Rastreamento da mutação 419 C>T (A140V) no gene MECP2, um regulador transcricional, em portadores de disfunções neurológicas

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1 UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO CENTRO BIOMÉDICO FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOPATOLOGIA CLÍNICA E EXPERIMENTAL (CLINEX) Rastreamento da mutação 419 C>T (A140V) no gene MECP2, um regulador transcricional, em portadores de disfunções neurológicas Jussara Mendonça dos Santos Rio de Janeiro 2004

2 UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO CENTRO BIOMÉDICO FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOPATOLOGIA CLÍNICA E EXPERIMENTAL (CLINEX) Rastreamento da mutação 419 C>T (A140V) no gene MECP2, um regulador transcricional, em portadores de disfunções neurológicas Jussara Mendonça dos Santos Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Fisiopatologia Clínica e Experimental da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ) visando a obtenção do título de Mestre em Ciências - Fisiopatologia Clínica e Experimental. Rio de Janeiro 2004

3 FICHA CATALOGRÁFICA Santos, Jussara Mendonça Rastreamento da mutação 419 C>T (A140V) no gene MECP2, um regulador transcricional, em portadores de disfunções neurológicas / Jussara Mendonça dos Santos. Rio de Janeiro, UERJ, Centro Biomédico, Faculdade de Ciências Médicas, xiii, 85 p., il. Orientadoras: Márcia Mattos Gonçalves Pimentel Cíntia Barros Santos Dissertação (Mestrado) Universidade do Estado do Rio de Janeiro UERJ, Centro Biomédico, Faculdades de Ciências Médicas. 1. MECP2. 2. Retardo Mental. 3. Remodelagem da cromatina. 4. Metilação do DNA. I. Márcia Mattos Gonçalves Pimentel / Cíntia Barros Santos. II. Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Centro Biomédico. Faculdade de Ciências Médicas. III. Título.

4 UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO CENTRO BIOMÉDICO FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOPATOLOGIA CLÍNICA E EXPERIMENTAL (CLINEX) Rastreamento da mutação 419 C>T (A140V) no gene MECP2, um regulador transcricional, em portadores de disfunções neurológicas Jussara Mendonça dos Santos Orientadoras: Prof. Drª Márcia Mattos Gonçalves Pimentel Prof. Drª Cíntia Barros Santos Aprovada em de de 2004 pela banca examinadora: Prof. Drª Teresa de Souza Fernandez Prof. Drª Jacyara Maria Brito Macedo Prof. Dr Jerson Laks Rio de Janeiro 2004

5 Senhor Deus, muito obrigado por existir em minha vida.

6 AGRADECIMENTOS A Deus, por me conceder sempre um novo dia para repensar os meus erros e tentar melhorar. Aos meus pais e familiares pelo carinho, apoio e compreensão pelas minhas constantes ausências em suas vidas. À Juciara pelo carinho e ajuda inestimável no cuidado com o Tonho, me aliviando de várias tarefas domésticas e me ajudando nos momentos difíceis. As minhas orientadoras Drª Márcia Pimentel e Drª Cíntia Barros Santos pela amizade, total confiança e oportunidade de realizar este trabalho. Agradeço muito pela generosidade com que se dispuseram do tempo de vocês, compartilhando comigo seus vastos conhecimentos científicos e profissionais. A minha tia Melli, exemplo de dedicação e paciência, pelo incentivo e carinho incondicional. Ao Temperini pelo carinho, companheirismo e paciência que só os grandes amigos possuem. Ao amigo Marcos Aurelio que mesmo com seu jeito de fera indomável é uma pessoa especial. Ao Victor Paulo, pela amizade e ajuda pessoal. Sua competência e profissionalismo são fontes inspiradoras. Aos pacientes e seus responsáveis, que foram essenciais para a realização deste trabalho. A Drª Sabine Klauck por ter gentilmente nos enviado uma amostra de um paciente com a mutação A140V para uso como controle positivo em nossos experimentos. Aos companheiros Cláudia e Mário pelos momentos de descontração e grande ajuda na parte experimental deste trabalho. Aos colegas de trabalho do Laboratório de Genética: Karla, Raquel, Stênio, Andrícia e Aline pelo período de convivência. À Lúcia Helena, pela amizade e por estar sempre disposta a ajudar. À Socorro, pelo incentivo e amizade. As amigas Andréia, Cristiane e Ana Paula pelas horas descontraídas que passamos juntas durante o curso. À Dra. Teresa de Souza Fernandez pela revisão deste trabalho. Aos professores, funcionários e alunos do Departamento de Biologia Celular e Genética pelo incentivo e convivência. E a todos que direta ou indiretamente tenham colaborado para a realização deste trabalho.

7 vi LISTA DE QUADROS, TABELAS E ANEXOS Quadro 1: Genes ligados ao X associados ao retardo mental sindrômico. Quadro 2: Genes ligados ao X associados ao retardo mental não sindrômico. Quadro 3: Genes ligados ao X associados tanto às formas sindrômicas quanto nãosindrômicas de retardo mental. Quadro 4: Oligonucleotídeos utilizados para o rastreamento da mutação 419C>T (A140V). Quadro 5: Freqüência da mutação A140V no gene MECP2 em diferentes estudos populacionais. Tabela 1: Localização de mutações no gene MECP2 identificadas em indivíduos do sexo masculino e fenótipos associados. Anexo 1: Carta de aprovação do projeto junto ao Comitê de Ética do Hospital Universitário Pedro Ernesto. Anexo 2: Termo de consentimento informado. Anexo 3a: Dados referentes aos indivíduos portadores de RM sindrômico. Anexo 3b: Dados referentes aos indivíduos portadores de RM não-sindrômico. Anexo 3c: Dados referentes aos indivíduos portadores de RM que não foram classificados clinicamente quanto à forma de RM. Anexo 4: Manuscrito submetido à revista Neuroscience Letters.

8 vii LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 - Famílias de proteínas com domínios de ligação a regiões metiladas (MBD). Figura 2: Participação da proteína MeCP2 na remodelagem da cromatina. Figura 3: Esquema do gene MECP2. Figura 4: Esquema mostrando a técnica de PCR-RFLP para a análise da mutação 419 C>T. Figura 5: Dispersão das idades apresentadas pelos pacientes avaliados neste estudo. Figura 6: Classificação do RM presente nos indivíduos analisados em casos isolados e familiares. Figura 7: Representação gráfica do percentual de pacientes com RM associado ou não a distúrbios psiquiátricos. Figura 8: Eletroforese em gel de poliacrilamida utilizado na análise da mutação 419 C>T (A140V), após digestão dos fragmentos amplificados com a enzima AccI.

9 viii LISTAS DE SIGLAS E ABREVIATURAS A - adenina Acc1 enzima de restrição Acinetobacter calcoaceticus APS persulfato de amônio ARX gene homeobox associado a malformações cerebrais e diversos tipos de câncer. ATRX gene relacionado à síndrome ATRX (α-talassemia) quando mutado BSA- albumina de soro bovino C- citosina datp 2 desoxiadenosina 5 - trifosfato dctp - 2 desoxicitidina 5 - trifosfato dgtp - 2 desoxiguanosina 5 - trifosfato dttp - 2 desoxitimidina 5 - trifosfato DNA ácido desoxirribonucléico DNMT1 enzima DNA metiltransferase 1 DNMT3A - enzima DNA metiltransferase 3A DNMT3B - enzima DNA metiltransferase 3B dntps - desoxirribonucleotídeos EDTA ácido etileno-diamino-tetracético FMR1 Fragile Mental Retardation 1 FMR2 Fragile Mental Retardation 2 g - grama G - guanina HAT- histona acetil transferase HDAC- complexo de histona desacetilase ICF síndrome relacionada à imunodeficiência de instabilidade da heterocromatina pericentromérica e anomalias faciais. Ilha CpG região rica em dinucleotídeos citosina e guanina, ligados covalentemente

10 ix Kb quilobase KDa quilodalton M- molar MBD domínio de ligação ao DNA metilado MBD1 Methyl binding domain protein 1 MBD2a Methyl binding domain protein 2a MBD2b - Methyl binding domain protein 2b MBD3 Methyl binding domain protein 3 MBD4 - Methyl binding domain protein 4 mc citosinas metiladas MeCP1 - Methyl-cytosine binding protein 1 MeCP2 Methyl-cytosine binding protein 2 MECP2 gene da Methyl-cytosine binding protein 2 mg - miligrama ml - mililitro mm - milimolar MTHFR gene da metilenotetraidrofolato redutase pb pares de bases PCR reação em cadeia da polimerase ph potencial hidrogeniônico pmol picomol PPM X síndrome caracterizada por RM, psicose maníaco-depressiva, sinais piramidais e macroorquidismo q braço longo de um cromossomo QI coeficiente de inteligência RFLP polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição RM retardo mental RMLX retardo mental ligado ao cromossomo X

11 x RMXS retardo mental ligado a X sindrômico RMX - retardo mental ligado a X inespecífico RNA ácido ribonucléico RNAm ácido ribonucléico mensageiro rpm rotações por minuto SDS dodecil sulfato de sódio SERVGEN Serviço de Genética Humana da UERJ Sin3a complexo co-repressor que atua no domínio TRD SSC solução salina-citrato de sódio T - timina Taq Thermus aquaticus TBE tampão tris-borato-edta TEMED - N N N N tetrametiletilenodiamina TRD domínio de repressão transcricional Tris trihidroximetil aminometano U unidades UTR região não traduzida do gene V volts μg micrograma μm - micromolar μl - microlitros ηg - nanograma

12 xi SUMÁRIO LISTA DE QUADROS E TABELAS LISTA DE ILUSTRAÇÃO LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS RESUMO ABSTRACT Página vi vii viii xii xiii 1- INTRODUÇÃO Regulação da Expressão Gênica e seu papel na Remodelagem da Cromatina Metilação do DNA A acetilação e desacetilação de histonas A proteína MeCP O gene MECP Mutações no gene MECP Mutação 419C>T (A140V) Retardo Mental OBJETIVOS METODOLOGIA Pacientes investigados Coleta de material Extração de DNA Quantificação do DNA Triagem da mutação A140V no gene MECP Reação em Cadeia da Polimerase Preparo do Gel de Poliacrilamida 5% Coloração utilizando nitrato de prata Digestão com endonuclease de restrição e análise de RFLPs RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS 58

13 xii RESUMO Em mamíferos, a metilação dos dinucleotídeos CpG é um mecanismo natural que está associado a vários processos epigenéticos e é essencial para o controle da transcrição gênica. A descoberta de um grande número de genes relacionados a desordens reforça o papel da conformação da cromatina na doença humana. Várias patologias comportamentais e neurológicas têm sido associadas em mutações no gene MECP2 (OMIM ), localizado em Xq28. Este gene pertence a uma nova classe de genes envolvidos no remodelamento da cromatina e codifica a proteína MeCP2, uma reguladora importante da expressão gênica em humanos. A transição C>T na posição 419 (A140V), situada no éxon 4, representa a mais freqüente mutação MECP2 identificada em pacientes do sexo masculino e está associada com diferentes fenótipos, que incluem retardo mental e alterações psiquiátricas. Neste estudo, amostras de DNA de 366 indivíduos portadores de retardo mental sindrômico e não-sindrômico e outros distúrbios psiquiátricos foram triados para a mutação A140V (419C>T) no gene MECP2. O rastreamento molecular foi realizado através da metodologia de PCR-RFLP. Os produtos de PCR foram digeridos com a endonuclease de restrição Acc1 e analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida 6%, corado com nitrato de prata. Nenhuma mutação 419 C>T foi encontrada, sugerindo que a mutação A140V no gene MECP2 não é uma causa etiológica comum de retardo mental em homens. Estes resultados são similares aos de outro estudo previamente publicado. Recentemente, foi descrita uma nova e abundante isoforma da proteína MeCP2, a qual possui uma extremidade N-terminal diferencial traduzida a partir do éxon 1, anteriormente reconhecido como uma região não-codificante e, que por isso, tem sido excluído de muitos programas de triagem mutacional, bem como as regiões não-traduzidas 3 e 5. Consideramos essencial proceder uma triagem em toda a extensão do gene MECP2, utilizando uma amostra bem documentada de maior tamanho para assegurarmos a real contribuição do gene MECP2 para o retardo mental.

14 xiii ABSTRACT In mammals, methylation at CpG dinucleotides is a natural mechanism associated to several epigenetics process, which is essential for the control of gene transcription. The discovery of a large number of disorders related genes reinforces the role of chromatin conformation in human disease. Several neurological and behavioral pathologies have been related to mutations in the MECP2 gene (OMIM ), located at Xq28. This gene belongs to a new class of genes involved in the chromatin remodelling and codifies the methyl-cpg binding protein 2, an important regulator of the gene expression in humans. The C T transition at position 419 (A140V), located at exon 4, represents the most frequent MECP2 mutation identified in male patients and it is associated to different phenotypes including mental retardation and psychiatric alterations. In this study, DNA samples from 366 individuals with syndromic and non syndromic mental retardation and other psychiatric diseases were screened for A140V (419C>T) mutation in the MECP2 gene. The molecular screening was performed by the PCR-RFLP assay. The amplicons were digested with the AccI restriction enzyme and analysed by electrophoresis in 6% polyacrilamide gel stained by silver nitrate. No mutation at 419C>T was found, suggesting that the A140V mutation in the MECP2 gene is not a common etiological cause of mental retardation in males. These results are similar to another study previously published. Recently, a new and abundant isoform of MeCP2 was described, which has an alternative N-terminus, translated from exon 1, that was previously thought to be non-coding and has been excluded from many mutational screening, as well, the 5 and 3 UTR regions. We consider essential proceeding further screening in the whole extension of the MECP2 gene using clinically well-documented and larger sized sample to assure the overall contribution of MECP2 to mental retardation.

15 1- INTRODUÇÃO

16 Regulação da Expressão Gênica e seu papel na Remodelagem da Cromatina A cromatina é o elemento central de controle funcional do genoma dos eucariotos (Urnov, 2003). O empacotamento da cromatina desempenha um papel dinâmico na regulação da expressão gênica, a qual se dá através da alteração da estrutura do nucleossomo, envolvendo diversos mecanismos bioquímicos, como a metilação do DNA, a acetilação e desacetilação das histonas e o reposicionamento dos octâmeros dependente da hidrólise de ATP (Huang et al., 2003). Desta maneira, a transcrição gênica é, em parte, controlada pela forma através da qual o DNA está acessível à maquinaria transcricional. Conhecer quais fatores regulam o empacotamento da cromatina é revelar como a expressão gênica é controlada. Atualmente, sabe-se que, além dos fatores genéticos, outros fatores estão associados, afetando a expressão do gene ou as propriedades de seu produto. Estas variações adicionais podem atuar sobre a regulação de um gene alvo e não estão relacionadas com mudanças na seqüência do DNA, mas influenciam o padrão de replicação do DNA e são transmitidos da célula mãe para as células filhas (Russo et al., 1996). Os processos que produzem essas variações deixam o código genético intacto e são freqüentemente reversíveis. Estas marcas são denominadas como memória epigenética. Os recentes relatos sobre processos epigenéticos associados com doenças humanas reforçam a importância da estrutura da cromatina no controle da regulação gênica (Huang et al., 2003). Por esta razão, existe grande interesse na caracterização de proteínas que atuam direta ou indiretamente na remodelagem da cromatina e, conseqüentemente, influenciam muitos passos bioquímicos, incluindo o controle de genes envolvidos no desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC). Mutações que interferem na remodelagem da cromatina, em geral, afetam a

17 3 expressão de inúmeros genes causando diversas patologias as chamadas doenças da cromatina (Hendrich & Bickmore, 2001) Metilação do DNA A metilação do DNA é uma modificação epigenética que exerce um papel essencial no controle da expressão gênica em mamíferos, e ocorre pela adição enzimática de um grupo metil ao carbono 5 da citosina pelas DNA metiltransferases, originando a 5-metilcitosina, que é quimicamente instável e pode sofrer desaminação espontânea, dando origem à timina (Strachan & Read, 2002). Os grupos metil (CH 3 ) são fornecidos através de uma via metabólica complexa a partir da ingestão do ácido fólico (folato). Nesta via estarão participando produtos de vários genes, dentre estes, o MTHFR, que atua como um doador, fornecendo os radicais metil para várias reações celulares, como a síntese das bases purinas e pirimidinas, o reparo do DNA e a apoptose (Choi & Mason, 1998; Green & Miller, 1999; Duthie, 1999; Fenech, 2001). Em células de mamíferos foram caracterizadas três DNA metil transferases: DNMT1, DNMT3A e a DNMT3B (Bestor et al., 1988; Okano et al., 1998; Okano et al., 1999). A DNMT1 é expressa amplamente nos tecidos somáticos e é responsável pela metilação de novo, enquanto que a DNMT3A e a DNMT3B estão envolvidas no processo de manutenção da metilação (Costello & Plass, 2001). Em geral, os genomas de vertebrados são metilados e a maioria das 5- metilcitosinas do DNA está presente dentro de ilhas CpGs, que consistem em regiões ricas em dinucleotídeos CG ligados covalentemente (Riggs & Jones, 1983). Aproximadamente, 50-60% de todos os genes humanos transcritos pela RNA polimerase II contêm uma ilha CpG (Bird et al., 1985; Bird, 1992),

18 4 mostrando que os padrões de metilação dividem o genoma em regiões funcionalmente ativas e inativas (Antequara & Bird, 1993; Costelo & Plass, 2001; Jones & Takai, 2001). O Projeto Genoma Humano identificou cerca de ilhas CpGs (Venter et al., 2001). Genes associados a ilhas CpG incluem todos os genes de manutenção, que são amplamente expressos e cerca de 40% dos genes que possuem uma expressão tecido-específica (Larsen et al., 1992). Em mamíferos, o mecanismo de metilação dos dinucleotídeos CpG é necessário para o desenvolvimento embrionário normal (Bird, 1999; Robertson & Wolffe, 2000), pois quando padrões de metilação não são apropriadamente estabelecidos ou mantidos, doenças tão diversas como retardo mental (RM), deficiência imune e tumores herdados ou esporádicos podem surgir (Costello & Plass, 2001). O mecanismo de metilação do DNA está associado aos processos de: inativação do cromossomo X (Lyon, 1999), imprinting parental (Nicholls et al., 1998), controle da expressão gênica tecido específica (Bird & Wolffe,1999), proteção contra o ataque de parasitas (Bestor, 1998) e manutenção da integridade cromossômica (Costelo & Plass, 2001). A importância dos padrões de metilação do DNA para a saúde humana foi marcada pela recente identificação de mutações em genes envolvidos com a metilação, os quais estão associados a doenças. Mutações no gene da metiltransferase (DNMT3B) foram encontradas em pacientes com a síndrome ICF (OMIM ), na qual ocorre imunodeficiência associada com instabilidade da heterocromatina pericentromérica e anomalias faciais (Xu et al., 1999), enquanto que mutações em genes imprintados foram relacionadas às síndromes de Beckwith-Wiedemann (OMIM ), de Angelman (OMIM ) e de Prader- Willi (OMIM ).

19 A acetilação e desacetilação de histonas A acetilação de histonas é um processo que está diretamente ligado a mudanças na conformação da cromatina, e consiste na adição de grupamentos acetil (CH 3 CO) aos resíduos de lisina próximos à região N-terminal das histonas por enzimas acetiltransferases (HAT) específicas. Como as histonas acetiladas possuem uma afinidade menor pelo DNA do que, uma pela outra, a cromatina sofre uma descondensação parcial, facilitando a transcrição (Tse et al., 1998). Em oposição, a desacetilação de histonas consiste na retirada dos grupamentos acetil por enzimas desacetilases (HDAC), promovendo a repressão da expressão gênica. Recentemente, o processo de metilação do DNA e o de desacetilação de histonas mostraram estar associados (Newell-Price et al., 2000). Sabemos que a atividade transcricional está relacionada com o grau de compactação da cromatina e, portanto, a alteração de sua estrutura prejudica o acesso da maquinaria transcricional ao DNA (Otten & Tapscoot, 1995). Dois mecanismos têm sido propostos para explicar de que maneira a metilação bloqueia a transcrição (Nan et al., 1998; Johnson, 2000). O primeiro deles se refere à inibição da ligação de determinados fatores de transcrição às ilhas CpGs, que contêm sítios de reconhecimento. O segundo mecanismo envolve proteínas ou complexos protéicos que se ligam especificamente aos CpGs metilados e podem, indiretamente, limitar o acesso dos fatores de transcrição aos elementos reguladores. Estas proteínas fazem parte de uma família de proteínas nucleares (MeCP1, MeCP2, MBD1, MBD2a, MBD2b, MBD3 e MBD4) (Meechan et al., 1989; Lewis et al., 1992; Hendrich & Bird, 1998; Newell-Price et al., 2000), denominadas proteínas com domínios de ligação à metilcitosina (MBD), os quais são altamente conservados entre várias espécies desde Xenopus laevis até o homem (Amir et al., 1999) (Figura 1).

20 6 Colled coil Colled coil * a Colled coil b glicosilase Figura 1 - Famílias de proteínas com domínios de ligação a regiões metiladas (MBD). *Repressores transcricionais associados à desacetilases de histonas (presença de domínios TRD ou colled coil). Dois ou três domínios CXXC ocorrem na MBD1. O (GR) n do MBD2a refere-se a tratos de glicina-arginina. MBD4 exibe uma glicosilase de timina A proteína MeCP2 Mesmo tendo sido caracterizado após a identificação da MeCP1, o repressor transcricional MeCP2 (Methyl-CpG binding protein 2) foi considerado a primeira proteína identificada como um membro verdadeiro da família MBD, por ser o primeiro a manter uma ligação estável com o DNA metilado, ao contrário da MeCP1, que possui essa habilidade, porém sua ligação com o DNA é do tipo transitória. A MeCP2 é um polipeptídeo de ligação cromossômica abundante, amplamente expresso no cérebro, principalmente nos neurônios (Coy et al., 1999; Akbarian et al., 2001; Shahbazian et al., 2002) e apresenta peso molecular de 52 kda e 486 aminoácidos de extensão (Nan et al., 1998). Ele é codificado pelo gene MECP2 e possui três domínios funcionais: um domínio de ligação ao DNA metilado (MBD) com 85 aminoácidos (Amir et al., 1999); um domínio de interação com repressores de transcrição (TRD) com 104 aminoácidos de comprimento

21 7 (Jones et al., 1998) e um domínio carboxi-terminal (Miltenberger-Miltenyi & Laccone, 2003). Esta proteína possui duas isoformas resultantes do encadeamento alternativo de seu RNAm. A isoforma MeCP2A ou simplesmente MeCP2 é resultante da união dos éxons 3, 4 e parte do 2, enquanto que a isoforma MeCP2B resulta da união dos éxons 1, 3 e 4. Esta última é mais abundante do que a isoforma MeCP2A e possui na sua região N- terminal tratos de polialanina e poliglicina (Kriaucionis & Bird, 2004; Mnatzakanian et al., 2004). A capacidade da MeCP2 reprimir a expressão gênica envolve um complexo de desacetilação de histonas (Ng & Bird, 1999). Quando a MeCP2 se liga a seqüências promotoras CpG metiladas, seu domínio de repressão transcricional (TRD) recruta um complexo co-repressor constituído pelo fator Sin3A e desacetilases de histonas (HDAC); as histonas H3 e H4 nos nucleossomos são desacetiladas pelas HDACs (Jones et al., 1998; Nan et al., 1998; Ng & Bird, 1999). Estas últimas removem o grupamento acetil das histonas, alterando a conformação da cromatina, tornando-a compactada e inacessível aos ativadores transcricionais, resultando na repressão estável dos genes alvos (Jones et al., 1998; Ng & Bird, 1999; Bird & Wolffe, 1999). Na ausência da MeCP2, a cromatina pode ser capaz de adotar uma estrutura mais aberta, mais adequada à transcrição gênica (Ng & Bird, 1999; Nakao et al., 2001) (Figura 2).

22 8 (A) (B) Figura 2: Participação da proteína MeCP2 na remodelagem da cromatina. (A) função normal do gene MECP2. A proteína MeCP2 se liga aos resíduos de citosina metilados (mc, em vermelho) nas ilhas CpGs e recruta o fator Sin3A (em amarelo) e desacetilases de histonas (HDAC, em verde). A desacetilação das histonas compacta a cromatina (em preto) e silencia a transcrição. (B) função anormal do gene MECP2 devido a mutações. A proteína MeCP2 mutada não consegue se ligar aos resíduos de citosina metilados ou recrutar o fator Sin3A e desacetilases de histonas, levando à perda parcial ou total da repressão da transcrição O gene MECP2 O gene MECP2 (OMIM ) localiza-se em Xq28 (Figura 3), região rica em genes envolvidos com o retardo mental (D Espósito et al., 1996; Vilain et al., 1996). Trata-se de um gene altamente conservado entre as espécies, que é expresso durante a embriogênese (Coy et al., 1999). Este gene possui 76 kb de peso molecular, sendo composto por quatro éxons, com uma seqüência codificante de nucleotídeos, que compreende os éxons 1, 2, 3 e 4 (Dragich et al., 2000; Reichwald et al., 2000; Kriaucionis & Bird, 2004; Mnatzakanian et al., 2004). A seqüência que codifica o domínio MBD está localizada nos éxons 3 e 4, e a seqüência codificante do domínio TRD situa-se no éxon 4. Este quarto éxon contém uma grande região 3 UTR que possui 8,5 kb de comprimento e sítios de poliadenilação alternativos, os quais originam um transcrito maior de 10 kb, amplamente expresso no cérebro fetal, e um transcrito de 5 kb, expresso

23 9 no cérebro adulto (Coy et al., 1999). O gene MECP2 juntamente com os genes ATRX (Gibbons et al., 1995), RSK2 (Trivier et al., 1996) e ARX (Strömme et al., 2002) pertencem a uma nova categoria de genes relacionados aos processos de remodelagem da cromatina. (a) Cromossomo X (b) gene MECP2 (c) proteína MeCP2 Xq28 Figura 3: Esquema do gene MECP2 e sua proteína MeCP2: (a) localização do gene; (b) estrutura dos éxons e íntrons que o compõem; (c) MeCP2 e seus domínios Mutações no gene MECP2 Mutações no gene MECP2 podem causar mudanças na estrutura e conformação da proteína, incapacitando-a de atuar como uma repressora da transcrição. As primeiras alterações no gene MECP2 foram descritas na síndrome de Rett (OMIM ), uma desordem severa do neurodesenvolvimento, que afeta quase exclusivamente meninas, com uma incidência de 1 em nascimentos (Kozinetz et al., 1993; Hagberg et al., 2002) e representa uma das causas genéticas mais freqüentes de retardo mental (RM) grave em meninas.

24 10 Pacientes com a síndrome de Rett clássica se desenvolvem normalmente até os 6-18 meses de idade, quando se inicia uma regressão no neurodesenvolvimento, perdendo gradualmente a fala e as habilidades manuais. Elas desenvolvem microcefalia, RM severo, características autísticas, ataxia, alterações respiratórias e movimentos estereotipados das mãos (Hagberg et al, 1983; Obata et al., 2000; van den Veyer & Zoghbi, 2001; Bienvenu et al., 2000; Couvert et al., 2001). Depois desta fase de regressão inicial, a doença se estabiliza e as pacientes, geralmente, sobrevivem até a idade adulta. Em cerca de 99% dos casos, as mutações ocorrem de novo, refletindo a hipermutabilidade deste gene (Zoghbi, 1988; Engerstrom & Forslund, 1992). Devido a sua ocorrência em meninas, foi proposto que a síndrome de Rett seria causada por uma mutação dominante com letalidade em meninos, hemizigotos para genes localizados no cromossomo X (Wan et al., 1999). Atualmente, sabemos que as mutações no gene MECP2 não são, necessariamente, letais em meninos. Mutações neste gene foram descritas em indivíduos do sexo masculino com os seguintes quadros clínicos: RM severo (Clayton-Smith et al., 2000; Meloni et al., 2000; Willard & Hendrich, 2000), encefalopatia não progressiva (Imessaoudene et al., 2001), fenótipo semelhante ao da síndrome de Angelman (OMIM ) (Watson et al., 2001), RM ligado ao X não-sindrômico (RMX) (Orrico et al., 2000; Couvert et al., 2001), síndrome PPM-X (OMIM ) (Klauck et al., 2002) e esquizofrenia (Cohen et al., 2002). A reunião destes achados sugere, fortemente, que o gene MECP2 é um candidato em potencial para o estudo do RM sindrômico e não-sindrômico em meninos. A maioria das mutações no gene MECP2 em homens situa-se nos domínios MBD ou TRD (Tabela 1). As transições C>T no gene MECP2 representam a maioria das substituições de bases, ocorrendo em hotspots (Webb & Latif, 2001). Até o momento, 23 mutações MECP2 diferentes foram identificadas em 53 indivíduos

25 11 do sexo masculino com diferentes graus de RM associado ou não a outras características neurológicas (Moog et al., 2003; Miltenberger-Miltennyi & Laccone, 2003). Estas mutações distribuem-se em toda a extensão do gene. Todas as mutações MECP2 encontradas em homens com deficiência mental, com exceção da mutação T158M, não foram descritas em meninas com a síndrome de Rett, o que sugere que estas mutações possam ter efeitos deletérios menores no complexo de repressão/transcrição, no qual o gene MECP2 esteja envolvido (Couvert et al., 2001).

26 Tabela 1: Localização de mutações no gene MECP2 identificadas em indivíduos do sexo masculino e fenótipos associados. Domínio Mutação Nucleotídeo Fenótipos Casos Familiar (F) Referência (N) /Isolado (I) T158M 473 C>T Encefalopatia congênita severa, síndrome de Rett clássica e XXY 3 F Villard et al., 2000; Hoffbuhr et al., 2001; Leonard et al., 2001 P56fsX del2 Encefalopatia e síndrome de 2 NI Clayton-Smith et al., Angelman 2000; Watson et al., 2001 A140V 419 C>T RM severo, tremores e desordem de movimentos 4 F Orrico et al., 2000; Dotti et al., 2002 A140V 419 C>T RM não-específico moderado 2 I Couvert et al., 2001 A140V 419 C>T Síndrome PPM-X (RM moderado, 5 F Klauck et al., 2002 MBD psicose, sinais piramidais e macroorquidismo) A140V 419 C>T Desordem de linguagem, psicose 1 I Cohen et al., 2002 e esquizofrenia A140V 419 C>T RM inespecífico 2 F Winnepenninckx et al., 2002 E137G 410 A>G RM não-específico leve a severo 7 F Couvert et al., 2001 R133H 398 G>A Rett clássica e RM 2 I Monrós et al., 2001; Armstrong et al., MBD- TRD Y141X 423 C>G Rett clássica e síndrome de 1 I Schwartzman et al., Klinefelter 2001 G163fs del2 RM e encefalopatia congênita 1 F Geerdink et al., 2002 R167W 499 C>T RM não-específico moderado, 4 F Couvert et al., 2001 obesidade, tremores

27 13 continuação Domínio Mutação Nucleotídeo Fenótipos Casos Familiar(F) Referência (N) /Isolado(I) E258X RM 1 NI Zeev et al., ins C 2002 TRD C terminal G252fs RM 1 I Milunsky et insg al., 2001 R270X 808 C >T Síndrome de Rett 1 I Topcu et al., 2001 R268 fs 806 delg Encefalopatia congênita 1 F Wan et al., X G273fs dup Fenótipo semelhante à síndrome de Rett 1 F Ravn et al., X332 AAAGCCG 2003 K284E 850 A>G RM 1 I Couvert et al., 2001 P387Md RM inespecífico ligado a X 3 F Yntema et al., el80 del b Q406X 1216 C>T RM inespecífico ligado a X 2 F Meloni et al., 2000 R344W 1030 C>T Fenótipo semelhante à síndrome de Rett 1 F Laccone et al., 2002 R471fs RM moderado, dismorfias brandas, 1 I Kleefstra et del2 hipotonia, ginecomastia, obesidade, fenótipo al., 2002 P385fs del32 semelhante à síndrome de Prader-Willi RM e síndrome de Rett e encefalopatia congênita 1 F Hoffbuhr et al., 2001