FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA RASTREAMENTO DE ALELOS DO GENE CFTR EM RONDÔNIA, AMAZÔNIA OCIDENTAL BRASILEIRA MARLENE GUIMARÃES SANTOS

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1 FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA RASTREAMENTO DE ALELOS DO GENE CFTR EM RONDÔNIA, AMAZÔNIA OCIDENTAL BRASILEIRA MARLENE GUIMARÃES SANTOS Porto Velho Rondônia 2013

2 FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA MARLENE GUIMARÃES SANTOS RASTREAMENTO DE ALELOS DO GENE CFTR EM RONDÔNIA, AMAZÔNIA OCIDENTAL BRASILEIRA Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental da Universidade Federal de Rondônia UNIR como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Biologia Experimental. Área de Concentração: Genética Humana Orientadora: Profª Dra. Vera Engracia Gama de Oliveira Porto Velho Rondônia 2013

3 FICHA CATALOGRÁFICA BIBLIOTECA CENTRAL PROF. ROBERTO DUARTE PIRES Santos, Marlene Guimarães. S237r Rastreamento de alelos do gene CFTR em Rondônia, Amazônia Ocidental Brasileira. / Marlene Guimarães Santos. Porto Velho, Rondônia, f.: il. Tese (Doutorado em Biologia Experimental) Núcleo de Saúde (NUSAU), Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental, Fundação Universidade Federal de Rondônia, Porto Velho, Orientadora: Profa. Dra. Vera Engracia Gama de Oliveira. 1. CFTR. 2. Fibrose Cística. 3. F R334W. 5. N1303K. I. Título. CDU: 575(811) Bibliotecária Responsável: Eliane Gemaque / CRB

4 UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA Programa de Pós Graduação em Biologia Experimental (PGBioExp) Candidata: MARLENE GUIMARÃES SANTOS Titulo da Tese: Rastreamento de Alelos do Gene CFTR em Porto Velho, Amazônia Ocidental Brasileira. Orientadora: Profa. Dra. Vera Engracia Gama de Oliveira A Comissão julgadora dos trabalhos de Defesa de tese de Doutorado, em sessão publica, realizada a 25/ 04/ 2013, considerou-o: ( X ) Aprovado ( ) Reprovado Profa. Dra. Vera Engracia Gama de Oliveira Orientadora (Presidente da Banca) Instituição: UNIR/PGBIOEXP Assinatura: Dr. Ricardo de Godoi Mattos Ferreira Instituição: FIOCRUZ/RO/PGBIOEXP Assinatura: Dra. Maria Manuela da Fonseca Moura Instituição: UNIR/PGBIOEXP Assinatura: Dr. Horácio Tamada Instituição: UNIR/RO Assinatura: Dr. Gilson Medeiros e Silva Instituição: UNIR/RO Assinatura:

5 AGRADECIMENTOS A Dra. Vera Engracia Gama de Oliveira, Docente/ Pesquisadora da Universidade Federal de Rondônia, minha Orientadora, pela confiança que sempre depositou em mim, por todas as oportunidades que me ofereceu e por sempre me incentivar em todos os aspectos. Suas contribuições como Geneticista sempre foram muito valiosas e imprescindíveis para a realização deste trabalho e para minha formação profissional. Ao Dr. Aguinaldo Luís Simões, do Laboratório de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP, que me recebeu em seu laboratório e esteve presente em várias fases de minha trajetória Acadêmica, no Mestrado e Doutorado, obrigada. À Dra. Giselda Kalil de Cabello, da FIOCRUZ-RJ, Dr. Ricardo Godoi, da FIOCRUZ- RO, Dr. Gilson Medeiros-UNIR por todas contribuições que resultaram no trabalho de Tese. Ao Dr. Mauro Shugiro Tada, Diretor Geral do Centro de Pesquisa em Medicina Tropical/CEPEM/RO, que além de facilitar nosso acesso a Hospitais e lugares de colega, discutiu conosco nossos primeiros resultados, na qualificação da Tese. Aos Drs. Ricardo Godoi, Maria Manuela, Gilson Medeiros e Horácio Tamada, membros da Banca do Doutorado, por terem aceito participar da Defesa da Tese, pela contribuição e atenção. Aos membros suplentes Dra. Ana Escobar, Dra.Rosely Rodrigues e Dr. Aguinaldo Luis obrigada pela contribuição. Aos colegas do laboratório de Genética Humana/UNIR, pela convivência, pelo respeito e atenção, Dr. Almeida Casseb, MSc Andonai Krauze, Dra. Josileide Farias, Daniel Delani, Leslee André meus agradecimentos. Aos estudantes Paulo Henrique Alves, Lilian Catanhede e Milena Jano, pela ajuda em coletas e bancada. Aos funcionários do IPEPATRO, hoje FIOCRUZ, Giovani, Rosineide e Marlene Donato, pelo apoio. A direção do Hospital Infantil Cosme e Damião e do Hospital de Base com suas equipes de enfermagem, técnicos e aos demais funcionários do onde foram coletadas as amostras.

6 As crianças, pais ou responsáveis e a todos os sujeitos que participaram sem os quais este trabalho não se realizaria. As Instituições UNIR/IPEPATRO, pela concessão de parte do suporte financeiro para a realização deste trabalho e pela oportunidade, incentivo e apoio institucional. Ao Programa de Pós Graduação em Biologia Experimental da Universidade Federal de Rondônia pela oportunidade que este curso propiciou à minha formação Acadêmica e Cientifica. As agencias de fomento, especialmente CAPES e CNPq, o agradecimento pelo fomento direto e indireto que contribuiu para minha formação Acadêmica e Científica. A minha família especialmente por suportar minha ausência durante esses anos. E a todos os que, de certa forma, contribuíram para realização deste trabalho, principalmente aos participantes, obrigada.

7 A meu querido pai in memoriam Francisco Beleza Guimarães Pelo homem de caráter, exemplo de honestidade e simplicidade. E por me ensinar O que é certo e o que é errado.

8 A diferença entre o vencedor e o perdedor não é a força nem o conhecimento, mas sim, a vontade de vencer. Vincent T. Lombardi

9 SUMÁRIO LISTA DE TABELAS... i LISTA DE FIGURAS......ii. LITA DE SIGLAS E ABEVIATURA...iv RESUMO...vi ABSTRACT...viii INTRODUÇÃO E ESTADO DA ARTE O GENE CFTR ESTRUTURA DA PROTEÍNA CFTR MUTAÇÕES NO GENE CFTR CORRELAÇÃO ENTRE GENÓTIPO E FENÓTIPO DIAGNÓSTICO JUSTIFICATIVA OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS MATERIAL E MÉTODOS POPULAÇÃO E ÁREA DE ESTUDO MICRO REGIÃO DE PORTO VELHO ( W; S) MICRO REGIÃO DE CACOAL (CAO; S, W) MICRO REGIÃO DO VALE DO GUAPORÉ (62 54 O; S) COLETA DE MATERIAL BIOLÓGICO MÉTODOS LABORATORIAIS EXTRAÇÃO DE DNA DE LEUCÓCITOS DO SANGUE PERIFÉRICO REAÇÃO DA POLIMERASE EM CADEIA (PCR) IDENTIFICAÇÃO DOS ALELOS DO GENE CFTR O ALELO ΔF OS ALELOS R334W, G85E, G551D, R553X, W1282X, N1303K, R1162X DIGESTÃO ENZIMÁTICA (RFLPS) ANÁLISES ESTATÍSTICAS RESULTADOS CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS SEGUNDO DADOS ANTROPOGENÉTICOS CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS SEGUNDO AS FREQUÊNCIAS ALELICAS INCIDÊNCIA DA FIBROSE CISTICA DISCUSSÃO...51

10 7.CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...61 Anexo I...73 Anexo II...74 Anexo III...75

11 i LISTA DE TABELAS Tabela01. Distribuição da mutação F508 em pacientes fibrocísticos de alguns países europeus, e américa Latina, segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS,2004) e Bobadilla e cols., (2002) Tabela 02. Amostras (total de indivíduos/localidade) analisadas Tabela 03. Concentração dos reagentes utilizados na reação de PCR e temperaturas de pareamento (Tp) usadas para a amplificação por PCR... Tabela 04. Descrição da sequência dos iniciadores utilizados na PCR dos exons 3, 7,11, Tabela 05. Tabela 06 19, 20 e 21, tamanho dos fragmentos resultantes desta reação e enzimas de restrição específicas Descrição da sequência dos iniciadores utilizados na PCR do exon 10 e tamanho do fragmento resultante desta reação Distribuição dos indivíduos das amostras do Hospital Infantil (HICD), das Mães da maternidade do Hospital de Base (Mães-HB), seus respectivos filhos (RN-HB), Engenho Velho, Cacoal e Vale do Guaporé de acordo com a etnia, determinada pela cor da pele e por traços físicos... Tabela 07. Frequências do alelo F508 nas amostras estudadas Tabela 08. Tabela 09. Frequências dos alelos DF508, R334W e N1303K na Amostra do hospital Infantil Cosme e Damião, Porto Velho-RO Mostra as frequências de dois alelos em duas amostras do Hospital de Base de Porto Velho Tabela 10. Frequência da mutação F508 em diferentes populações do Brasil Tabela 11. Frequências de alelos do gene CFTR em alguns estados brasileiros

12 ii LISTA DE FIGURAS Figura 01. Representação esquemática do segmento de 27 exons do gene CFTR Figura 02. Estrutura da proteína CFTR Figura 03. Representação das classes de mutações do gene CFTR Figura 04. Mapa do Brasil e de Rondônia mostrando a localização da área de estudo Figura 05. Figura 06. Figura 07. Figura 08. Figura 09. Figura 10. Figura 11. Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10%: Marcador de peso molecular de 100 pb.produto de PCR, nas colunas 1 a 22 indivíduos homozigotos normais para a mutação e na ultima coluna o controle negativo... Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10%: Marcador de peso molecular de 50 pb. Produto de PCR, detecção do alelo F508. Nas colunas 1 a 5 indivíduos heterozigoto para mutação F Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% para a detecção da mutação R334W. Marcador de peso molecular de 50 pb. Produto de PCR, Nas colunas 1 a 21 digestão do produto da PCR. Presença do alelo R334W nas colunas 16 e 21 indivíduos heterozigotos para mutação R334W... Eletroforese em gel de agarose a 1.5% para detecção da mutação G85E. Marcador de peso molecular de 100 pb. Nas colunas 1 a 9 produtos de PCR resulta em fragmento de 309 e ultima coluna controle negativo... Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% para detecção da mutação G85E Marcador de peso molecular de 100 pb. Produto de PCR, Nas colunas 1 a 19 digestão do produto da PCR indivíduos normais... Eletroforese em gel de agarose a 1.5% para a detecção da mutação G551D. Marcador de peso molecular de 100 pb. Nas colunas 1 a 7 produtos de PCR resulta em fragmento de 425 e ultima coluna controle negativo... Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% para a detecção da mutação G551D. Marcador de peso molecular de 50 pb. Produto de PCR, Nas colunas 1 a 13 digestão do produto da PCR. Todos os indivíduos normais para a mutação

13 iii Figura 12. Figura 13. Figura 14. Eletroforese em gel de agarose a 1.5% para a detecção da mutação R553X. Marcador de peso molecular de 100 pb. Nas colunas 1 a 9 produtos de PCR resulta em fragmento de 425 e ultima coluna controle negativo... Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% para a detecção da mutação R553X. Marcador de peso molecular de 100 pb. Nas colunas 1 a 7 digestão do produto da PCR. Todos os indivíduos normais para a mutação... Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% para detecção da mutação W1282X. Marcador de peso molecular de 50 pb. Produto de PCR. 473 pb. Nas colunas 1 a 19 digestão do produto da PCR indivíduos normais 178,172 e 123 pb. E na ultima coluna controle negativo... Figura 15. Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% para detecção da mutação N1303K. Marcador de peso molecular de 50 pb. Controle negativo. Nas colunas 1 a 18 digestão do produto da PCR... Figura 16. Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% para detecção da mutação R1162X. Marcador de peso molecular de 100 pb. Produto de PCR. 454 pb. Nas colunas 1 a 19 digestão do produto da PCR indivíduos normais e 179 pb para mutação

14 iv LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS Sigla ou Abreviatura A AM ARMS-PCR ASO ATP CBAVD CEPEM CFTR CFGAC Cols CONEP Cl C CEPEM CONEP Da DNA Dntp DGGE dhplc EDTA FC FIOCRUZ G HB HBM HBRN Significado Adenina Amazonas Sistema de mutação refratário à amplificação Hibridização de oligonucleotídeos alelo específicos. Adenina Tri-fosfato Aplasia congênita bilateral dos vasos deferentes Centro de Pesquisa em Medicina Tropical Gene Regulador da Condutância Transmembrânica Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium Colaboradores Comissão Nacional de Ética e Pesquisa Cloro Citosina Centro de Pesquisas em Medicina Tropical Comissão de Ética e Pesquisa Daltons Ácido nucléico Desoxinucleotídeo Eletroforese em gel com gradiente de desnaturação Cromatografia líquida desnaturante de alta performace Ácido etileno diaminotetraacético Fibrose Cística Fundação Instituto Oswaldo Cruz Guanina Hospital de Base Parturientes Recém -nascidos

15 v HICD Hospital Infantil Cosme e Damião IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística IRT Teste da tripsina imunoreativa IPEPATRO Instituto de Pesquisa em Patologias Tropicais kb Kilobase mrna RNA mensageiro MSD Transmembrane domain of CFTR protein NBD Domain Nucleotide- Binding Na Sódio Gel de Poliacrilamida PCR Reação da Polimerase em Cadeia pb Pares de bases PN Pedras Negras R -domain regulatory domain of CFTR protein SSCP Polimorfismo conformacional de fita simples SESAU Secretaria de Estado da Saúde de Rondônia SPSS Software Statistical Package for Social Sciences T Timina TBE Tris-Ácido Bórico-EDTA TEMED N, N, N, N tetrametilenodiamina 2 Teste do Qui-quadrado

16 vi RESUMO Guimarães, M. Rastreamento de alelos do Gene CFTR em Rondônia, Amazônia Ocidental Brasileira Tese. Programa de Pós Graduação em Biologia Experimental, Fundação Universidade Federal de Rondônia, Porto Velho-Rondônia, Brasil. Fibrose Cística é uma doença genética de herança autossômica recessiva, crônica, com manifestações sistêmicas, altos níveis de eletrólitos no suor, comprometendo os sistemas respiratório, digestivo e reprodutor. O gene de Fibrose Cística está localizado no braço longo do cromossomo 7, na posição 7q. 31. Estão atualmente descritas 1932 mutações no gene CFTR, classificadas de acordo com o tipo de alterações que acarretam na proteína CFTR. Apesar da heterogeneidade que se verifica nas manifestações e evolução da doença, o diagnóstico de Fibrose Cística é clínico e na maioria das vezes apresenta-se com fenótipo clínico diverso, com intensidade diferente, em diferentes indivíduos. Propusemo-nos a rastrear oito alelos do gene CFTR ( F508, N1303K, W1282X, G551D, R553X, R1162X, G85E e R334W) no intuito de começarmos uma competência local em Genética no estudo de Fibrose Cística, partindo da hipótese de que o processo de colonização desta região Amazônica propiciou a fixação de genes europeus, o que determina a presença de indivíduos fibrocisticos na região. Foram analisadas seis amostras de três regiões do estado de Rondônia: quatro na cidade de Porto Velho, uma na Região Central de Rondônia e uma no Vale do Guaporé, situado na região Leste de Rondônia. As amostras coletadas em Porto Velho foram três hospitalares (uma de Recém-nascidos e outra, suas respectivas Mães do Hospital estatal Ari Pinheiro, e a terceira constituída por crianças, de 0 a 10 anos, do Hospital estatal infantil Cosme e Damião) e uma populacional, peri- urbana, de características ribeirinhas, Engenho Velho. A amostra da região Central de Rondônia era hospitalar e foi coletada na cidade de Cacoal. A sexta amostra foi coletada no vilarejo de Pedras Negras, localizado na região centro-leste de Rondônia e era constituída de indivíduos remanescentes de Quilombolas. O DNA foi extraído seguindo a metodologia que emprega digestão com Proteinase K. Após amplificação por PCR, das regiões alvo para cada alelo, as amostras foram fenotipadas segundo protocolos já descritos na literatura. A visualização ocorreu em gel de PAGE a 10% corado com nitrato de prata. As análises estatísticas foram realizadas com os programas GENEPOP (versão 3.4) e o nível de significância adotado foi de 5%. O alelo

17 vii ΔF508 foi observado apenas em heterozigose com o alelo Normal do gene CFTR, na frequência de 0,0065 ± 0,006; p= 0,1639 na amostra de crianças do Hospital Infantil Cosme e Damião. Na amostra de Recém-nascidos a frequencia alélica foi quase polimórfica (0,0098 ± 0,008; p= 0,1377) e não satisfez as condições de equilíbrio de Hardy-Weinberg. Na amostra de Cacoal, apenas um indivíduo foi heterozigoto para ΔF508, sendo a frequência de ± 0.000; p= Apenas outros dois alelos, em todas os indivíduos analisados nesta Tese, os genes R334W e N1303K, foram detectados, em heterozigose com o alelo normal, em duas crianças cada um, na amostra do Hospital Infantil, ambos com frequências de Não foram observadas diferenças significantes na distribuição das frequências dos alelos analisados quando comparados com outras populações brasileiras, com exceção de uma amostra, descrita na literatura, a do povoado Santa Flora/MA, de origem portuguesa, e reflexo de efeito do fundador. As várias ondas migratórias, responsáveis pelo povoamento de Rondônia, introduziram alelos fibrocísticos, de origem européia, observados na população atual do estado. A ausência de indivíduos homozigotos, mesmo sob suspeita clínica de apresentarem Fibrose Cística (caso de crianças do Hospital Infantil) indica a necessidade de se ampliar o rastreamento ora iniciado, introduzindo-se alelos já descritos em populações Ameríndias e Negróides, além de se colocar em atividade o rastreamento neonatal de genes fibrocísticos nos hospitais públicos de Rondônia. Palavras- chave: CFTR, Fibrose Cística, F508, R334W, N1303K

18 viii ABSTRACT Guimarães, M. Tracking alleles of the gene CFTR in Rondonia, Western Brazilian Amazon Thesis. Postgraduate Program in Experimental Biology, Federal University of Rondonia, Porto Velho, Rondonia, Brazil. Cystic Fibrosis is a genetic disease of inheritance autosomal recessive, chronic, with systemic manifestations, high levels of electrolytes in sweat, affecting the respiratory, digestive and reproductive systems. The gene of the cystic fibrosis is located on the long arm of the chromosome 7, in the position 7q. 31. Currently are described 1932 mutations in the CFTR gene, classified according to the type of changes that result in the CFTR protein. Despite the heterogeneity that exists in the manifestations and evolution of the disease, the diagnostic of the cystic fibrosis is clinical and in the most of time presents with a diverse clinical phenotype, with different intensity in different individuals. We proposed to track down eight alleles of the CFTR gene ( F508, N1303K, W1282X, G551D, R553X, R1162X, G85E and R334W) in order to begin a local competence in Genetics on the study of Cystic Fibrosis, based on the hypothesis that the process of colonization of this amazonic region propitiated the fixation of european genes, which determines the presence of fibrocystic individuals in the area. We analyzed six samples from three regions of the state of Rondonia: four in the city of Porto Velho, one in the Central Region of Rondonia and one in the Vale do Guapore, located in the eastern region of Rondonia. Samples collected in Porto Velho were from three hospitals (one of newborns and their respective mothers from the Ari Pinheiro Hospital, and the third made up of children from 0 to 10 years, from the State Children's Hospital Cosme and Damiao) And a population, peri-urban with riverside characteristics, Engenho Velho. The sample from the Central Region of Rondonia was hospital and was collected in the city of Cacoal. The sixth sample was collected in the Pedras Negras, located in the central-east of Rondônia and consisted by individuals remaining of Quilombola. The DNA was extracted following the method it employs digestion with Proteinase K. Following PCR amplification, target regions for each allele, samples were phenotyped second protocols described in the literature. A visualization occurred on PAGE gel stained with 10% silver nitrate. The statistical analysis was performed with the programs GENEPOP (version 3.4)

19 ix and the significance level adopted was 5%. The ΔF508 allele was observed only in heterozygous with the normal allele to the gene CFTR, at frequency of 0,0065 ± 0,006; p= 0,1639 sample of children in the State Children's Hospital Cosme and Damiao. In the sample of newborns the allelic frequency was almost polymorphic (0,0098 ± 0,008; p= 0,1377) and does not satisfy the conditions of Hardy-Weinberg equilibrium. In Cacoal sample, only one individual was heterozygous for ΔF508, with a frequency of ± 0.000; p= Only two other alleles, in all 1840 individuals analyzed in this thesis, R334W and N1303K genes were detected in heterozygous with the normal allele, in two children each of them, on the sample Children's Hospital, both with frequencies There were no significant differences in the distribution of frequencies of the alleles analyzed when compared with other Brazilian populations, except for one sample, described in the literature, the town of Santa Flora-MA, of Portuguese origin, and reflects the founder's effect. The various migratory waves, responsible for the populating Rondonia, introduced fibrocystic alleles, of european origin, observed in the current population of the state. The absence of homozygous individuals, even under clinical suspicion of submitting Cystic Fibrosis (cases of children at Children's Hospital) indicates the need to expand the tracking started now, introducing alleles already described in amerindian and negroid populations, in addition to putting in activity the neonatal screening of genes fibrocystic in public hospitals of Rondonia. Keywords: CFTR, Cystic Fibrosis, F508, R334W, N1303K

20 INTRODUÇÃO E ESTADO DA ARTE 19 Fibrose Cística, também conhecida como Mucoviscidose, é uma doença genética de herança autossômica recessiva, crônica, com manifestações sistêmicas, altos níveis de eletrólitos no suor, comprometendo os sistemas respiratório, digestivo e reprodutor. Apresenta uma das principais causas de doença pulmonar crônica na faixa etária pediátrica afetando cerca de 1/2.000 nascidos vivos na população caucasiana de pacientes com fibrose cística (Lemos e cols., 2004; Cimmino e cols., 2003). É uma condição que resulta em secreções mucosas muito espessas e viscosas, havendo obstrução nos ductos e canalículos glandulares. A doença tem uma tríade clínica característica: (a) doença pulmonar obstrutiva supurativa crônica, com evolução progressiva para cor pulmonale; (b) insuficiência pancreática com má digestão e má absorção e desnutrição secundária e (c) níveis anormalmente elevados de Cl- no suor (Rosov e cols., 1999). Em 1953 Di Sant 'Agnese e colaboradores evidenciaram o teor extremamente elevado do íon cloreto no suor de pacientes fibrocisticos. A comprovação de que a doença resultava de defeito na permeabilidade do cloro surgiram de estudos em células epiteliais das vias aéreas de pacientes. Esta característica foi observada, posteriormente, em todos os indivíduos com Fibrose Cística, tornando um fator decisivo para o diagnóstico da doença (Welsh e Liedtke, 1986). Das doenças genéticas que, na maioria dos casos, levam a óbito ainda na infância, Fibrose Cística é a mais comum entre os indivíduos caucasianos (Rosenstein e cols., 1998; Zielenski e cols., 1995), sendo rara em populações Africanas (1: ) e asiáticos (1: ) (htt// 2009; Ratjen e cols., 2003; Ribeiro e cols., 2002). A prevalência da doença varia de acordo com o local geográfico (Welsh e cols., 2001). Estima-se que ao redor de a pessoas são acometidas por Fibrose Cística no mundo (htt// 2009), sendo mais frequente no norte da Europa, região em que a ocorrência é de 1 para cada nascimentos vivos. Entre os latino-americanos e afroamericanos a incidência varia de 1/ a 1/ nascimentos vivos, respectivamente (O Sullivan e cols., 2009). O quadro epidemiológico da doença tem variado nas últimas três décadas, quando se avaliam os dados dos países desenvolvidos. Nos Estados Unidos havia, em 1969, cerca de indivíduos oficialmente registrados com Fibrose Cística. Em 1991 eram , sendo que em 2004 esse número já alcançava pacientes (Davies, 2006). A incidência de fibrose cística no Brasil varia entre as diferentes regiões, sendo de 1: nascimentos vivos em Minas Gerais, 1:9.500 no Paraná, 1:8.700 em Santa Catarina e 1:1.600 no Rio Grande do Sul (Raskin e cols., 2008; Honório e cols., 2006; Reis e cols., 2006; Santos e cols., 2005).

21 I n t r o d u ç ã o 2120 Diversas áreas do território brasileiro (Suarez-Kurtz, 2005). Outro fator da disparidade na observação de Fibrose Cística é a ausência de diagnóstico clínico e/ou molecular. A dificuldade no diagnóstico decorre muitas vezes devido à superposição de sintomas da Fibrose Cística com os de outras doenças mais comuns, como diarreia crônica, desnutrição e as infecções respiratórias (Reis e Cerqueira, 1991). A necessidade de realização de exames laboratoriais específicos também dificulta o diagnóstico, que muitas vezes é feito tardiamente, acarretando um prejuízo irreparável ao prognóstico e à determinação correta da incidência (Raskin e cols., 2008). As investigações envolvendo a incidência da doença no Brasil são realizadas principalmente nas regiões Sul e Sudeste e podem não refletir a realidade de todo o País (Raskim e cols., 2008). GENE CFTR As primeiras hipóteses sobre o caráter genético da fibrose cística foram formuladas por Lowe, May e Reed (1949), que postularam ser a doença a consequência de defeito em um único gene, que gerava uma proteína anormal, sendo a herança autossômica recessiva. Em 1985, Tsui e colaboradores forneceram as primeiras evidências de um gene candidato para Fibrose Cística no cromossomo 7. A detecção do loco responsável foi feita por Estivill e cols., (1987). Identificado pela técnica de clonagem posicional (mapeamento gênico; Riordan e cols., 1989; Collins e Weissman, 1984), o gene de Fibrose Cística foi localizado no braço longo do cromossomo 7, na posição 7q. 31. Este gene possui 250 Kb, 27 éxons, com tamanhos que variam de 38 a 724 pares de bases (Zielenski e cols., 1991). O gene codifica um mrna de 6.5 Kb e massa molecular de Da, dando origem a uma glicoproteína com aminoácidos (Welsh e cols., 2001). Os exons estão numerados de 1 a 24, sendo incluídos os éxons 6a, 6b, 14a, 14b, 17a e 17b. Este gene, localizado na membrana citoplasmática das células epiteliais, foi denominado Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator CFTR, desde que o produto proteico atua como canal de íons de cloreto (Tsui e Durie, 1997; Zielenski e cols., 1991; figura 1).

22 I n t r o d u ç ã o q31.3 Figura 1. Representação esquemática do segmento de 27 exons do gene CFTR (Zielenski e cols., 1991).

23 ESTRUTURA DA PROTEÍNA CFTR I n t r o d u ç ã o 22 Estruturalmente, a proteína CFTR possui 5 domínios (figura 2) e dois grandes domínios transmembranários (Membrane Spanning Domain ou MSD), que são duas unidades repetidas que atravessam a membrana de lado a lado 6 vezes. As subunidades dos domínios MSD contribuem para a formação do poro do canal de Cl -, uma vez que mutações em sítios específicos dentro dos MSD alteram sua seletividade a ânions (Wesh e cols., 1993). Adicionalmente, existem dois domínios de ligação a nucleotídeos, ou NBDs (Nucleotídeo Binding Domain; Lyzac e cols., 2002). Os domínios NBD são responsáveis pela ligação e pela hidrólise de ATP e fornecem a energia necessária para a atividade do canal. A proteína possui ainda um domínio de regulação (R), em posição intracitoplasmática (Kerem e cols., 1989; Riordan e cols., 1989; Rommens e cols., 1989). O domínio R tem o papel de bloquear ou não o canal de cloro, dependendo do seu estado de fosforilação e do AMP cíclico ( Smith e Welsh, 1995; Welsh, 1993; Riordan e cols., 1989). O domínio regulatório modula também a atividade de CFTR e pode ter efeito inibitório ou estimulatório (Welsh e cols., 2001). Figura 2. Estrutura da proteína CFTR (adaptado por Smith &Welsh, 1995). A proteína CFTR faz parte da membrana citoplasmática das células epiteliais de diversos órgãos, como nos ductos pancreáticos, epitélios intestinais, no trato respiratório, ductos das glândulas sudoríparas e sistema reprodutor, onde atua como regulador de fluxo de cloretos (Welsh e cols., 1993).

24 MUTAÇÕES NO GENE CFTR I n t r o d u ç ã o Estão atualmente descritas 1932 mutações no gene CFTR, classificadas de acordo com o tipo de alterações que acarretam na proteína CFTR (The Cystic fibrosis mutation database, CFMDB, 2013). Em geral as mutações ocorrem na primeira metade do gene CFTR, a maioria na primeira região NBD, nos exons 10 e 11. A segunda região NBD, notadamente nos éxons 19 e 20, apresenta também numerosas mutações. A primeira região MSD (exons 4 e 7) apresenta um conjunto de mutações, sendo estas quase inexistentes na segunda região MSD. Estas mutações em exons são devidas, na maioria das vezes, a transições G A (24.1%) e C T (14.7%), e a transversões G T (11.9%); ao contrário do que ocorre em outros genes humanos, observam-se poucas mutações em sítios CG (Morral e cols., 1994; Cooper e Krawczak, 1990). Estas mutações, de modo geral, estão agrupadas em seis diferentes classes (Vankeerberghen e cols., 2002; Welsh e cols., 2001): Classe I: caracteriza-se por mutações que conduzem a um sinal de término de transcrição, originando proteínas truncadas ou instáveis, alterando assim a quantidade de proteína produzida. Como exemplos temos a mutação G542X, em que ocorre a substituição de uma glicina por um códon STOP na posição 542 (Mishra e cols., 2005; Rowntree and Harris, 2003; Welsh e cols., 2001); a mutação R1162X, que consiste na troca de C T no nucleotídeo 3616 do exon 19, levando à substituição de arginina por código de parada no códon 1162 (Gasparini e cols., 1991), sendo a décima quinta mutação mais frequente em CFTR na população mundial. A mutação W1282X, que consiste na transcrição de G A no nucleotídeo 3978 do exon 20, leva à substituição de triptofano por um código de parada, no códon 1282 (CFGAC, 1990); é a quinta mutação mais frequente no mundo (Estivill e cols., 1997). A mutação R553X consiste na transcrição de C T no nucleotídeo 1789 do exon 11, havendo substituição de arginina por um código de parada no códon 553. Classe II: corresponde a mutações em sítios responsáveis pelo processamento e transporte anômalo da proteína até a membrana. Incluem-se nesta classe as mutações F508, N1303K e G85E (Mishra e cols., 2005; Welsh e cols., 2001). A mutação F508, ou deleção Phe508, consiste em uma deleção de 3pb, adenina-timina-timina (ATT) entre os nucleotídeos 1652 e 1655 do éxon 10, tendo como consequência perda do aminoácido fenilalanina no códon 508 da proteína resultante (Zielenski e cols., 1997). É a mutação mais frequente nas