos (Figura 2). Todos os pacientes realizaram o tratamento completo com benzonidazol seguindo as recomendações médicas. Efeitos colaterais leves foram constatados em 32,9% (31/94) dos pacientes, mas em nenhum caso houve necessidade de interrupção do tratamento. A avaliação epidemiológica revelou que 59,6% (56/94) dos pacientes estudados são agricultores, dos quais 23,4% (22/94) são analfabetos e 55,3% (52/94) têm o primeiro grau incompleto. Quanto à moradia, 91,5 % (86/94) dos pacientes nasceram em casas construídas com adobe. O reconhecimento dos triatomíneos foi confirmado por 92,6% (87/94) dos pacientes e as espécies P. megistus e T. pseudomaculata foram as mais reconhecidas. Apenas quatro pacientes desta casuística já doaram sangue e outros quatro já receberam doação em algum momento. Durante a entrevista, 80,9% (76/94) dos pacientes relataram a existência de algum parente com doença de Chagas e 40,4% (38/94) revelaram casos de morte súbita no grupo familiar. 49

68 Resultados Figura 2 - Distribuição dos pacientes chagásicos tratados com benzonidazol, há mais de 10 anos, residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, segundo a idade antes do tratamento e tempo pós-tratamento Avaliação laboratorial Sorologia convencional A avaliação sorológica dos pacientes tratados pelo teste de ELISA convencional revelou que 75,5% (71/94) deles permanecem com sorologia positiva, 12,8% (12/94) resultados na zona cinza de reatividade (cut-off ± 10%) e 11,7% (11/94) foram negativos (Figura 3). Dentre os pacientes positivos, 23,4% apresentaram alta reatividade (IR>2) e 52,1% baixa reatividade (1,2 IR 2). O teste de imunofluorescência indireta revelou que 68,1% (64/94) dos pacientes foram positivos e 31,9% (30/94) negativos (Figura 3). O teste de hemaglutinação indireta constatou que 88,3% (83/94) dos pacientes foram positivos e 11,7% (11/94) negativos (Figura 3). 50

69 Resultados Figura 3 - Reatividade na sorologia convencional (ELISA, IFI e HAI) dos 94 pacientes chagásicos tratados com benzonidazol há mais de 10 anos, residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG Associação dos testes da sorologia convencional Considerando como critério de cura a associação de resultados de dois ou três testes da sorologia convencional negativos foi possível agrupar os pacientes em tratados não curados (TNC), tratados em avaliação (TEA) e tratados curados (TC) (Tabela 1). A percentagem de TNC, TEA e TC levando em consideração as associações de ELISA + IFI, ELISA + HAI e IFI + HAI foram similares (p > 0,05) e o percentual de TC variou de 8,5 a 10,6% (Tabela 1). Se o resultado da associação de quaisquer dois testes sorológico for considerado as percentagens de TNC, TEA e TC foram de 78,5%, 8.5% e 12,8% respectivamente. Os resultados encontrados com a 51

70 Resultados associação de quaisquer dois testes da sorologia convencional apresentaram diferenças significativas (p < 0.05) entre as associações de ELISA + IFI e IFI + HAI e resultados similares (p > 0,05) com a associação de ELISA + HAI (Tabela 1). Tabela I - Distribuição dos pacientes chagásicos tratados há mais de 10 anos residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, segundo o critério clássico de cura (dois testes sorológicos negativos) ou o critério de três testes sorológicos negativos. REATIVIDADE SOROLÓGICA GRUPOS Categorias Critério clássico dois testes Três testes Dois testes ELISA+IFI ELISA+HAI IFI+HAI ELISA+IFI+HAI Tratados não curados (TNC) Positivo 78.7% (74/94) 63.8% (60/94) 75.5% (71/94) 67% (63/94) 63.8% (60/94) Tratados em avaliação (TEA) Inconclusivo 8.5% (8/94) 27.7% (26/94) 13.8% (13/94) 22.3% (21/94) 28.7% (27/94) Tratados curados (TC) Negativo 12.8% (12/94) 8.5% (8/94) 8.5% (8/94) 10.6% (10/94) 7.4% (7/94) Quando a associação dos três testes da sorologia convencional foi considerada, as percentagens de TNC, TEA e TC foram 63,8%, 28,7% e 7,4% respectivamente. Estes resultados foram similares com os obtidos entre as associações de ELISA + IFI e IFI + HAI (p > 0,05) e ELISA + HAI (p = 0,05) (Tabela 1). A utilização do critério de cura clássico revelou 12 (12,8%) pacientes TC. O critério mais rigoroso, que preconiza a soronegativação dos três testes da sorologia convencional, demonstrou apenas sete pacientes TC (7,4%) (Tabela 1). Estes resultados foram significativamente diferentes (p < 0.001). 52

71 Resultados Sorologia convencional x Sorologia alternativa A Figura 4A e 4B mostra a representação individual dos pacientes categorizados nos grupos TNC, TEA e TC pelo critério clássico de cura e três testes sorológicos negativos versus o resultado revelado na sorologia alternativa (rec-elisa e FC-ALTA). O teste rec-elisa confirmou o resultado positivo em todos os pacientes categorizados como TNC pelos dois critérios adotados e revelou como negativo um paciente pertencente ao grupo TEA pelo critério clássico e dois pacientes classificados pelo critério de três testes negativos. No grupo TC particularmente, foi observada uma melhor segregação entre os resultados encontrados com a rec-elisa e o critério de três testes negativos (Figura 4A) uma vez que a maioria dos pacientes (4/7) ficou abaixo da linha de corte em ambos. (A) Rec-ELISA (B) FC-ALTA Indíce de reatividade (IR) Clássico Três Testes Clássico Três Testes Clássico TNC TEA TC Três Testes % PPFP Clássico Três Testes Clássico Três Testes Clássico Três Testes TNC TEA TC Grupos de pacientes Figura 4 - Representação individual da reatividade dos soros de pacientes chagásicos tratados com benzonidazol há mais de 10 anos, categorizados pelo critério clássico de cura e três testes sorológicos negativos versus rec-elisa e FC-ALTA. TNC= tratado não curado, TEA= tratado em avaliação e TC= tratado curado. 53

72 Resultados O teste FC-ALTA confirmou a positividade de todos os pacientes categorizados como TNC pelos dois critérios, com exceção apenas de um paciente categorizado pelo critério clássico que revelou FC-ALTA negativo. No grupo TEA (ambos os critérios) todos os pacientes apresentaram resultados positivos, com exceção de dois pacientes categorizados pelo critério de três testes que revelaram resultados negativos. Novamente no grupo TC, categorizado pelo critério de três testes negativos, observouse uma melhor segregação dos resultados encontrados com a FC-ALTA e a sorologia convencional (Figura 4B). Dos 12 pacientes considerados TC pelo critério clássico de cura, cinco (41,7%) foram negativos na rec-elisa e cinco na FC-ALTA. Quatro (33,3%) foram negativos em ambas e um deles foi distinto entre as duas técnicas. A utilização de qualquer teste da sorologia alternativa (rec-elisa e/ou FC-ALTA) detectou seis (50%) pacientes negativos dentre os 12 considerados TC pelo critério clássico (Figura 5). Dos sete pacientes considerados TC pelo critério mais rigoroso (três testes negativos), quatro (57,1%) foram também negativos na rec-elisa e FC-ALTA e três (42,9%) foram negativos em ambas. A utilização de qualquer teste da sorologia alternativa (rec-elisa e/ou FC-ALTA) foi capaz de detectar cinco (71,4%) pacientes negativos dentre os sete considerados TC pelo critério mais rigoroso (Figura 5). Estes resultados revelam uma melhor concordância entre a sorologia alternativa e o critério mais rigoroso. Apenas em três pacientes (#718, #1117 e #1128) todos os testes da sorologia convencional e alternativa foram negativos e apenas a associação da ELISA + HAI foi capaz de detectar um paciente negativo (#697) revelado também pelos testes alternativos (rec-elisa e FC-ALTA) (Figura 5). 54

73 Resultados Figura 5 - Distribuição dos pacientes chagásicos considerados tratados curados (TC) segundo o critério clássico de cura e o critério mais rigoroso (três testes negativos) frente aos resultados da sorologia alternativa. Resultado positivo Resultado negativo Sorologia convencional x Métodos parasitológicos A técnica de hemocultura revelou falha terapêutica em 21,6% e 26,7% dos pacientes categorizados como TNC pelo critério clássico de cura e três testes negativos respectivamente. Não foi observada positividade desta técnica em nenhum paciente categorizado como TEA e TC por ambos os critérios de cura (Figura 6A). A técnica de PCR foi positiva em 66,2% e 65% dos pacientes categorizados como TNC pelo critério clássico de cura e três testes sorológicos negativos respectivamente. No grupo TEA a positividade desta técnica foi de 12,5% nos pacientes agrupados pelo critério clássico de cura e de 40,7% dentre os pacientes agrupados pelo critério de três testes negativos, não sendo esta diferença significativa 55

74 Resultados (p>0,05). Nenhum paciente categorizado como TC por ambos os critérios apresentou PCR positivo (Figura 6B). Figura 6 - Percentuais de resultados positivos para a técnica de hemocultura e PCR realizada em amostras de sangue coletadas dos pacientes chagásicos tratados com benzonidazol há mais 10 anos, categorizados segundo o critério de cura clássico e o critério de três testes sorológicos negativos. TNC= tratado não curado, TEA= tratado em avaliação e TC= tratado curado. A técnica de PCR avaliada isoladamente no total dos pacientes revelou um percentual de positividade na primeira amostra de 33% (31/94), na segunda amostra de 38,3% (36/94) e um percentual acumulado de 53,2% (50/94) (Figura 7). A Figura 8 corresponde a um gel demonstrativo da técnica de PCR realizada neste estudo. 56

75 Resultados Figura 7 - Percentuais de positividade da técnica de PCR em amostras dos pacientes chagásicos tratados com benzonidazol há mais de 10 anos residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG. Figura 8 - Positividade da técnica de PCR em amostras dos pacientes chagásicos tratados com benzonidazol há mais de 10 anos, residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG. Eletroforese em gel de poliacrilamida a 6%. PM= peso molecular (padrão de 100Pb), Br= branco, C - = controle negativo, 1 11 = amostras e C+= controle positivo. 330Pb = T. cruzi e 110 Pb = β- globina humana. 57

76 Resultados Avaliação clínica A avaliação clínica atual revelou que 34% (32/94) dos pacientes chagásicos tratados estão na forma indeterminada, 33% (31/94) na forma cardíaca, 9,6% (9/94) na forma digestiva e 23% na forma mista (Figura 9). Figura 9 - Percentuais das formas clínicas encontradas nos pacientes chagásicos tratados há mais de 10 anos, residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG. FI= forma indeterminada, FC= forma cardíaca, FD= forma digestiva e FM= forma mista Após a demonstração que o critério de cura mais rigoroso (três testes sorológicos negativos) foi mais coerente com os resultados apresentados pela sorologia alternativa, os dados clínicos foram avaliados levando em consideração apenas este critério. Os percentuais das formas clínicas dos pacientes categorizados como TNC, TEA e TC estão demonstradas na Figura 10. Foi observado que a forma digestiva está ausente no grupo TC e o percentual de pacientes na forma indeterminada é maior neste grupo quando comparado com os grupos TNC e TEA. A percentagem de formas cardíacas foi também menor no grupo TC que o observado nos outros grupos. O percentual de forma mista foi menor no 58

77 Resultados grupo TEA e igual nos outros grupos (TNC e TC). Não foram constatadas diferenças significativas em nenhuma das situações (Figura 10). Figura 10 - Percentuais de formas clínicas dos pacientes chagásico tratados com benzonidazol há pelo menos 10 anos, categorizados em tratados não curados (TNC), tratados em avaliação (TEA) e tratados curados (TC) segundo o critério mais rigoroso (três testes sorológicos negativos). FI = forma indeterminada, FC = forma cardíaca, FD = forma digestiva e FM = forma mista Idade quando tratado e tempo pós-tratamento versus cura A avaliação dos pacientes considerados TC quanto à idade no tratamento e o tempo pós-tratamento está demonstrado na Figura 11. Foi constatado que os pacientes TC estão distribuídos em todas as faixas etárias com exceção de anos. Dos sete pacientes TC, quatro estavam entre anos pós-tratamento e três entre anos (Figura 11). 59

78 Resultados (A) Idade (anos) (B) Tempo pós-tratamento (anos) Número de pacientes TC Número de pacientes (total) Número de pacientes TC Número de pacientes (total) Figura 11 - Distribuição dos pacientes chagásicos tratados e tratados curados (TC) pelo critério cura de três testes sorológicos negativos por faixa etária quando tratados (A) e por tempo pós-tratamento (B). 4.2 Efetividade terapêutica e evolução clínica (coorte descritiva de pacientes tratados) Neste estudo foi feita a comparação entre os resultados sorológicos e clínicos obtidos em parte dos pacientes estudados (29/94) anteriormente nos seguintes períodos: antes do tratamento (AT- 1997), nove anos (PT ) e 13 anos póstratamento (PT 2010). Os dados parasitológicos aqui apresentados foram obtidos após a avaliação de duas coletas de sangue realizada durante o período deste estudo Avaliação laboratorial Métodos parasitológicos A técnica de hemocultura foi positiva em 10,3% (3/29) dos pacientes (Figura 12). A técnica de PCR realizada em duas amostras distintas de cada paciente, coletadas em 2007 e 2010, revelou uma positividade geral de 58,6% (17/29) (Figura 12). 60

79 Resultados Figura 12 - Resultados das técnicas de hemocultura e PCR realizadas em pacientes chagásicos tratados com benzonidazol há pelo menos 10 anos, residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG. POS= positivo NEG= negativo Avaliação sorológica Os testes da sorologia convencional (ELISA + HAI) e não convencional (rec- ELISA e FC-ALTA) foram positivos em todas as amostras dos pacientes avaliadas após treze anos do tratamento. A avaliação sorológica por ELISA utilizando os soros dos pacientes obtidos antes do tratamento (AT -1997), nove anos (PT 2006) e treze anos (PT 2010) póstratamento, realizada em paralelo, revelou uma ligeira queda nas absorbâncias não sendo estas diferenças significativas (p=0,1464) (Figura 13). 61

80 Resultados DO (490nm) AT PT PT Figura 13 - Absorbância de soros dos pacientes chagásicos obtidos antes do tratamento (AT 1997), nove anos (PT 2006) e treze anos (PT 2010) pós-tratamento avaliados pelo teste de ELISA in house (diluição do soro 1:80) Avaliação clínica A forma clínica dos pacientes antes do tratamento, nove e treze anos póstratamento está apresentada na Tabela II. Os pacientes que apresentaram evolução clínica ao longo das avaliações estão com as formas clínicas escritas em letras vermelhas. Nesta tabela estão também os resultados da técnica de hemocultura e PCR dos pacientes em estudo. Comparando a forma clínica dos pacientes com os resultados de HC e PCR constatou-se que dois pacientes (#1107 e #543) que evoluíram clinicamente apresentaram resultados positivos na técnica de hemocultura e um deles (#543) resultado positivo também na PCR. Outro paciente (#1100) não evoluiu clinicamente, mas apresentou HC positiva e PCR negativo (Tabela II). Considerando os oito pacientes que apresentaram uma evolução progressiva, a técnica de HC foi positiva em 25% (2/8) e a PCR em 62,5% (5/8) deles. Dentre os pacientes que apresentaram uma evolução inalterada (n=21), a HC revelou um percentual de positividade de 4,8% (1/21) e a PCR de 57,1% (12/21). 62

81 Resultados Tabela II - Idade, sexo, forma clínica ( ) e resultado dos métodos de hemocultura e PCR dos pacientes chagásicos tratados com benzonidazol há 13 anos, residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG. Pacientes Idade (anos) Sexo Forma Clínica (1997) Forma Clínica (2006) Forma Clínica (2010) HC PCR # F F.C Leve F.C Grave F.C Grave NEG POS # F F.C Leve F.C Leve F.C Leve NEG POS # M F.C Leve F.C Moderada F.C Grave POS NEG # M F.C Leve F.C Leve F.C Moderada POS POS # F F.C Leve F.C Leve F.C Leve NEG POS # F F.D 1 F.D 3 F.D 3 NEG POS # F F.I F.C Leve F.C Leve NEG POS # M F.I F.I FI NEG POS # F F.I F.I FI NEG NEG # M F.I F.I FI NEG POS # M F.I F.I FI NEG POS # F F.I F.I FI NEG NEG # F F.I F.I FI NEG NEG # M F.I F.I FI NEG NEG # M F.I F.I FI NEG NEG # M F.I F.I FI NEG POS # F F.I F.I FI POS NEG # F F.I F.I FI NEG POS # F F.I F.I FI NEG POS # F F.I F.I FI NEG NEG # F F.I F.I FI NEG POS # F F.I F.I FI NEG NEG # F F.I F.I FI NEG NEG # M F.I F.I FI NEG POS # F F.I F.I FI NEG POS # F F.I F.I FI NEG POS # F F.I F.I F.C Leve NEG POS # M F.I F.C Leve F.C Leve NEG NEG # F F.I F.C Leve F.C Leve NEG NEG F.I = forma indeterminada, F.C Leve = forma cardíaca leve, F.C Moderada = forma cardíaca moderada, F.C grave = forma cardíaca grave, F.D 1 = forma digestiva grau I e F.D 3 = forma digestiva grau III. NEG= negativo e POS= positivo. 63

82 Resultados A evolução clínica dos pacientes no período de revelou um percentual geral de 20,7% (6/29). Dos pacientes que estavam na forma indeterminada anteriormente ao tratamento o percentual de evolução clínica foi de 13% (3/23) enquanto que naqueles que apresentavam alguma alteração cardíaca ou digestiva o porcentual de evolução foi de 50% (3/6) (Figura 14A). Estes resultados demonstram uma evolução clínica geral de 2,3% ao ano, sendo 1,4% nos pacientes que estavam na forma indeterminada e 5,6% naqueles que apresentavam alguma alteração cardíaca ou digestiva (Figura 14D) % evolução clínica ,3% 20,7% 87% 13% A B 95% P= 0,03 C ,7% ,6% 77,8% 72,4% ,7% 50% 50% ,3% ,6% 22,2% 17,4% 10,3% 20 5% % evolução clínica/ano Inalterada Progressiva Inalterada Progressiva Inalterada Progressiva Inalterada Progressiva Inalterada Progressiva Inalterada Progressiva Inalterada Progressiva Inalterada Progressiva Inalterada Progressiva 6 5,6% D 5,6% E F 6 6 5,1% 4 2 2,3% 1,4% 4 2 2,6% 1,25% 4 2 2,1% 1,3% 0 CHt (n=29) INDt (n= 23) CARD/DIGt (n=6) 0 CHt (n=29) INDt (n= 20) CARD/DIGt (n=9) 0 CHt (n=29) INDt (n= 23) CARD/DIGt (n=6) Figura 14 - Percentuais de evolução clínica geral (A, B e C) e anual (D, E e F) dos pacientes chagásicos tratados com benzonidazol avaliados nos períodos de , e CHt = chagásicos total, INDt = chagásicos tratados na forma indeterminada e CARD/DIGt = chagásicos que apresentavam alguma alteração cardíaca ou digestiva quando tratados. 64

83 Resultados A forma clínica dos pacientes chagásicos tratados avaliados em 2006 e 2010 revelou um percentual de evolução clínica geral de 10,3% neste período. Dos pacientes que estavam na forma indeterminada em 2006 o percentual de evolução clínica foi de 5% (1/20) enquanto que naqueles que apresentavam alguma alteração cardíaca ou digestiva o porcentual de evolução foi de 22,2% (2/9) (Figura 14B). Estes resultados revelam uma taxa geral de evolução clínica de 2,6% ao ano, dos quais um índice de 1,25% foi observado em pacientes da forma indeterminada e 5,6% naqueles que apresentavam alguma alteração cardíaca ou digestiva (Figura 14E). A comparação dos dados clínicos dos pacientes antes do tratamento (1997) com a avaliação após 13 anos do tratamento (2010) revelou um percentual de evolução geral de 27,6% (8/29). No grupo de pacientes que estavam na forma indeterminada em 1997 o percentual de evolução clínica foi de 17,4% (4/23) enquanto que naqueles que apresentavam alguma alteração cardíaca ou digestiva o porcentual de evolução foi de 66,7% (4/6) (Figura 14C). Estes resultados revelam uma taxa geral de evolução de 2,1% ao ano, dos quais um índice de 1,3% foi observado nos pacientes com forma indeterminada e 5,1% naqueles que apresentavam alguma alteração cardíaca ou digestiva (Figura 14F) Estudo de intervenção Neste estudo foram comparados os dados laboratoriais e clínicos de 58 pacientes chagásicos diagnosticados em Destes, 29 são os mesmos avaliados no estudo anterior e submetidos a tratamento etiológico com benzonidazol há 13 anos. Os outros 29 constituíram o grupo controle pareado não tratado. O pareamento dos pacientes foi realizado levando em consideração sexo, idade, forma clínica e procedência Avaliação laboratorial Os dados aqui apresentados são referentes à avaliação laboratorial e clínica dos pacientes chagásicos tratados e não tratados realizada no ano de 2010, permitindo 65

84 Resultados assim uma comparação dos dados do tempo zero (AT 1997) e 13 anos póstratamento (13 anos PT). Os resultados dos métodos parasitológicos são apenas da avaliação 13 anos pós-tratamento, pois não foram realizados antes da intervenção Métodos parasitológicos A técnica de hemocultura revelou uma positividade de 6,9% (2/29) entre os pacientes tratados (CHt) e 27,6% (8/29) no grupo não tratado (CHnt) (Figura 15), sendo esta diferença significativa (p<0,05). A PCR revelou uma positividade de 44,8% (13/29) entre os pacientes que foram tratados (CHt) e 13,8% (4/29) entre aqueles que não foram tratados (CHnt), sendo esta diferença significativa (p<0,05) (Figura 15). Figura 15 - Percentuais de positividade da técnica de hemocultura e PCR entre os pacientes chagásicos tratados (CHt) e não tratados (CHnt) residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG. HC= hemocultura, PCR= reação em cadeia da polimerase 66

85 Resultados Avaliação sorológica Todos os pacientes tratados e não tratados apresentaram resultados positivos nos testes de HAI e ELISA recombinante. A avaliação da absorbância dos soros obtidos antes do tratamento e dos seus respectivos controles, através da técnica de ELISA in house, não demonstrou diferenças estatísticas (p>0,05) (Figura 16A). A avaliação pelo teste de ELISA dos soros dos pacientes chagásicos tratados e não tratados obtidos após 13 anos revelou uma menor absorbância no grupo tratado quando comparado com o não tratado, sendo esta diferença significativa (p<0,05) (Figura 16A). A avaliação dos soros antes do tratamento segundo a forma clínica inicial revelou que os pacientes tratados na forma indeterminada e seus respectivos controles não apresentaram diferenças nas absorbâncias (Figura 16B). Entretanto a avaliação após treze anos revelou que o grupo tratado com esta forma clínica apresenta menor absorbância que o grupo não tratado, sendo esta diferença significativa (P<0,05) (Figura 16B). Não houve diferença significativa entre a absorbância dos soros entre os pacientes chagásicos que apresentavam alguma alteração cardíaca ou digestiva e seus respectivos controles avaliados antes e treze anos depois. (Figura 16B). 67

86 Resultados (A) Absorbância no tempo zero (AT 1997) e treze anos depois DO (490nm) P> 0.05 P< CHt CHnt CHt CHnt AT 13 anos PT (B) Absorbância no tempo zero (AT 1997) e treze anos depois x Formas Clínicas DO (490nm) Forma Indeterminada CHt CHnt CHt CHnt Forma CARD/DIG P> 0.05 P< 0.05 P> 0.05 P> 0.05 CHt CHnt CHt CHnt AT 13 anos PT AT 13 anos PT Figura 16 - Absorbância dos soros dos pacientes chagásicos antes do tratamento e de seus respectivos controle e treze anos depois avaliados pelo teste de ELISA (A) e estratificados segundo a forma clínica (B). CHt= chagásicos tratado, CHnt= chagásicos não tratados, AT= antes do tratamento, PT= pós-tratamento 68

87 Resultados Avaliação clínica A avaliação clínica dos pacientes chagásicos tratados e não tratados após treze anos revelou um percentual de evolução clínica geral de 27,6% entre os pacientes tratados e de 65,5% dentre os não tratados (Figura 17). Os pacientes que apresentavam a forma indeterminada da doença antes do tratamento e seus respectivos controles apresentou um percentual de evolução clínica de 17,4% entre os tratados e de 56,5% entre os não tratados (Figura 17). Entre os pacientes que apresentavam alguma alteração cardíaca ou digestiva antes do tratamento e seus respectivos controles verificou-se um percentual de evolução clínica de 67% entre os tratados e de 100% entre os não tratados (Figura 17). Figura 17 - Percentual de evolução clínica geral e por formas clínicas dos pacientes chagásicos tratados (CHt) e não tratados (CHnt) após 13 anos ( ). FI= forma indeterminada e CARD/DIG= pacientes com alguma alteração cardíaca ou digestiva. 69

88 5 - DISCUSSÃO

89 Discussão 5.1 Avaliação da efetividade terapêutica (casuística completa) Os diversos estudos que avaliam a eficiência terapêutica contra o T. cruzi são controversos e os resultados encontrados são muitas vezes discordantes devido a diferenças na casuística, nos métodos utilizados na avaliação pós-tratamento, no tempo de seguimento e nos critérios de cura adotados (COURA & CASTRO, 2002). Além disto, a divergência de resultados pode ser atribuída também à diversidade genética do parasita revelada em regiões geográficas distintas (MILES et al., 2003), em função da resistência natural de determinadas cepas aos quimioterápicos disponíveis (FILARDI & BRENER, 1987; MURTA et al., 1998; TOLEDO et al., 2003). A primeira parte deste estudo teve como propósito avaliar 94 pacientes chagásicos tratados há mais de 10 anos, utilizando técnicas laboratoriais tais como: sorologia convencional (ELISA, IFI e HAI), sorologia alternativa (rec-elisa e FC-ALTA) e métodos parasitológicos (HC e PCR) empregados na avaliação da eficácia terapêutica. A Organização Mundial da Saúde (WHO, 2002) e o Ministério da Saúde (MS, 2005) recomendam a utilização de dois testes sorológicos convencionais de princípios diferentes para a definição do diagnóstico e/ou controle de cura da doença de Chagas, mas não deixa claro em nenhuma destas publicações quais testes sorológicos são os mais recomendados. Neste trabalho o teste de ELISA aplicado isoladamente revelou que 75,5% (71/94) dos pacientes apresentaram resultado positivo, 11,7% (11/94) negativo e 12,8% (12/94) reatividade na zona cinza ou indeterminado. Constatou-se também que 23,4% (22/94) dos pacientes apresentaram alta reatividade neste teste (IR>2) e 52,1% (49/94) baixa reatividade (1,2 IR 2). O teste de IFI isolado revelou que 68,1% (64/94) dos pacientes apresentaram resultado positivo, enquanto 31,9% (30/94) apresentaram resultado negativo. O teste de HAI isolado revelou que 88,3% (83/94) dos pacientes apresentaram resultado positivo e 11,7% (11/94) negativo. As associações de dois testes sorológicos considerando os três realizados revelaram que o percentual de soroconversão foi de 8,5% para a associação ELISA+IFI e ELISA+HAI e de 10,6% para IFI+HAI, sendo estes resultados similares. 71

90 Discussão A utilização de dois testes quaisquer da sorologia convencional, conforme preconiza o critério clássico de cura, revelou um percentual de soroconversão igual a 12,4% (12/94). O critério mais rigoroso adotado também neste estudo, que preconiza a negativação de três testes da sorologia convencional, revelou um percentual de soroconversão igual a 7,4% (7/94), sendo este resultado estatisticamente diferente (p<0,05) do encontrado com o critério clássico de cura. Os resultados aqui apresentados revelam um baixo índice de cura parasitológica nos pacientes avaliados e conseqüentemente uma alta resistência ao tratamento das cepas de T.cruzi presente na região em estudo. Verificou-se ainda que a associação ELISA+HAI foi à única capaz de detectar um paciente (#697) negativo revelado também por ambos os testes da sorologia alternativa (rec-elisa e FC-ALTA). Além disto, sabe-se que os testes ELISA+HAI são de fácil manuseio em laboratórios comuns de análises clínicas e o teste de HAI não requer nenhum equipamento para sua realização. Os resultados aqui apresentados indicam que as associações de apenas dois testes sorológicos (ELISA+IFI e IFI+HAI) podem ser utilizadas no monitoramento de cura da DCh por serem de fácil execução e apresentarem resultados confiáveis. Os resultados encontrados com o critério mais rigoroso corroboram os achados de outros autores que encontraram índices de soroconversão variando de 0 19,1% em avaliações pós-tratamento de pacientes tratados na fase crônica da doença de Chagas no Brasil e na Argentina (LAURIA-PIRES et al., 2000; BRAGA et al., 2000; CANÇADO, 2002; VIOTTI et al., 2006; FERNANDES et al., 2009). FERREIRA et al. (1990) avaliando um grupo de 100 pacientes tratados na forma indeterminada (50 com nifurtimox e 50 com benzonidazol), durante pelo menos cinco anos de acompanhamento, demonstraram uma taxa de soroconversão de 6% dentre os tratados com nifurtimox e de 10% entre os tratados com benzonidazol. Este estudo revelou um índice de cura para o tratamento etiológico de 8%. O critério clássico (dois testes sorológicos quaisquer negativos) e o mais rigoroso (três testes negativos) permitiram categorizar os pacientes em tratados não 72

91 Discussão curados (TNC), tratados em avaliação (TEA) e tratados curados (TC) que foram posteriormente avaliados pelos testes da sorologia alternativa (rec-elisa e FC-ALTA). A rec-elisa aplicada isoladamente revelou um percentual de soroconversão de 6,4% (6/94). Este resultado foi mais coerente com o critério de cura de três testes sorológicos negativos, uma vez que a rec-elisa confirmou 57,1% (4/7) dos pacientes como negativos. Por outro lado verificou-se que a concordância da rec-elisa com o critério clássico foi menor e de apenas 41,7% (5/12) dos pacientes considerados TC. Esta técnica revelou também um paciente com resultado negativo que não foi encontrado em nenhuma das outras associações dos testes sorológicos convencionais. A rec-elisa tem sido considerada um teste de alta sensibilidade e especificidade e têm contribuído bastante para a redução de casos falsos positivos, resultados inconclusivos e reações cruzadas com outras doenças parasitárias, principalmente as Leishmanioses (CABALLERO et al., 2007). Este teste vem sendo ainda aplicado em diversos estudos de monitoramento de cura oferecendo bons resultados, além da facilidade de manuseio e reprodutibilidade (NEGRETTE et al., 2008; YUN et al., 2009; ESCRIBÀ et al., 2009). Nos últimos anos diversos pesquisadores têm obtido bons resultados utilizando antígenos recombinantes, peptídeos sintéticos ou antígenos semi-purificados para o diagnóstico da infecção pelo T. cruzi e avaliação pós-tratamento (MARTINS et al., 1985; KRIEGGER et al., 1992; PERALTA et al., 1994; NORRIS et al., 1994; KRAUTZ et al., 1995; UMEZAWA et al., 1999; GOMES et al., 2001; SILVEIRA et al., 2001; FERREIRA et al., 2001; SILVA et al., 2002; MEIRA et al., 2002, 2004). KRAUTZ et al. (1995), utilizando uma proteína recombinante de 24 kda presente na membrana de todos os estágios evolutivos do T. cruzi, no monitoramento de cura demonstraram uma boa correlação entre os resultados das técnicas de ELISA e Western Blotting em comparação com a LMCo. Os autores justificam também a utilização dos antígenos recombinantes devido a facilidade de execução das técnicas em laboratórios de análises clínicas comuns o que não é possível com o método de LMCo. Também MEIRA et al. (2004), utilizando uma proteína recombinante de 160 kda (principal alvo dos anticorpos líticos) para avaliar 31 pacientes chagásicos, antes e quatro anos pós-tratamento, demonstraram queda da reatividade sorológica quando 73

92 Discussão utilizaram ELISA recombinante e LMCo. Este resultado não foi observado com a sorologia convencional na qual todos os pacientes permaneciam positivos. Os resultados deste estudo revelaram que a ELISA recombinante (gp160) pode ser utilizada para detecta eficácia terapêutica precocemente em substituição a LMCo devido a sua facilidade de execução e a ausência de parasitos vivos na metodologia. No trabalho de SILVA et al. (2002), avaliando um kit de ELISA recombinante produzido por Biomanguinhos (EIE-recombinant-Chagas-Biomanguinhos), que utiliza antígenos CRA e FRA para o monitoramento de cura de pacientes chagásicos, constataram uma boa correlação entre os resultados encontrados e os métodos convencionais. A FC-ALTA aplicada isoladamente na avaliação dos pacientes revelou um percentual de soroconversão de 6,4% (6/94). Destes pacientes, três apresentaram resultados negativos em todos os testes da sorologia convencional e rec-elisa. A FC- ALTA foi também negativa em quatro pacientes considerados TC pelo critério mais rigoroso (três testes) e em mais um paciente soropositivo nos demais testes (sorologia convencional e rec-elisa). Os dados encontrados com o teste FC-ALTA apresentaram uma maior coerência com o critério mais rigoroso de cura uma vez que 57,1% (4/7) dos pacientes considerados TC por este critério apresentaram valores inferiores ao ponto de corte nesta técnica. Por outro lado esta técnica constatou um índice menor de soroconversão de 41,7% (5/12) dentre os pacientes categorizados como TC pelo critério clássico (dois testes da sorologia convencional negativos). Os resultados encontrados neste estudo diferem dos obtidos por MARTINS et al. (2008) que trabalhando em condições experimentais em modelo murino demonstraram que a FC- ALTA tornou-se negativa antes da sorologia convencional. Uma análise geral dos resultados encontrados com a sorologia convencional e alternativa permite sugerir uma melhor concordância entre o critério mais rigoroso (três testes negativos) e a sorologia alternativa. Estes resultados reforçam ainda a necessidade de no mínimo dois testes sorológicos de princípios diferentes para definição do diagnóstico da DCh e também para o acompanhamento pós-tratamento, uma vez que exames aplicados isoladamente podem apresentar falsos resultados. Todos os pacientes foram também avaliados por métodos parasitológicos. A técnica de HC foi positiva em 17,2% (16/94) dos pacientes, todos categorizados como 74

93 Discussão TNC por ambos os critérios de cura aqui considerados (dois e três testes da sorologia convencional negativos). Verificou-se ainda que nenhum paciente pertencente ao grupo TEA e TC apresentou HC positiva o que reforça a importância deste método como revelador inquestionável de fracasso terapêutico. A positividade da hemocultura revela a presença de parasitos circulantes, porém os resultados negativos obtidos por esta técnica isoladamente não indicam cura e podendo ser atribuídos a períodos de parasitemia intermitente ou à baixa sensibilidade deste método (CHIARI et al,. 1989). Esta baixa sensibilidade constitui um fator limitante, tanto no diagnóstico da DCh quanto na avaliação pós-terapêutica. No entanto, a realização seriada deste método permite uma considerável elevação da positividade (LUZ et al., 1994; CASTRO et al., 2002). Vale ressaltar ainda que a HC oferece como grande vantagem a possibilidade de isolamento do parasito para estudos sobre a caracterização biológica, bioquímica e molecular das diferentes populações deste protozoário. A técnica de PCR apresentou um percentual de positividade bem semelhante (66,2% e 65%) entre os pacientes categorizados como TNC por ambos os critérios de cura aqui empregados e discutidos. O percentual de positividade entre os pacientes categorizados como TEA pelo critério clássico e três testes negativos foi de 12,5% e 40,7% respectivamente. Já no grupo categorizado como TC por ambos os critérios, nenhum paciente apresentou resultado positivo. Estes resultados da PCR demonstraram uma boa coerência com os outros métodos empregados na avaliação dos pacientes, entretanto temos que considerar que a repetição da realização deste método aumenta a sua positividade como verificado neste estudo e em trabalhos de outros autores (LAGES-SILVA et al., 2001; CASTRO et al., 2002; BRITTO, 2009). A técnica de PCR demonstrou uma maior sensibilidade quando comparada com a hemocultura, sendo capaz de detectar um maior percentual de positividade no grupo TNC e 37% de positividade dentre os pacientes considerados TEA pelo critério de três testes negativos que apresentavam sucessivas HC negativas. Considerando que a PCR pode estar detectando DNA de parasitos vivos ou recentemente lisados pelo mecanismo de reação de lise mediada por complemento (LMCo) - (KRETTLI E BRENER, 1984), estes resultados reforçam a sua maior eficiência em detectar fracasso terapêutico quando comparado à hemocultura corroborando os trabalhos realizados por 75

94 Discussão outros pesquisadores na avaliação pós-tratamento em amostras de pacientes de regiões geográficas distintas (RUSSOMANDO et al., 1998; GALVÃO et al.,2003; LANA et al., 2009). Além da elevada sensibilidade, a PCR é superior a hemocultura devido ao baixo volume de sangue coletado (5mL), permite a análise de várias amostras simultaneamente e o resultado é obtido em um curto período de tempo (CHIARAMONTE et al., 1999). A PCR emprega ainda reagentes caros e aparelhagem específica, requer treinamento especializado, além de requerer cuidados especiais para evitar contaminação das amostras, sendo necessário além do emprego em paralelo de amostras de referência o de controle de reagentes, de ambientes/salas distintos para realização das diversas etapas da manipulação. A PCR tem sido muito utilizada em diversos estudos associada aos testes sorológicos sendo, portanto uma ferramenta muito importante principalmente para detectar falha terapêutica precoce (BRITTO et al., 1995, 2009; GALVÃO et al., 2003; ZULANTAY et al., 2004; SÁNCHEZ et al., 2005). Os resultados negativos da técnica de PCR quando usada isoladamente não caracterizam seguramente cura parasitológica, podendo retratar momentos de parasitemia intermitente. Admite-se que resultados positivos pós-tratamento estão associados a parasitos extracelulares intactos ou parasitos recentemente lisados presentes no sangue (TARLETON & ZHANG, 1999). Entretanto, a combinação de resultados negativos entre sorologia convencional e PCR é indicativa de cura (BRITTO et al., 2001, 2009; CASTRO et al., 2002; RASSI & LUQUETTI, 2003; GALVÃO et al,. 2003). A avaliação global dos resultados revelados com todas as metodologias empregadas na avaliação pós-terapêutica nos permite afirmar que o monitoramento de cura dos pacientes chagásicos não deve ser feito empregando apenas uma das metodologias utilizadas. No entanto, foi confirmado que a sorologia alternativa comprova a maioria dos casos (4/7) considerados TC pelo critério de três testes negativos. Em contrapartida, os testes da sorologia alternativa revelaram dois outros pacientes negativos que não foram detectados como tal pela sorologia convencional em nenhum dos critérios adotados no estudo e ainda, que estes não foram os mesmos em ambos os testes. 76

95 Discussão A avaliação pós-terapêutica em pacientes chagásicos tratados na fase crônica da doença ainda representa um grande desafio devido à persistência por longos períodos de anticorpos detectáveis pela sorologia convencional, presentes inclusive em pacientes com métodos parasitológicos persistentemente negativos, tais como hemocultura e PCR (KRETTLI et al., 1984; ANDRADE et al., 1991; GALVÃO et al., 1993; CANÇADO et al., 2002). Alguns fatores contribuem para a permanência da sorologia convencional positiva em pacientes que obtiveram cura parasitológica, tais como: mecanismos auto-imunes, antígenos do parasita em células dendríticas e cardíacas, anticorpos anti-idiotípicos, anticorpos anti-laminina, anticorpos anti epítopos de resíduos de açucares e a presença de outros microorganismos (bactérias e outros protozoários) da microflora intestinal e pulmonar que induzem a positividade da sorologia convencional (GAZZINELLI et al., 1987, 1988; KRETTLI et al., 2009; LANA & MARTINS-FILHO, 2009). Outro ponto de grande relevância está relacionado ao impacto do tratamento na morbidade da doença. Este assunto tem sido muito discutido e constitui o objetivo principal do projeto BENEFIT (BENznidazole Evaluation For Interrupting Trypanosomiasis). Este projeto constitui uma parceria entre Brasil, Argentina, Venezuela e Colômbia e trata-se de um estudo clínico randomizado, controlado por placebo, com mascaramento duplo, sobre a avaliação do impacto do tratamento com benzonidazol em pacientes com cardiopatia chagásica crônica. A avaliação clínica de todos os pacientes envolvidos neste estudo revelou que 66% (62/94) deles apresentam alguma alteração cardíaca e/ou digestiva. Entretanto, quando a distribuição das formas clínicas foi comparada entre os grupos de pacientes categorizados como TNC, TEA e TC pelo critério de três testes sorológicos negativos, observou-se que o percentual de formas indeterminada no grupo TC foi maior que no total dos pacientes. Além disto, a forma digestiva estava ausente no grupo TC. Considerando que este estudo é transversal e que não possuímos informações clínicas de parte destes pacientes antes do tratamento, a ausência de grupo controle avaliado em paralelo e que estas diferenças não foram significativas, não é possível concluir que o tratamento proporcionou melhora na evolução clínica. Entretanto, em outro estudo de nossa equipe utilizando parte desta casuística (28/94) foi demonstrado uma melhor 77

96 Discussão evolução clínica da morbidade da doença nos pacientes tratados na forma indeterminada (LANA et al., 2009). Vários estudos foram feitos nos últimos anos, principalmente no Brasil e Argentina, avaliando o efeito tripanomicida das drogas disponíveis, benzonidazol e nifurtimox, na fase crônica tardia da infecção. Estes estudos revelaram uma baixa atividade antiparasitária nesta fase da doença, cujas razões ainda não são bem conhecidas. Os resultados são controversos e discordantes basicamente devido a diferenças na população amostrada, nos métodos de avaliação utilizados, ao tempo de seguimento, aos critérios de cura e esquemas terapêuticos adotados (COURA & CASTRO, 2002; BAHIA et al., 2005; GUEDES et al., 2006). MACEDO & SILVEIRA (1987) avaliaram 171 pacientes chagásicos na fase crônica da doença onde 103 receberam tratamento (nifurtimox ou benzonidazol) e 68 placebo, com seguimento de até sete anos. Este estudo revelou progressão de alterações no ECG em seis pacientes (5,8%) do grupo tratado e oito (11,8%) do grupo placebo, não sendo estas diferenças significativas. Também IANNI et al. (1993) avaliando 33 pacientes chagásicos com a forma indeterminada por oito anos revelou alterações no ECG em 13,3% (2/15) dos pacientes tratados com benzonidazol e 0% dos casos que receberam placebo (n = 18). Por outro lado, MIRANDA et al. (1994) avaliando por anos a evolução clínica, de ECG e radiológica em 76 pacientes tratados com benzonidazol na fase indeterminada ou com mínimas alterações cardíacas ou digestivas versus 44 outros pacientes pareados e não tratados, constataram que a progressão da doença foi mais freqüente no grupo não tratado (63,6%) quando comparado com o tratado (10,5%). Também VIOTTI et al. (1994) avaliando 131 pacientes chagásicos argentinos tratados com benzonidazol e 70 não tratados por um período de seguimento de 8 anos, observaram menos alterações eletrocardiográficas no grupo tratado (4,2%) quando comparado com o grupo não tratado (30%), sugerindo assim uma estabilização do quadro clínico. O tratamento proporcionou ainda uma queda significativa nos títulos sorológicos e uma soroconversão em 19,1% dos pacientes tratados. Neste mesmo estudo foi possível constatar também uma menor evolução clínica entre os tratados (2,1%) quando comparados com os não tratados (17%). 78

97 Discussão Dois grandes estudos foram realizados no Brasil e Argentina envolvendo crianças de 6 12 anos de idade que ainda não apresentavam nenhuma alteração manifesta da doença. Estes trabalhos tinham como principal objetivo avaliar a eficácia terapêutica em pacientes chagásicos tratados na forma crônica recente da doença. Num deles, ANDRADE et al. (1996) num estudo randomizado, duplo-cego, placebo controlado em escolares de 7 12 anos moradores de área rural do Brasil do estado da Góias, demonstraram um percentual de soroconversão de 57,8% (37/64) nos pacientes tratados (BZ 7,5mg/kg/dia durante 60 dias) e 4,6% (3/65) no grupo placebo. Neste seguimento de 36 anos foi possível verificar também que as crianças que receberam o tratamento com BZ apresentavam títulos na IFI cinco vezes menor que o grupo que recebeu o placebo. Diante dos resultados encontrados os autores recomendaram o tratamento etiológico para todas as crianças soropositivas. No segundo estudo, SOSA-ESTANI et al. (1998) avaliando crianças da Argentina de 6 a 12 anos tratadas com BZ, na fase indeterminada da DCh, demonstraram soroconversão após 48 meses em 11,3% (5/44) dos pacientes tratados e 4,5% (2/44) no grupo placebo quando avaliadas pela sorologia convencional (ELISA, HAI e IFI). Utilizando um novo teste de ELISA com antígenos de flagelo T. cruzi (F29) os autores demonstraram uma soroconversão de 35,7% em seis meses pós-tratamento e 62,1% em 48 meses pós-tratamento. Nenhum paciente do grupo placebo apresentou soroconversão quando se utilizou o antígeno F29. A avaliação parasitológica realizada por xenodiagnóstico revelou 51,2% de positividade para o grupo placebo e 4,7% para o grupo tratado. Estes resultados indicaram a importância do emprego de testes sorológicos utilizando antígenos recombinantes na identificação de pacientes potencialmente curados. Outro estudo foi realizado em pacientes chagásicos crônicos residentes nos municípios de Pains e Iguatama, oeste de Minas Gerais, com o propósito de avaliar a eficácia terapêutica e a tolerância ao nifurtimox e ao benzonidazol (COURA et al., 1997). Dos 77 pacientes estudados, 27 foram tratados com nifurtimox, 26 com benzonidazol, ambos na dose de 5mg/kg/dia, durante 30 dias consecutivos, e 24 pacientes receberam placebo. Dos 77 pacientes, 64 (83,1%) completaram o tratamento: 23 (88,4%) com benzonidazol, 19 (70,3%) com nifurtimox e 22 (91,6%) com 79

98 Discussão placebo. O controle de cura foi realizado com xenodiagnóstico que revelou uma falha terapêutica em 1,8% no grupo tratado com benzonidazol, 9,6% no grupo do nifurtimox e 34,3% no grupo placebo. Todas as reações sorológicas continuavam positivas após um ano do tratamento e nenhuma alteração clínica, eletrocardiográfica ou radiológica foi verificada ao longo do estudo (COURA et al., 1997). A duração da infecção pelo T. cruzi, quando os pacientes foram tratados, e o tempo pós-tratamento são variáveis fortemente relacionados com o índice de cura relatado em diversos estudos (COURA & CASTRO, 2002; CANÇADO et al., 2002; LUQUETTI & RASSI, 2002; MS, 2005). Neste trabalho, essa associação não foi verificada devido ao baixo número de pacientes TC e estes se distribuíram em diversas faixas etárias. Esta ausência de correlação pode ser atribuída à alta percentagem de pacientes adultos jovens (21 40 anos) na casuística estudada. Mesmo com a maioria dos pacientes (n=67) entre anos de idade, quando tratados, uma percentagem elevada de pacientes TC foi observada na faixa de e anos após o tratamento, o que corrobora os achados de outros autores (LUQUETTI & RASSI, 2002). Estes períodos após o tratamento são de suma importância, porque 10 anos é o tempo médio necessário para que pacientes tratados na fase crônica tenham seus títulos sorológicos convertidos após o tratamento específico. Estudos posteriores avaliando estes pacientes em período de tempo mais prolongado poderão revelar índices de cura ainda maiores, uma vez que vários pacientes aqui estudados já apresentam resultados sorológicos discordantes entre os testes utilizados, demandando assim avaliações futuras. Finalmente, os resultados aqui apresentados revelam que a utilização de um critério de cura mais rigoroso para avaliar o tratamento da DCh (negativação simultânea dos três testes da sorologia convencional) oferece resultados mais consistentes que os resultados apresentados isoladamente pelos testes sorológicos convencionais (ELISA, IFI, HAI e diversas associações), sorológicos alternativos (rec- ELISA e FC-ALTA) e avaliações parasitológicas (HC e PCR). Neste contexto, o único método com especificidade inquestionável é a HC, mas este método apresenta, em contrapartida, uma baixa sensibilidade. Estudos prospectivos utilizando a técnica de PCR no contexto do critério de cura são recomendados, devido à necessidade de 80

99 Discussão padronização e validação de um protocolo único que possa ser utilizado por diversos laboratórios em vários países para o diagnóstico e monitoramento pós-terapêutico (BRITTO, 2009; SCHIJMAN et al. 2011). Os dados demonstram também a necessidade de avaliações futuras, principalmente nos pacientes do grupo TEA, com a possibilidade de identificar mais pacientes TC Efetividade terapêutica e evolução clínica em parte da casuística: coorte descritiva de pacientes tratados (n=29) Um dos maiores desafios na investigação da DCh é avaliar o impacto da quimioterapia nas parâmetros clínicos e laboratoriais dos pacientes. Um século após a sua descoberta muitos avanços já foram conquistados em vastas áreas, como o controle vetorial e transfusional, mas existem ainda controvérsias principalmente sobre os reais benefícios que o tratamento etiológico traz para o paciente chagásico (BAHIA et al., 2005; GUEDES et al., 2006). Estas controvérsias são devido às diferenças nas casuísticas avaliadas, no tempo de seguimento, esquema terapêutico utilizado e critério de cura adotado por diversos pesquisadores. Possivelmente as diferenças genéticas dos parasitos envolvidos podem estar relacionadas uma vez que estudos experimentais em laboratórios revelaram diferenças nos resultados sorológicos e soroconversão em modelos animais infectados com parasitos pertencentes a genótipos distintos (ANDRADE et al., 1985; MURTA et al., 1998; TOLEDO et al., 2003; MIYAMOTO et al., 2008; SANTOS et al., 2010). Merece comentário especial neste sentido, o trabalho de ANDRADE et al. (1992) que ao compararem a susceptibilidade ao BZ de pacientes em comparação com as amostras de parasitos deles isolados em camundongos encontraram um alto índice de correlação (81,8%) entre os resultados observados. As diferenças obtidas por diferentes autores, associadas à necessidade de um longo período de seguimento para a verificação da cura parasitológica, dificultam a comparação dos dados obtidos pelos diversos estudos, resultando em uma descrença e desmotivação dos clínicos em relação ao tratamento etiológico da doença de Chagas. 81

100 Discussão Nesta segunda parte do estudo foram avaliados 29 pacientes chagásicos tratados com benzonidazol na fase crônica da infecção utilizando métodos sorológicos convencionais e alternativos, parasitológicos e clínicos. Estes pacientes foram avaliados antes do tratamento (1997), reavaliados nove anos pós-tratamento (2006) e mais recentemente aos treze anos pós-tratamento (2010). Antes do tratamento, todos apresentavam sorologia convencional positiva (ELISA e IFI), 23 apresentavam a forma indeterminada da doença e seis apresentavam alguma alteração cardíaca ou digestiva. A técnica de HC revelou falha terapêutica em 10,3% (3/29) dos pacientes, demonstrando assim que os mesmos apresentavam parasitos circulantes. Estes três pacientes foram diferentes dos que apresentaram HC positiva na avaliação de 2006 (dois outros pacientes), totalizando assim uma falha terapêutica em 17,2% (5/29) dos pacientes considerando todas as avaliações. Estes resultados corroboram outros trabalhos que demonstraram que a repetição dos métodos parasitológicos resulta em um aumento considerável na positividade (CHIARI et al., 1989, LUZ et al., 1994; CASTRO et al., 2002). A PCR foi positiva em 58,6% (17/29) dos pacientes. Considerando sua positividade como demonstração de DNA de parasitos vivos ou recentemente lisados pelo complemento, esta técnica demonstrou maior sensibilidade para detectar falha terapêutica quando comparado com a HC, o que corrobora os resultados obtidos por outros autores ((RUSSOMANDO et al., 1998; GALVÃO et al.,2003; LANA et al., 2009). Considerando os critérios clássicos de cura verificou-se que todos os pacientes apresentam sorologia positiva, revelando assim a inexistência de cura entre os pacientes em estudo considerando os critérios de cura atuais. Este resultado foi confirmado também através da sorologia alternativa utilizando rec-elisa e FC-ALTA. Constatou-se também, avaliando as amostras de soros armazenadas antes do tratamento em comparação com as amostras coletadas nove e 13 anos póstratamento, uma ligeira queda nas absorbâncias comprovada através do teste de ELISA, não sendo estas diferenças significativas (p>0,05). Quando os dados clínicos obtidos foram analisados frente aos resultados de HC e PCR, verificou-se que dois pacientes que apresentaram evolução progressiva também apresentaram HC positiva. Além disto, um deles apresentou também resultado 82

101 Discussão de PCR positivo. Este dado reforça a importância da presença do parasito na evolução clínica da doença, pois esta poderia estar associada à injúria tecidual, resultando na sua evolução clínica. Entretanto, nem sempre se verifica esta associação, inclusive em pacientes da mesma região em estudo realizados por BORGES-PEREIRA (1992) em Virgem da Lapa, município situado a apenas 20km de Berilo. Outro paciente apresentou HC positiva, mas teve uma evolução inalterada nos últimos 13 anos. Este paciente revela um equilíbrio na relação parasito hospedeiro e provavelmente um resposta imune favorável. Este resultado corrobora o trabalho de BORGES-PEREIRA (1992), realizado na região em estudo, que demonstrou que o aparecimento ou a progressão da cardiopatia chagásica crônica não se mostra associado à parasitemia. Também ZULANTAY et al. (2005), avaliando 30 pacientes chagásicos crônicos que receberam tratamento com itraconazol ou allopurinol, durante seis anos com ECG e xenodiagnóstico, demonstraram que não existe associação entre a persistência do parasito e evolução do traçado eletrocardiográfico. Outro trabalho realizado por CASTRO et al. (2005), avaliando 190 pacientes chagásicos participantes do projeto Mambaí (Góias, Brasil), durante 13 anos de acompanhamento clínico e parasitológico, demonstraram que a alta parasitemia não influenciou na evolução clínica da doença. Devido à escassez de parasitos na fase crônica da DCh tem sido difícil estabelecer uma correlação entre a severidade das lesões e o parasitismo sanguíneo e/ou tissular do hospedeiro. Por esta razão os mecanismos autoimunes foram por muitos anos considerados como os principais desencadeadores dos processos patológicos (TEIXEIRA et al., 1975; CUNHA-NETO et al., 1995). No entanto, com o uso de técnicas mais sensíveis, como a imunohistoquímica e a PCR, antígenos e fragmentos de DNA do parasito associados a focos inflamatórios têm sido detectados em pacientes chagásicos (JONES et al., 1993; HIGUCHI et al., 1993; VAGO et al., 2000; LAGES-SILVA et al., 2001). Com base nestes estudos não se pode negar a participação do parasito e de seus antígenos na patogenia da fase crônica da DCh, sem todavia descartar totalmente o papel da auto-imunidade desencadeada pela presença do parasito (TARLETON et al., 2003). 83

102 Discussão Avaliando os resultados encontrados nos três períodos em análise (antes, nove e 13 anos pós-tratamento) constatou-se que o percentual de evolução clínica geral variou de 2,1% a 2,6% ao ano. Nos pacientes da forma indeterminada este percentual variou de 1,25% a 1,4% ao ano e entre aqueles que já apresentavam alguma alteração cardíaca ou digestiva este percentual variou de 5,1% a 5,6% ao ano. Apesar do baixo número de pacientes avaliados (n=29) os resultados demonstram uma evolução clínica geral semelhante ao observado em outros estudos realizados em pacientes tratados (GALLERANO & SOSA, 2000; VIOTTI et al., 2006; FABBRO et al., 2007). Entretanto a análise dos dados indica que o perce ntual de evolução clínica dos pacientes tratados na forma indeterminada da doença é significativamente menor que o observado por outros autores em estudos clínico-epidemiológicos de pacientes não tratados realizados no Brasil, onde tem sido revelado um percentual de evolução anual de 2% a 4% (PRATA et al., 2001; DIAS et al., 2006). Vale ressaltar ainda que o percentual de evolução clínica anual dos pacientes tratados na forma indeterminada é cerca de quatro vezes menor que o observado nos pacientes tratados que apresentavam alguma alteração cardíaca ou digestiva. Estes dados reforçam a importância do diagnóstico e tratamento precoce dos pacientes chagásicos diante do bom prognóstico observado quando esta intervenção é realizada na forma indeterminada (MACEDO et al, 1987; MIRANDA et al., 1994; LANA et al., 2009). BORGES-PEREIRA et al., (1985) avaliando a morbidade da DCh durante seis anos através de um estudo longitudinal clínico, radiológico e eletrocardiográfico do tipo caso-controle realizado no município de Virgem da Lapa, vizinho ao município de Berilo, em pacientes não tratados revelaram que 62,1% dos pacientes permanecem com o quadro inicial inalterado, a maioria deles na forma indeterminada, 32,3% evoluíram com progressão da doença, índice este de evolução de 5,4% ao ano, muito superior ao observado neste trabalho em pacientes tratados. Índices similares de evolução clínica da doença foram também encontrados por AGUILAR (1988), avaliando os aspectos clínicos relacionados à DCh em pacientes chagásicos não tratados do município de Berilo que revelou uma freqüência de eletrocardiograma alterados em 52% dos pacientes. As alterações mais freqüentes foram hemibloqueio anterior 84

103 Discussão esquerdo, bloqueio completo do ramo direito, bloqueio aurículo-ventricular e extrassístoles ventriculares que revelam a gravidade da doença. Neste estudo, a forma clínica mais observada foi a indeterminada (53%) seguida da cardíaca (39%), mista (4%) e digestiva (4%). Além disso, MONTOYA (1998), avaliando uma casuística de pacientes chagásicos também residentes no município de Berilo, verificou uma maior freqüência de alterações eletrocardiográficas entre os pacientes chagásicos (30,5%) quando comparado com o grupo controle (2,6%), confirmando assim a alta prevalência da cardiopatia chagásica neste município. Neste estudo constatou-se também uma taxa de evolução progressiva da cardiopatia em torno de 28% em dez anos de seguimento, e que esta foi ainda maior naqueles pacientes que já apresentavam uma cardiopatia instalada. O impacto do tratamento na fase crônica da infecção é controverso e difícil de ser comprovado devido às limitações dos métodos sorológicos e parasitológicos disponíveis para o monitoramento de cura. Diversos estudos têm demonstrado que o tratamento promove uma redução drástica nos níveis de anticorpos, da parasitemia e promove um retardo ou impedimento da evolução clínica (COURA et al., 1997; SOSA- ESTANI et al., 1998; VIOTTI et al., 2006; FABBRO et al., 2007). Apesar da ausência de um grupo controle e da pequena casuística (n=29) aqui considerada, os dados obtidos após 13 anos de tratamento demonstram que o percentual de evolução clínica dos pacientes tratados na forma indeterminada (17,4%) é significativamente menor quando comparados com aqueles que já apresentavam alguma alteração cardíaca ou digestiva (66,7%) antes do tratamento. Estes dados reforçam que o tratamento etiológico proporciona uma estabilização da condição clínica e, conseqüentemente, uma melhoria no prognóstico da doença. 5.3 Estudo de intervenção: parte da casuística Diversos estudos randomizados sugerem que o tratamento etiológico da doença de Chagas leva a negativação dos testes sorológicos e/ou previne mudanças clínicas e eletrocardiográficas relacionadas à progressão da doença (MACEDO & SILVEIRA, 1987; MIRANDA et al., 1994; COURA et al., 1997; VIOTTI et al., 1994, 2006; 85

104 Discussão FRAGATA-FILHO et al., 1995; FABBRO et al., 2000, 2007; GALLERANO & SOSA, 2001; LANA et al., 2009). Entretanto, outros estudos revelam resultados discordantes, demonstrando que quando o tratamento administrado na fase crônica da DCh não elimina o parasito, não interrompe o progresso da doença e conseqüentemente não previne as complicações decorrentes da infecção (IANNI et al., 1993; IANNI & MADY, 1998; AMATO-NETO, 1998; CATALIOTI & ACQUATELLA, 1999; LAURIA-PIRES et al., 2000; BRAGA et al., 2000). O propósito deste estudo foi avaliar os aspectos laboratoriais e clínicos dos pacientes chagásicos tratados e não tratados utilizando testes sorológicos, métodos parasitológicos e exames clínicos. A técnica de HC revelou maior positividade entre os pacientes não tratados (27,6%) quando comparados com os tratados (6,9%), sendo esta diferença significativa (P<0,05). Este resultado revela falha terapêutica em dois pacientes pertencentes ao grupo tratado. Esta técnica tem sido muito utilizada no monitoramento de cura, mas deve ser analisada com cautela devido ao fato de que resultados negativos não serem seguramente indicativos de cura, principalmente em pacientes tratados, devido à baixa parasitemia e seu caráter intermitente que explicam a baixa sensibilidade da técnica (CHIARI et al., 1989, JUNQUEIRA et al., 1996; GOMES et al., 1999). Os dados revelados pela HC sugerem que o tratamento proporcionou uma redução da parasitemia dos pacientes tratados quando comparados com os não tratados e corroboram os achados de COURA et al. (1997) que realizando um estudo controlado com emprego de BZ, NFX e placebo na forma crônica da doença de Chagas, verificaram após um ano de tratamento, uma redução drástica na parasitemia dos pacientes avaliada através de xenodiagnóstico. A PCR revelou positividade em 44,8% (13/29) dos pacientes tratados e em 13,8% (4/29) dentre os não tratados. Estudos posteriores são necessários para verificar os resultados encontrados por esta metodologia no contexto de avaliação da efetividade terapêutica frente aos demais métodos laboratoriais empregados tanto em modelos experimentais e em humanos. Este resultado pode ser atribuído também ao caráter intermitente da parasitemia, principalmente, em pacientes crônicos. Vale 86

105 Discussão ressaltar também que estes resultados são referentes a uma amostra de sangue coletada, demonstrando assim a ausência do DNA do parasito naquele momento. A sorologia convencional (ELISA e HAI) e alternativa (rec-elisa) revelou positividade em todas as amostras dos pacientes tratados e não tratados. Antes da intervenção do tratamento as absorbâncias na ELISA foram semelhantes (P>0,05) nos dois grupos. Porém foi verificado através do teste de ELISA que atualmente os pacientes tratados apresentam uma menor absorbância quando comparados com os não tratados. Esta menor absorbância foi atribuída aos pacientes tratados na forma indeterminada da doença, pois antes do tratamento os valores de absorbâncias em ambos os grupos não apresentavam diferenças estatísticas (P>0,05), observada apenas na avaliação 13 anos pós-tratamento. O mesmo não foi verificado quando se comparou os pacientes tratados que apresentavam alguma alteração cardíaca ou digestiva com os seus respectivos controles não tratados. A queda sorológica pós-tratamento tem sido verificada em diversos estudos (ANDRADE et al., 1996; SOSA-ESTANI et al., 1998; VIOTTI et al., 1994, 2006; FABBRO et al., 2007; FERNANDES et al., 2009), porém ocorre de forma muito lenta principalmente entre os pacientes tratados na forma crônica da doença, o que justifica a necessidade de vários anos de seguimento para a verificação da cura parasitológica. A avaliação clínica após 13 anos revelou um percentual de evolução de 27,6% (8/29) nos pacientes tratados e de 65,5% (19/29) dentre os não tratados. Este resultado demonstra que o tratamento retarda a evolução clínica da doença de maneira considerável, mesmo em casos onde a cura parasitológica não foi observada. Este dado corrobora os achados de diversos outros autores que também avaliaram comparativamente pacientes tratados e não tratados (VIOTTI et al., 1994, 2006; GALLERANO et al., 2001; FABBRO et al., 2000, 2007). VIOTTI et al. (2006) avaliando um grupo de pacientes chagásicos crônicos tratados com benzonidazol (n=283) e não tratados (n=283) verificaram que os pacientes tratados apresentaram menor progressão da doença (12/283 x 40/283), menos alterações de ECG (15/283 x 45/283) e maiores taxas de soroconversão (32/218 x 12/212). Os autores sugerem que o tratamento etiológico na forma crônica indeterminada da doença de Chagas contribui para diminuir os riscos de progressão da 87

106 Discussão doença, e conseqüentemente, proporciona melhorias no prognóstico. Também FABBRO et al. (2007) avaliando 111 pacientes chagásicos (54 tratados e 57 não tratados) observaram no grupo tratado que 37% dos pacientes apresentaram soroconversão e que em 27,8% foi constatado queda sorológica. Por outro lado os pacientes do grupo não tratado permaneceram com os títulos sorológicos inalterados. Dentre os pacientes tratados, o percentual de evolução clínica foi de 3,7% e nos não tratados de 15,8%, sugerindo assim que o tratamento produz efeito de combate ao parasito em pelo menos 37% dos infectados crônicos adultos com conseqüente efeito protetor na evolução clínica. GALLERANO & SOSA (2001), avaliando uma casuística de 1203 pacientes chagásicos onde 535 foram tratados com allopurinol, benzonidazol ou nifurtimox e de 668 não tratados, verificaram uma taxa de cura parasitológica de 5% e que o tratamento preveniu a incidência de ECG alterado e a progressão da cardiopatia em cardiopatas leves e moderados. Neste estudo foi verificado também que os pacientes chagásicos não tratados evoluíram clinicamente mais rapidamente quando comparados com os tratados (17,9% versus 5,8%). Os autores sugeriram que o tratamento precoce torna os resultados mais efetivos, previne a incidência de ECG alterados e diminui a progressão da cardiopatia já instalada. Diante das dúvidas e controvérsias sobre os efeitos benéficos do tratamento em pacientes com alterações cardíacas evidentes justifica-se o projeto BENEFIT que já se encontra em andamento (MARIN-NETO et al. 2009). Avaliando a evolução clínica dos pacientes tratados e não tratados que apresentavam a forma indeterminada da doença antes do tratamento, constatou-se evolução clínica em 17,4% (4/23) dos pacientes tratados e em 56,5% (12/23) dos não tratados. Estes resultados demonstram que o tratamento pode prevenir a evolução da doença e revela o bom prognóstico dos pacientes chagásicos tratados na forma indeterminada, corroborando assim os trabalhos de outros autores (GALLERANO & SOSA, 2000; VIOTTI et al., 2006). Quando os grupos de pacientes tratados e não tratados que apresentavam alguma alteração cardíaca ou digestiva em 1997 foram avaliados constatou-se progressão clínica em 67% (4/6) dos pacientes tratados e em 100% (6/6) dos não 88

107 Discussão tratados o que reforça as evidências de que o tratamento etiológico contribui para retardar a evolução clínica da doença de Chagas mesmo em situações onde a cura parasitológica não foi constatada. 89

108 6 - CONCLUSÕES

109 Conclusões 1 O critério mais rigoroso de cura da doença de Chagas (três testes sorológicos negativos) na casuística completa de pacientes chagásicos do município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, tratados com benzonidazol apresentou resultados mais coerentes com os métodos parasitológicos e sorológicos alternativos empregados no monitoramento da efetividade terapêutica, revelando um percentual de cura parasitológica igual a 7,4%. 2 As associações dos métodos sorológicos convencionais ELISA+IFI e IFI+HAI apresentaram resultados bastante similares ao critério mais rigoroso de cura e podem ser indicadas na avaliação da eficiência terapêutica. 3 Nenhum teste da sorologia alternativa (rec-elisa e FC-ALTA), empregado isoladamente ou em associação, pode ser utilizado no monitoramento de cura parasitológica da doença de Chagas. 4 - A técnica de PCR apresentou resultados negativos em coerência com os demais métodos sorológicos e parasitológicos empregados como critério de cura. 5 Os pacientes categorizados como TEA merecem avaliações futuras com todas as metodologias aqui empregadas no monitoramento de cura, pois muitos já apresentam HC e PCR negativos em todas as avaliações realizadas. 6 - Foi constatado no grupo TC um maior percentual de pacientes na forma clínica indeterminada, um menor percentual de forma cardíaca e ausência da forma digestiva, sugerindo ação benéfica do tratamento na evolução da doença. 7 O estudo longitudinal em parte da casuística (29/94) não constatou cura parasitológica em nenhum paciente e nem queda sorológica entre as amostras coletadas no tempo zero, nove e treze anos pós-tratamento, demonstrando alta resistência dos parasitos presentes em pacientes da região ao benzonidazol. 91

110 Conclusões 8 Neste estudo o índice de evolução clínica dos pacientes chagásicos tratados na forma indeterminada foi quatro vezes menor quando comparado com aqueles que apresentavam alguma alteração cardíaca ou digestiva antes do tratamento, sugerindo que o tratamento apresenta maior benefício quando administrado em pacientes sem alterações clínicas decorrentes da infecção. 9 O estudo de intervenção demonstrou que a técnica de hemocultura apresenta maior percentual de positividade nos pacientes não tratados (27,6%) quando comparados com os tratados (6,9%) reforçando a importância do tratamento na redução da parasitemia. 10 Nos pacientes tratados foi observada uma queda sorológica significativa na teste de ELISA quando comparados com os não tratados, sendo esta mais elevada nos pacientes tratados na forma indeterminada. 11 Os pacientes tratados apresentaram menor evolução clínica quando comparados com os não tratados (27,6 % versus 65,5%), demonstrando mais uma vez o real benefício do tratamento na evolução clínica da doença. 12 Os pacientes tratados na forma indeterminada apresentaram menor percentual de evolução clínica que os pacientes não tratados (17,4% versus 56,5%), reforçando assim o bom prognóstico apresentado pelos pacientes tratados com benzonidazol, especialmente quando o tratamento foi instituído em pacientes portadores da forma indeterminada da doença de Chagas. 92

111 7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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132 Referências Bibliográficas chagasic patients treated with itraconazole or allopurinol. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 48: ,

133 8 - ANEXOS

134 Anexos Anexo I TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO Eu,...ou meu responsável... tenho conhecimento de minha participação como voluntário no projeto de pesquisa Inquérito sorológico sobre doença de Chagas no municípios de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, antes e após a implantação da vigilância epidemiológica desenvolvido sob a responsabilidade da Pesquisadora: Dra. Marta de Lana da Universidade Federal de Ouro Preto e do médico..., endereço..., telefone...que tem como objetivo realizar um inquérito sorológico sobre a doença de Chagas em escolares, diagnóstico e tratamento dos casos positivos. A doença de Chagas é uma doença crônica degenerativa, de evolução lenta que atinge especialmente o coração (aumento da área cardíaca, insuficiência cardíaca, risco de morte súbita) e o trato gastro-intestinal (megaesôfago e megacólon). O tratamento será feito com o Rochagan (benznidazol), em esquema prolongado, 5 a 10 mg/kg/dia, via oral, durante 60 dias consecutivos, sob supervisão médica e controle da leucometria. A minha participação é voluntária e será restrita a doação de sangue para diagnóstico, isolamento do parasita, recebimento de tratamento com benznidazole (Rochagan) e controle de cura da infecção. O sangue será coletado por picada na polpa digital (inquérito sorológico em escolares), por via endovenosa (confirmação do diagnóstico da doença de Chagas, controle de cura pela sorologia e PCR), ou para realização da hemocultura (diagnóstico parasitológico e isolamento do parasita antes do tratamento) utilizando seringa e agulha estéreis e descartáveis, ou seja, de uso individual e seguro. O volume de sangue a ser coletado poderá variar de 3ml e no caso da hemocultura, de 30 ml em função do peso do paciente. Fui informado que caso se confirme o meu diagnóstico para doença de Chagas me será oferecido tratamento em função de meu quadro clínico, o qual poderá acarretar ou não a cura da doença. Estou também informado que o tratamento causa efeitos colaterais que devem ser comunicados ao meu médico para o devido controle ou mesmo interrupção do tratamento, se necessário. Tenho consciência que a minha participação como voluntário não me trará nenhum benefício financeiro. Os exames de procedimentos aplicados serão gratuitos e receberei atenção médica adequada para o controle dos efeitos adversos que possam ocorrer em conseqüência do tratamento e também para verificar se houve cura da infecção. Poderei a qualquer momento me retirar do projeto de pesquisa por qualquer motivo, o que pode acarretar prejuízo no efeito do tratamento. Isto não implica na interrupção de meu atendimento pelo meu médico no tocante à doença de Chagas. Tal procedimento também não acarretará em prejuízos a outros pacientes ou membros de minha família. Um eventual corte de recursos do projeto não acarretará interrupção de meu tratamento e nem de meu atendimento por meu médico...tel:...no tocante à doença de Chagas. Local e data: Assinatura do voluntário ou seu responsável: Assinatura do pesquisador responsável: 116

135 Anexos Anexo II Primeira parte FICHA EPIDEMIOLÓGICA E CLÍNICA Município de Berilo e José Gonçalves de Minas - MG Nº de Registro no SUS: Código projeto: Médico responsável: Dr/a. Data: / / DADOS PESSOAIS Nome (completo): Apelido: Idade: Data de Nascimento: / / Sexo: (1) Masculino (2) Feminino Nome do pai: Nome da mãe: Endereço/comunidade: Alguma referência perto do endereço: Profissão: Estudos: (1) analfabeto (2) 1º grau incompleto (3) 1º grau completo (4) 2º grau incompleto (5) 2º grau completo (6) estudos superiores Você fuma? (1) sim (2) não Quanto por semana? Você toma bebidas com álcool? (1) de alto teor (cachaça, conhaque...) (2) de baixo teor (cerveja, vinho...) (3) nada Quanto por semana? Você faz exercício físico? (1) Leve (andar a pé distâncias curtas sem carregar peso) (2) Moderado (intermédio entre 1 e 3) (3) Intenso (carregar pedras, trabalhar no machado...) RESIDÊNCIAS ANTERIORES Lugar de residência Anos de residência Piso Parede Teto Códigos da tabela: Piso: (1) alvenaria/cemento; (2) barro/adobe; (3) madeira. Parede: (1) alvenaria/cimento; (2) barro/adobe; (3) madeira. Teto: (4) laje; (5) telha; (6) sapé; (7) madeira/amianto/pvc RESIDÊNCIA ATUAL Anos de residência: Casa própria: (1) sim (2) não (3) não sei Alugada: (1) sim (2) não (3) não sei Emprestada/cedida: (1) sim (2) não (3) não sei Piso: (1) alvenaria; (2) barro/adobe; (3) madeira Parede :(1) alvenaria; (2) barro/adobe; (3) madeira Teto: (4) laje; (5) telha; (6) sapé; (7) madeira/amianto/pvc DIVERSOS 117

136 Anexos Água encanada (dentro ou fora de casa): (1) sim (2) não Água de córrego/rio: (1) sim (2) não Dejetos (cocô...) vão para esgoto? (1) sim (2) não Dejetos (cocô...) ficam ao ar livre? (1) sim (2) não Eletricidade: (1) sim (2) não Rádio: (1) sim (2) não Você tem horta no quintal? (1) sim (2) não Você tem cão? (1) sim (2) não Você viu gambá na sua casa? (1) sim (2) não Você viu ratos na sua casa? (1) sim (2) não Água de poço: (1) sim (2) não Caminhão pipa: (1) sim (2) não Dejetos (cocô...) vão para fossa? (1) sim (2) não Geladeira: (1) sim (2) não TV: (1) sim (2) não Galinheiro: (1) sim (2) não Você tem gato? (1)sim (2) não Você viu sarué na sua casa? (1) sim (2) não BARBEIRO (Realizar teste de reconhecimento com caixinha) Reconheceu o barbeiro? (1) sim (2) não (3) não sei Reconheceu a espécie? (1) P. megistus (2) P. geniculatus (3) T. sordida (4) T. pseudomaculata (5) R. neglectus (6) não sei Onde o viu? (1) dentro de casa (2) peridomicílio (ao redor de casa) (3) longe de casa (roça, outros...) Já foi picado por ele alguma vez? (1) sim (2) não (3) não sei Como o viu? Quando o viu? HISTÓRIA CLÍNICA ANTECEDENTES TRANSFUSIONAIS Você já doou sangue? (1) sim (2) não Você recebeu sangue? (1) sim (2) não (3) não sei Quantas vezes? Quando (em que ano)? ANTECEDENTES OBSTÉTRICOS Nº de gravidezes: Nº de abortos (perdas com menos de 20 semanas): Nº de partos: Nº cesárias: Nº de filhos nascidos vivos: Nº de prematuros (entre 20 e 38 semanas): Nº de filhos com baixo peso (< 2.500g): Problemas ou doenças durante a gestação (sangramento, pressão alta, açúcar alto, infecções...): Observação: Perguntar quantas consultas pré-natal fez nas gestações ou partos complicados. ANTECEDENTES PESSOAIS RELATIVOS À DOENÇA DE CHAGAS Você tem doença de Chagas? (1) sim (2) não (3) não sei Você tem algum problema no coração? (1) sim (2) não (3) não sei Você tem algum problema no esôfago (entalo/engasgo) ou no intestino grosso? (1) sim (2) não (3) não sei Como você descobriu que tinha doença de Chagas? (1) na consulta com o médico (2) com exame que confirmou a doença (anexar resultados) Quais? (3) não sei Há quanto tempo você sabe que tem doença de Chagas? anos Você está em tratamento de doença de Chagas? (1) sim (2) não (3) não sei Quais os medicamentos que você usa no momento para doença de Chagas? (0) nenhum (1) Rochagan (2) Lampit (3) outro (8) não sabe 118

137 Anexos Se outro, cite o medicamento: HISTÓRIA FAMILIAR DE DOENÇA DE CHAGAS Atualmente há alguém com problema no coração na sua família? (1) sim (2) não (3) não sei Qual é o grau de parentesco? (1) pai (2) mãe (3) irmão (4) filho (5) tio (6) primo carnal (7) sobrinho (8) avô paterno (9) avó paterna (10) avô materno (11) avó materna (12) outros: Há alguém com problema no esôfago (entalo) ou intestino grosso na família? (1) sim (2) não (3) não sei Qual é o grau de parentesco? (1) pai (2) mãe (3) irmão (4) filho (5) tio (6) primo carnal (7) sobrinho (8) avô paterno (9) avó paterna (10) avô materno (11) avó materna (12) outros: Atualmente há alguém com outras doenças na sua família: Atualmente você tem parentes com doença de Chagas? (1) sim (2) não (3) não sei Qual é o grau de parentesco? (1) pai (2) mãe (3) irmão (4) filho (5) tio (6) primo carnal (7) sobrinho (8) avô paterno (9) avó paterna (10) avô materno (11) avó materna (12) outros: Você tem parentes falecidos com doença de Chagas? (1) sim (2) não (3) não sei Quantos? Há quanto tempo faleceram? anos Qual é o grau de parentesco? (1) pai (2) mãe (3) irmão (4) filho (5) tio (6) primo carnal (7) sobrinho (8) avô paterno (9) avó paterna (10) avô materno (11) avó materna (12) outros: Você tem parentes que morreram de repente? (1) sim (2) não (8) não sei Qual é o grau de parentesco? (1) pai (2) mãe (3) irmão (4) filho (5) tio (6) primo carnal (7) sobrinho (8) avô paterno (9) avó paterna (10) avô materno (11) avó materna (12) outros: HISTÓRIA DE INTERNAÇÃO, TRATAMENTO E APOSENTADORIA Você já foi internado por causa da doença de Chagas? (1) sim (2) não (8) não sei Há quanto tempo? Em que hospital ou cidade? Você consultou com cardiologista devido à doença de Chagas? (1) sim (2) não (8) não sei Em que hospital ou cidade? Você já usou: (1) Rochagan (2) Lampit (3) nenhum (4) não sei Quantas vezes? Quando? Você tem receitas do tratamento? (citar/anexar) (1) sim (2) não (3) não sei Quantos comprimidos ao dia? Quantos vidros? Por quanto tempo? Em qual município você foi tratado? 119

138 Anexos Você apresentou alguma reação de mal estar durante o tratamento? (1) sim (2) não (3) não sei Qual/quais? Quando? Foi preciso parar o tratamento? (1) sim (2) não (3) não sei Quando? Foi feita mudança na forma de tratamento? (1) sim (2) não (3) não sei Quando? Você já é aposentado por Doença de Chagas? (1) sim (2) não anos Há quanto tempo? HISTÓRIA DOS EXAMES LABORATORIAIS Quais os exames (com seus resultados) que você fez durante o tratamento? Você tem algum dos exames com você? (citar/anexar) (1) sim (2) não (3) não sei DÚVIDAS SOBRE A DOENÇA E O TRATAMENTO Você tem alguma dúvida sobre a Doença de Chagas? Você tem alguma dúvida sobre o tratamento com Rochagan? Segunda parte FICHA MÉDICA Município de Berilo e José Gonçalves de Minas - MG Nº de Registro no SUS: Código projeto: Médico responsável: Dr/a. Data: / / ANAMNESE Queixa principal: Doenças atuais: (1) Diabete (2) Hipertensão Outras (citar): Sintomatologia respiratória (dispnéia, quase sempre aos esforços, ortopnéia, etc.): Sintomatologia cardiovascular (fadiga aos esforços, astenia, palpitações, tonturas, vertígens, lipotimia, síncope, escurecimento da vista, confusão mental, dor precordial de características anginóides ou não, edema de membros inferiores, manifestações tromboembólicas pulmonares ou sistêmicas, etc.): 120

139 Anexos Disfagia com comida fria? (1) sim (2) não Disfagia com comida seca? (1) sim (2) não Precisa água para engolir alimentos? (1) sim (2) não Regurgitação? (1) sim (2) não Odinofagia (durante a ingestão de alimentos)? (1) sim (2) não Pirose (ardor, queimação...)? (1) sim (2) não Dor esofagiana retroesternal (independente das refeições, espontânea, urente, constritiva...)? (1) sim (2) não Singulto (soluço)? (1) sim (2) não Náuseas? (1) sim (2) não Tosse? (1) sim (2) não Sialose (hipersalivação)? (1) sim (2) não Obstipação intestinal? (1) sim (2) não Nº evacuações por mês: Meteorismo? (1) sim (2) não Distensão abdominal? (1) sim (2) não Disquezia (dificuldade para evacuar)? (1) sim (2) não Sensação de peso no hipocôndrio direito? (1) sim (2) não Dores no hipocôndrio direito? (1) sim (2) não Sensação de peso na região epigástrica? (1) sim (2) não Dores epigástricas? (1) sim (2) não Sintomatologia urinária (disúria, polaquiúria, tenesmo, hematúria, oligúria): DUM: / / EXAME FÍSICO Peso: Altura: IMC [Kg/(altura em metros) 2 ]: Temperatura axial: (1) <37º (2) 37-38º (3) >38º Pulso: bpm (1) regular (2) irregular PA sistólica: mm Hg PA diastólica: mm Hg Estado Geral (astenia, anorexia, desnutrição, obnubilação com sudorese e pele fria...): Coloração mucocutânea: (1) Normal (2) Palidez (3) Cianose (4) Outra: Hidratação mucocutânea: (1) Normal (2) Deshidratação Sinal de Romaña (edema bipalpebral unilateral elástico, indolor, de coloração róseo-violácea, com adenopatias pré-auriculares, parotídeas ou submaxilares...)? (1) sim (2) não Chagoma (lesão em partes descobertas, sobrelevada, eritematosa, dura, pouco dolorosa, com linfonodos satélites, etc.)? (1) sim (2) não Edema subcutâneo (localizado ou generalizado, com ou sem insuf. Cardíaca)? (1) sim (2) não Características: Adenopatias? (1) sim (2) não Características (hipertrofia leve ou moderada, não aderentes aos planos contíguos, isoladas, indolores...): Hipertrofia parótidas: (1) sim (2) não Ictus cordis: (1) desviado (2) normal Características do desvio: Ingurgitação jugular (a 45º...)? (1) sim (2) não Bulhas: (1) normofonéticas (2) hipofonéticas Desdobramento B2 (foco pulmonar): (1) sim (2) não Nº de extrasístoles por minuto: Sopro: (1) sim (2) não 121

140 Anexos Características do sopro (proto, meso, tele ou pan-sistólico, diastólico, focalidade mitral, tricúspide, aórtica ou pulmonar, etc.): Sinais respiratórios (estertores finos e crepitantes nas bases, ortopnéia, etc.): Distensão abdominal (abdome globoso, assimétrico...)? (1)sim (2)não Timpanismo na percussão abdominal (presença de gases na alça dilatada, no hipocôndrio esquerdo se houver retenção de gases no ângulo esplênico do colo, etc.)? (1)sim (2)não Palpação de fecaloma (tumor inelástico, que cede à compressão sem retornar à sua forma primitiva...)? (1)sim (2)não Hepatomegalia? (1) sim (2) não Quantos cm abaixo da reborda costal direita? Consistência alterada? (1) sim (2) não Superfície lisa? (1) sim (2) não Esplenomegalia? (1) sim (2) não Consistência alterada? (1) sim (2) não Quantos cm abaixo da reborda costal esquerda? Superfície lisa? (1) sim (2) não Alteração do SNC? (1) sim (2) não Qual/Quais (rigidez de nuca, convulsões generalizadas, focalidade neurológica, etc.): Alteração dos reflexos osteotendinosos? (1) sim (2) não Alteração da sensibilidade superficial? (1) sim (2) não Alterações do sistema neurovegetativo (obnubilação com sudorese e pele fria...)? (1) sim (2) não Outros: Terceira parte FICHA DE EXAMES COMPLEMENTARES Município de Berilo e José Gonçalves de Minas - MG Nº de Registro no SUS: Código projeto: Médico responsável: Dr/a. Exame Data Resultado Observações 1 RX tórax (1) N (2) AN 2 ECG* (1) N (2) AN 3 Ecocardiograma (1) N (2) AN 4 Prova de esforço (1) N (2) AN 5 Esofagograma (1) N (2) AN 6 Colonoscopia (1) N (2) AN 7 Hemaglutinação (1) N (2) AN 8 ELISA (1) N (2) AN 9 Imunofluorescência (IFI) (1) N (2) AN 10 AATV (citometria de fluxo) (1) N (2) AN 122

141 Anexos 11 Hemocultura (1) N (2) AN 12 PCR (1) N (2) AN 13 Xenodiagnóstico (1) N (2) AN 14 Perfil de citocinas (1) N (2) AN 15 EPF (1) N (2) AN 16 Hemograma (1) N (2) AN 17 Leucograma (1) N (2) AN 18 GOT/GPT (1) N (2) AN 19 Bilirrubina T/C (1) N (2) AN 20 Uréia/Creatinina (1) N (2) AN 21 (1) N (2) AN 22 (1) N (2) AN 23 (1) N (2) AN 24 (1) N (2) AN 25 (1) N (2) AN 26 (1) N (2) AN 27 (1) N (2) AN 28 (1) N (2) AN 29 (1) N (2) AN 30 (1) N (2) AN 31 (1) N (2) AN 32 (1) N (2) AN 33 (1) N (2) AN 34 (1) N (2) AN Código da tabela: N = resultado normal; AN = resultado anormal Cepa Isolada: (1) sim (2) não Data: / / * Alterações eletrocardiográficas sugestivas de cardiopatia chagásica são: bloqueio de ramo direito, hemi-bloqueio anterior esquerdo (ou bloqueio da divisão antero-superior do ramo esquerdo), bloqueio atrioventricular, bradicardia sinusal e batimentos ventriculares prematuros superiores a três por minuto e quando acompanhados de bradicardia. Infecção chagásica: (1) sim (2) não CONCLUSÕES Forma Indeterminada (I Reunião de Pesquisa Aplicada em Doença de Chagas ): (1) sim (2) não (1) Positividade de exames sorológicos e/ou parasitológicos; ausência de sintomas e/ou sinais de doença; eletrocardiograma convencional normal; coração, esôfago e cólon radiologicamente normais. Forma Cardíaca (Classificação da OMS 1971): (1) (2) (3) (4) (1) infecção sem evidência clínica, radiológica ou eletrocardiográfica. (2) sintomatologia ausente ou discreta, área cardíaca normal ou levemente aumentada no RX, alterações no ECG: bloqueio completo de ramo direito, distúrbios da repolarização ventricular, extrasístoles ventriculares. (3) sintomatologia evidente, cardiomegalia moderada e alterações no ECG: bloqueiro completo de ramo direito com desvio do eixo elétrico para a esquerda, zonas eletricamente inativas. (4) insuficiência cardíaca, cardiomegalia nítida no RX e severas e numerosas alterações no ECG: arritmias compleas e graves, extensas zonas eletricamente inativas. 123

142 Anexos Forma Digestiva Esofagopatia (Classificação de Rezende et al. 1960): (0) (1) (2) (3) (4) (0) Normalidade. (1) Grupo I há retardo no esvaziamento esofágico, sem dilatação (2) Grupo II, se além do retardo no esvaziamento ha dilatação leve a moderada (até 5cm). (3) Grupo III, se dilatação é grande (> 5cm), com hipotonia no esôfago inferior. (4) Grupo IV ou dólico-megaesôfago, se além do mais o esôfago alongado, dobrado sobre si mesmo no terço inferior. Colonopatia: (1) (2) (1) Dentro da normalidade. (2) Dilatação colonoscópica no adulto > a 7cm. Comprometimento do SNC (meningoencefalite): (1) sim (2) não Outra(s) doença(s) concomitantes: (1) sim (2) não Citar: ENCAMINHAMENTOS REALIZADOS Data: / / Obs: Data: / / Obs: Data: / / Obs: Data: / / Obs: Data: / / Obs: 124

143 Anexos Anexo III A Classificação funcional da New York Heart Association (NYHA) proporciona um meio simples de classificar a extensão da insuficiência cardíaca. Categoriza os doentes em uma de quatro categorias baseada na limitação da atividade física (dispnéia e angina de peito). Classe NYHA I II III IV Sem sintomas e nenhuma limitação em atividades rotineiras; mais de 6 METs na ergonometria; Leves sintomas e limitações em atividades rotineiras. Confortáveis no repouso. De 4 a 6 METs na ergonometria; Com limitação importante na atividade física; atividades menores que as rotineiras produzem sintomas. Confortáveis somente em repouso. 2-4 METs na ergonometria; e Severas limitações. Sintomas presentes mesmo em repouso. Não tolera a ergonometria. References: The Criteria Committee for the New York Heart Association. Nomenclature and Criteria for Disease Sixth Edition. Little Brown and Company, The Criteria Committee for the New York Heart Association. Nomenclature and Criteria for Diagnosis of Diseases of the Heart and Great Vessels Ninth Edition. Little Brown and Company, pages ,

144 Anexos Anexo IV Artigo submetido 126