Aspectos relacionados ao uso do sêmen congelado de garanhões

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1 Aspectos relacionados ao uso do sêmen congelado de garanhões Paulo Roberto Rojas Scaldelai Beatriz Ramos Bertozzo Mônica Yurie Machado Shiroma Juliana Bueno de Castro Carmem Estefânia Serra Neto Zúccari RESUMO O sêmen congelado atua como seguro biológico do garanhão. Permite o transporte a longas distâncias e preserva os gametas por tempo indeterminado. As desvantagens advêm da baixa criorresistência, variação entre raças, garanhões e ejaculados, menores taxas de prenhez e rendimento de doses por ejaculado. Diferentes metodologias para as etapas envolvidas no uso do sêmen congelado procuram aumentar a aplicabilidade em nível de campo. A presente revisão aborda aspectos relacionados à utilização do sêmen congelado de garanhões enfocando número total de espermatozoides e volume da dose, local de deposição, momento e frequência da inseminação, transporte espermático, resposta uterina e utilização do sêmen sexado. Palavras-chave: Criopreservação. Equino. Espermatozoide. Inseminação artificial. Aspects related to the use of stallion frozen semen ABSTRACT The frozen-thawed semen acts like a stallion s biological insurance, allows the long distances transportation and preserves the gametes for an indefinite time. The disadvantages come from low cryoresistance, breed variation, stallions and ejaculates, lower pregnancy rates and dose-income per ejaculate. Different methodologies for the steps involved in the use of frozen-thawed semen seek to increase the field applicability. The present review brings up aspects related to the stallion frozen-thawed semen utilization, focusing total sperm number and volume of the dose, site, moment and frequency of the insemination, sperm transport, uterine response and sexed semen utilization. Keywords: Artificial insemination. Cryopreservation. Equine. Spermatozoa. Paulo Roberto Rojas Scaldelai é acadêmico de Medicina Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UFMS. Bolsista PIBIC 2007/08. Beatriz Ramos Bertozzo é acadêmica de Medicina Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UFMS. Bolsista PIBIC 2007/08. Mônica Yurie Machado Shiroma é acadêmica de Medicina Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UFMS. Bolsista PIBIC 2007/08. Juliana Bueno de Castro é acadêmica de Medicina Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UFMS. Carmem Estefânia Serra Neto Zúccari é Médica Veterinária, Professora, MSc., Dra., Laboratório de Biotecnologia da Reprodução Animal, Departamento de Zootecnia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UFMS. Endereço para correspondência: Avenida Senador Felinto Müller, Campo Grande/MS. zuccari@nin.ufms.br Veterinária em Foco Canoas v.7 n.2 p jan./jun. 2010

2 INTRODUÇÃO A longevidade dos gametas e a duração do estro são fatores determinantes no estabelecimento do momento e frequência das inseminações artificias (IA). Além disso, na espécie equina o momento da ovulação está relacionado ao término do cio e não ao seu início, como na maioria das espécies domésticas (GINTHER, 1992). Para o sêmen criopreservado atenção especial deve ser dispensada quanto a esses aspectos, pois o ciclo congelação/descongelação tanto reduz, em cerca de 50%, o número de espermatozoides viáveis, como também sua longevidade. Portanto, a IA deve ser efetuada o mais próximo possível do momento da ovulação (SQUIRES et al., 1999). Alguns fatores impedem que o sêmen equino congelado seja usado em larga escala, dentre eles, a variação individual a criopreservação e o baixo rendimento de doses por ejaculado (MORRIS et al., 2003). Pelo método tradicional as éguas são inseminadas no corpo do útero, com uma dose mínima de 300 a 500 x 10 6 espermatozoides (SAMPER, 2001). Novas técnicas de inseminação artificial vêm sendo avaliadas com o objetivo de aumentar o rendimento de doses/ejaculado. Com o auxílio de histeroscópio ou pipetas longas flexíveis, um número reduzido de espermatozoides pode ser depositado sobre ou ao redor da papila útero-tubárica (RIGBY et al., 2001). Estes métodos são de especial importância quando se utiliza o sêmen sexado por citometria de fluxo, pois são obtidos apenas cerca de 5 a 15 x 10 6 espermatozoides/hora (LINDSEY et al., 2001). A presente revisão tem como objetivo abordar aspectos relacionados à utilização do sêmen congelado de garanhões, com enfoque sobre número total de espermatozoides e volume da dose, local de deposição, momento e frequência da inseminação, transporte espermático, resposta uterina frente ao sêmen e a utilização de sêmen sexado. REVISÃO DE LITERATURA Número total de espermatozoides e volume da dose inseminante O volume utilizado na inseminação artificial varia de acordo com a técnica adotada. Valores entre 0,6 a 120 ml resultaram em taxas de prenhez aceitáveis para a inseminação artificial convencional no corpo do útero (ALLEN et al., 1976; BEDFORD; HINRICHS, 1994 citados por MORRIS, 2004). Volumes inferiores aos normalmente utilizados têm sido testados por diminuírem o refluxo uterino (KATILA et al., 2000) e otimizarem o uso do sêmen congelado. Morris et al. (2000) trabalharam com sêmen resfriado na inseminação por histeroscopia e, ao testarem diferentes doses com volumes de 30 a 150 μl, constataram que a variação no volume não exerceu influência sobre as taxas de prenhez. Doses de sêmen congelado, com motilidade > 35%, foram comparadas quanto ao volume (0,5 ml vs 4 ml + 8 ml diluente INRA82) e concentração (100 x 10 6 vs 800 x

3 espermatozoides), respectivamente, não sendo observada diferença significativa entre os grupos para a taxa de prenhez (SIEME et al., 2004). Neste estudo as doses com volume e concentração menores equivaliam a 10% daquelas geralmente recomendadas, no entanto as taxas de prenhez foram satisfatórias, o que sugere uma reavaliação da dose mais indicada. Não há um protocolo padrão adotado mundialmente para a congelação do sêmen equino. Apesar do número mínimo de espermatozoides/dose inseminante variar entre reprodutores é importante determinar o menor valor necessário, para se atingir taxas de prenhez aceitáveis para a maioria dos garanhões. Além disso, dado laboratório geralmente utiliza uma metodologia única, portanto, o número de espermatozoides/ palheta, como de palhetas/inseminação também varia conforme o laboratório e não apenas em função do garanhão. Na busca de uniformidade a Federação Mundial de Reprodução para Cavalos de Esporte (WBFSH) estabeleceu uma concentração mínima 250 x 10 6 espermatozoides viáveis e motilidade progressiva 35% (MILLER, 2008). A maioria dos experimentos na área utiliza essa concentração e motilidade mínimas para utilização do sêmen congelado. Uma concentração de 100 a 1600 x 10 6 espermatozoides/ml pode ser utilizada ao congelar sêmen em palhetas de 0,5 ml. Nos testes de fertilidade o sêmen deve conter, pósdescongelação, no mínimo 30% de espermatozoides com motilidade progressiva e, em razão desta variar entre garanhões, deve se obter entre 100 e 400 milhões de espermatozoides viáveis após a descongelação (SQUIRES et al., 1999). Samper e Morris (1998) reportaram uma taxa de concepção/ciclo de 73% para éguas inseminadas, 24 e 36 horas após indução da ovulação, com uma dose de 600 x 10 6 espermatozoides congelados. O desenvolvimento da técnica de inseminação artificial com baixa concentração espermática tem trazido benefícios como aumentar o rendimento de doses/ejaculado e ser uma ferramenta potencial no aumento da fertilidade de garanhões com subfertilidade adquirida (SIEME et al., 2004). Para doses inferiores a 5 x 10 6 espermatozoides totais (MORRIS; ALLEN, 2002) ou volumes menores que 0,5 ml (MILLER, 2008) a literatura recomenda, preferencialmente, o uso da histeroscopia para se obter taxas mais altas de concepção. A histeroscopia permite que a concentração de sêmen criopreservado seja reduzida com sucesso para 3 x 10 6 espermatozoides (MORRIS, 2004). Lindsey et al. (2005) utilizando a histeroscopia obtiveram 72% de taxa de prenhez para dose de 20 x 10 6 de espermatozoides resfriados sexados, em volume de 300 μl, enquanto para inseminação no corno uterino, guiada por palpação retal, com a mesma dose e volume, esta caiu para 38%. Samper et al. (2005) trabalhando com palhetas de 0,5 ml e concentrações de 50 a 150 x 10 6 espermatozoides totais, inseminaram 265 éguas, com pipeta flexível no ápice do corno uterino ou por histeroscopia. A ovulação foi induzida e as inseminações feitas após sua detecção. As taxas médias de recuperação embrionária não diferiram significativamente entre as técnicas, sendo de 50,7% para histeroscopia e 46% para pipeta flexível. A inseminação com baixa concentração espermática irá maximizar a relação macho:fêmea e terá muita importância para o sêmen sexado ou quando um número 110

4 restrito de doses de sêmen congelado estiver disponível (MORRIS; ALLEN, 2002). Squires et al. (2000) avaliaram a diferença nas taxas de prenhez considerando quatro tratamentos: sêmen fresco sexado e não sexado e sêmen congelado sexado e não sexado. A inseminação era realizada por histeroscopia com 5 x 10 6 espermatozoides viáveis em volume de 230 μl. A taxa de prenhez para o sêmen congelado sexado foi inferior (13%; p<0,05) a dos demais tratamentos, que não diferiram entre si (40, 38 e 38% para fresco não sexado, fresco sexado e congelado não sexado, respectivamente). Rotineiramente, as éguas são inseminadas com sêmen fresco no corpo uterino, com 500 x 10 6 de espermatozoides viáveis, diariamente ou em dias alternados, durante o estro. Recomenda-se 800 x 10 6 espermatozoides com motilidade 30% após a descongelação (SIEME et al., 2004). Volkman e Van Zyl (1987) utilizando sêmen congelado em palhetas de 0,5 ml de dois garanhões para inseminar 60 éguas, relataram um aumento significativo da taxa de prenhez, de 44 para 73% quando a dose inseminante média se elevou de 175 para 249 x 10 6 espermatozoides viáveis. Kloppe et al. (1988) empregaram sêmen congelado na concentração de 600 x 10 6 espermatozoides/macrotubo (5 x 240 mm) e obtiveram taxas de prenhez variando de 55 a 60%. Leipold et al. (1998) ao utilizarem dose inseminante de 320 e 800 x 10 6 espermatozoides viáveis e compararem concentrações de 400 e 1600 x 10 6 espermatozoides/ml congelados em palhetas de 0,5 ml (fatorial 2 x 2), obtiveram maiores taxas de prenhez (37%) para a concentração de 1600 ao invés de 400 x 10 6 espermatozoides/ml (22%). O aumento de 320 para 800 x 10 6 espermatozoides viáveis, não exerceu diferença significativa nas taxas de prenhez. Diante dos resultados obtidos os autores recomendam a congelação de 800 x 10 6 espermatozoides/palheta de 0,5 ml e uma dose inseminante com 320 x 10 6 espermatozoides viáveis. Squires et al. (2003) utilizando dose inseminante única com 800 x 10 6 espermatozoides totais ou duas inseminações pós-ovulação, contendo a metade do número de espermatozoides totais (400 x 10 6 ), obtiveram taxas de recuperação embrionária de 55% e 60%, respectivamente, não constatando diferença significativa. Já, para éguas inseminadas duas vezes, após indução da ovulação, com doses de 200 x 10 6 espermatozoides totais, no corno ou no corpo uterino, as taxas de recuperação embrionária diferiram significativamente (20% vs 50%, respectivamente). Da mesma forma, Barbacini et al. (2005) buscando determinar as melhores dose e frequência para a inseminação artificial, encontraram para éguas inseminadas com 800 x 10 6 espermatozoides totais pós-ovulação, taxa de prenhez/ciclo em torno de 47%. A seguir usaram o mesmo número total de espermatozoides, mas comparando uma ou duas inseminações e obtiveram taxas de prenhez/ciclo significativamente diferentes (57% e 76%, respectivamente). Por outro lado, éguas que foram inseminadas duas vezes com 400 x 10 6 espermatozoides totais por dose atingiram uma taxa de prenhez/ ciclo de 80%, resultado bastante satisfatório. Metcalf (2005) trabalhando com duas inseminações após indução da ovulação e com <200, , , e > 800 x 10 6 espermatozoides viáveis, relatou taxas de prenhez de 54%, 70%, 60%, 88,2% e 56,4%, respectivamente. 111

5 Concluiu que a dose inseminante entre x 10 6 espermatozoides viáveis foi significativamente melhor que as demais, as quais não diferiram entre si. Entretanto, Barbacini et al. (2005) testaram duas inseminações, após a indução da ovulação, com valores de 400 e 800 x 10 6 espermatozoides e obtiveram taxas de prenhez de 60% e 31% (p>0,05), respectivamente. A inseminação artificial é seguida de uma endometrite e o uso de doses e volumes menores parece minimizar esse processo (SIEME et al., 2004). Essa não é a única vantagem da diminuição da dose e volume inseminantes, levando em consideração o aumento do rendimento de doses/ejaculado, aumento da fertilidade de garanhões com subfertilidade adquirida e viabilidade no uso do sêmen sexado. Portanto, doses com cerca de 300 milhões de espermatozoides viáveis são recomendadas para o sêmen congelado, mas estudos mostram um crescente sucesso no uso de doses menores quando associadas às novas técnicas de inseminação artificial. Local da inseminação artificial A maximização na utilização do sêmen de determinados garanhões, principalmente daqueles com infertilidade adquirida, gera discussões quanto à melhor dose a ser usada e o local de deposição seminal. O objetivo é alcançar uma alta taxa de concepção com a menor dose, embora o número mínimo de espermatozoides por dose inseminante varie entre garanhões. A introdução da técnica de congelação do sêmen equino gerou polêmicas quanto à sua eficiência na obtenção de taxas satisfatórias de prenhez. Muller (1982) inseminando 175 éguas, com 200x10 6 espermatozoides/ml viáveis e deposição seminal na porção média do corpo uterino, obteve uma taxa de prenhez de 40-45%. Em estudo posterior, Müller (1987) avaliando 959 éguas, relatou taxa de prenhez de 56%, quando a deposição seminal foi realizada na porção inicial do corpo uterino. Valores similares foram observados por Cristanelli et al. (1984) que trabalhando com 108 ciclos estrais de 90 éguas, compararam a eficiência da inseminação artificial no corpo do útero com sêmen fresco ou congelado de três garanhões. Os autores constataram que embora não tenham diferido significativamente, as taxas de prenhez para o congelado (50, 56 e 61%) corresponderam a 86% daquelas obtidas com o sêmen fresco (67, 67, 61%). Uma alternativa à deposição do sêmen no corpo do útero é a inseminação no ápice do corno uterino. Rigby et al. (2000) constataram a presença de espermatozoides viáveis na junção útero-tubárica após a inseminação no ápice do corno ou na porção média do corpo do útero. Os autores acreditam que a inseminação artificial no corno possa aumentar a taxa de prenhez por elevar o número de espermatozoides viáveis no oviduto, em especial quando se utiliza sêmen congelado, pois o número de espermatozoides viáveis é reduzido. Embora Squires et al. (2003) tenham obtido uma taxa de recuperação embrionária menor para inseminação no corno (4/20; 20%) que no corpo do útero (10/20; 112

6 50%), os autores atribuem esse pior resultado à inexperiência do técnico em posicionar corretamente o cateter e também a possível resposta inflamatória uterina mais intensa pelo fato das éguas terem sido inseminadas 24 e 40 h após a aplicação do hcg. Güvenc et al. (2005) avaliaram o efeito do número total de espermatozoides na dose inseminante e do local de deposição do sêmen, corpo do útero e ápice do corno ipsis lateral ao folículo pré-ovulatório, sobre a resposta inflamatória intrauterina. Verificaram que a inseminação no ápice do corno uterino com o uso da pipeta plástica flexível associada à palpação transretal, não aumentou a resposta inflamatória local, sugerindo que o uso de baixo número de espermatozoides é mais recomendável quando a inseminação é realizada na extremidade do corno. Por outro lado, Clulow et al. (2008) usando a inseminação histeroscópica para testar diferentes doses (6, 13 e 25 x 10 6 ) e volumes (250, 500 e 1000 µl) de sêmen sexado ou não, adotaram a inseminação convencional no corpo do útero com 4 ml contendo 500 x 10 6 espermatozoides móveis, como grupo controle. O método convencional resultou em taxa de prenhez/ciclo significativamente maior (22/62 ciclos; 35,5%) que aquela com baixo número de espermatozoides, que variou de 0 a 20%, não diferindo entre sêmen sexado e não sexado. Squires et al. (2000), comparando a taxa de prenhez entre deposição seminal no corno uterino com pipeta plástica flexível guiada por ultrassonografia e inseminação na papila útero-tubárica por histeroscopia, obtiveram valores de 0 (0/10) e 50% (5/10), respectivamente. Utilizando sêmen fresco, Buchanan et al. (2000) verificaram que a deposição no corpo uterino de 500x10 6 de espermatozoides, em 20 ml de diluidor, resultou em taxa de prenhez de 90%, significativamente maior que aquela obtida para o ápice do corno uterino ipsis lateral ao folículo pré-ovulatório contendo 25 x 10 6 espermatozoides diluídos em 1 ml de meio (57%). Esta dose por sua vez não diferiu da prenhez observada no grupo inseminado com 5 x 10 6 espermatozoides (35%). Sieme et al. (2004) trabalhando com sêmen fresco, verificaram que éguas com trato reprodutivo normal tiveram taxa de prenhez superior (27/38; 71%) com inseminações no corno, com auxílio da histeroscopia, quando comparada ao corpo do útero (18/38; 47,3%). No entanto, o mesmo não foi observado para as éguas com problema no trato reprodutivo que apresentaram taxas de prenhez de 33,3% (5/15) e 84,2% (16/19), para inseminações no corno e corpo uterino, respectivamente. A inseminação artificial rotineiramente realizada no corpo do útero com sêmen congelado de garanhões resultada em taxa de prenhez equivalente a cerca de 60% a 80% daquela obtida com o sêmen fresco ou refrigerado. A deposição seminal no corno uterino, por histeroscopia ou com pipeta flexível guiada por palpação transretal, são técnicas que permitem redução drástica do número necessário de espermatozoides viáveis, viabilizando o uso de garanhões com subfertilidade adquirida (oligospérmicos), aumentando o rendimento de doses por ejaculado e possibilitando o uso do sêmen sexado. Por histeroscopia a deposição seminal pode ser realizada sobre a papila no ápice do corno uterino, contudo com aplicabilidade limitada devido ao alto custo do equipamento. 113

7 Momento e frequência da inseminação artificial A gonadotrofina coriônica humana (hcg) e análogos do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) como o acetato de deslorelina são utilizados para a indução e sincronização da ovulação, permitindo a escolha do melhor momento para a inseminação artificial das éguas. Esses hormônios podem ser administrados por várias vias, dentre elas, intramuscular, intravenosa ou implantes vulvares, após se detectar folículos com diâmetro 35 mm (KLOPPE et al., 1998; LEIPOLD et al., 1998; MORRIS et al., 2000; BUCHANAN et al., 2000; SQUIRES et al., 2000; SQUIRES et al., 2003), ou 42 mm (HEMBERG, 2006). Durante a estação de monta, o uso repetido de hcg pode estar associado a uma diminuição na eficiência em induzir a ovulação pois sendo uma proteína heteróloga, sua administração provocará a produção de anticorpos, diminuindo sua eficácia, fato que também pode ocorrer com o aumento da idade da égua (VOSS, 1993; McCUE et al., 2004). McCue et al. (2004) constataram que a ovulação em éguas após a administração de hcg ocorreu dentro de 48 horas em 78,4% dos ciclos, entre 24 e 48 horas em 59,9% e 4,4% não ovularam durante o tratamento. Sugere-se que o hcg não deve ser usado por mais de uma ou duas vezes durante uma estação de monta, recomendandose o emprego de hormônios alternativos, como os análogos do GnRH, procedimento preconizado também por Squires et al. (2003). Morris et al. (2000) utilizaram um protocolo de indução da ovulação com uma dose intravenosa de UI de hcg ou implante subcutâneo de liberação lenta de GnRH (2,1 mg) administrado 8 horas antes ou no momento da inseminação. A ovulação ocorreu no segundo dia após a indução em 79,1% das éguas, não havendo diferença entre o hcg e GnRH para as taxas de prenhez. Hemberg (2006) determinou o momento da ovulação em éguas tratadas com acetato de deslorelina (Ovuplant ) e inseminadas uma vez pós-ovulação. As ovulações ocorreram em média com 39,4 horas dentro de um intervalo de 36 a 48 horas e 94,1% ovularam 38 a 42 horas após o tratamento, obtendo taxa de prenhez de 45,4%. Leipold et al. (1998), utilizando inseminação com sêmen congelado pré e pósovulação, em diferentes doses e usando implante de 2,2 mg de análogo de GnRH para indução da ovulação, detectaram 89,7% delas ocorrendo 48 horas após o tratamento, com taxas de prenhez variando de 15 a 40%. Testando estratégias de inseminação artificial, visando racionalizar o manejo quando da utilização do sêmen congelado, Squires et al. (2003) induziram a ovulação com a administração intravenosa de UI de hcg. Não encontraram diferença para as taxas de prenhez quando as éguas foram inseminadas dentro de 6 horas pós-ovulação ou 24 e 40 horas após o hcg (83,3 e 86,6%, respectivamente; p>0,05). Segundo os autores a alta fertilidade se deveu, provavelmente, à seleção de garanhões férteis e com boa criorresistência. 114

8 Segundo Kloppe et al. (1988) as recomendações gerais nos programas reprodutivos que utilizam sêmen congelado são de inseminar as éguas diariamente durante o cio ou acompanhar frequentemente o desenvolvimento folicular e inseminá-las uma vez após a ovulação. As éguas receberam UI de hcg intravenoso. Utilizando esses protocolos em seu trabalho obteve taxas de prenhez de 60 e 55%, respectivamente, não havendo diferença significativa entre elas. Barbacini et al. (2005) avaliaram a inseminação em tempo fixo, 24 e 40 horas após a indução da ovulação com UI de hcg intravenoso, ou uma inseminação pós-ovulação e obtiveram taxas de prenhez de 46% e 47% (p>0,05), respectivamente. Os autores concluíram que sendo o sêmen de boa qualidade, fertilidade semelhante é atingida quando as éguas são inseminadas pós-ovulação ou as 24 e 40 horas após a administração de hcg. Em síntese, a indução da ovulação é usada rotineiramente para inseminações com sêmen congelado. O GnRH é a alternativa quando mais de duas doses de hcg forem empregadas na mesma estação de monta. Em geral, o intervalo entre o tratamento e a ocorrência da ovulação é superior para o hcg. Além disso, os resultados demonstram que as taxas de prenhez não diferem entre os indutores. Pesquisas têm demonstrado que a inseminação artificial em tempo fixo nas éguas é uma estratégia a ser adotada visando à racionalização do manejo das inseminações. Transporte espermático O transporte espermático é fundamental para que a fecundação ocorra, pois através dele os espermatozoides colonizam o oviduto. Os gametas masculinos devem ser transportados até o sítio da fecundação no oviduto, se manter no trato reprodutor feminino até a liberação do ovócito e estarem fisiologicamente preparados para penetrálo (TROEDSSON et al., 1998). Nas éguas o estro tem uma duração de 5 a 7 dias e a fecundação pode ocorrer até 6 dias após a monta ou inseminação, portanto é necessário um armazenamento prolongado de espermatozoides viáveis no trato reprodutivo da fêmea (THOMAS et al., 1994). A maior porção do ejaculado é depositada no útero da égua durante a cópula. Em função disso a junção útero-tubárica é a principal barreira que os espermatozoides devem transpor para atingirem a ampola, o local da fecundação (TROEDSSON et al., 1998). Após o transporte até o oviduto os espermatozoides se aderem às células do epitélio tubárico formando o reservatório espermático. Nos mamíferos o reservatório se forma no istmo do oviduto algumas horas após a monta ou inseminação artificial (BADER, 1982). Thomas et al. (1994) avaliaram in vitro como se estabelece a ligação dos espermatozoides com as células de diferentes regiões anatômicas do oviduto (ampola e istmo), em diferentes fases do ciclo estral. Os explants celulares foram coletados de éguas em três fases do ciclo: fase folicular, imediatamente após a ovulação e no 115

9 diestro. As células foram coincubadas com sêmen fresco na concentração final de 50 x 10 6 espermatozoides/ml e aos 30 minutos, 24 e 48 horas foram retiradas amostras para avaliar a motilidade e o número de espermatozoides fixados entre as células do oviduto. A análise por micrografia eletrônica demonstrou que os espermatozoides se ligaram às células ciliadas e não ciliadas. As células epiteliais do istmo apresentaram maior número de espermatozoides fixados quando comparadas às da ampola e mais células se ligaram ao epitélio do oviduto nas fases folicular e pós-ovulação que no diestro. A motilidade dos espermatozoides fixados foi maior na fase folicular. Usando as técnicas de inseminação artificial no corpo do útero e no ápice do corno uterino Rigby et al. (2000) relataram que o número médio de espermatozoides no oviduto de éguas normais e daquelas com limpeza uterina tardia foi semelhante entre as técnicas usadas. Os autores sugerem que as éguas com limpeza uterina tardia necessitam de mais tempo para que os espermatozoides migrem até o oviduto, devido à contratilidade uterina reduzida. As células espermáticas ficam retidas no reservatório pela combinação de uma série de fatores. Dentre eles: constrição localizada do istmo, queda da motilidade espermática no istmo, fixação às células epiteliais do oviduto, aprisionamento dos espermatozoides no muco local e o edema da mucosa do oviduto associado à fase do ciclo estral (THOMAS et al., 1994). In vitro o reservatório espermático aumenta a viabilidade do espermatozoide equino (TROEDSSON et al., 1998). Sugere-se que ele possua diferentes funções como redução do risco de poliespermia por liberar uma quantidade pequena e suficiente de espermatozoides para a fecundação no momento da ovulação (LEFEBVRE et al., 1995) e previne a capacitação espermática precoce por manter em nível basal a concentração intracelular de cálcio. Morris et al. (2000) determinaram que a concentração mínima para a formação de um reservatório espermático adequado por um a quatro dias é de 1x10 6 espermatozoides viáveis. Scott et al. (2002) descreveram a presença de espermatozoide equino nos tecidos do trato genital de éguas 18 e 26 horas após a inseminação. Os espermatozoides estavam presentes na junção útero-tubárica de 70% dos animais. As 18 e 26 horas após a inseminação os espermatozoides estavam localizados principalmente no lúmen da junção útero-tubárica e não na porção uterina da papila. Os autores concluíram que a junção útero-tubárica é o reservatório espermático na égua. Fiala et al. (2007) avaliaram após 2, 4 e 24 horas da inseminação artificial se a concentração influenciava no transporte dos gametas até o reservatório espermático. Utilizando doses de 5x10 6, 25x10 6 e 50x10 6 espermatozoides/ml verificaram que o número deles presente no oviduto e na junção útero-tubárica foi semelhante para as concentrações de 25x10 6 e 5x10 6 espermatozoides/ml, em todos os momentos analisados. Os autores sugerem que a resposta inflamatória intensa observada às 4 horas pós-inseminação é prejudicial ao transporte espermático nesse período. Independente da concentração testada, 2 horas após a inseminação artificial havia espermatozoides suficientes para permitir a fecundação na junção útero-tubárica, em mais de 54% das 116

10 éguas, fato observado para 67% e 74% delas as 4 e 24 horas, respectivamente. A partir das 4 horas após a inseminação o transporte espermático não foi influenciado pela concentração utilizada. O transporte e a sobrevivência dos espermatozoides variam de acordo com a fertilidade da égua, do garanhão e entre sêmen fresco e congelado, sendo que no trato reprodutor feminino a longevidade do espermatozoide criopreservado é menor (TROEDSSON et al., 1998). Bader (1982) inseminou 14 éguas com sêmen fresco e nove com criopreservado no corpo do útero, imediatamente após ou até 6 horas pós-ovulação. As éguas foram sacrificadas 2, 4 ou 6 horas após a inseminação, sendo realizados lavados da junção úterotubárica, istmo e ampola do oviduto ipsis lateral à ovulação. O número de espermatozoides na junção útero-tubárica e oviduto foi muito baixo após 2 e 6 horas da inseminação com sêmen fresco ou congelado, porém às 4 horas grande número de espermatozoides do sêmen fresco atingiu a junção útero-tubárica. A habilidade dos espermatozoides congelados ascenderem ao oviduto e alcançarem à ampola foi muito menor que daqueles do sêmen a fresco. Os resultados indicam que embora poucos espermatozoides estejam presentes na junção útero-tubárica e istmo após 2 horas da inseminação, o transporte até a ampola ainda não se completou, evento observado após 4 horas. Dobrinski et al. (1995) utilizando sêmen congelado e fresco diluído em meio à base de leite ou em diluente de congelação, demonstraram que espermatozoides criopreservados têm uma habilidade reduzida de se ligar às células do oviduto e, principalmente, se encontram em número reduzido no istmo antes da fecundação. Da mesma forma, a motilidade foi significativamente menor para o sêmen congelado. Os autores relatam que o processo de criopreservação modifica a estrutura e o funcionamento da membrana plasmática através da reorganização dos seus lipídios e alterações nas ligações entre estes e as proteínas. Possivelmente, as mudanças nas glicoproteínas e glicolipídeos da membrana impeçam que os espermatozoides estabeleçam um contato íntimo com as células epiteliais do oviduto, reduzindo assim a fertilidade do sêmen congelado. Resposta inflamatória uterina Após a monta natural ou a inseminação artificial as éguas desenvolvem um processo inflamatório fisiológico que se caracteriza pelo acúmulo de fluido intrauterino rico em leucócitos polimorfonucleares. Essa endometrite fisiológica serve para remover o material estranho presente no útero como excesso de espermatozoides, plasma seminal, bactérias e diluente (BARBACINI et al., 2003). A limpeza do útero fornece um ambiente compatível à sobrevivência do embrião quando este ingressa no lúmen uterino cinco dias após a fecundação (TROEDSSON et al., 1998). Apesar dos espermatozoides aparentemente não exercerem efeito quimiotático direto sobre os neutrófilos, eles induzem a quimiotaxia de polimorfonucleares através 117

11 da ativação do sistema complemento, ao contrário do plasma seminal que tem um efeito inibidor sobre a migração dos leucócitos (TROEDSSON et al., 1998). A endometrite induzida pelos espermatozoides parece estar associada com queda na fertilidade das éguas, pois altera o microambiente uterino e prejudica a sobrevivência do embrião (CARD, 2005). Com o objetivo de avaliar se ocorria queda da fertilidade do sêmen congelado quando a inseminação era realizada 4 a 10 horas após uma inseminação prévia, Metcalf (2000) utilizou a inseminação heterospérmica que compreende o uso de espermatozoides provenientes de mais de um reprodutor. As éguas foram inseminadas com sêmen congelado do Garanhão A e após a detecção da ovulação as éguas foram inseminadas com sêmen congelado do Garanhão B, 6 a 10 horas após a primeira inseminação. A taxa de prenhez foi de 82%, sendo o Garanhão B responsável pela maioria das gestações, porém não houve diferença significativa entre as inseminações. A autora concluiu que aparentemente a endometrite desencadeada após a inseminação inicial com sêmen congelado não está associada à infertilidade das subsequentes até mesmo quando realizada no pico de atividade dos neutrófilos e da queda da motilidade espermática. Os resultados reforçam a hipótese de que os neutrófilos fazem fagocitose seletiva dos espermatozoides anormais e inférteis concomitante à endometrite pósinseminação. A utilização de baixa concentração e volume de sêmen com deposição direta na papila da junção útero-tubárica parece reduzir a endometrite pós-inseminação (LINDSEY et al., 2001). Güvenc et al. (2005), estudando o efeito do número total de espermatozoides e do local da inseminação na resposta inflamatória do útero equino concluíram que ambos não afetaram a intensidade da reação inflamatória, medida pelo número de neutrófilos e presença de fluido no útero, 24 horas após a inseminação. Além disso, os autores relatam que a inseminação no ápice do corno uterino com auxílio de pipeta associada à palpação retal não aumentou a irritação da mucosa uterina, nem a resposta inflamatória local, com o acúmulo de fluido sendo significativamente menor para dose de 20 x 10 6 espermatozoides/0,5 ml. Dessa forma, sugerem que um menor número de espermatozoides é preferível quando a inseminação é realizada na extremidade do corno uterino. Fiala et al. (2007) avaliaram o efeito de diferentes concentrações espermáticas e da presença de plasma seminal ou do diluente sobre a intensidade da resposta inflamatória no útero 2, 4 e 24 horas após a inseminação artificial. As éguas foram submetidas a seis tratamentos: (1) 5 x 10 6 espermatozoides/ml; (2) 25 x 10 6 espermatozoides/ml; (3) 50 x 10 6 espermatozoides/ml; (4) infusão de 20 ml de plasma seminal; (5) infusão de 20 ml de diluente a base de leite desnatado e; (6) controle. Os animais foram sacrificados 2, 4 e 24 horas após os tratamentos. Foram feitos lavados do útero e ovidutos para detectar a presença de neutrófilos. O número de neutrófilos no lavado uterino das éguas tratadas foi significativamente maior que no grupo controle demonstrando que o plasma seminal, diluente e concentração de espermatozoides provocaram uma resposta inflamatória mais intensa às 4 horas que aquela observada para o controle. Provavelmente, a concentração 118

12 de 50 x 10 6 /ml promoveu um estímulo quimiotático mais intenso através da ativação do sistema complemento e outros mediadores inflamatórios. A concentração mais elevada de espermatozoides acelerou o desaparecimento da inflamação devido à maior eficácia da fagocitose. Quando a habilidade fisiológica da fêmea de combater a endometrite está comprometida a inflamação persiste e se torna patológica resultando em queda da fertilidade, portando é importante considerar a duração da resposta inflamatória em éguas inseminadas repetidamente com sêmen congelado. A remoção do plasma seminal durante o processo de criopreservação parece ser um importante fator para uma resposta inflamatória acentuada após a inseminação, que geralmente é observada clinicamente ao se utilizar sêmen congelado (TROEDSSON et al., 1998). Uso de sêmen sexado e não-sexado A possibilidade de selecionar o sexo do embrião antes da fecundação possui uma série de vantagens nas espécies domésticas voltadas para a produção de carne ou leite. Nos equinos estas não são muito evidentes, embora muito desejadas pela maioria dos criadores (LINDSEY et al., 2001). Johnson et al. (1989) citado por Lindsey et al. (2001) foi o primeiro a realizar a sexagem pela análise quantitativa de DNA nos cromossomos de espermatozoides X e Y, produzindo embriões saudáveis de coelhos. O primeiro potro produzido a partir de sêmen sexado originou-se da inseminação cirúrgica diretamente no oviduto de espermatozoides (LINDSEY et al., 2001). Os principais fatores que afetam as taxas de prenhez do sêmen sexado são o número reduzido de espermatozoides disponíveis para a inseminação e sua criopreservação (MORRIS, 2005). O processo de sexagem é prejudicial para a célula e acredita-se que o espermatozoide equino seja mais sensível aos procedimentos que o bovino. Em decorrência da baixa recuperação de células sexadas, passam a ter relevância técnicas de inseminação que resultem em taxas de prenhez aceitáveis quando o menor número possível de espermatozoides é utilizado (LINDSEY et al., 2001). Buchanan et al. (2000) trabalhando com sêmen fresco diluído na dose de 25x10 6 espermatozoides sexados, avaliaram o efeito da adição de 4% de gema de ovo, visando aumentar a motilidade, sobre a taxa de prenhez. O sêmen foi depositado no ápice do corno uterino ipsis lateral ao ovário contendo o folículo pré-ovulatório. A taxa de prenhez não diferiu (p>0,05) entre os grupos controle e com gema de ovo, sendo de 33% e 50%, respectivamente. O mesmo foi observado no experimento de Squires et al. (2000) em que a adição de gema de ovo ao diluente do sêmen sexado não afetou as taxas de concepção. Lindsey et al. (2000) compararam a fertilidade do sêmen sexado e não-sexado na dose de 5 x 10 6 espermatozoides, frente a diferentes técnicas de inseminação, sendo elas: deposição guiada pelo ultrassom no corno uterino (não-sexado); diretamente na papila da junção útero-tubárica (não-sexado) e; histeroscópica, na papila uterina 119

13 (sexados). A taxa de prenhez foi maior para a inseminação histeroscópica ao se utilizar sêmen não-sexado. Porém, a taxa de prenhez com a utilização do sêmen sexado não foi significativamente menor (25%) que aquela com não-sexado (50%), utilizando a inseminação histeroscópica. Os autores concluíram que a histeroscopia é mais recomendada quando se dispõe de baixa concentração de espermatozoides sexados de garanhão. A possibilidade de criopreservar o sêmen sexado aumenta consideravelmente a aplicabilidade desta biotecnologia na indústria equina. O espermatozoide de garanhões sobrevive por curto período de tempo após a sexagem, portanto as éguas devem ser inseminadas imediatamente após para que se atinjam boas taxas de prenhez. Em virtude disso a criopreservação é vantajosa, pois permitirá usar o sêmen no momento e local desejados. Comparando as taxas de concepção de éguas inseminadas com 5 x 10 6 espermatozoides sexados e não-sexados, Squires et al. (2000) utilizaram 40 éguas, divididas em três grupos: (1) sêmen fresco não-sexado, depositado profundamente no corno uterino com auxílio de pipeta flexível e ultrassonografia; (2) sêmen fresco nãosexado, diretamente na papila da junção útero-tubárica do corno uterino ipsis lateral ao ovário com folículo dominante e; (3) sêmen fresco sexado utilizando vídeo-endoscopia. A taxa de prenhez para o não-sexado foi 50%, enquanto para o sexado de 25%, não havendo diferença (p>0,05) entre elas. Clulow et al. (2008) também não encontraram diferença significativa entre as taxas de prenhez ao utilizarem sêmen congelado nãosexado e sexado, porém, a motilidade pós-descongelação do sêmen sexado foi menor até 90 minutos de incubação, momento a partir do qual não houve mais diferença entre as amostras. Squires et al. (2000) conduziram experimentos para avaliar os efeitos da dose e técnica de inseminação, histeroscópica ou pipeta flexível, comparando sêmen sexado vs não-sexado e sêmen fresco vs congelado. Embora não tenha sido detectada diferença significativa entre os grupos, o sêmen congelado sexado resultou na menor taxa de prenhez, de 13%. Em bovinos é possível criopreservar o sêmen sexado sem queda significativa da fertilidade, já em equinos os resultados de Squires et al. (2000) levaram a concluir que a criopreservação do sêmen sexado levou a queda da fertilidade do sêmen, provavelmente por danos que as técnicas de sexagem por citometria de fluxo e congelação provocaram na célula espermática. Uma alternativa para aumentar a longevidade do sêmen sexado é armazená-lo antes da sexagem. Lindsey et al. (2000) compararam a fertilidade do sêmen sexado com a do sêmen armazenado sob refrigeração por 18 horas e então sexado. Os resultados do estudo indicaram que não houve diferença nas taxas de prenhez entre os tratamentos, sugerindo que é possível armazenar o sêmen refrigerado antes da sexagem sem prejuízos na fertilidade. Os experimentos demonstram que a utilização do sêmen sexado na reprodução equina ainda não é uma prática muito vantajosa em virtude de sua fertilidade reduzida a campo. Portanto, são necessários estudos tanto para aperfeiçoar a utilização do sêmen 120

14 equino sexado, quanto para aumentar a longevidade deste através de refrigeração ou criopreservação sem que haja queda significativa da fertilidade. CONSIDERAÇÕES FINAIS Em síntese, a dose influencia o grau da resposta uterina, portanto doses menores associadas às técnicas de inseminação no ápice do corno compensam a menor longevidade do espermatozoide equino criopreservado, pela deposição dos gametas nas proximidades do reservatório espermático. Assim, essa associação aumenta o rendimento das doses disponíveis, com taxas de prenhez equivalentes àquelas da inseminação no corpo do útero. Além disso, indutores da ovulação viabilizam a adoção da inseminação artificial em tempo fixo racionalizando o manejo das inseminações. O sêmen sexado se mostra mais sensível à congelação e resulta em baixas taxas de prenhez. Estudos sobre a criobiologia do espermatozoide equino associados a estratégias de aplicação condizentes com a fisiologia reprodutiva das éguas devem ser realizados visando ao aumento da eficiência reprodutiva da espécie. REFERÊNCIAS BADER, H. A. An investigation of sperm migration into the oviducts of the mare. J. Reprod. Fertil, v.32, p.59-64, BARBACINI, S.; LOOMIS, P.; SQUIRES, E. L. The effect of sperm number and frequency of insemination on pregnancy rates of mares inseminated with frozen-thawed spermatozoa. Anim. Reprod. Sci., v.89, p , BARBACINI, S. et al. Retrospective study on the incidence of postinsemination uterine fluid in mares inseminated with frozen/thawed semen. J. Eq. Vet. Sci., v.23, p , BUCHANAN, B. R. et al. Insemination of mares with low numbers of either unsexed or sexed spermatozoa. Theriogenology, v.53, p , CARD, C. Post-breeding inflammation and endometrial cytology in mares. Theriogenology, v.64, p , CLULOW, J. R. et al. Field fertility of sex-sorted and non-sorted frozen-thawed stallion spermatozoa. Anim. Reprod. Sci., v.108, p , CRISTANELLI, M. J. et al. Fertility of stallion semen processed, frozen and thawed by a new procedure. Theriogenology, v.22, p.39-45, DOBRINSKI, I., THOMAS, P. G. A., BALL, B. A. Cryopreservation reduces the ability of equine spermatozoa to attach the oviductal epithelial cells and zonae pellucidae in vitro. J. Androl, v.16, n.6, p , FIALA, S. M. et al. Effect of sperm numbers and concentration on sperm transport and uterine inflammatory response in the mare. Theriogenology, v.67, p , GINTHER, O. J. Reproductive biology of the mare: basic and applied aspects. 2.ed. Madison: Equiservices, p. GÜVENC, K.; REILAS, T.; KATILA, T. Effect of insemination dose and site on uterine 121

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