Comunicado 144 Técnico

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1 Comunicado 144 Técnico ISSN Brasília, DF Setembro, 2006 EFEITO NEMATICIDA DE EXTRATOS AQUOSOS DE SEMENTES DE PLANTAS SOBRE JUVENIS DE SEGUNDO ESTÁDIO DE Meloidogyne incógnita Thales Lima Rocha 1 Aline Melro Murad 23 Raphael Garcia de Sousa Evaristo 3 Warley da Silva Almeida 3 José Cesamildo Cruz Magalhães 4 Maria Cristina da Silva Mattar 5 Maria Fátima Grossi-de-Sá 5 Introdução A interação nematóide-vegetal geralmente induz a diferenciação de focos celulares, provocando a formação de galhas radiculares que reduzem severamente a produtividade. Nos casos mais graves, esta patogenia conhecida como meloidoginose pode levar a morte da planta (DUFOUR et al., 2006). A meloidoginose é provocada por fitonematóides do gênero Meloidogyne spp. Estes fitoparasitas são cosmopolitas, possuem ampla disseminação, um alto poder destrutivo e representam um severo problema para a agricultura brasileira e mundial (ABAD et al., 2003; DUFOUR et al., 2006; AMARAL et al., 2002). As perdas provocadas a culturas como algodão, café e cana-de-açúcar atingem patamares de US$ 4,1 bilhões, US$ 2,6 bilhões e US$ 16,5 bilhões, respectivamente (BALDWIN et al., 2004; VEECH e DICKSON, 1987). As estratégias mais utilizadas no controle destes fitoparasitas têm sido o uso de variedades resistentes, rotação de culturas e os nematicidas sintéticos (DUFOUR et al., 2006; AMARAL et al., 2002; CHITWOOD, 2002; INSUNZA et al., 2001). A utilização de variedades resistentes é uma maneira natural e bastante recomendável de controlar pragas e doenças. Porém, no caso específico de fitonematóides, são poucas as variedades resistentes disponíveis para o agricultor e, mesmo assim, a resistência geralmente é direcionada a umas poucas espécies de nematóides considerados mais relevantes para certas culturas (DUFOUR et al., 2006; FERRAZ e FREITAS, 1 Biólogo, Ph.D., Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia 2 Graduanda em Biologia, Universidade Católica de Brasília (UCB) 3 Graduando em Biologia, Faculdades Integradas da Terra de Brasília (FTB) 4 Auxiliar de Operações 3, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia 5 Bióloga, Ph.D., Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

2 2004). Uma alternativa que tem se mostrado bastante atrativa está relacionada ao uso de plantas antagonistas em esquemas de rotação de culturas ou plantio consorciado. Algumas destas plantas fixam nitrogênio da atmosfera e todas fornecem grandes volumes de matéria orgânica, aumentando a atividade de fungos antagonistas e melhorando consideravelmente as características do solo (DUFOUR et al., 2006; FERRAZ e FREITAS, 2004). Embora esta estratégia propicie benefícios como a diminuição de pragas e doenças, normalmente os produtores se decepcionam com os gastos extras, que reduzem significativamente os lucros esperados assim como a falta de aumento de produção. O método mais utilizado atualmente no controle destes fitoparasitas é a aplicação de nematicidas sintéticos. Além de caros, esses produtos podem ser também detrimentais ao ambiente, à saúde humana e à organismos não alvo (DUFOUR et al., 2006). Normalmente estes fazem parte de dois grupos predominantes: os fumigantes de solo que apresentam baixo peso molecular e os de contato constituídos por carbamatos ou organofosfatos (BAKKER, 1993; WHITEHEAD, 1997). Conseqüentemente, pesquisas que levem à obtenção de métodos de controle mais aceitáveis e viáveis ecologicamente tornamse fundamentais. Reconhecidamente, as plantas são fontes de um espectro amplo de mais de produtos naturais de baixo peso molecular conhecidos como substâncias vegetais/metabólitos secundários (COELHO et al., 2006; DIXON, 2001). Existem inúmeros trabalhos descritos na literatura sobre a utilização de extratos de plantas como fontes em potencial de compostos nematicidas e nematostáticos, principalmente de folhas, raízes e sementes (SILVA et al., 2002; CHITWOOD, 2002). Esses efeitos têm sido relacionados geralmente à presença de lectinas e metabólitos secundários (ÁLVAREZ, 1989; MOLAN et al., 2000). As lectinas são amplamente encontradas na natureza, especialmente em leguminosas (MARBAN-MENDONZA et al., 1987, 1992). Lectinas são proteínas ou glicoproteínas que se ligam reversivelmente a um mono ou oligossacarídeo específico. Vários papéis biológicos são atribuídos as lectinas, dentre eles as atividades inseticida, fungicida e nematicida. As lectinas têm sido associadas ao bloqueio de quimioreceptores de nematóides, o qual dificulta tanto a motilidade quanto a localização da planta por parte do parasita (MARBAN-MENDONZA et al., 1987). Metabólitos secundários são pequenas moléculas orgânicas que interagem diretamente com proteínas e outras macromoléculas (TAIZ e ZIEGER, 2002) e podem atuar como substratos, inibidores ou ativadores alostéricos de uma enzima. Além disso, podem ser precursores de alguma

3 molécula importante nas inúmeras rotas metabólicas celulares ou até mesmo um resíduo metabólico de alguma via de síntese ou degradação de macromoléculas que por algum motivo é estocado e utilizado como defesa química contra algum patógeno. Os metabólitos são mais comuns em plantas e fungos e podem atuar como componentes estruturais, defesas contra herbívoros e patógeno, atrativos para polinizadores e agentes nas interações interespecificas como alelopatia. (TAIZ e ZIEGER, 2002; CHALLIS e HOPWOOD, 2003). Dentre os metabólitos secundários destacam-se os polietienos encontrados em Tagetes, isotiocianatos e glicosinolatos oriundos de Brassica e outros compostos isolados de diferentes famílias vegetais como glicosídeos cianogênicos, alcalóides, terpenóides e compostos fenólicos (VIEIRA et al., 2001). Tendo em vista a necessidade de se encontrar novas alternativas mais viáveis e eficientes para o controle de fitonematoides, o objetivo desse trabalho foi testar a eficácia de extratos aquosos de sementes de Phaseolus lunatus (semente branca, vermelha e preta), Solanum lycocarpum (lobeira), Luetzelburgea auriculata e Phaseolus spp, contra o fitonematóide Meloidogyne incognita. Os resultados deste trabalho serão importantes para dar inicio a composição de um banco de extratos e moléculas nematicidas dentro do Laboratório de Interação Molecular Planta-Praga (LIMPP). Além disso, as informações obtidas poderão ser usada em projetos de pesquisa na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnogia, visando a obtenção de biomoléculas efetivas no controle de pragas da agricultura. Materiais e Métodos Obtenção dos extratos aquosos: As sementes das plantas foram cedidas pela Embrapa Sede. Para a obtenção dos extratos aquosos, vinte gramas de sementes de P. lunatus (semente branca, vermelha e preta), S. lycocarpum, L. auriculata e Phaseolus spp. foram trituradas com auxílio de um triturador elétrico Turrax. As sementes moídas foram homogeneizadas em 120 ml de água destilada. Os extratos foram mantidos em agitação lenta por 8 horas à 4ºC. Em seguida as amostras foram centrifugadas a rpm por 40 minutos à 4ºC em tubos de polipropileno de 30 ml. Os sobrenadantes foram coletados e filtrados com filtro estéril descartável Milipore de 0,22 m. A concentração de proteínas dos sobrenadantes foi determinada pelo método de Bradford (1976) utilizando BSA como padrão. O perfil protéico dos extratos foi determinado em SDS-PAGE 12% de acordo com Laemmli (1970).

4 Obtenção de Juvenis de segundo estádio: A extração de ovos de M. incognita foi realizada utilizando raízes de tomateiro (Lycopersicum esculentum) infestadas. Essas raízes tiveram suas galhas seccionadas e trituradas em um liquidificador contendo uma solução de hipoclorito de sódio 0,5% para a obtenção dos ovos, de acordo com a metodologia desenvolvida por Hussey e Barker (1973). Esses ovos foram colocados em uma câmara de eclosão e, após 48 horas, os J2 foram contados utilizando microscópio óptico e lâmina de Peters e posteriormente, transferidos para placas de Petri de 5 cm de diâmetro, na proporção de 100 nematóides por placa, para a execução dos testes biológicos. Testes in vitro para avaliação da atividade nematicida dos extratos vegetais: Para avaliar o efeito dos extratos de sementes sobre a mortalidade dos nematóides, foi utilizado 500 µg de cada extrato contra 100 J2 em um volume final de 3 ml por placa de Petri. As placas foram mantidas a 26ºC e após 24 h os J2 mortos e vivos foram contados com o auxílio de microscópio estereoscópico e lâmina de Peters. Os ensaios foram realizados em triplicata tendo como controle negativo água destilada. A mortalidade dos J2 foi certificada transferindo alguns dos juvenis tratados, aparentemente mortos, para uma placa de Petri contendo água destilada e examinando-os após um período de cinco a seis horas (para verificar se os nematóides se reanimaram). Resultados e discussão Os extratos aquosos das sementes apresentaram concentrações protéicas que variavam de 6 a 15 µg/µl. O SDS-PAGE 12% demonstrou a presença de muitas proteínas, com pesos moleculares entre 7 kda e 200 kda. Adicionalmente, foi observada a existência de polimorfismo entre os extratos aquosos das diferentes sementes analisadas (Figura 1).

5 Figura 1: SDS-PAGE 12% dos extratos vegetais. Foram aplicados ao redor de 30µg de amostra em cada poço. M: marcador molecular; 1: P. lunatus (semente branca); 2: P. lunatus (semente vermelha); 3: P. lunatus (semente preta); 4: S. lycocarpum; 5: L. auriculata; 6: Phaseolus sp. Todos os extratos apresentaram efeito tóxico aos nematóides, entretanto, com intensidades diferentes (Figura 2). Figura 2: Análise do efeito nematicida de extratos aquosos de sementes de plantas contra J2 de M. incognita. Foram utilizados 500 µg de proteínas de cada amostra contra 100 nematóides em um volume final de 3mL. 1: Controle (dh2o); 2: S. lycocarpum; 3: Phaseolus sp.; 4: L. auriculata; 5:P. lunatus (semente branca); 6: P. lunatus (semente vermelha); 7: P. lunatus (semente preta). Os testes foram realizados em triplicata.

6 A adição de 500 µg dos extratos aquosos nos bioensaios mostrou níveis mais altos de atividade nematicida para L. auriculata, com 100% de mortalidade, seguido por P. lunatus (semente branca) com 68,5% (figura 2). Vale ressaltar que a mortalidade foi confirmada transferindo-se os J2 aparentemente mortos para água e examinando-os após 6 horas. Depois deste período de tempo, não foi observada a recuperação da movimentação dos J2 mesmo quando estimulados com auxílio de um estilete. O tipo de molécula ativa responsável pela mortalidade dos nematóides (protéico ou composto secundário) não foi identificado. Existem relatos a cerca de extratos vegetais ricos em metabólitos secundários, peptídeos ou proteínas com atividade nematicida (DEMUNER et al., 2003; CHITWOOD, 2002; SILVA et al., 2002). O efeito de lectinas (glicoproteínas) sobre fitonematóides foi primeiramente estudado por Zuckerman (1983) que constatou bloqueio das reações do sistema quimioreceptor de nematóides, alterando o quimiotropismo. A orientação e a migração dos fitonematóides para raízes de plantas dependem de vários fatores, dentre os quais a natureza dos exsudatos radiculares. As lectinas poderiam modificar a constituição química do exsudato da planta e com isso afetar a recepção dos estímulos quimioreceptores dos juvenis, o que explicaria a baixa penetração e posterior formação de galhas nas raízes (WALLACE, 1963). De acordo com Marban-Mendonza et al., 1987 estas proteínas poderiam também aumentar a resistência das plantas ao nematóide. Apesar do grande número de trabalhos publicados indicando a atividade de diversos extratos contendo metabólitos secundários, pouco se sabe a respeito das biomoléculas atuantes, muito menos sobre o mecanismo de ação das mesmas. Isto reforça a necessidade de mais estudos na área de prospecção de biomoléculas oriundas de fontes vegetais. Grande parte dos trabalhos realizados visando à busca de moléculas vegetais para o controle de M. incognita utiliza folha, caule ou então raízes de plantas (CUNHA et al., 2003), poucos são os que usam sementes. Essas são fontes de inúmeras substâncias, dentre elas proteínas, carboidratos, lipídeos e metabólicos secundários como alcalóides, compostos fenólicos, entre outros (MOLAN et al., 2000; DEMUNER et al, 2003). A presença dessas substâncias em sementes evidencia a relevância dos estudos de prospecção de possíveis moléculas ativas contra M. incognita utilizando essa fonte vegetal (SILVA et al., 2002). Os novos extratos aquosos apresentando efeito nematicida gerados nesse trabalho de pesquisa serão depositados e ampliarão o banco de extratos e substâncias vegetais recém estabelecido no LIMPP. Esses resultados representam um avanço e são a

7 base para as atividades relacionadas à prospecção de biomoléculas efetivas no controle de nematóides fitopatogênicos que constitui uma das principais linhas de pesquisa dentro dos projetos do LIMPP. Espera-se que as informações e dados obtidos nesse e nos trabalhos anteriores sejam, no futuro, a base para a implantação da plataforma tecnológica de engenharia de metabolismo na Embrapa. Essa plataforma possibilitará não somente entender a rota de síntese e produção das moléculas nematicidas, mas também regular a produção destas em plantas relevantes para a agricultura. Referências Bibliográficas ABAD, P.; FAVERY, B.; ROSSO, M. N.; CASTAGNOME-SERENO, P. Root-knot nematode parasitism and host response: molecular basis of a sophisticated interaction. Molecular Plant Pathology, Oxford, UK, v. 4, p , ALVAREZ, N. G. La rotacion com leguminosas como alternative para reducer el dano causado por fitopatogenos del suelo y elevar la productividad del agro ecosistema maiz em el tropico humedo Tese (Mestrado) - Colegio Posgraduados, Montecillo, México. AMARAL, D. R.; OLIVEIRA, D. F.; CAMPOS, V. P.; CARVALHO, D. A. Efeitos de alguns extratos vegetais na eclosão, mobilidade, mortalidade e patogenicidade de Meloidogyne exígua do cafeeiro. Nematologia Brasileira, Campinas, v. 26, n. 1, p , BAKKER, J. Current state of nematicides. In: ZADOKS, J. C. (Ed.). Modern crop protection: development and perspectives. Wageningen: Wageningen Agric. Univ. Press, p BALDWIN, J. G.; NADLER, S. A.; ADAMS, B. J. Evolution of plant parasitism among nematodes. Annual Review Phytopathology, Palo Alto, CA, US, v. 42, p , BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of micogram quantities of protein utilizing the principle of protein - dye binding. Analytical Biochemistry, New York, US, v. 72, p , CHALLIS, G. L.; HOPWOOD, D. A. Synergy and contingency as driving forces for the evolution of multiple secondary metabolite production by Streptomyces species. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Washington, US, v. 100, p , CHITWOOD, D. J. Phytochemical based strategies for nematode control. Annual Review Phytopathology, Palo Alto, CA, US, v. 40, p , COELHO, A. A. M.; DE PAULA, J. E.; ESPÍNDOLA, L. S. Insecticidal Activity of Cerrado Plant Extracts on Rhodnius milesi Carcavallo, Rocha, Galvão & Jurberg (Hemiptera: Reduviidae), under Laboratory Conditions. Neotropical Entomology, Londrina, v. 35, p , CUNHA, F. R.; OLIVEIRA, D. F.; CAMPOS, V. P. Extratos vegetais com propriedades nematicidas e purificação do principio ativo do extrato de Leucaena leucocephala. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 28, n. 4, p , DEMUNER, A. J.; BARBOSA, L. C. de A.; NASCIMENTO, J. C. do; VIEIRA, J. J.; SANTOS, M. A. dos. Isolamento e avaliação da atividade nematicida de constituintes químicos de Mucuna cinérea contra Meloidogyne incognita e Heterodera glycines. Química Nova, São Paulo, SP, v. 26, n. 3, p , 2003.

8 DIXON, R. A. Natural products and plant disease resistance. Nature, London, GB, v. 411, p , DUFOUR, R.; GUERRERA, M.; EARLES, R. Appropriate technology transfer for rural areas: alternative nematode control. Disponível em: < Acesso em: 06 de junho de FERRAZ, S.; FREITAS, L. G. de. O controle de fitonematóides por plantas antagonistas e produtos naturais, Universidade Federal de Viçosa, Disponível em: < ntagonistas.pdf>. Acesso em: 14 de junho de HUSSEY, R. S.; BARKER, A. A. Comparation methods of colleting inocula of Meloidogyne spp. including a new technique. Plant Disease Reporter, Washington, US, v. 57, p , INSUNZA, V.; ABALLAY, E.; MACAYA, J. Nematicidal activity of aqueous plant extract on Xiphinema index. Nematologia Mediterrânea, Bari, IT, v. 29, p , LAEMMLI, U. K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, London, GB, v. 227, p , MARBAN-MENDONZA, N.; DICKLOW, M. B.; ZUCKERMAN, B. M. Control of Meloidogyne incognita on tomato by two leguminous plants. Fundamental and Applied Nematology, Montrouge, FR, v. 15, p , of three sheep gastrointestinal nematodes. Proceedings of the New Zealand Society of Animal Production, Hamilton, New Zealand, v. 60, p , SILVA, G. S.; SOUZA, I. M. R.; CUTRIM, F. A. Efeito da incorporação de sementes trituradas de feijão de porco ao solo sobre parasitismo de Meloidogyne incognita em tomateiro. Fitopatologia brasileira, Brasília, v. 27, n. 4, p , TAIZ, L.; ZEIGER, E. Plant physiology. Sunderland: Sinauer, p. VEECH, J. A.; DICKSON, D. W. (Ed.). Vistas on nematology. De Leon Springs, Florida: E. O. Painter Printing, VIEIRA, P. C.; MAFEZOLI, J.; BAVATTI, M. W. Inseticidas de Origem Vegetal. In: FERREIRA, J. T. B; CORRÊA, A. G.; VIEIRA, P. C. (Ed.). Produtos naturais no controle de insetos. São Carlos: Universidade Federal de São Carlos, WALLACE, H. R. The biology of plant parasitic nematodes. London: Edward Arnold, WHITEHEAD, A. G. Plant-parasitism nematodes: their importance and control. In: WHITEHEAD, A. G. Plant nematode control. Wallingord, UK: CAB International, p ZUCKERMAN, B. M. Hypotheses and possibilities of intervention in nematode chemoresponses. Journal of Nematology, College Park, Md., US, v. 15, p , MARBAN-MENDONZA, N.; JEYAPRAKASH, A.; JANSON, H. B.; DAMON JR., R. A.; ZUCKERMAN, B. M. Control of root-knot nematodes on tomato by lectins. Journal of Nematology, College Park, Md., US, v. 19, p , MOLAN, A. L.; ALEXANDER, R.; BROOKAS, I. M.; MCNABB, W. C. Effects of sulla condensed tannins on the viability

9 Comunicado Técnico, 144 Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento Exemplares desta edição podem ser adquiridos na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Serviço de Atendimento ao Cidadão Parque Estação Biológica, Av. W/5 Norte (Final) Brasília, DF CEP Caixa Postal PABX: (61) Fax: (61) e.mail:sac@cenargen.embrapa.br 1ª edição 1ª impressão (2006): Comitê de Publicações Expediente Presidente: Sergio Mauro Folle Secretário-Executivo: Maria da Graça Simões Pires Negrão Membros: Arthur da Silva Mariante Maria da Graça S. P. Negrão Maria de Fátima Batista Maurício Machain Franco Regina Maria Dechechi Carneiro Sueli Correa Marques de Mello Vera Tavares de Campos Carneiro Supervisor editorial: Maria da Graça S. P. Negrão Normalização Bibliográfica: Maria Iara Pereira Machado Editoração eletrônica: Maria da Graça Simões Pires Negrão