ultraview Universal Alkaline Phosphatase Red Detection Kit

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1 ultraview Universal Alkaline Phosphatase Red Detection Kit FINALIDADE O VENTANA ultraview Universal Alkaline Phosphatase Red Detection Kit (kit de detecção ultraview AP Red) é um sistema indirecto sem biotina para detecção dos anticorpos primários IgG do ratinho, IgM do ratinho e do coelho utilizando através de microscopia óptica. O kit destina-se a ser utilizado no laboratório para identificar alvos através de immunohistochemistry (IHC) em secções de tecido fixado em formol e impregnado em parafina marcadas nos instrumentos VENTANA BenchMark IHC/ISH. Este produto deverá ser interpretado por um patologista qualificado, em conjunto com um exame histológico, a informação clínica relevante e os controlos adequados. Este produto destina-se ao diagnóstico in vitro (IVD). Precipitado vermelho Tecido Conjugado AP Anticorpo primário Antigénio alvo Detecção com ultraview Universal Phosphatase Red Figura 1. Reacção de ultraview Universal Alkaline Phosphatase Red Intensificador Naftol Vermelho rápido RESUMO E EXPLICAÇÃO MATERIAIS E MÉTODOS A immunohistochemistry (IHC) é uma técnica utilizada em laboratórios para fins de diagnóstico. A IHC utiliza anticorpos primários para localizar e se ligar aos antigénios Reagentes fornecidos nas secções de tecido fixadas ou congeladas. A ligação do anticorpo ao antigénio é O kit de detecção ultraview AP Red contém reagente suficiente para 250 testes. visualizada através de um método de detecção indirecta. As técnicas mais comuns para Um dispensador de O ultraview Universal AP Red Multimer contém um cocktail métodos indirectos utilizam um anticorpo secundário direccionado contra as espécies do anticorpo primário e uma enzima com um sistema de substrato cromogénico de anticorpos marcados com Alkaline Phosphatase (AP) correspondente. Esta combinação resulta numa precipitação colorida no local da ligação (< 50 μg/ml) num tampão com solução conservante específica do anticorpo. O kit de detecção ultraview AP Red utiliza um método indirecto ProClin 300. para visualizar anticorpos específicos ligados a antigénios, depositando um precipitado de cor vermelha. Um dispensador de O ultraview Universal AP Red Fast Red A contém 1,0% (p/v) de Fast Red em tampão acetato com solução conservante ProClin 300. PRINCÍPIO DO PROCEDIMENTO Um dispensador de O ultraview Universal AP Red Fast Red B contém 1,0% O kit de detecção ultraview AP Red detecta anticorpos específicos de ratinho e de coelho (p/v) de Fast Red em tampão acetato com solução ligados a um antigénio em secções de tecido impregnado em parafina. O anticorpo conservante ProClin 300. específico é localizado por um cocktail de anticorpos secundários marcados com enzima que localizam o anticorpo primário ligado. O complexo é então visualizado com substrato Naphthol e cromogénio Fast Red, que produz um precipitado vermelho prontamente observado pela microscopia óptica. Um dispensador de O ultraview Universal AP Red Naphthol contém 1,0% (p/v) de Naphthol em tampão Tris com solução conservante ProClin 300. O protocolo de marcação é constituído por várias etapas, em que os reagentes são Um dispensador de O ultraview Universal AP Red Enhancer contém 3% (v/v) incubados durante períodos de tempo predeterminados a temperaturas específicas. de MgCl2 num tampão Tris com solução conservante No final de cada etapa de incubação, o instrumento BenchMark IHC/ISH lava as secções ProClin 300. para remover o material não ligado e aplica solução de protecção na lâmina, que minimiza a evaporação dos reagentes aquosos da lâmina. 1 Os resultados são interpretados utilizando um microscópio óptico e auxiliam no diagnóstico diferencial de processos fisiopatológicos que podem ou não estar associados a um antigénio específico. Para informações mais detalhadas sobre o funcionamento do dispositivo, consultar o Manual do Operador apropriado. A figura 1 ilustra o método de detecção indirecta. Reconstituição, homogeneização, diluição e titulação O kit de detecção ultraview AP Red está optimizado para utilização em instrumentos BenchMark IHC/ISH. Não é necessária qualquer reconstituição, homogeneização, diluição ou titulação de reagentes do kit. A diluição subsequente pode originar a perda de marcação do antigénio. O utilizador deverá validar tais alterações. As diferenças a nível do processamento de tecidos e do procedimento de pré-exame no laboratório podem dar origem a uma variabilidade significativa nos resultados. Para mais informações sobre os controlos, consultar a secção de Procedimentos de controlo de qualidade. Materiais e reagentes necessários mas não fornecidos Os produtos indicados no folheto informativo podem não estar todos disponíveis em todas as regiões. Consultar o representante de assistência local. Poderão ser necessários os seguintes reagentes e materiais para a marcação, mas não são fornecidos com o kit de detecção: 1. Anticorpo primário 2. Reagente de controlo negativo 3. Controlos tecidulares positivos e negativos (consultar os folhetos informativos dos anticorpos quanto aos tipos recomendados) 4. Kit de amplificação / PT Rev G

2 5. OptiView Amplification Kit 6. OptiView DAB IHC Detection Kit 7. ultraview Universal DAB Detection Kit 8. Protéase 1 9. Protéase Protéase Hematoxylin 12. Hematoxylin II 13. Bluing Reagent 14. Reaction Buffer Concentrate (10X) 15. Cell Conditioning Solution (CC1) 16. Cell Conditioning Solution 2 (CC2) 17. ULTRA Cell Conditioning Solution (ULTRA CC1) 18. ULTRA Cell Conditioning Solution 2 (ULTRA CC2) 19. Antibody Diluent 20. EZ Prep Concentrate (10X) 21. Solução de protecção da lâmina (Alta temperatura) 22. ULTRA LCS (Predilute) 23. Lâminas de microscópio carregadas positivamente 24. Estufa de secagem capaz de manter uma temperatura de 60 ºC ± 5 ºC 25. Etiquetas de código de barras (etiquetas de código de barras apropriadas para o controlo de reagente negativo e para o anticorpo primário a testar) 26. Xilol (intensidade histológica) 27. Água desionizada ou destilada 28. Lamela e método de cobertura suficiente para cobrir o tecido 29. Microscópio óptico 30. Detergente para a loiça suave 31. Dispositivo automático de cobertura (como o Tissue-Tek SCA Automated Coverslipper) Conservação e manuseamento Após a recepção e quando não estiver a ser utilizado, conservar entre 2 e 8 C. Não congelar. O utilizador deverá validar quaisquer outras condições de conservação que não as especificadas no folheto informativo incluído na embalagem. Este kit de detecção pode ser utilizado imediatamente depois de retirado do frigorífico. Para garantir uma correcta distribuição e a estabilidade de cada reagente, deve-se voltar a colocar a tampa do dispensador após cada utilização e o dispensador deverá ser imediatamente colocado no frigorífico na posição vertical. Todos os kits de detecção têm indicada a respectiva data de validade. Quando correctamente conservado, o produto permanece estável até à data indicada no rótulo. Não utilizar o produto depois de ultrapassada a data de validade para o método de conservação indicado. Não existem quaisquer sinais definitivos que indiquem a instabilidade deste produto, como tal, deverão ser processados simultaneamente controlos positivos e negativos com as amostras desconhecidas. Deverá contactar-se imediatamente o representante de assistência local se houver qualquer indício de instabilidade do reagente. Colheita das amostras e preparação para análise Os tecidos fixados em formol e impregnados em parafina são adequados para utilização com o kit de detecção ultraview AP Red e um instrumento BenchMark IHC/ISH (consultar a secção Materiais e reagentes necessários mas não fornecidos). O fixador tecidular recomendado é o formol neutro tamponado a 10% (NBF). 2 Poderão ocorrer resultados variáveis em consequência da espessura da secção do tecido, do tipo de fixação, da fixação prolongada incompleta ou de processos especiais, tais como a descalcificação de preparações de medula óssea. Cada secção deve ser cortada à espessura apropriada (2 5 µm) para o anticorpo primário a ser utilizado e colocada numa lâmina de microscópio de vidro carregada positivamente. As lâminas que contêm a secção de tecido podem ser aquecidas durante pelo menos 2 horas (mas não mais de 24 horas) numa estufa a 60 C ± 5 C. O aquecimento das lâminas é utilizado para secar o tecido após a montagem na lâmina e para intensificar a adesão do tecido ao vidro. NOTA: Consultar o folheto informativo do anticorpo primário para identificar as limitações de aquecimento. O aquecimento prolongado do tecido poderá resultar numa disponibilidade reduzida de antigénio. O decreto Clinical Laboratory Improvement Act (CLIA) de 1988 exige, em 42CFR (b), que O laboratório deve guardar as lâminas durante pelo menos dez anos a partir da data do exame bem como os blocos de amostras durante pelo menos dois anos a partir da data do exame. AVISOS E PRECAUÇÕES 1. Para utilização em diagnóstico in vitro (IVD). 2. Apenas para utilização profissional. 3. O ProClin 300 é utilizado como um conservante nesta solução. É classificado como irritante e pode causar sensibilização através do contacto com a pele. Tomar as precauções razoáveis ao manusear o mesmo. Evitar o contacto dos reagentes com os olhos, a pele e as membranas mucosas. Utilizar luvas e vestuário de protecção. 4. Os materiais de origem humana ou animal deverão ser manuseados como materiais que constituem perigo biológico e devem ser eliminados com as devidas precauções. 5. Tomar as precauções razoáveis ao manusear os reagentes. Evitar o contacto dos reagentes com os olhos, a pele e as membranas mucosas. Usar luvas descartáveis e vestuário de protecção adequado ao manusear substâncias que se suspeite serem cancerígenas ou materiais tóxicos. 6. Se os reagentes entrarem em contacto com áreas sensíveis, lavar com grandes quantidades de água. Evitar a inalação de reagentes. 7. Assegurar-se de que o recipiente de resíduos está vazio antes de iniciar um processamento no instrumento. Caso não se tome esta precaução, o recipiente de resíduos pode extravasar e o utilizador arrisca-se a escorregar e cair. 8. Evitar a contaminação microbiana dos reagentes, pois tal poderá produzir resultados incorrectos. 9. Consultar as autoridades locais e/ou estatais para determinar o método de eliminação recomendado. 10. Para obter informações de segurança adicionais, consultar a Ficha de Dados de Segurança e o Guia de Símbolos e Perigos do produto disponíveis em INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO O kit de detecção ultraview AP Red foi desenvolvido para utilização em instrumentos BenchMark IHC/ISH em combinação com os anticorpos primários e acessórios VENTANA. Os parâmetros para os procedimentos automáticos podem ser apresentados, impressos e editados de acordo com o procedimento no Manual do Operador do instrumento. Foram predefinidos na fábrica outros parâmetros de funcionamento para o instrumento. Os procedimentos para marcação nos instrumentos BenchMark IHC/ISH são os seguintes. Para obter instruções mais detalhadas e as opções adicionais do protocolo consultar o Manual do Operador do instrumento. O facto de uma amostra necessitar de Cell Conditioning ou não depende do anticorpo em causa. Para indicações de utilização, consultar o folheto informativo do anticorpo. Instrumentos BenchMark IHC/ISH 1. Colar na lâmina a etiqueta de código de barras que corresponde ao protocolo a ser realizado. 2. Colocar o anticorpo primário, os dispensadores do kit de detecção apropriados e o reagente acessório necessário no tabuleiro de reagentes e colocá-los no dispositivo automático de marcação. 3. Verificar os fluidos volumosos e esvaziar os resíduos. 4. Colocar as lâminas no dispositivo automático de marcação. 5. Iniciar a sessão de marcação. 6. Quando a sessão estiver concluída, retirar as lâminas do dispositivo automático de marcação. Capacidade de marcação dupla A configuração de marcação dupla consiste numa marcação sequencial, com a marcação do primeiro anticorpo primário com detecção DAB utilizando o VENTANA ultraview Universal DAB Detection Kit (kit de detecção ultraview DAB) ou VENTANA OptiView DAB IHC Detection Kit (kit de detecção OptiView DAB) seguida da detecção do segundo anticorpo primário utilizando o kit de detecção ultraview AP Red. Na configuração de marcação dupla, os kits de detecção ultraview DAB e OptiView DAB foram optimizados para tempos de incubação específicos utilizando CONFIRM anti-cd20 (L26) Primary Antibody (anticorpo CONFIRM anti-cd20 (L26)). O kit de detecção ultraview AP Red foi optimizado para tempos de incubação específicos utilizando CONFIRM anti-cd3 (2GV6) Rabbit Monoclonal Primary Antibody (anticorpo CONFIRM anti- CD3 (2GV6)). O utilizador / PT Rev G

3 terá de validar os resultados obtidos com este reagente. Consultar os protocolos de marcação recomendados na Tabela 1 e Tabela 2. Tabela 1. Protocolo de marcação recomendado para o kit de detecção ultraview DAB (utilizando o anticorpo CONFIRM anti-cd20 (L26)) e kit de detecção ultraview AP Red (utilizando o anticorpo CONFIRM anti-cd3 (2GV6)) num instrumento BenchMark GX, BenchMark XT ou BenchMark ULTRA. Tipo de procedimento Método Desparafinação seleccionado Cell Conditioning (CC1) (revelação de antigénio) Anticorpo (DAB) DS Antibody (Red) Contrastante Pós-contrastante Instrumento BenchMark GX, Suave Instrumento BenchMark XT, Suave Instrumento BenchMark ULTRA, 36 minutos Anticorpo CONFIRM anti-cd20 (L26) Instrumento BenchMark GX, 6 minutos Instrumento BenchMark XT, 16 minutos Instrumento BenchMark ULTRA, 16 minutos Anticorpo CONFIRM anti-cd3 (2GV6) Instrumento BenchMark GX, 20 minutos Instrumento BenchMark XT, 20 minutos Instrumento BenchMark ULTRA, 20 minutos Hematoxylin II, 4 minutos Bluing, 4 minutos Tabela 2. Protocolo de marcação recomendado para o kit de detecção OptiView DAB (utilizando o anticorpo CONFIRM anti-cd20 (L26)) e kit de detecção ultraview AP Red (utilizando o anticorpo CONFIRM anti-cd3 (2GV6)) num instrumento BenchMark GX, BenchMark XT ou BenchMark ULTRA. Tipo de procedimento Método Desparafinação seleccionado Cell Conditioning (CC1) (revelação de antigénio) Pre-Primary Peroxidase Inhibitor Anticorpo (DAB) DS Antibody (Red) Contrastante Pós-contrastante Instrumento BenchMark GX, 32 minutos Instrumento BenchMark XT, 32 minutos Instrumento BenchMark ULTRA, 32 minutos seleccionado Anticorpo CONFIRM anti-cd20 (L26) Instrumento BenchMark GX, 6 minutos Instrumento BenchMark XT, 8 minutos Instrumento BenchMark ULTRA, 16 minutos Anticorpo CONFIRM anti-cd3 (2GV6) Instrumento BenchMark GX, 20 minutos Instrumento BenchMark XT, 20 minutos Instrumento BenchMark ULTRA, 20 minutos Hematoxylin II, 4 minutos Bluing, 4 minutos Devido à variação na fixação e processamento dos tecidos, bem como às condições laboratoriais e ambientais gerais, poderá ser necessário aumentar ou diminuir a incubação do anticorpo primário ou o condicionamento celular com base nas amostras individuais, na detecção utilizada e na preferência do leitor. Para mais informações sobre as variáveis da fixação, consultar Immunohistochemistry Principles and Advances. 7 Procedimentos de processamento pós-instrumento recomendado Nota: O cromogénio Fast Red é solúvel em álcool e acetona. Não utilizar banhos de álcool nem acetona nem lavagens de xilol para desidratar e limpar lâminas. 1. Para remover a solução Liquid Coverslip, lavar as lâminas em 2 soluções sequenciais de detergente suave (não utilizar detergente concebido para máquinas de louça automáticas). 2. Lavar bem as lâminas com água desionizada durante cerca de 1 minuto. Sacudir a água em excesso. 3. Secar as lâminas durante, pelo menos, 15 minutos numa estufa (45 a 60 C) ou à temperatura ambiente. Certificar-se de que as lâminas estão completamente secas antes de as proteger com a respectiva solução. 4. Transferir as lâminas para dentro de um segundo banho de xilol para uma lavagem rápida, durante aproximadamente 30 segundos. 5. Colocar a solução de protecção na lâmina. Para obter os melhores resultados, utilizar um meio de montagem compatível com os substratos de fosfatase alcalina. Procedimentos de controlo de qualidade Controlo tecidular positivo Cada procedimento de marcação efectuado deverá ser acompanhado de um controlo tecidular positivo. A prática laboratorial ideal deve incluir uma secção de controlo positivo na mesma lâmina que contém o tecido do doente. Esta prática ajuda a identificar a não aplicação de anticorpo primário ou de outros reagentes críticos na lâmina de teste do doente. Um tecido com marcação positiva fraca é o mais adequado para um controlo de qualidade ideal. Os componentes tecidulares positivos são utilizados para confirmar se o anticorpo foi aplicado e se o dispositivo estava a funcionar adequadamente. Este tecido poderá conter componentes ou células de marcação negativa e positiva e servir como tecido de controlo positivo e negativo. Os tecidos de controlo deverão ser amostras recém-colhidas de autópsia, biópsia ou cirurgia, preparados ou fixados o mais cedo possível de forma idêntica às secções de teste. Tais tecidos poderão monitorizar todas as etapas do procedimento, desde a preparação dos tecidos até à marcação. A utilização de uma secção de tecido fixado ou processado de forma diferente da amostra de teste facultará um controlo para todos os reagentes e etapas do método, excepto para a fixação e processamento de tecidos. Os controlos tecidulares positivos conhecidos deverão ser utilizados apenas para monitorizar o correcto desempenho dos tecidos processados e dos reagentes de teste, e não para auxiliar na determinação de um diagnóstico específico de amostras de doentes. Se os controlos tecidulares positivos não demonstrarem uma marcação positiva, os resultados das amostras de teste deverão ser considerados inválidos. Controlo tecidular negativo Poderá ser utilizado como controlo tecidular negativo o mesmo tecido utilizado para o controlo tecidular positivo. Os vários tipos de células presentes na maioria das secções de tecidos proporcionam locais de controlo negativo interno, mas tal deverá ser confirmado pelo utilizador. Os componentes que não marcam deverão demonstrar a ausência de marcação específica e fornecer uma indicação de marcação de fundo (ou seja, manchas ou tom rosado). Se ocorrer uma marcação específica nos locais de controlo tecidular negativo, os resultados das amostras dos doentes deverão ser considerados inválidos. Discrepâncias inexplicáveis Quaisquer discrepâncias inexplicáveis nos controlos deverão ser imediatamente comunicadas ao representante de assistência local. Se os resultados do controlo de qualidade não estiverem em conformidade com as especificações, os resultados dos doentes são inválidos. Consultar a secção de Resolução de problemas deste folheto. Identificar e corrigir o problema e, em seguida, repetir as amostras dos doentes. Controlo de reagente negativo Deverá ser processado um controlo de reagente negativo para cada amostra, para auxiliar na interpretação dos resultados. É utilizado um controlo de reagente negativo em vez do anticorpo primário para avaliar a marcação não específica (ou seja, manchas ou tom rosado). A lâmina deverá ser marcada com controlo Negative Control Mouse ou controlo Negative Control Rabbit, conforme adequado. Se for utilizado um reagente de controlo negativo alternativo, diluir para a mesma concentração do antissoro/anticorpo primário com Antibody Diluent. Poder-se-á utilizar o diluente isoladamente em alternativa aos controlos de reagente negativos acima descritos. O período de incubação do controlo de reagente negativo deverá ser igual ao período de incubação do anticorpo primário. Quando forem utilizados painéis de vários anticorpos em secções em série, o controlo de reagente negativo existente numa lâmina poderá servir como controlo negativo ou controlo de ligação não específica de fundo para outros anticorpos / PT Rev G

4 Verificação do ensaio Antes da primeira utilização de um anticorpo primário ou de um sistema de marcação num procedimento de diagnóstico, a especificidade do anticorpo primário deverá ser verificada através de testes numa série de tecidos com características de desempenho de imuno-histoquímica conhecidas, representando tecidos conhecidos positivos e negativos (consultar a secção Controlo tecidular positivo no folheto informativo do anticorpo primário, bem como as recomendações de controlo de qualidade do College of American Pathologists Laboratory Accreditation Program, Anatomic Pathology Checklist, 3 ou a norma aprovada CLSI 4 ou ambos os documentos). Estes procedimentos de controlo de qualidade devem ser repetidos para cada novo lote de anticorpo ou sempre que houver alterações nos parâmetros do ensaio. Os tecidos indicados na secção Características de desempenho do anticorpo primário são adequados para verificação do ensaio. Interpretação dos resultados O ultraview AP Red detection provoca a precipitação de um produto de reacção com cor vermelha nos locais do antigénio identificados pelo anticorpo primário. Um patologista qualificado com experiência em procedimentos de imuno-histoquímica tem que avaliar os controlos e qualificar o produto marcado antes de interpretar os resultados. A marcação de controlos negativos tem que ser observada em primeiro lugar e estes resultados deverão ser comparados com o material marcado para se verificar se o sinal gerado não é a causa de interacções não específicas. Controlo tecidular positivo O controlo tecidular marcado positivo deverá ser examinado primeiro para conferir que todos os reagentes estão a funcionar correctamente. A presença de um produto de reacção com marcação correcta dentro das células alvo indica uma reactividade positiva. Dependendo da duração da incubação e da potência da hematoxilina utilizada, a aplicação de constrastante resultará numa marcação azul clara a escura dos núcleos das células. A adição excessiva ou insuficiente de contrastante poderá comprometer a interpretação correcta dos resultados. Se o controlo tecidular positivo não demonstrar uma marcação positiva, quaisquer resultados das amostras de teste deverão ser considerados inválidos. Controlo tecidular negativo O controlo tecidular negativo deverá ser examinado depois do controlo tecidular positivo para verificar a identificação específica do antigénio alvo pelo anticorpo primário. A ausência de marcação específica no controlo tecidular negativo confirma a inexistência de reactividade cruzada do anticorpo relativamente às células ou componentes celulares. Se ocorrer uma marcação específica no controlo tecidular negativo, os resultados da amostra do doente deverão ser considerados inválidos. A marcação não específica, se existente, terá uma aparência difusa. Poderá ser igualmente observada uma marcação ligeira esporádica do tecido conjuntivo, em secções de tecidos excessivamente fixados em formol. Deverão ser utilizadas células intactas para a interpretação dos resultados da marcação. As células necróticas ou degeneradas apresentam, normalmente, uma marcação não específica. Tecido do doente As amostras do doente deverão ser examinadas em último lugar. A intensidade da marcação positiva deverá ser avaliada dentro do contexto de qualquer marcação de fundo não específica do controlo de reagente negativo (ou seja, manchas ou tom rosado). Tal como acontece com qualquer teste de imuno-histoquímica, um resultado negativo significa que o antigénio em questão não foi detectado, e não que o antigénio não existe nas células ou tecidos analisados. Se necessário, utilizar um painel de anticorpos para auxiliar na identificação de reacções falsas negativas. Ao interpretar qualquer resultado de imuno-histoquímica, a morfologia de cada amostra de tecido deverá ser igualmente examinada utilizando uma secção marcada com hematoxilina e eosina. Os resultados morfológicos e os dados clínicos pertinentes do doente devem ser interpretados por um patologista qualificado. LIMITAÇÕES Limitações gerais 1. A IHC é um processo de diagnóstico de várias etapas que exige uma formação especializada na selecção dos reagentes apropriados, selecções de tecidos, fixação, processamento, preparação da lâmina de imuno-histoquímica e interpretação dos resultados da marcação. 2. A marcação do tecido depende do manuseamento e do processamento do tecido antes da marcação. Uma incorrecta fixação, congelação, descongelação, lavagem, secagem, aquecimento, seccionamento ou contaminação com outros tecidos ou fluidos pode produzir artefactos, aprisionamento de anticorpos ou resultados falsos negativos. Os resultados inconsistentes podem ser resultantes de variações nos métodos de fixação e impregnação ou de irregularidades inerentes ao tecido. 3. A adição excessiva ou insuficiente de contrastante poderá comprometer a interpretação correcta dos resultados. 4. A interpretação clínica de qualquer marcação positiva, ou da sua ausência, tem que ser avaliada dentro do contexto do historial clínico, morfologia e outros critérios histo-patológicos. A interpretação clínica de qualquer marcação, ou da sua ausência, tem que ser complementada por meio de estudos morfológicos e controlos adequados, bem como por meio de outros testes de diagnóstico. É da responsabilidade de um patologista qualificado estar familiarizado com os anticorpos, reagentes e métodos utilizados na interpretação da preparação marcada. A marcação deve ser realizada num laboratório licenciado, certificado, mediante a supervisão de um patologista responsável pela revisão das lâminas marcadas e que assegure a conformidade dos controlos positivos e negativos. 5. A Ventana Medical Systems, Inc. fornece anticorpos e reagentes com uma diluição ideal para serem utilizados quando se seguem as instruções fornecidas. Qualquer desvio dos procedimentos de teste recomendados pode invalidar os resultados previstos. É essencial que sejam utilizados os controlos apropriados, devidamente documentados. Os utilizadores que se desviem dos procedimentos de teste recomendados terão que aceitar a responsabilidade da interpretação dos resultados dos doentes. 6. Os reagentes podem demonstrar reacções inesperadas em tecidos não testados anteriormente. A possibilidade de surgirem reacções inesperadas, mesmo nos grupos de tecidos testados, não pode ser totalmente eliminada devido à variabilidade biológica da expressão de antigénios em neoplasias ou outros tecidos patológicos. 5 Contactar o representante local para comunicar quaisquer reacções inesperadas documentadas. 7. Quando utilizado em etapas de bloqueio, o soro normal da mesma origem animal que o antissoro secundário poderá provocar resultados falsos negativos ou falsos positivos devido à presença de auto-anticorpos ou anticorpos naturais. 8. Poderão observar-se resultados falsos positivos devido a ligação não imunológica de proteínas ou produtos de reacção dos substratos. Tais resultados poderão ser igualmente provocados por actividade de pseudo-peroxidase (eritrócitos) ou de peroxidase endógena, 6 ou de fosfatase alcalina endógena. 9. Tal como acontece com qualquer teste de imuno-histoquímica, um resultado negativo significa que o antigénio não foi detectado, e não que o antigénio não existia nas células ou tecidos analisados. Limitações específicas 1. Cada passo deste procedimento do kit de detecção foi optimizado em instrumentos BenchMark IHC/ISH e está predefinido. Devido à variação na fixação e processamento dos tecidos, poderá ser necessário aumentar ou diminuir o tempo de incubação do anticorpo primário em amostras individuais. O tempo de incubação do anticorpo primário depende do grau de fixação do tecido e pode variar entre 8 e 32 minutos. Para mais informações sobre as variáveis de fixação, consultar Immunohistochemistry Principles and Advances 7 ou Immunomicroscopy: A Diagnostic Tool for the Surgical Pathologist Este kit de detecção, em combinação com os anticorpos primários e acessórios VENTANA, detecta o antigénio que resiste à fixação por formol, ao processamento de tecidos e ao seccionamento de rotina. 3. Este kit de detecção foi optimizado para ser utilizado com solução de lavagem Reaction Buffer, anticorpos primários, acessórios e instrumentos BenchMark IHC/ISH. A utilização da solução de lavagem Reaction Buffer é importante para o funcionamento correcto deste kit de detecção. Os utilizadores que se desviem dos procedimentos de teste recomendados são responsáveis pela interpretação dos resultados dos doentes nestas circunstâncias. 4. Este kit de detecção foi optimizado para utilização com LCS (Predilute) ou ULTRA LCS (Predilute), também conhecido como LCS ou Liquid Coverslip (High Temperature). O LCS é uma solução de protecção pré-diluída utilizada como uma barreira entre reagentes aquosos e o ar, bem como um reagente para remoção de parafina de amostras de tecido durante o processo de desparafinação. A barreira do LCS reduz a evaporação, fornecendo assim um ambiente aquoso estável para as reacções de IHC ou reacções de in situ hybridization (ISH) realizadas em dispositivos automáticos de marcação da Ventana. 5. A utilização de tempos de incubação e temperaturas que não os especificados pode dar origem a resultados erróneos. O utilizador deverá validar tais alterações / PT Rev G

5 6. Podem ser observadas ligeiras alterações de nuance nos cromogénios individuais, devido à reactividade cruzada entre as reacções cromogénicas quando da utilização da marcação dupla. Estudos de concordância - Marcação simples RESUMO DOS RESULTADOS PREVISTOS Características de desempenho O desempenho do kit de detecção ultraview AP Red foi avaliado através da realização de estudos de reprodutibilidade e outros estudos relevantes. Estudos de reprodutibilidade - Marcação simples Os testes de reprodutibilidade foram realizados através da marcação em série de secções de tecido de amígdalas fixado em formol e impregnado em parafina com anticorpo primário anti-ki67 em instrumentos BenchMark IHC/ISH, excepto quando especificado de outro modo. O tempo de incubação dos anticorpos primários foi de 16 minutos e todas as lâminas foram sujeitas a um contrastante utilizando Hematoxylin II seguido de Bluing Reagent. Todas as lâminas marcadas com um anticorpo primário foram comparadas com as outras para uma adequação e intensidade de marcação e pontuadas por um leitor de lâminas qualificado. RESOLUÇÃO DE PROBLEMAS 1. A sessão de marcação de reprodutibilidade da marcação intra-ensaio (mesmo anticorpo primário com marcação numa plataforma) comparou as lâminas com marcação no mesmo dia numa sessão de uma plataforma. Para este critério, as lâminas foram marcadas num instrumento BenchMark XT e foram comparados os resultados. A reprodutibilidade da marcação intra-ensaio foi de 100% para o instrumento BenchMark XT. 2. A reprodutibilidade da marcação inter-ensaio foi calculada com base no número de lâminas marcadas em 3 ensaios por cada tipo de instrumento. As sessões de marcação foram realizadas uma vez por dia, em 3 dias separados, utilizando um instrumento BenchMark XT. A reprodutibilidade da marcação inter-ensaio para o instrumento BenchMark XT foi de 100% (30 de 30 lâminas, 10 lâminas marcadas para um anticorpo primário em 3 sessões individuais). 3. A reprodutibilidade inter-instrumento foi calculada com base no número de lâminas marcadas em 9 sessões em todos os tipos de instrumentos. As sessões de marcação foram realizadas 1 vez por dia, em 3 dias separados, utilizando 3 instrumentos diferentes: BenchMark GX, BenchMark XT e BenchMark ULTRA para IHC. A reprodutibilidade inter-instrumento do kit de detecção ultraview AP Red foi de 100% (90 de 90 lâminas marcadas). O desempenho do kit de detecção ultraview AP Red foi determinado através da marcação de 66 tecidos normais e doentes fixados em formol neutro tamponado utilizando 22 anticorpos primários. Os anticorpos seleccionados representavam espécies e isotipos habitualmente utilizados para fins de IHC. Em 98% dos casos testados (65 de 66 casos marcados), o kit de detecção ultraview AP Red reconheceu o anticorpo primário e providenciou a utilidade clínica apropriada, conforme determinado pelo leitor de lâminas qualificado. Estudos de reprodutibilidade - Marcação dupla Os estudos de reprodutibilidade para o kit de detecção ultraview AP Red (utilizando o anticorpo CONFIRM anti-cd3 (2GV6)) com kit de detecção ultraview DAB (utilizando o anticorpo CONFIRM anti-cd20 (L26)) foram realizados para demonstrar: A reprodutibilidade intra-ensaio e inter-ensaio nos instrumentos BenchMark IHC/ISH. A reprodutibilidade intra-plataforma nos instrumentos BenchMark IHC/ISH. A reprodutibilidade inter-plataforma entre os instrumentos BenchMark GX, BenchMark XT e BenchMark ULTRA. Todos os estudos cumpriram os respectivos critérios de aceitação. Os estudos de reprodutibilidade para o kit de detecção ultraview AP Red (utilizando o anticorpo CONFIRM anti-cd3 (2GV6)) com kit de detecção OptiView DAB IHC (utilizando o anticorpo CONFIRM anti-cd20 (L26)) foram realizados para demonstrar: BIBLIOGRAFIA A reprodutibilidade intra-ensaio e inter-ensaio nos instrumentos BenchMark IHC/ISH. A reprodutibilidade intra-plataforma nos instrumentos BenchMark IHC/ISH. A reprodutibilidade inter-plataforma entre os instrumentos BenchMark GX, BenchMark XT e BenchMark ULTRA. Todos os estudos cumpriram os respectivos critérios de aceitação. Foi realizado um estudo nos instrumentos BenchMark GX, BenchMark XT e BenchMark ULTRA para demonstrar a concordância entre a lâmina com marcação dupla utilizando o kit de detecção ultraview DAB (utilizando o anticorpo CONFIRM anti-cd20 (L26)) com kit de detecção ultraview AP Red (utilizando o anticorpo CONFIRM anti-cd3 (2GV6)) e as lâminas com marcação simples com o anticorpo CONFIRM anti-cd3 (2GV6) e CONFIRM anti-cd20 (L26). As lâminas com marcação simples foram processadas utilizando o kit de detecção ultraview DAB de acordo com as condições no folheto informativo. Foi realizado um estudo nos instrumentos BenchMark GX, BenchMark XT, and BenchMark ULTRA para demonstrar a concordância entre a lâmina com marcação dupla utilizando o kit de detecção OptiView DAB (utilizando o anticorpo CONFIRM anti-cd20 (L26)) com kit de detecção ultraview AP Red (utilizando o anticorpo CONFIRM anti-cd3 (2GV6)) e as lâminas com marcação simples com o anticorpo CONFIRM anti-cd3 (2GV6) e CONFIRM anti-cd20 (L26). As lâminas com marcação simples foram processadas utilizando o kit de detecção ultraview DAB de acordo com as condições no folheto informativo. Todos os estudos cumpriram os respectivos critérios de aceitação. 1. Se o controlo positivo apresentar uma marcação mais fraca que a esperada, deverão verificar-se os restantes controlos positivos processados durante o mesmo ensaio no instrumento em questão, para determinar se tal situação foi causada pelo anticorpo primário ou por um dos reagentes secundários comuns. 2. Se o controlo positivo apresentar um resultado negativo, deve verificar-se se a lâmina possui a etiqueta de código de barras correcta. Se a lâmina tiver a etiqueta correcta, deverão verificar-se os restantes controlos positivos processados durante o mesmo ensaio no instrumento em questão, para determinar se tal situação foi causada pelo anticorpo primário ou por um dos reagentes secundários comuns. Os tecidos poderão ter sido colhidos, fixados ou desparafinados incorrectamente. Deverá seguir-se o procedimento correcto para a colheita, conservação e fixação. 3. Uma remoção incompleta da parafina poderá resultar em artefactos de marcação ou na ausência de marcação. Caso a parafina não tenha sido removida da lâmina na totalidade, a sessão de marcação deve ser repetida utilizando, se disponível, a opção de desparafinação prolongada. Como alternativa, pode ser realizada uma desparafinação manual fora do instrumento. Se for utilizada a opção manual, anular a selecção da opção de desparafinação online do protocolo de marcação, antes de colocar as lâminas no instrumento. É necessário ter extremo cuidado para garantir que as lâminas não secam antes da sessão de marcação. 4. Se a marcação específica dos anticorpos for demasiado intensa, deverá repetir-se o ensaio reduzindo o tempo de incubação em intervalos de 4 minutos até que seja atingida a intensidade de marcação pretendida. 5. Se as secções de tecido desaparecerem (forem varridas ) da lâmina, as lâminas deverão ser verificadas para garantir que se encontram carregadas positivamente. 6. Para acções correctivas, consultar a secção de Instruções de utilização, o Manual do Operador do instrumento ou contactar o representante de assistência local. 7. Se um dispensador de reagentes não dispensar fluido, verificar a câmara de preparação ou o menisco para verificar se existe material estranho ou partículas, tais como fibras ou precipitados. Se o dispensador ficar obstruído, não utilizar o dispensador e contactar o representante de assistência local. Caso contrário, voltar a preparar o dispensador apontando o dispensador por cima de um recipiente de resíduos, retirando a tampa do bocal e pressionando na parte superior do dispensador. 8. O cromogénio Fast Red é solúvel em álcool e acetona. As lâminas marcadas expostas ao álcool e à acetona podem resultar na perda de um sinal específico. 1. Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe ES, Battifora H, Brigati DJ. Quality control in immunohistochemistry. Report of a workshop sponsored by the Biological Stain Commission. Am J Clin Pathol. 1989;92(6): Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and Practice of Histotechnology. 2nd edition. St. Louis, MO: The C.V. Mosby Company; College of American Pathologists Laboratory Accreditation Program, Anatomic Pathology Checklist, / PT Rev G

6 4. CLSI (formerly NCCLS). Quality Assurance for Immunocytochemistry: Approved Guideline. CLSI document MM4-A (ISBN ). CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA USA, Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: the new era of quality control. Biotech Histochem. 1991;66(4): Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase: part 1. The technique and its pitfalls. Lab Med. 1983;14: Roche PC, Hsi ED. Immunohistochemistry-Principles and Advances. Manual of Clinical Laboratory Immunology, 6th edition. In: NR Rose, ed. ASM Press; Taylor C, Cote RJ. Immunomicroscopy: A Diagnostic Tool for the Surgical Pathologist. 2nd Edition. Philadelphia, PA: W.B. Saunders Company; PROPRIEDADE INTELECTUAL BENCHMARK, CONFIRM, ultraview, OPTIVIEW, VENTANA e o logótipo VENTANA são marcas comerciais da Roche. Todas as restantes marcas comerciais são propriedade dos respectivos titulares Ventana Medical Systems, Inc. INFORMAÇÃO DE CONTACTO Ventana Medical Systems, Inc E. Innovation Park Drive Tucson, Arizona USA (USA) Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Strasse 116 D Mannheim Germany / PT Rev G

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