Universidade Federal de Juiz de Fora Programa de Pós-Graduação em Saúde Área de concentração: Saúde Brasileira

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1 Universidade Federal de Juiz de Fora Programa de Pós-Graduação em Saúde Área de concentração: Saúde Brasileira EDUARDO MACHADO VILELA EFEITOS DO TRATAMENTO DA DOENÇA PERIODONTAL SOBRE MARCADORES INFLAMATÓRIOS DE PACIENTES COM DOENÇA RENAL CRÔNICA NA PRÉ-DIÁLISE Juiz de Fora 2007

2 EDUARDO MACHADO VILELA EFEITOS DO TRATAMENTO DA DOENÇA PERIODONTAL SOBRE MARCADORES INFLAMATÓRIOS DE PACIENTES COM DOENÇA RENAL CRÔNICA NA PRÉ-DIÁLISE Projeto apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Saúde da Universidade Federal de Juiz de Fora, para qualificação a nível de doutorado. Área de concentração: Saúde Brasileira. Orientador: Prof. Dr. MARCUS GOMES BASTOS Juiz de Fora 2007

3 EDUARDO MACHADO VILELA EFEITOS DO TRATAMENTO DA DOENÇA PERIODONTAL SOBRE MARCADORES INFLAMATÓRIOS DE PACIENTES COM DOENÇA RENAL CRÔNICA NA PRÉ-DIÁLISE. BANCA EXAMINADORA Profa. Dra. Hélady Sanders Pinheiro Universidade Federal de Juiz de Fora Profa. Dra. Andréa Márcia Marcaccini Universidade de São Paulo Prof. Dr. Evandro de Toledo Lourenço Júnior Universidade Federal de Juiz de Fora

4 LISTA DE ABREVIATURAS AAP American Academy of Periodontology CAPD Continuous ambulatory peritonial dialysis CKD Chronic kidney disease DCV Doenças cardiovasculares DM Diabetes mellitus DP Doença periodontal DRC Doença renal crônica EDTA Ácido etilenodiaminotetracético ESDR Estágio final da doença renal FFR Falência funcional renal HA Hipertensão arterial HD Hemodiálise IL-6 Interleucina-6 IMEPEN Fundação Instituto Mineiro de Estudos e Pesquisas em Nefrologia IP Índice de Placa K/DOQI Kidney Disease Outcomes Quality Initiative LDL Low density lipoprotein (lipoproteína de baixa densidade) NICR Nível de inserção clínica relativa NKF National Kidney Foundation PCR Proteína C reativa PS Profundidade de sondagem RFG Ritmo de filtração glomerular RG Recessão gengival SS Sangramento à sondagem STAT3 Signal transducer and activator of transcription 3 TGF β Fator de transformação do crescimento-β TNF-α Fator de necrose tumoral-α TRS Terapia renal substitutivas

5 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO... 2 REVISÃO DA LITERATURA Considerações sobre doença renal crônica Papel da hepcidina na doença renal crônica Considerações sobre doença periodontal crônica Impactos da doença periodontal na doença renal crônica Marcadores inflamatórios na doença periodontal e na doença renal crônica... 3 HIPÓTESE... 4 OBJETIVOS... 5 CASUÍSTICA E METODOS População e amostra Avaliações Exame clínico geral Exame clínico periodontal Avaliações laboratoriais Protocolo experimental Tratamento periodontal Reavaliação clinica Análise estatística Aspectos éticos... 6 RESULTADOS E IMPACTOS ESPERADOS... REFERÊNCIAS... ANEXOS...

6 LISTA DE ILUSTRAÇÕES QUADRO 1 FIGURA 1 FIGURA 2 Estagiamento da doença renal crônica Doença periodontal crônica Fluxograma dos intervalos dos procedimentos clínicos

7 6 1 INTRODUÇÃO O interesse no estudo da relação entre a doença periodontal (DP) e o comprometimento da função renal de indivíduos adultos tem sido crescente, especialmente na terapia renal substitutiva por hemodiálise e, em menor proporção, em estágios pré-dialiticos. Isto se deve, em parte, à freqüente associação da doença periodontal com a Diabetes mellitus tipo 2 (DM2) e com a doença cardiovascular, como ateroesclerose, que são algumas das principais causas de insuficiência renal crônica (DRC) em todo o mundo (ELSAYED; TIGHIOUART; GRIFFITH, 2007). A crescente prevalência da doença renal crônica e da doença periodontal aumenta a probabilidade de que mais indivíduos possam ser portadores das duas patologias concomitantemente (PIHLSTROM; MICHALOWICZ; JOHNSON, 2005; ROMÃO JR., 2004). A DP é caracterizada por um processo inflamatório em que várias substâncias que participam deste processo são produzidas, como citocinas inflamatórias (RAHMATI et al., 2002). Além disso, a doença periodontal pode estar envolvida diretamente na gênese da lesão renal de indivíduos adultos através de mecanismos ligados à inflamação, já que podem induzir a elevação plasmática do nível de proteínas de fase aguda, como por exemplo, a proteína C reativa (PCR) (SALZBERG et al., 2006). Tal fato demonstra que a DP crônica é um protótipo de infecção local de baixo grau associado com uma resposta inflamatória sistêmica moderada (BUHLIN et al., 2003; CRAIG et al., 2007). Todavia, a compreensão do papel destes marcadores inflamatórios, bem como a descoberta de novos marcadores, como a hepcidina (HUGMAN, 2006),

8 7 ainda não está totalmente elucidada e novos estudos são necessários para o melhor entendimento dos mecanismos envolvidos com a DP na indução e progressão dos estágios clínicos de lesão renal.

9 8 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Considerações sobre doença renal crônica Os rins são órgãos fundamentais para a manutenção da homeostase do corpo humano, pois atuam como órgãos de função endócrina, reguladora e excretora, ações estas fundamentais à manutenção do equilíbrio no metabolismo corporal (ROMÃO JR., 2004). A lesão renal (glomerular, tubular e endócrina) e a perda progressiva e irreversível de sua função leva à doença renal crônica (DRC), com comprometimento para todo o organismo (RIELLA, 2003) De acordo com a National Kidney Foundation (NKF) americana, em seu documento Kidney Disease Outcomes Quality Initiative (K/DOQI, 2002) (Iniciativa na qualidade de resultados da doença renal), definiu a DRC baseada nos seguintes critérios: a. lesão presente por um período igual ou superior a três meses, definida por anormalidades estruturais e/ou funcionais do rim, com ou sem diminuição do ritmo de filtração glomerular (RFG), manifestada por anormalidades patológicas ou marcadores de lesão renal, especialmente microalbuminúria, incluindo alterações sanguíneas ou urinárias, ou nos exames de imagem; b. RFG <60mL/min/1,73m 2 por um período 3 meses, com ou sem lesão renal. Baseado nesta definição, o grupo de trabalho que desenvolveu o K/DOQI propôs a classificação para a DRC conforme mostrado no Quadro 1.

10 9 QUADRO 1 - Estagiamento da doença renal crônica Estágio Descrição RFG (ml/min/1,73 m 2 ) 1 Lesão renal com RFG normal ou aumentado 90 2 Lesão renal com leve diminuição do RFG Lesão renal com moderada diminuição do RFG Lesão renal com acentuada diminuição do RFG Falência renal funcional ou em TRS <15 Fonte: K/DOQI, 2002 A doença renal crônica é uma enfermidade que causa declínio progressivo e irreversível no número total de néfrons funcionais, resultando na diminuição da taxa de filtração glomerular (RFG - medida clinicamente pela taxa de remoção de creatinina) (RIELLA, 2003). Quando a queda do RFG atinge valores muito baixos, geralmente inferiores a 15mL/min, estabelece-se o que se denomina falência funcional renal, ou seja, o estágio final da doença renal (ESDR) (K/DOQI, 2002). Na falência renal funcional o paciente apresenta sintomatologia importante relacionada a danos de quase todos os órgãos e sistemas, ao que se denomina em conjunto, síndrome urêmica. A síndrome urêmica cursa com várias manifestações cardiovasculares, endócrinas, metabólicas, osteomioarticulares, neurológicas, gastrointestinais, pleuropulmonares, hematológicas, psicológicas, dermatológicas, oculares e imunológicas (RIELLA, 2003). Nestes casos, a terapia renal substitutiva (TRS) torna-se indicada, como por exemplo, a hemodiálise, diálise peritoneal ou transplante renal (ROMÃO JR., 2004).

11 10 Segundo Riella (2003), a etiologia da DRC está associada a aspectos multifatoriais como Diabetes mellitus (DM), hipertensão arterial (HA), glomerulonefrites crônicas, doenças císticas dos rins, uropatia obstrutiva, rejeição crônica do transplante, entre outras. Os principais grupos de risco para a DRC são DM, HA, idade acima de 60 anos, transplante renal e familiares em terapia renal substitutiva (K/DOQI, 2002). Ao longo do seu curso, a DRC se associa a uma série de complicações sistêmicas adversas, incluindo a anemia, neuropatia, doenças ósseas, mortalidade de todas as causas e as doenças cardiovasculares fatais e não fatais. Estudos recentes mostram que a maioria dos pacientes com DRC morrem antes da ocorrência da falência funcional renal (FFR) e que os óbitos não decorrem da falência do funcionamento renal, mas sim das complicações cardiovasculares, as quais são agravadas pela concomitância de Diabetes mellitus (K/DOQI, 2002; KEITH et al., 2004; BUBOSE JR., 2007). Os pacientes com DRC são mais susceptíveis às doenças cardiovasculares por apresentarem os fatores de risco tradicionais (p. ex., tabagismo, Diabetes mellitus, dislipidemia, e hipertensão arterial) e os chamados fatores de risco não tradicionais, aqueles decorrentes da DRC (p. ex., anemia, estresse oxidativo, microalbuminúria, hiperparatireoidismo e déficit funcional renal) (SARNARK et al., 2003; 54. ELSAYED et al., 2007). De maneira geral, os dados existentes apóiam a idéia de que a DRC contribui de maneira independente para a ocorrência ou aceleração da doença aterosclerótica na circulação coronariana, cerebral e periférica. A DRC é um dos mais importantes fatores de risco independente para complicações após cirurgias de revascularização, disfunção

12 11 sistólica e diastólica e ocorrência de arritmias atriais e ventriculares e morte súbita (McCULLOUGH, 2003; McCULLOUGH e SANDBERG, 2004; SOMAN et al., 2002). Pelo exposto, fica evidente que o manejo da DRC, suas complicações e comorbidades é complexo e o sucesso do tratamento dependerá da identificação precoce da doença, do controle adequado dos fatores de risco determinantes da perda funcional renal e das doenças cardiovasculares associadas, e do envolvimento de equipe visando o tratamento interdisciplinar. A DRC é crescente em todo o mundo, como conseqüência, um número cada vez maior de indivíduos com tal doença provavelmente necessitará de cuidados. Coresh et al. (2003) avaliaram o RFG e a presença de lesão renal em indivíduos acompanhados no Third National Health and Nutrition Examination Survey - NHANES III. Os autores verificaram que a prevalência de DRC na população americana foi de 11% (19,2 milhões de indivíduos), e quanto aos cinco estágios da DRC foram encontrados 5,9 milhões (3,3%) de indivíduos no estágio 1; 5,3 milhões (3,0%) no estágio 2; 7,6 milhões (4,3%) no estágio 3; (0,2%) no estágio 4 e (0,2%) no estágio 5. Dados obtidos do National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES) no período de 1999 a 2004 evidenciam que aproximadamente 18% da população adulta americana, ou seja, cerca de 28 milhões apresentam DRC nos seus diferentes estágios (SAYDAH et al., 2007). No Brasil, ainda não se dispõe de estudos sobre a epidemiologia da DRC utilizando a nova definição da doença, a não ser aqueles referentes à TRS. Baseado nos dados obtidos em janeiro de 2006, o número de pacientes com FFR em tratamento dialítico era de (383 por milhão da população), que corresponde a um aumento anual de 9,9%. A prevalência de pacientes em TRS (incluindo os

13 12 transplantados renais) é de 518 pmp. Já a taxa de incidência anual reportada foi de 175 pacientes/pmp, correspondendo a, pelo menos, pacientes novos por ano. Na fase pré-dialítica, o número de pacientes nos diferentes estágios da DRC não é exatamente conhecido. Recentemente, Sesso e Gordan (2007) estimaram que existe cerca de 1,960 milhão (ou 1,87%) de brasileiros adultos com RFG <60mL/min/1,73m 2, ou seja, estágios 3, 4 e 5 da DRC. 2.2 Papel da hepcidina na doença renal crônica O ferro é o quarto elemento mais comum na crosta da terra e o metal de transição mais abundante no corpo humano. O ferro é necessário para enzimas e proteínas catalíticas cruciais para a síntese do DNA, o transporte do oxigênio na hemoglobina, o transporte de elétrons, a respiração da célula, a fosforilação oxidativa, o ciclo do ácido tricarboxílico e muitas outras reações bioquímicas (BRIDGES e SELIGMAN, 1995; ROY e ENNS, 2000). A maioria do ferro absorvido da dieta ou reciclado de hemoglobina está destinada à produção de glóbulos vermelhos Sabe-se que a ferroportina está fortemente expressa em enterócitos, macrófagos, e sinciciotrofoblastos placental (ABBOUD e HAILE, 2000; DONOVAN et al., 2005). É um dos principais transportadores de ferro para fora das células. Ela transporta o ferro da mãe para o feto, transfere o ferro que é absorvido de enterócitos para a corrente sanguínea e participa na reciclagem do ferro de enterócitos para macrófagos e de lá para a corrente sanguínea. Geralmente se aceita que a homeostase do ferro seja controlada principalmente pela absorção de ferro alimentício no trato gastrointestinal. A taxa de

14 13 absorção de ferro é regulada pelas reservas de ferro no corpo, atividade eritropoiética da medula óssea, concentração de hemoglobina, saturação do sangue com oxigênio, e pela presença de uma inflamação sistêmica. O ferro alimentício é trivalente; portanto, deve ser reduzido por meio da ferrireductase antes de poder ser ligado a um metal divalente. O restante é ferro para armazenamento na forma de ferritina ou hemosiderina. A exigência diária de ferro para o eritropoiese é de aproximadamente 20 25mg. Ele é liberado em grande parte dos macrófagos (DONOVAN et al., 2005). A anemia desenvolve-se gradualmente durante o declínio progressivo da função renal com deficiência de eritropoietina que é, sem dúvida, a causa principal (RIELLA, 2003). A sobrevivência diminuída dos eritrócitos (devido à hemólise, sangramento e aumento da tensão oxidativa) é um contribuinte secundário. Mais de 90% dos voluntários respondem adequadamente aos agentes estimulantes de eritropoietina (eritropoietina alfa, beta ou darbepoetina alfa) (PANICHI et al., 2001, RIELLA, 2003). Pacientes com doença renal crônica apresentam um estado inflamatório crônico. Isso é devido a muitos fatores subjacentes, inclusive uma incidência aumentada de infecções, o ambiente urêmico, os níveis elevados de citocinas próinflamatórias, a presença freqüente de aterosclerose difundida e outros. Uma função renal diminuída também pode afetar os níveis de moléculas inflamatórias adicionais, como a proteína C-reativa sérica (PCR) e a interleucina-6 (IL-6), que são inversamente relacionadas à liberação de creatinina (PANICHI et al., 2001). Durante o processo inflamatório as citocinas IL-6, IL-1β, fator de necrose tumoral-α (TNF-α), interferon-γ, e fator de transformação do crescimento-β (TGF β) são produzidas principalmente por macrófagos e monócitos. Tais citocinas

15 14 estimulam a produção de proteínas de fase aguda, sendo a IL-6 o principal indutor da maioria dos reagentes de fase aguda. Nos humanos, o fígado tem um papel central na resposta imune inata e é responsável pela síntese elevada de muitas proteínas de fase aguda que estão envolvidas na defesa do organismo. A hepcidina é uma proteína de fase aguda que parece estar diretamente envolvida no metabolismo do ferro e sua síntese é aumentada substancialmente durante infecção e inflamação reduzindo o ferro no soro sanguíneo (NICOLAS et al., 2002; PIGEON et al., 2001). A hepcidina, um peptídeo catiônico pequeno e rico em cisteína recentemente descoberta, foi isolado independentemente por dois grupos que procuravam novos peptídeos antimicrobiais. Em 2000, Krause et al. isolaram um peptídeo novo no plasma. Já que era produzido pelo fígado e tinha propriedades antimicrobiais, foi nomeado liver-expressed antimicrobial peptide-1, já Park et al. (2001) isolaram este peptídeo na urina humana e a nomearam hepcidin (hepatic bactericial protein). A hepcidina é um produto de um gene de 2,5-kb HAMP, composto por três exons e dois introns, situado no braço longo do cromossomo 19 (NCBI Gene ID 57817). As mais importantes formas bioativas circulantes da hepcidina compõem-se somente da porção carboxy-terminal (peptídeos de 25, 22 e 20 aminoácidos) (HUNTER et al., 2002; PIGEON et al., 2001). O fígado é o órgão que produz predominantemente a hepcidina, mas produção mais baixa também foi detectada nos rins, coração, músculos esqueléticos e cérebro. A principal função da hepcidina é a regulação homeostática do metabolismo de ferro e a modulação da defesa orgânica. Ela é o regulador negativo predominante da absorção de ferro no intestino delgado, controla o transporte de ferro através da placenta e liberação de ferro dos macrófagos (GANZ, 2003),

16 15 controla a absorção de ferro pelo intestino por meio da regulação da expressão de ferroportina na membrana basolateral dos enterócitos, regula diretamente a expressão de ferroportina em membranas celulares, e induz sua internalização e degradação, retendo, assim, o ferro nos enterócitos, macrófagos e hepatócitos (GANZ, 2005). O gene que codifica a hepcidina é regulado pela anemia, a hipóxia e a inflamação (NICOLAS et al., 2002). A anemia e a hipóxia diminuem a expressão da hepcidina no fígado. Assim, a hepcidina pode servir como um importante mediador na patogênese da anemia de doença crônica (ROY e ANDREWS, 2005). Nemeth et al. (2004) relataram que a citocina inflamatória IL-6, aparentemente, é um indutor fundamental da síntese da hepcidina durante a inflamação. Num recente relatório, Wrighting e Andrews (2006) demonstraram que a IL-6 regulou diretamente a hepcidina por meio da indução do promotor pela ligação do fator de ativação da transcrição STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3). Durante a inflamação e infecção a hepcidina elevada resulta em um decréscimo na liberação do ferro dos enterócitos, hepatócitos e macrófagos. A concentração de ferritina sérica está fortemente relacionada com os níveis protéicos de hepcidina, tanto no soro como na urina. A IL-6 é requerida para a indução da hepcidina e hipoferremia durante a inflamação tanto em animais quanto em humanos (GANZ, 2003). Assim, Nemeth et al. (2004) sugeriram que a hepcidina é um mediador fundamental da anemia da doença crônica. Por esta razão, tem sido proposto que a hepcidina é um fator primário na patogênese da anemia de doença crônica.

17 16 Vários pesquisadores investigaram a hepcidina como uma molécula de ligação entre inflamação e anemia (DEICHER e HÖRL, 2004; MALYSZKO et al., 2005; PIETRANGELO e TRAUTWEIN, 2004; VYORAL e PETRÁK, 2005). O mecanismo da função de hepcidina parece ser a regulação do transporte de ferro transmembrana, o complexo ferroportina-hepcidina é então degradado em lisossomos e o ferro é mantido dentro das células (principalmente enterócitos, hepatócitos e macrófagos). Isto leva à diminuição de absorção de ferro no intestino e a uma diminuição na concentração de ferro sérico. Por este mecanismo, a hepcidina regula os níveis de ferro sérico durante a inflamação, infecção e possivelmente também no câncer (MALYSZKO et al., 2005; MALYSZKO e MYSLIWIEC, 2007). Resumindo, é possível concluir que a hepcidina tem sido considerada um marcador para a regulação do ferro no organismo, seu aumento está relacionado com o aumento da anemia na doença renal crônica e sua expressão é estimulada por processos inflamatórios através da ação de citocinas. 2.3 Considerações sobre doença periodontal crônica A doença periodontal crônica é uma doença infecto-inflamatória dos tecidos de suporte dos dentes, causada por microrganismos específicos, principalmente por bactérias gram-negativas e anaeróbicas como Porphyromonas gingivalis e Actinobacillus actinomycetemcomitans que formam placas bacterianas e cálculos dentais (LOE, 1993). Caracteriza-se pela perda de inserção do ligamento periodontal, destruição do osso alveolar adjacente, com formação de bolsas periodontais, mobilidade excessiva do dente e conseqüente perda prematura dos dentes (CARRANZA, 2004; LOE, 1993) (FIG. 1).

18 17 FIGURA 1 Doença periodontal crônica Fonte: SANI NETO e TRAVIZANI FILHO. Disponível em: As bactérias têm grande importância na etiopatogenia e, juntamente com a resposta tecidual do hospedeiro, representam os componentes essenciais para o processo inflamatório da doença periodontal (DP). A doença periodontal crônica é iniciada pela colonização bacteriana, seguida pela proliferação e extensão da placa junto ao ambiente subgengival (LINDHE, 1999). Concomitantemente a essa progressão apical, ocorre uma destruição tecidual envolvendo metabólitos bacterianos (enzimas, endotoxinas, e outros componentes antigênicos) e, possivelmente, a invasão bacteriana das estruturas periodontais (DELIMA e VAN DYKE, 2003). A patogênese da DP consiste em uma cascata de reações inflamatórias e imunológicas, que ainda não foram completamente elucidadas (LAPPIN et al., 2000). Aspectos protetores da resposta do hospedeiro incluem recrutamento de neutrófilos, produção de anticorpos protetores e, possivelmente, a liberação de citocinas

19 18 antiinflamatórias incluindo o fator de crescimento transformador beta (TGF-β), interleucina-4 (IL-4), IL-10, e IL-12 (PAGE, 1998). A destruição dos tecidos parece resultar de uma interação complexa entre estas bactérias e o sistema imuneinflamatório do hospedeiro (POZO et al., 2005). A perpetuação da resposta do hospedeiro devida ao desafio bacteriano persistente interrompe os mecanismos homeostáticos e resulta em liberação de mediadores incluindo citocinas pró-inflamatórias (IL-1, IL-6, fator de necrose tumoral alfa [TNF-α]), proteases (metaloproteinases), e prostanóides (prostaglandina E 2 ) que podem promover destruição da matriz extracelular na gengiva e estimular a reabsorção óssea (PAGE, 1998). De acordo com a American Academy of Periodontology (AAP), a classificação da doença periodontal (periodontite) crônica divide-se em: localizada (quando acomete menos de 30% dos sítios) ou generalizada (para mais de 30% dos sítios). Quanto à severidade de perda de inserção do ligamento periodontal, dividese em: leve (1 a 2mm), moderada (3 a 4mm) ou severa (mais de 5mm) (ARMITAGE, 1999). A doença periodontal crônica caracteriza-se por apresentar um curso de progressão de lento a moderado, porém, podem ocorrer períodos de destruição mais rápidos, possivelmente modificada por doenças sistêmicas e fatores ambientais, sendo, portanto, mais prevalente em adultos, entre 30 e 65 anos (MACHTEI et al., 1992). Manifesta-se na sua forma moderada entre 44 a 57% dos adultos, sendo que 10% têm a periodontite severa (CARRANZA, 2004; LOE, 1993). A doença periodontal dentre as suas diferentes formas clínicas, desde as gengivites até as periodontites mais agressivas, pode afetar em torno de 90% da população mundial. Especificamente a doença periodontal crônica, alvo deste

20 19 estudo, acomete 22% de adultos norte-americanos, quanto ao sexo e raça; nesta população mostrou-se mais prevalente em homens e em negros (PIHLSTROM, MICHALOWICZ; JOHNSON; 2005). Segundos dados do Ministério da Saúde (BRASIL, 2004) mais de 78% da população adulta brasileira apresenta alterações gengivais como condição predominante e entre os idosos mais de 92% apresentam algum grau de inflamação periodontal. O percentual de indivíduos com problemas periodontais nas faixas etárias de 15 a 19, 35 a 44 e 65 a 74 anos é, respectivamente, 53,8%, 78,1% e 92,1% no Brasil. As proporções mais favoráveis foram encontradas na Região Centro-Oeste para faixas etárias de 15 a 19 e 35 a 44 anos e, na Região Sul, para a faixa etária de 65 a 74 anos de idade. 2.4 Impactos da doença periodontal na doença renal crônica Hipócrates já propunha que focos de infecções dentárias eram a causa de doenças sistêmicas infecciosas quando a causa destas não era evidente. Considerando o organismo humano único, e os sistemas orgânicos interdependentes e integrados, Petersen (2005) ressaltou que o sistema estomatognático pode interferir em outros sistemas. Alguns autores sugeriram que a DP possa ter um papel etiológico e modulador em doenças sistêmicas, como cardiovasculares e cerebrovasculares (BECK et al., 1996; DANESH, 1999; MATTILA et al., 1989; MORRISON et al., 1999; WU et al., 2000). Outros sugerem que ela esteja presente em maior grau em indivíduos portadores de artrite reumatóide (RIBEIRO; LEÂO, NOVAES, 2005), diabetes (GROSSI e GENCO, 1998), doenças respiratórias (HAYES et al., 1998),

21 20 que provoquem o nascimento de bebês prematuros de baixo peso (OFFENBACHER et al., 1996) e ainda, mais recentemente, na doença renal crônica (BORAWSKI et al., 2007; CRAIG et al., 2007). A incidência de uma variedade de patologias dentais associadas à doença renal crônica, como o estreitamento da câmara pulpar, anormalidades no esmalte e erosão da superfície dentária, parecem favorecer a instalação de infecção bucal como a cárie dental. Já a hiposalivação manifestada por xerostomia, predispõe os tecidos bucais à doença periodontal, e conseqüentemente à perda prematura de dentes, especialmente em pacientes de diálise (KLASSEN e KRASKO, 2002). A crescente prevalência das doenças renal crônica e periodontal crônica aumenta a probabilidade de que mais indivíduos possam ser portadores das duas patologias concomitantemente (PIHLSTROM; MICHALOWICZ; JOHNSON, 2005, ROMÃO JR., 2004). Klassen e Krasko (2002) relataram em um estudo que a higiene oral de pacientes de hemodiálise é pior que a da população em geral e que, conseqüentemente, há maior formação de cálculos, gengivites, cáries, osteodistrofia do osso alveolar, mobilidade patológica proporcional à reabsorção óssea, favorecendo, assim a evolução da doença periodontal e, conseqüentemente, perda dos dentes, já que a DP é a principal causa de perda dental. O estudo acima, contou com 45 pacientes em hemodiálise e verificou que todos os pacientes apresentavam alguma forma de doença periodontal. As manifestações orais mais comuns na DRC são palidez da mucosa oral, estomatite urêmica, petéquias, equimoses, inflamação gengival, perda de inserção do ligamento periodontal, o que também predispõem à doença periodontal. Os autores observaram baixa prevalência de cárie dental, apesar de ter sido

22 21 diagnosticado hipoplasia do esmalte e obliteração da polpa (DAVIDOVICH et al., 2005) Os estudos clínicos entre DRC e DP têm objetivado, principalmente, pacientes com falência funcional renal, em TRS (terapia renal substitutiva) e os achados clínicos apresentaram maior incidência e gravidade de destruição periodontal quando em tratamento dialítico (BOTS et al., 2006). Dessa forma, são necessários mais estudos com pacientes em estágio pré-diálise. De acordo com Kadiroglu et al. (2006), as alterações sistêmicas da DRC desencadeiam manifestações na cavidade oral, tais como: alta concentração de uréia na saliva, cheiro de amônia, xerostomia, sangramento oral, estomatite, gengiva pálida e hiperplasiada, perda da lâmina dura do ligamento periodontal, remodelação anormal do osso, hipoplasia do esmalte, padrão de erupção tardio de dentes permanentes, baixa prevalência de cárie, erosão dental, sensibilidade à percussão e mastigação, mobilidade de dentes e má oclusão. Estudos de Franek et al. (2006) mostraram prevalência de periodontite crônica avançada em aproximadamente 38% dos pacientes sob hemodiálise. Hamid; Dummer; Pinto (2006) registraram que, aproximadamente, 100% da amostra apresentava algum tipo de doença periodontal, 64% tinha gengivite severa e 28% tinha periodontite crônica proporcional ao tempo de diálise. Um estudo mostrou que todos os pacientes em hemodiálise (HD) analisados tinham inflamação na gengiva e a forma mais comum de doença periodontal entre os pacientes sob HD era a periodontite branda a moderada e severa (KADIROGLU et al., 2006). Recentemente, Borawski et al. (2007) afirmaram que a periodontite é altamente severa em todos os grupos com problemas renais se comparados com

23 22 indivíduos da população saudável. A doença é mais avançada em pacientes mantidos em HD e sucessivamente diminuída em indivíduos em diálise peritonial ambulatorial contínua (CAPD continuous ambulatory peritonial dialysis) e prédiálise (CKD chronic kidney disease). Além disso, verificaram que a doença periodontal é prevalente, severa e mal reconhecida em pacientes com problemas renais. A Organização Mundial de Saúde publicou documento destacando que quando fatores de risco para doenças crônicas são minimizados e os fatores de prevenção à saúde são maximizados, as pessoas vivem mais e melhor. Este documento também ressaltou a implicação das doenças orais na saúde geral e na qualidade de vida, principalmente, de pessoas idosas e concluiu enfatizando a importância da promoção da saúde bucal (PETERSEN e OGAWA, 2005). Devido à alta incidência de doença periodontal crônica em doentes renais crônicos, torna-se fundamental o conhecimento mais profundo da fisiopatologia da doença periodontal, em especial em relação a marcadores inflamatórios sistêmicos que poderão impactar sistemicamente e alterar o prognóstico e a evolução da DRC. Além disso, vale ressaltar que quanto antes estes pacientes forem tratados, maiores poderão ser as chances de um melhor prognóstico. 2.5 Marcadores inflamatórios na doença periodontal e na doença renal crônica A DP é caracterizada por um processo inflamatório em que várias substâncias que participam deste processo são produzidas (LINDHE, 1999). Tais substâncias são denominadas de marcadores inflamatórios e incluem citocinas,

24 23 interleucinas, moléculas de adesão, proteínas de fase aguda, quimiocinas, entre outras (NOACK et al., 2001). Citocina é o termo genérico para designar as proteínas mediadoras da inter-relação celular e controle das respostas imunes secretadas por células (IDE et al., 2003). Já as interleucinas são citocinas que regulam as interações entre linfócitos e outros leucócitos (BLUM e MILLER, 1998) Muitos trabalhos na literatura médica estudaram marcadores inflamatórios sistêmicos (D AIUTO; READY; TONETTI, 2004, FRANEK, 2006; NOACK et al., 2001, e vários destes marcadores parecem estar aumentados na DP crônica não tratada (D'AIUTO et al., 2005; IDE et al., 2003), inclusive em pacientes com DRC (FRANEK, 2006). Apesar de haver uma relação demonstrada entre doenças sistêmicas crônicas inflamatórias e DP, não se sabe como estas doenças se relacionam. Pacientes com DP crônica têm uma produção aumentada de citocinas inflamatórias (IL-1β, TNF-α, IL-6) (OFFENBACHER, 1996; GORSKA et al., 2003), e podem induzir a elevação plasmática do nível de proteínas de fase aguda, como por exemplo, a PCR (AMAR et al., 2003; BUHLIN et al., 2003; CRAIG et al., 2003), promovendo uma resposta inflamatória sistêmica moderada (EBERSOLE et al., 1997; LOOS et al., 2000; NOACK et al., 2001). Tal fato demonstra que a DP crônica é um protótipo de infecção local de baixo grau associado com uma resposta inflamatória sistêmica moderada (D'AIUTO et al., 2005; GEMMELL et al., 1997; MATTILA et al., 2002;). Segundo Lamster et al. (1999), a destruição tecidual na doença periodontal é o resultado direto de efeitos tóxicos de bactérias e da resposta inflamatória do hospedeiro. Os principais mediadores da resposta infamatória são interleucina 1, interleucina 6 e TNF-alfa.

25 24 A IL-6 é uma citocina circulante produzida, principalmente, por uma grande variedade de células, como linfócitos T e B, fibroblastos, células endoteliais e hepatócitos e tem sido identificada como um marcador associado com a aterosclerose e sua progressão (TZOULAKI et al., 2005). As concentrações séricas de IL-6 aumentam em resposta a inflamações crônicas como a DP (FORNER et al., 2006). A IL-6 estimula a agregação plaquetária e a expressão de fator tecidual, receptores de proteína de baixa densidade (LDL - low density lipoprotein) em macrófagos, PCR (CRP, do inglês C-Reactive Protein), fibrinogênio e hepcidina. A IL-6 também regula a expressão de outras citocinas inflamatórias, tais como a IL-1 e o TNF-α (IKEDA; ITO; SHIMADA, 2001). Forner et al. (2006) investigaram a hipótese de que a bacteremia causada após curetagem periodontal de pacientes com doença periodontal resultaria na alteração de níveis plasmáticos de citocinas. Vinte pacientes com periodontite crônica foram submetidos à curetagem e amostras de sangue foram obtidas oito horas após o tratamento para dosagem das citocinas. Os autores concluíram que os níveis de IL-6 estavam significativamente aumentados e os níveis de IL-8 diminuídos. Nenhuma mudança significativa ocorreu nos níveis de TNF(α), IL-10 e IL-1β. A inflamação crônica tem sido associada e amplamente reconhecida como um fator etiológico na rejeição de transplante de órgãos (IOANNIDOU et al. 2006). A avaliação da expressão de IL-6 no soro e no periodonto de pacientes submetidos a transplante de órgãos mostrou que os indivíduos transplantados têm, significativamente, maior nível sérico de IL-6. (HARTONO et al., 2004; RAASVELD et al., 1993). A destruição do tecido periodontal e a síntese de IL-6 local estão

26 25 associadas com elevados níveis séricos de IL-6 em transplantados, o que pode implicar como fator de rejeição de transplantes (IOANNIDOU et al., 2006). A IL-6 ativa proteínas de fase aguda que são aquelas cujas concentrações plasmáticas se alteram em, pelo menos, 25% durante as doenças inflamatórias. Entre as proteínas de fase aguda, a PCR destaca-se por apresentar meia-vida plasmática curta (aproximadamente 19h) e a sua concentração plasmática está exclusivamente relacionada à síntese nesse período (KOENIG et al., 1999). A PCR é um pentâmero de 115 kda, produzida principalmente no fígado em resposta a secreção de IL-6, mas também tem sido mostrado que a PCR pode ser produzida no endotélio de placas ateroscleróticas, células musculares lisas, macrófagos e adipócitos (CALABRO; WILLERSON; YEH, 2003; YASOJIMA et al., 2001). A PCR pode ser produzida como parte de uma resposta não específica de fase aguda para danos teciduais, infecções, inflamação e neoplasias malignas (PEPYS e HIRSCHFIELD, 2003). Esta proteína tem se mostrado um forte preditor de risco para eventos cardiovasculares entre indivíduos com doenças cardiovasculares (HAVERKATE et al., 1997) e indivíduos sem doenças cardiovasculares conhecidas. Essa predição é igualmente forte para homens e mulheres, e é independente do valor preditivo dos lipídios séricos (DANESH et al., 2000; RIDKER; GLYNN; HENNEKENS, 1998; RIDKER et al., 2000). A PCR é rotineiramente monitorada como um marcador sistêmico da inflamação (CRAIG; SPITTLE; LEVIN, 2002). Níveis sanguíneos elevados podem ser encontrados praticamente em todas as doenças associadas com inflamação ativa ou destruição de tecido, particularmente em indivíduos com artrite reumatóide, infecção aguda, pós-infarto do miocárdio ou cirurgia, e infecções (D AIUTO; READY; TONETTI, 2004). A PCR e outras moléculas de fase aguda estão, geralmente,

27 26 presentes em níveis relativamente baixos no plasma, mas podem ter seu nível elevado dramaticamente em apenas 72 horas de injúria tecidual ou com infecção (IDE et al., 2003). Os níveis plasmáticos de PCR na periodontite e a correlação entre a gravidade da doença periodontal e a microflora periodontal foram avaliados em um estudo e foi observado que o aumento das concentrações de PCR em pacientes com periodontite dependem da gravidade da doença, considerando fatores como idade, tabagismo, índice de massa corporal, triglicerídios e colesterol (NOACK et al., 2001). Também foi constatado que as concentrações elevadas de PCR estavam associadas a infecção por microrganismos subgengivais da doença periodontal, especialmente: Porphyromonas gingivalis, Prevotela intermédia, Campylobacter recta e Bacteroides forsythus (KADIROGLU et al., 2006). D Aiuto; Ready; Tonetti (2004) avaliaram o efeito da terapia periodontal sobre as concentrações de PCR associada ao risco da doença cardiovascular. Para isto, selecionaram 94 pacientes sistemicamente saudáveis com periodontite severa generalizada que receberam terapia periodontal convencional. Parâmetros clínicos periodontais, IL-6 e PCR foram avaliados dois e seis meses após tratamento. Este estudo indicou que a periodontite pode adicionar carga inflamatória e pode resultar em níveis aumentados de risco cardiovascular na concentração de PCR. Resultados contraditórios foram observados em pacientes japoneses com periodontite. O efeito do tratamento periodontal sobre citocinas pró-inflamatórias e PCR mostrou que os níveis de citocina, IL-6 e TNF(α) não mudaram com o tratamento periodontal (YAMAZAKI et al., 2005). Além disso, uma meta-análise de estudos controlados e randomizados do efeito do tratamento periodontal sobre as concentrações séricas de PCR, concluiu não haver diferença significativa nos níveis

28 27 de PCR sérico antes e após terapia periodontal (IOANNODOU; MALEKZADEH e DONGARI-BAGTZOGLOU, 2006). Um estudo com pacientes sob hemodiálise investigou a possível associação entre inflamação periodontal e o processo ateroesclerótico. Em todos os pacientes foram avaliados: PCR, TNF(α), IL-6 além de espessura da íntima-média da artéria carótida. Os resultados mostraram que pacientes com DRC e periodontite avançada apresentaram significativo aumento na concentração de PCR sérica e maior espessura da íntima-média da artéria carótida (FRANEK et al., 2006). As avaliações das concentrações de PCR séricas em relação aos tratamentos periodontais mostram muitas divergências na literatura. Entretanto, sabe-se que o processo inflamatório desencadeia a liberação de citocinas como a IL-6 que é o principal fator desencadeante da produção de proteínas de fase aguda como a PCR e também a hepcidina. Assim, poder-se-ia imaginar que a doença periodontal, sendo uma doença inflamatória, pode desencadear uma inflamação sistêmica produzindo mediadores que podem contribuir para um mal prognóstico e pior evolução dos pacientes com doença renal crônica, contribuindo também para o surgimento de anemia nestes pacientes através do aumento das concentrações de hepcidina.

29 28 3 HIPÓTESE De acordo com a literatura apresentada, pode-se fazer as seguintes considerações, como hipóteses: a. a doença periodontal crônica tem caráter inflamatório e grande carga bacteriana que, provavelmente, interfere negativamente em outras doenças inflamatórias crônicas sistêmicas; b. o tratamento periodontal não-cirúrgico pode ter efeitos na melhora de doenças inflamatórias crônicas sistêmicas, como doença renal crônica, a partir do restabelecimento da saúde periodontal e diminuição dos níveis de mediadores inflamatórios locais e sistêmicos; c. ainda não se sabe se há relação entre a ativação/aumento da hepcidina circulante associado à doença periodontal crônica. Portanto, a hipótese do presente estudo é que o tratamento periodontal poderia diminuir a atividade e/ou ativação de mediadores inflamatórios circulantes em pacientes com doença renal crônica. Assim, pela reprodutibilidade das técnicas e a grande importância dos marcadores inflamatórios na evolução da doença renal crônica e na DP, acredita-se ser possível testar a hipótese de haver correlação entre os níveis plasmáticos dos principais marcadores inflamatórios sistêmicos IL-6, PCR e da hepcidina circulante, na presença e ausência de doença periodontal crônica. Caso essa hipótese se confirme, um passo importante terá sido dado no estabelecimento da relação da DP crônica com doenças inflamatórias crônicas sistêmicas, especialmente na DRC.

30 29 4 OBJETIVOS Avaliar a expressão de Interleucina-6, Proteína C Reativa e hepcidna no plasma de pacientes com doença renal crônica e doença periodontal crônica, antes e depois do tratamento periodontal básico; correlacionando a presença e atividade/ativação dos níveis plasmáticos destes marcadores inflamatórios, com o estadiamento clínico da doença renal crônica, especialmente, na anemia de doença crônica.

31 30 5 CASUÍSTICA E METODOS O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Humana da UFJF, conforme parecer No 327/2006, protocolo sob No (ANEXO A). Inicialmente, todos os indivíduos receberão informações a respeito da pesquisa, seus objetivos, importância e benefícios e assinarão Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (ANEXO B). A adesão à pesquisa será espontânea, obtida através de consentimento pós-informado, não se promovendo obrigatoriedade ou constrangimento ao paciente. 5.1 População e amostra Participarão deste estudo quarenta voluntários, de ambos os sexos, de idade entre 30 e 65 anos, portadores de doença renal crônica, nos estágios prédialítico 3, 4 e 5, selecionados na clínica de nefrologia da Fundação Instituto Mineiro de Estudos e Pesquisas em Nefrologia (IMEPEN), classificados de acordo com a tabela para cálculo estimado do ritmo de filtração glomerular, proposto por Bastos e Bastos (2005). Os critérios de inclusão para o diagnóstico da doença periodontal crônica serão os propostos por Machtei et al. (1992), (ANEXO C) que compreende voluntários entre idade de 30 a 65 anos, com no mínimo 20 dentes remanescentes, que apresentem dois ou mais dentes com nível de inserção clínica 6mm e um ou mais sítios com profundidade de sondagem 5mm. Serão respeitados os critérios de exclusão propostos por Ide et al. (2003) quando da seleção dos voluntários; não ter recebido tratamento periodontal no início

32 31 do estudo; história negativa de uso de tabaco a no mínimo cinco anos; história negativa de antibioticoterapia e de medicação antiinflamatória esteróide ou não esteróide nos últimos seis meses antecessores ao estudo e durante o mesmo. Também será considerado critério de exclusão, os voluntários em reposição de ferro para tratamento de anemia (ANEXO A). 5.2 Avaliações Numa primeira visita, serão realizados procedimentos de exame clínico geral e exame clínico periodontal, conforme descrito abaixo, para seleção de voluntários e inclusão no estudo Exame clínico geral O exame das condições clínicas sistêmicas será realizado por um único examinador, através de anamnese para obtenção dos dados pessoais, da história da doença atual, de doenças de base, de co-morbidades, história familiar, história social, medicamentos em uso, e de exame físico para avaliação da pressão artéria em três posições (deitado, sentado e em pé), freqüência cardíaca, freqüência respiratória, altura, peso, cintura abdominal, cintura de quadril e presença de linfonodos cervicais. O índice de massa corporal será definido como o peso em quilogramas dividido pela altura ao quadrado em metros (ANEXO D)

33 Exame clínico periodontal A anamnese compreenderá a história dental completa, posteriormente, será procedido o exame físico bucal e periodontal por um único examinador, previamente treinado, utilizando-se de uma sonda periodontal milimetrada tipo Williams 1 e espelho bucal, devidamente esterilizados. Depois de realizado o exame clínico periodontal, estes voluntários serão diagnosticados como portadores ou não de doença periodontal crônica, segundo Machtei et al. (1992) (ANEXO E) Será estimado o Índice de Placa IP (presente e ausente) (SILNESS e LÖE 1964). O exame periodontal compreenderá a sondagem de seis sítios em cada dente (mésio vestibular, mesial, mésio lingual, disto vestibular, distal, disto lingual), realizado por um único examinador, utilizando uma sonda periodontal milimetrada, tipo Williams, graduada a cada milímetro. Os seguintes parâmetros clínicos serão avaliados: a. profundidade de sondagem (PS) distância do fundo do sulco até a margem gengival; b. sangramento à sondagem (SS) determinado pela presença (+) ou ausência (-) de sangramento observado, durante 30 segundos, após a primeira inserção da sonda na bolsa periodontal; c. nível de inserção clínica relativa (NICR) distância do fundo do sulco à margem da placa; d. recessão gengival (RG) distância da margem gengival livre à linha do cemento/esmalte. 1 Hu-Friedy, Mgf. Co. Inc., Chicago, IL, USA

34 Avaliações laboratoriais Amostras de sangue venoso (20mL) serão coletadas antes da terapia periodontal e aos três meses depois de completado o tratamento. Uma parte do sangue total será anticoagulado em EDTA e uma alíquota separada para avaliação do hemograma, pela técnica automatizada Coulter 2. O restante do sangue anticoagulado em EDTA será centrifugado por cinco minutos a 1800 x g para a separação do plasma, que será aliquotado e armazenado a 70ºC até as análises futuras das concentrações de interleucina-6. O soro será obtido pela adição de sangue venoso em tubo a vácuo contendo um ativador da coagulação. Após centrifugação por 15 minutos a 1800 x g, o soro será separado. Parte do soro será aliquotado para avaliação de ferritina pela técnica de Electroquimioluminescencia 3 ; ferro sérico pela técnica de Ferrozine 4 e índice de saturação de transferrina, pela técnica Goodwin modificada 5. E o restante do soro será estocado a 70 o C para futura análise dos marcadores inflamatórios proteína C reativa e hepcidina (ANEXO F). A IL-6 será avaliada no plasma pela técnica de imunoensaio através do kit comercial de ELISA 6 de acordo com instruções do fabricante. As leituras serão realizadas por leitor automático de micro placas, a absorvância será lida no comprimento de onda de 450nm em espectofotômetro 7. A hepcidina será avaliada no soro pela técnica de imunoensaio através do kit DRG Hepcidin Prohormone ELISA 8 de acordo com instruções do fabricante. As 2 Stks, Coulter Corporation, Miami USA 3 Modular Roche, Roche Diagnostic System, New Jersey USA 4 Backman, Synchron Clinical System, San Diego, CA 5 Backman, Synchron Clinical System, San Diego, CA 6 BD OPTEIA Kit IL-6 Humana 7 Spectramax 190, Modular Device 8 DRG International, Inc., USA

35 34 leituras serão realizadas por leitor automático de micro placas, a absorvância será lida no comprimento de onda de 450nm em espectofotômetro 7. A PCR ultra-sensível será quantificada no soro pelo método de nefelometria de alta sensibilidade 9, de acordo com ensaios já padronizados, com os valores expressos em miligramas por litro (mg/l). 5.3 Protocolo experimental Cronograma de consultas (visitas) dos indivíduos: a. Visita 1 exame clínico geral e exame clínico periodontal. b. Visita 2 1ª coleta de sangue c. Visita 3 orientação de higienização, e profilaxia periodontal. d. Visita 4 - tratamento periodontal, por raspagem supra e subgengival da arcada. e. Visita 5 - tratamento periodontal, por raspagem supra e subgengival da arcada. f. Baselie 0 dia 0 para inicio de contagem de intervalo de três meses; um dia após a visita 5. g. Visita 6 - interconsulta de manutenção periodontal após 15 dias. h. Visita 7 - interconsulta de manutenção periodontal após 30 dias. i. Visita 8 - interconsulta de manutenção periodontal após 60 dias. j. Visita 9 - reavaliação do exame clínico geral e periodontal após 90 dias. k. Visita 10-2º coleta de sangue As datas das visitas serão anotadas em formulário elaborado para este fim (ANEXO G). 9 Cobas Mira, Roche Diagnostic System, New Jersey USA

36 35 A amostra será categorizada em um único grupo experimental de 40 indivíduos que serão avaliados clínica e laboratorialmente antes e após a terapia periodontal, sendo que este grupo será o próprio controle. Os intervalos dos procedimentos clínicos são mostrados na FIG. 2. Exame periodontal e clínico Visita 1 (Dia: 1) Coleta de sangue Visita 2 (Dia: 3) Tratamento periodontal Profilaxia Visita 3 (Dia: 7) Raspagem Visita 4 (Dia: 14) Raspagem Visita 5 (Dia: 21) Baseline 0 Manutenção 15 dias Visita 6 30 dias Visita 7 60 dias Visita 8 Reavaliação periodontal e clínica 90 dias - Visita 9 Coleta de sangue Visita 10 FIGURA 2 - Fluxograma dos intervalos dos procedimentos clínicos

37 Tratamento periodontal Um único periodontista realizará a terapia periodontal básica não cirúrgica, de acordo com o grupo de estudo: As raspagens supragengival, subgengival e aplainamento radicular sob anestesia local serão realizados utilizando ultra-som 10 e curetas de Gracey e mini- Gracey 11 da coleção principal (5-6, 7-8, e 13-14), profilaxia com taça de borracha e pasta profilática 12 de granulação fina. Esta terapia será realizada em duas sessões no intervalo de sete dias, sem limite de tempo, de acordo com a necessidade individual. Em cada sessão, todos os indivíduos receberão instrução de higiene oral para utilização de escova dental pela técnica de Bass modificada, fio dental e outros meios complementares (escova interdental, escova unitufo, escovação de língua, etc.), de acordo com a necessidade individual. As áreas instrumentadas serão reavaliadas após duas semanas e poderão sofrer uma reinstrumentação, quando existir a persistência de cálculo e sangramento. Após 30 e 60 dias, será realizada a manutenção do tratamento, quando todos os indivíduos serão submetidos novamente a controle de placa supra e subgengival, profilaxia profissional e reforço das instruções de higiene oral de forma individualizada para motivação, orientação e monitoramento. Será realizado um novo exame aos 90 dias após completado o tratamento, e serão coletados novamente os mesmos parâmetros clínicos e sangue. Todos os procedimentos realizados serão registrados a cada consulta em ficha de evolução clínica (ANEXO H). 10 Modelo Profi 2 Dabi S. Paulo 11 Hu-Friedy, Mgf. Co. Inc., Chicago, IL, USA 12 Herjos Vigodent São Paulo

38 Reavaliação clinica Será realizado um novo exame do indivíduo aos 90 dias após completado o tratamento periodontal, quando serão realizadas novos exames clínico geral e periodontal, de acordo com os mesmos parâmetros da avaliação inicial, conforme descrito acima. 5.4 Análise estatística Para definição do número de indivíduos a ser utilizado neste estudo foi levada em consideração a variação encontrada em dois estudos publicados (BUHLIN et al., 2003; YASMIN et al., 2005), que apresentavam como objeto de pesquisa marcadores plasmáticos de inflamação em indivíduos com características semelhantes aos deste estudo. A análise estatística incluirá análise descritiva utilizando médias e desvios padrão para as variáveis quantitativas e freqüências relativas (percentagens) para variáveis qualitativas. Serão realizados testes de normalidade para decisão sobre o teste a ser aplicado. Para marcadores com distribuição normal, testes paramétricos serão aplicados. Nas comparações de médias de cada marcador no baseline 0 e no período final (após três meses) será utilizado o teste t-student pareado. Nos casos de distribuições não normais, será utilizado o teste de Wilcoxon. Para avaliar as possíveis relações entre as alterações nos marcadores inflamatórios e os dados hematológicos clínicos, será utilizada a análise de correlação de Pearson. O nível de significância utilizado será o de α=0,05.