DESINFESTAÇÃO E GERMINAÇÃO in vitro DE SEMENTES DE IPÊ ROXO

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1 DESINFESTAÇÃO E GERMINAÇÃO in vitro DE SEMENTES DE IPÊ ROXO Talita Cristina Mamedes¹; Saulo Araújo da Silva² 1 Graduanda do curso de Engenharia Florestal, da Universidade Estadual de Goiás, Unidade Universitária de Ipameri (UEG - UnU de Ipameri), CEP , Brasil. ² Orientador, docente dos cursos de Agronomia e Engenharia Florestal da UEG - UnU de Ipameri. PALAVRAS-CHAVE: Tabebuia impetiginosa; micropropagação; contaminação; espécie florestal nativa. 1 INTRODUÇÃO A cultura de tecidos vegetais é um conjunto de técnicas nas quais células, tecidos ou órgãos são isolados e cultivados em meio nutritivo asséptico. É aplicada em plantas que necessitam ser propagadas em curto espaço de tempo e em grande escala (Pasqual, 2001). O explante (células, tecidos ou órgãos), pode ser um fragmento de folha, de raiz, de caule ou de qualquer tecido que responda às condições de indução do meio de cultura, objetivando regeneração vegetal in vitro (Torres et al., 2001). De acordo com TORRES et al. (2001) cada planta ou explante cultivado in vitro traz exigência nutricional específica e requer meios nutritivos compostos por minerais, vitaminas e fontes de energia. Os meios de cultura podem ser modificados de acordo com a necessidade de cada tipo de explante e a espécie com a qual se esteja trabalhando. Assim, ao adicionar fitorreguladores em meios nutritivos são supridas as possíveis deficiências de teores endógenos de hormônios nos explantes que se encontram isolados das

2 regiões produtoras na planta matriz (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). Segundo CALDAS et al. (1998), os meios nutritivos utilizados para a cultura de tecidos vegetais fornecem as substâncias essenciais para o seu crescimento e desenvolvimento in vitro. As mesmas vias bioquímicas e metabólicas básicas que funcionam nas plantas ex vitro, são conservadas no material vegetal in vitro. Por isso, os meios nutritivos se baseiam nas exigências das plantas quanto aos nutrientes minerais, com algumas modificações para atender as necessidades específicas in vitro. A desinfestação do explante é uma etapa essencial na qual podem ser utilizadas diversas substâncias de ação germicida, dentre os quais os mais utilizados estão o etanol, o hipoclorito de sódio e o hipoclorito de cálcio. Além destas, podem ser utilizados os tensoativos, que podem ser aplicados na solução desinfestante, com a finalidade de facilitar o contato dos agentes esterilizantes com o tecido, reduzindo a tensão superficial. O tensoativo deve ser adicionado em teor muito baixo, enquanto a concentração dos agentes desinfestantes e o tempo de exposição pode variar, de acordo com o objetivo do trabalho, o tamanho e a natureza do explante (WILLADINO & CÂMARA, 2010). Tabebuia impetiginosa é uma espécie arbórea pertencente à família Bignoniaceae, conhecida como pau d arco, ipê roxo de bola, ipê una, casquinho, ipê roxo da mata, cabroe, ipê, ipê de flor roxa, ipê preto, ipê uva roxa, ipeúva roxa, pau d'arco roxo e ipê roxo (GEMAQUE et al., 2002). As plantas dessa espécie podem atingir de 8,0 m a 12,0 metros de altura, com tronco de 60 cm a 90 cm de diâmetro. Folhas compostas cinco folioladas; folíolos coriáceos, pubescentes em ambas as faces, de 9,0 cm a 18,0 cm de comprimento por quatro a 10 cm de largura. As flores em forma de trombeta são numerosas, de coloração rósea ou arroxeada, e despontam em volumosas inflorescências (LORENZI, 2002). As sementes são cordiformes, tendendo à oblonga plana, apresentam superfície lisa lustrosa de cor marrom clara, com presença de ala

3 membranácea nas duas extremidades de coloração marrom clara transparente de até três centímetros de comprimento, sendo sua dispersão anemocórica (Reitz et al., 1988). Dados literários sobre estudos relacionados com sementes do gênero Tabebuia são escassos, principalmente, os que possam esclarecer aspectos sobre a germinação e a conservação de sementes. Nas pesquisas que estudam a cadeia do desenvolvimento de sementes tem se empregado a técnica de cultivo in vitro, por permitir multiplicar em qualquer época do ano. Esta técnica favorece por utilizar materiais genéticos que, normalmente, perdem sua capacidade regenerativa, dificultando a propagação da descendência (Bajaj et al., 1998). A micropropagação de espécies lenhosas requer estudos mais específicos e desenvolvimento de metodologias que atendam às exigências dos explantes (DECCETI, 2000; PEREIRA, 2004). A maioria dos trabalhos encontrados visa testes germinação ou estudos anatômicos para comparações de plantas submetidas à ambiente in vitro e ex vitro. Protocolos de desinfestação de sementes são criados para proporcionar, assepsia, qualidade as plantas e aumento na cadeira produtiva. A cultura de tecidos de plantas é vantajosa, pois é uma forma rápida de multiplicar uma determinada planta, ou genótipo, que apresente características desejáveis, que podem ser, por exemplo, elevada produtividade, elevada qualidade de sementes ou frutos, tolerância a pragas ou doenças, entre outras. Este trabalho teve como objetivo a eliminação de agentes patogênicos em sementes de Tabebuia impetiginosa, que podem causar danos à germinação e ao futuro estabelecimento no campo, sem prejudicar sua percentagem de germinação, vigor e velocidade de germinação, utilizando as vantagens do cultivo in vitro para a realização da propagação da espécie em escala em curto tempo. 2. MATERIAL E MÉTODOS

4 Para a realização deste trabalho foram utilizadas sementes de ipê roxo (Tabebuia impetiginosa) coletadas, no mês de novembro, do ano de 2009, na região de Ipameri, GO. A fim de atender a metodologia proposta para assepsia e assegurar as adequadas condições de execução do experimento, este foi conduzido no laboratório de cultura de tecidos, no Instituto de Ciências Biológicas, da Universidade Federal de Goiás (ICB-UFG). Os frutos foram coletados em plantas, da arborização urbana, da cidade de Ipameri, GO. Estes foram colhidos quando se tornou visível o ponto de maturação fisiológica, observando-se a mudança na coloração dos frutos, a deiscência dos frutos e o início da queda das sementes. Então se coletou, com ao auxilio de um podão, os frutos diretamente da planta matriz, armazenandoos em sacos de papel. Os frutos foram levados para o laboratório de sementes florestais da UEG. Neste, foram extraídas as sementes dos frutos que secaram em temperatura ambiente. Estas foram beneficiadas, retirando restos dos frutos e outros materiais inertes encontrados. As sementes foram, então, agrupadas de acordo com suas características físicas em: sementes boas, chochas e atacadas por inseto. Sendo usadas para este estudo, somente, as sementes boas que foram, posteriormente, armazenadas durante dois meses em sacos de papel, até a implantação do experimento. O meio de cultura utilizado foi o meio MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962) uma das primeiras formulações usadas em cultura de tecidos de plantas, apresentando altos níveis de nitrato, potássio e amônio. A consistência do meio de cultura foi ajustada pela adição de agente gelificante ágar-ágar. Antes da autoclavagem ajustou-se o ph do meio para ± 5,8. Os frascos foram fechados com tampas de polipropileno. A autoclavagem foi realizada durante 21 minutos, aproximadamente, sob temperatura de 121 C ± 3 e 1,5 Atm de pressão. Utilizou-se 250 sementes para o experimento. Antes da desinfestação das sementes retirou-se a ala membranácea de 125 destas. A outra metade permaneceu envolta pela ala membranácea.

5 Após estes procedimentos as sementes foram lavadas com água corrente. Em seguida, iniciou-se a instalação do experimento, em que todos os lotes foram submetidos aos mesmos tratamentos de desinfestação. Para tanto, utilizou-se frascos de 200 ml. As sementes permaneceram nos frascos conforme o tempo estipulado de cada tratamento (Tabela 1). Primeiramente as sementes foram imersas a solução de álcool 70% e logo após na solução de hipoclorito de sódio 2% (v/v) de cloro ativo, acrescida de algumas gotas de tensoativo. Os tratamentos utilizados foram: T1. Sementes inoculadas diretamente no meio, sem tratamento para desinfestação; T2. Imersão por 30 minutos em água destilada, 02 minutos em álcool etílico 70% e 10 minutos em hipoclorito de sódio; T3. Imersão por 30 minutos em água destilada, 05 minutos em álcool etílico 70% e 20 minutos em hipoclorito de sódio; T4. Imersão por 30 minutos em água destilada, 07 minutos em álcool etílico 70% e 30 minutos em hipoclorito de sódio; T5. Imersão por 30 minutos em água destilada, 15 minutos em álcool etílico 70% e 50 minutos em hipoclorito de sódio. Tabela 1. Período de imersão em minutos e permanência das sementes de Tabebuia impetiginosa em água, álcool etílico (70%) e hipoclorito de sódio 2% (v/v). Tratamento Água Álcool etílico (70%) Hipoclorito de sódio (2%) T T T T T T1. Sementes inoculadas diretamente no meio, sem tratamento para desinfestação; T2. Imersão por 30 minutos em água destilada, 02 minutos em álcool etílico 70% e 10 minutos em hipoclorito de sódio; T3. Imersão por 30 minutos em água destilada, 05 minutos em álcool etílico 70% e 20 minutos em hipoclorito de sódio; T4. Imersão por 30 minutos em água destilada, 07 minutos em álcool etílico 70% e 30 minutos em hipoclorito de sódio; T5. Imersão por 30 minutos em água destilada, 15 minutos em álcool etílico 70% e 50 minutos em hipoclorito de sódio. Após o tempo de imersão em álcool 70% e em hipoclorito de sódio as sementes foram levadas à câmara de fluxo laminar. Estas foram lavadas cinco

6 vezes com água destilada esterilizada e inoculadas em meio MS, com as devidas precauções de assepsia. Os vidros foram cobertos com tampas de polipropileno. Cada unidade experimental foi composta por um frasco com capacidade para 150 ml contendo 20 ml de meio de cultura e um explante (sementes), em um total de 250 unidades experimentais inoculados. Os frascos foram mantidos em sala de cultivo com temperatura controlada de 25ºC ± 2ºC e fotoperíodo de 16 horas dia, com intensidade luminosa de 20 µmol m -2.s -1, obtida por meio de lâmpadas fluorescentes brancas frias. Após a inoculação, iniciaram-se as avaliações, que verificavam as variáveis: fungos ou bactérias, sementes oxidadas, emissão de parte aérea, emissão de radícula, desenvolvimento de plântula normal e plântulas anormais. As avaliações foram feitas, com descarte de material contaminado. Estes foram enviados ao laboratório de patologia do ICB-UFG para identificação de fungos. O experimento foi conduzido em delineamento experimental casualizado, conforme os tratamentos (Tabela 1). Para análise dos dados foi utilizada, a correlação linear simples, que significa associação entre duas variáveis aleatórias. A correlação entre duas variáveis pode ser calculada quando se deseja saber se a variação de uma delas acompanha proporcional ou inversamente a variação da outra, conforme o coeficiente de correlação, seguindo a equação: A correlação positiva ou negativa entre duas variáveis mostra, apenas, que essas variáveis crescem no mesmo sentido, não indicando que uma variável influência a outra. Foi feito o teste t, para análise da correlação. As hipóteses testadas no teste t foram às seguintes: H 0 : ρ = 0 contra H a : ρ 0. Neste, quando t. tabelado é maior que t. calculado rejeita-se H 0, ou seja, existe correlação entre as

7 variáveis analisadas. O valor de t tabelado foi obtido com n 2 graus de liberdade. O valor de t. calculado foi obtido por meio da seguinte equação: r t = n 2 1 r 2 Em que: t = estatística t de Student r = coeficiente de correlação n = número de observações (tratamentos) 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Este estudo sobre o protocolo para a desinfestação de sementes de Tabebuia impetiginosa foi criado para proporcionar assepsia adequada às sementes e favorecer a cadeia produtiva da viveiricultura de essências nativas, gerando plantas de qualidade. Os resultados obtidos demonstraram que a contaminação fúngica foi maior em sementes com ala membranácea, que em sementes nuas (Tabela 2). A germinação também foi maior em sementes nuas. As testemunhas (T1), sem utilização de agentes desinfestantes, tanto para as sementes sem ala, como para as sementes com ala apresentaram 100% de contaminação (Figura 1), desde o 14º dia após a semeadura, sendo descartadas. BOTELHO et al., (2008) em seu trabalho também detectou de forma expressiva, a incidência de fungos em todas as amostras avaliadas, sem a utilização de agentes desinfestantes. Evidenciou, ainda, que os fungos estavam sendo transportados pelas alas membranáceas das sementes de ipê roxo, pois foram praticamente erradicados nas sementes que tiveram assepsia. Tabela 2. Percentagem de germinação e contaminação de sementes alaladas membranácea e sementes sem ala membranácea, aos 25 dias após a inoculação em meio MS. ICB-UFG. Goiânia, GO Tratamentos Sementes sem ala membranácea Sementes com ala membranácea Germinação Contaminação Germinação Contaminação T T T T T T1. Sementes inoculadas diretamente no meio, sem tratamento para desinfestação; T2. Imersão por 30 minutos em água destilada, 02 minutos em álcool etílico 70% e 10 minutos em

8 hipoclorito de sódio; T3. Imersão por 30 minutos em água destilada, 05 minutos em álcool etílico 70% e 20 minutos em hipoclorito de sódio; T4. Imersão por 30 minutos em água destilada, 07 minutos em álcool etílico 70% e 30 minutos em hipoclorito de sódio; T5. Imersão por 30 minutos em água destilada, 15 minutos em álcool etílico 70% e 50 minutos em hipoclorito de sódio. Figura 1. Percentagem de contaminação por fungos em sementes de Tabebuia impetiginosa, com ala membranácea e sem ala membranácea, aos 25 dias após a inoculação em meio MS. ICB-UFG. Goiânia, GO O tratamento (T2), imersão por 30 minutos em água destilada, 02 minutos em álcool etílico 70% e 10 minutos em hipoclorito de sódio, nas sementes aladas reduziu a contaminação em 64%, se comparado as testemunhas. O Tratamento (T3) com alas, atingiu a redução de 88% da contaminação fúngica, comparado ao tratamento (T4) com 84%, e tratamento T5 com 96% de desinfestação, sendo este o melhor resultado. No tratamento (T4), imersão por 30 minutos em água destilada, 07 minutos em álcool 70% e 30 minutos em hipoclorito, nas sementes com ala, os fungos demoraram a se manifestar, somente após os 55 dias após a inoculação, sendo um padrão para a maioria dos tratamentos. COUTO et al. (2004), testando a desinfestação de sementes de Swietenia macrophylla (King), verificaram 89% de contaminação quando as sementes não foram submetidas ao tratamento com hipoclorito de sódio. No presente estudo, a contaminação por fungos em sementes sem ala foi inversamente proporcional ao tempo de imersão nos agentes desinfestantes

9 para os tratamentos T2, T3, T4 e T5. Nas sementes sem ala, o T2 reduziu a contaminação em 72%, se comparado as testemunhas. Para estas sementes o T3 apresentou 8% de contaminação, não havendo contaminações nos tratamentos T4 e T5 (Tabela 2). A eliminação completa de determinados fungos detectados pode depender de vários fatores, sendo alguns deles a localização na semente, a condição em que as sementes se encontram a concentração e o período de imersão no produto desinfestante. CASTELLANI et al. (1996) ressaltaram que a contaminação das sementes pode afetar, de forma severa, a qualidade fisiológica e, em alguns casos, inibir por completo a capacidade germinativa das sementes. Ao observar a germinação das sementes sem ala membranácea submetidas ao tratamento T3 apresentaram o dobro de germinação nos primeiros 14 dias, quando comparado aos demais tratamentos. O percentual de germinação em sementes sem ala ocorreu de maneira decrescente iniciando com T5 com 68% de germinação, T2 com 88% de germinação, T4 com 92% de germinação, e o tratamento T3 chegando a 96% de germinação. O T5 sem ala obteve 68% de germinação, demonstrando resistência aos desinfestantes, mesmo em contato direto (Figura 2). No entanto, o T5 com ala obtiveram 0% de germinação, não sendo indicado para assepsia de sementes de ipê roxo. Explicado pela retenção dos agentes desinfestantes nas alas membranáceas que se embeberam durante o processo de desinfestação e ao tentar germinar, os embriões entravam em contato com o produto e senesciam. NERY et al. (2008), também encontrou resultado semelhante com o uso de hipoclorito de sódio em sementes de Tabebuia serratifolia cultivadas ex-vitro observando a redução na germinação devido ao seu efeito fitotóxico. Para T. impetiginosa o percentual de germinação das sementes com ala foi de 0% para T5, 52% de germinação para T2, 72% para T4 e 76% para o T3 (Figura 3). Além do dano por embebição, a concentração do produto

10 utilizada e o tempo de imersão, provavelmente, tenham prejudicado a germinação, causando anormalidades e aumentando a percentagem de sementes mortas. As sementes de T. impetiginosa germinaram com 14 e 16 dias sem ala e com ala membranácea respectivamente. NERY et al. (2008) verificou que os embriões de Tabebuia serratifolia apresentaram capacidade germinativa in vitro aos 39 dias após a antese, em meio MS. Em sementes sem ala membranácea boa parte das sementes germinou aos 14 dias para a maioria dos tratamentos (Figura 2) e para as sementes com ala ocorreu somente após o décimo sexto dia (Figura 3). Figura 2. Porcentagem de germinação in vitro de sementes de Tabebuia impetiginosa sem ala membranácea aos 14, 16, 18 e 25 dias após a semeadura, de acordo com os tratamentos utilizados para desinfestação.

11 Figura 3. Percentagem de germinação in vitro de sementes de Tabebuia impetiginosa com ala membranácea aos 14, 16, 18 e 25 dias após a semeadura, de acordo com os tratamentos utilizados para desinfestação. Observou-se que o tratamento T3 (imersão por 30 minutos em água destilada, 05 minutos em álcool etílico 70% e 20 minutos em hipoclorito de sódio) obteve os maiores resultados para a germinação tanto para as sementes aladas, quanto para sementes sem ala membranácea. Pode-se inferir que o período de imersão nestas substâncias, chegou próximo ao ideal para as sementes de ipê roxo. Apresentou, também, o menor índice de contaminação fúngica. OLIVEIRA et al. (2004), não observou efeitos negativos quando sementes de ipê amarelo e ipê roxo foram submetidas à assepsia com hipoclorito de sódio a 2% durante dois minutos. Ao contrário dos resultados acima, nesse trabalho foram utilizados protocolos de desinfestação bem mais severos e encontraram-se bons resultados de germinação e desenvolvimento de plântulas para sementes de ipê roxo. Houve a presença esporádica de contaminação por bactérias, como nos tratamentos T3 e T4 em sementes com presença de ala membranácea. Dentre os microorganismos que podem associar-se as sementes, os fungos

12 formam o maior grupo, seguido das bactérias e, em menor proporção, dos vírus e nematóides (MACHADO, 2000). Taxas elevadas de contaminação bacteriana in vitro são comumente encontradas em espécies lenhosas (GEORGE, 1993), como as registradas em Ilex paraguariensis (BERNASCONI et al., 1996) e Mangifera indica (CORDEIRO et al., 2002). Estas apresentam dificuldade de se estabelecer em cultivo in vitro quando a contaminação é proveniente do campo. Os agentes contaminantes (fungos e bactérias) agem de forma indireta, comprometendo o desenvolvimento normal dos cultivos pela competição por nutrientes e vitaminas do meio de cultura e pela produção de metabólitos fitotóxico, como os ácidos lácticos e acéticos e o cianeto (LIMA e MORAES et al., 2006). Nesse estudo, não foi observada nenhuma deficiência nutricional em relação ao meio MS e sua adequação às exigências nutricionais das plântulas desta espécie. NERY et al. (2008) em seu trabalho com ipê amarelo para germinação in vitro, os meios de cultura MS e Wood Plant Médium (WPM) proporcionaram o mesmo resultado de germinação. Existem situações em que é interessante estudar o comportamento de duas variáveis em conjunto que podem se comportar de forma distinta. Isso pôde ser observado quando se analisou a germinação e a contaminação de T. impetiginosa (Tabela 2). Para isso, pode ser realizada análise de correlação destas variáveis. Na análise de correlação (Tabela 3) verificou-se que esta foi uma correlação negativa (-1 < r XY < 0), pois a variável X (germinação) cresceu enquanto a variável Y (contaminação fúngica) decresceu. O t. calculado foi menor que o t. tabelado tanto para sementes com ala quanto para sementes sem ala, então não se rejeita a hipótese H 0. Em sementes sem asa membranácea a análise demonstrou que a correlação foi alta negativa (r = - 0,91782), comprovada por uma dispersão inversa. Sendo que os maiores valores de germinação correspondem aos menores de contaminação fúngica. Já nas sementes com asas membranáceas a análise demonstrou uma correlação mediana (r = - 0,50491), ou dependência

13 linear. A correlação é considerada negativa quando os valores crescentes da variável X estiverem associados a valores decrescentes da variável Y, ou valores decrescentes de X associados a valores crescentes de Y. Tabela 3. Coeficiente de correlação, t. calculado e t. tabelado de germinação e contaminação de sementes cobertas por ala membranácea e sementes sem ala membranácea. Variáveis r t. calculado t. tabelado Sementes com ala / contaminação -0, * Sementes sem ala / contaminação * significativo a 5% de probabilidade 4. CONCLUSÕES O melhor protocolo de desinfestação de sementes, aladas ou sem alas membranáceas, de ipê roxo realizando a interação entre tempo de imersão em álcool 70% e hipoclorito de sódio 2%, foi o tratamento T4 (imersão por 30 minutos em água destilada, sete minutos em álcool 70% e 30 minutos em hipoclorito), conciliando os melhores resultados para as variáveis desinfestação das sementes e germinação. A ala membranácea das sementes agiu como proteção para os fungos e fonte de armazenamento de substâncias desinfestantes, sendo positiva sua retirada ao cultivar sementes de ipê roxo in vitro. O meio MS foi eficiente para o cultivo in vitro de T. impetiginosa. Os resultados obtidos permitiram ampliar o conhecimento sobre a espécie e facilitar a propagação de T. Impetiginosa. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BAJAJ, Y.P.S. Cryopreservation and the retention of biosynthetic potential in cell

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