Resumo A infecção pelo Papilomavírus humano (HPV) é o principal responsável pela

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1 REVISÃO Identificação molecular do HPV em infecções do colo uterino no Brasil: revisão Molecular identification of HPV infections in cervical cancer in Brazil: review Jomar Diogo Costa Nunes 1 Sally Cristina Moutinho Monteiro 2 Flávia Castello Branco Vidal 3 Luciane Maria Oliveira Brito 4 Palavras-chave HPV Reação em cadeia da polimerase Neoplasias do colo do úterol Keywords HPV Polymerase chain reaction Uterine cervical neoplasms Resumo A infecção pelo Papilomavírus humano (HPV) é o principal responsável pela ocorrência do câncer cervical, sendo que o seu estudo por meio de técnicas moleculares sofreu um aumento significativo na última década. Objetivo: Analisar as publicações sobre a identificação molecular do HPV no colo uterino no Brasil. Metodologia: Trata-se de revisão sistemática nos portais PubMed e Biblioteca Virtual em Saúde entre os anos de 2007 a 2012, utilizando os termos: human papillomavirus, cervical cancer, polymerase chain reaction e Brazil. Dos 37 artigos identificados, 16 permaneceram após leitura dos mesmos na integra, sendo excluídos: os disponíveis apenas o resumo; os estudos que focaram a população masculina; os retrospectivos; com dados dos tipos de HPV indisponíveis; estudos experimentais; comparativo de técnicas; e de variantes intratípicas. De posse desses artigos, realizou-se a distribuição entre a frequência dos tipos de HPV em relação às diferentes técnicas de genotipagem e regiões do Brasil onde ocorreram as pesquisas que originaram os artigos. Resultados: Houve um predomínio das publicações na região Sudeste (43,7%), seguido pelo Nordeste (25,0%) e Sul (18,7%). Dos 16 artigos incluídos, observou-se uma maior frequência pelo HPV tipo 16 seguido do 31. Conclusão: As técnicas de diagnóstico moleculares são importantes ferramentas para a identificação dos tipos de HPV presentes em infecções do colo uterino, observando a necessidade de identificação dos genótipos que predominam na população brasileira, com a finalidade de melhoria na elaboração de políticas públicas em saúde. Abstract The infection by human papillomavirus (HPV) is the main responsible for the occurrence of cervical cancer, and their study using molecular techniques has increased significantly in the last decade. Objective: To analyze the publications on the molecular identification of HPV in cervical cancer in Brazil. Methodology: This is a systematic review in PubMed and Virtual Health Library postals between the years 2007 and 2012 using the terms: humanpapillomavirus, cervical cancer, polymerasechainreaction and Brazil. Out of the 37 articles identified, 16 remained after their fully reading, being excluded: available only the summary, the studies that focused on the male population; retrospective; with data of HPV types unavailable; experimental studies, comparative techniques; and intratypical variants. Based on these articles the frequency distribution of HPV types was held relative to different genotyping techniques and regions of Brazil where the articles research took place. Results: There was a predominance of publications in the Southeast (43.7%), followed by the Northeast (25.0%) and South (18.7%) out of the 16 articles included, we observed a higher frequency of HPV type 16 followed by 31. Conclusion: The molecular diagnostic techniques are important tools to the identification of HPV types in cervical infections, observing the need for identification of genotypes that predominate in the Brazilian population, with the aim of improving the development of public health policies. 1 Mestrando em Saúde Materno-Infantil pela Universidade Federal do Maranhão (UFMA) São Luís (MA), Brasil; Membro do Banco de Tumores e DNA do Maranhão (BTMA) São Luís (MA), Brasil. 2 Doutora em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia pela Universidade Estadual de São Paulo (UNESP) São Paulo (SP), Brasil; Professora Adjunto do Departamento de Farmácia da UFMA São Luís (MA), Brasil; Membro do BTMA São Luís (MA), Brasil. 3 Doutora em Ciências pela Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ) Rio de Janeiro (RJ), Brasil; Pós-Doc do Programa de Pós-Graduação em Saúde Materno-Infantil da UFMA São Luís (MA), Brasil; Membro do BTMA São Luís (MA), Brasil. 4 Doutora em Medicina (Mastologia) pela Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) Rio de Janeiro (RJ), Brasil; Professora Associada IV do Departamento de Medicina III da UFMA São Luís (MA); Vice- Coordenadora do Programa de Pós-Graduação Saúde Materno-Infantil da UFMA São Luís (MA), Brasil; Membro do BTMA São Luís (MA), Brasil. Endereço para correspondência: Jomar Diogo Costa Nunes Programa de Pós-Graduação em Saúde Materno-Infantil da Universidade Federal do Maranhão Praça Gonçalves Dias, 21, 2º andar CEP: São Luís (MA), Brasil jomdiogo@yahoo.com.br

2 Nunes JDC, Monteiro SCM, Vidal FCB, Brito UMO Introdução O câncer cervical é responsável por 6% de todas as neoplasias entre mulheres, com cerca de 500 mil novos casos diagnosticados a cada ano. Aproximadamente 231 mil mulheres morrem anualmente por câncer cervical invasivo, sendo que 80% dessas mortes ocorrem em países subdesenvolvidos 1 (A). O HPV de fato é um fator necessário para o desenvolvimento do colo do útero, o qual poder ser potencializado com fatores de risco inespecíficos como o tabagismo, etilismo, imunodepressão, entre outros 2 (A). Os subgrupos do HPV são classificados em relação ao seu potencial oncogênico em baixo grau ou alto grau. Exemplos de vírus de baixo grau incluem os tipos 6, 11, 42, 43 e 44, esses geralmente não desenvolvem neoplasias, restringindo-se a alterações dermatológicas como verrugas. Os tipos virais de alto grau como o 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 46, 51, 52, 56, 58, 59 e 68, apresentam potencialidade no desenvolvimento de neoplasias dependendo do órgão infectado 3 (D). O artigo teve como objetivo analisar as publicações sobre a identificação molecular do HPV em infecções do colo uterino em pacientes brasileiras. Metodologia Revisão sistemática de estudos sobre a prevalência dos tipos de HPV identificado através de exames moleculares em mulheres brasileiras. Foram analisadas publicações indexadas nas bases Medical Literature e na Biblioteca Virtual em Saúde (BIREME). Os artigos selecionados foram entre os anos de 2007 a 2012, utilizando os termos: human papillomavirus, cervical cancer, polymerase chain reaction e Brazil. Dentre os 37 artigos selecionados, 16 permaneceram após leitura dos mesmos na integra, sendo que os excluídos encontram-se apresentados na Figura 1. De posse desses artigos, foi realizada a distribuição entre a frequência dos tipos de HPV em relação às diferentes técnicas de genotipagem e regiões do Brasil baseados nos genótipos 16, 18, 31, 33, 35, 39 e 45. Cabe destacar que os resultados das infecções múltiplas foram quantificados separadamente nos respectivos genótipos. Resultados e Discussão A Tabela 1 mostra a distribuição dos artigos incluídos na revisão em relação às regiões onde foram realizadas as pesquisas, observando um predomínio de publicações na região Sudeste (43,7%), seguido pelo Nordeste (25,0%). A maior concentração de publicações no Sudeste é justificada pela realização da distribuição dos recursos governamentais no país que se baseiam na concentração populacional, a qual é de 63% (região Sudeste), 17% (região Sul), 13% (região Nordeste), 5% (região Centro-Oeste) e 2% (região Norte). Esses recursos possibilitam uma maior quantidade de instituições de ensino superior e cursos de pós-graduação, contribuindo com o aumento das pesquisas cientificas 4 (D). Seguindo essa lógica, seria plausível que a segunda maior região em relação às publicações deveria ser o Sul e não o Nordeste, esse fato pode apresentar como justificativa as intensas medidas preventivas de rastreamento realizadas nas últimas décadas na região Sul, na qual alcançou uma cobertura de cerca de 90% das mulheres na faixa de risco, propiciando uma redução no número de casos de câncer cervical e desta forma fazendo com que outras enfermidades mais prevalentes da região sejam o foco das pesquisas locais. Os artigos foram selecionados de 2007 a outubro de 2012, os quais encontram-se na Tabela 2. Observa-se que, em relação ao ano, houve um aumento progressivo no número de publicações de 2009 a Esse aumento nas publicações pode ser explicado pelo fato das últimas duas décadas ter ocorrido uma expansão nas pesquisas epidemiológicas no Brasil e no mundo, principalmente em relação a doenças transmissíveis, dentre elas o HPV 5 (A). O número amostral variou entre 30 a 409. Um número de participantes reduzidos pode interferir na extrapolação para a população das características observadas, o que reduz a qualidade do estudo. A distribuição dos genótipos em relação aos diferentes tipos de técnicas encontram-se distribuídos na Tabela 3 (metodologia de PCR alelo especifico), Tabela 4 (metodologia de hibridização reversa) e Tabela 5 (metodologia PCR-RFLP). Observou-se que a metodologia da PCR alelo específica foi escolhida pela maioria dos artigos selecionados (44%). Essa técnica apresenta como principal limitação à impossibilidade de identificação de tipos raros e de baixa frequência, pois para a realização dessa metodologia é necessária a utilização de sequências iniciadoras (primers) para cada tipo de HPV. Para análise de mais 100 tipos de genótipos, seria necessário a utilização da mesma quantidade de primers, o que elevaria os custos de tal pesquisa. Dessa forma, a fim de reduzir os custos, ocorre uma seleção dos tipos HPV mais frequente. Apesar das técnicas de biologia molecular serem relativamente onerosas, a PCR alelo específica é mais econômica em relação à hibridização reversa e ao sequenciamento automatizado 22 (D). A Tabela 4 demonstra os estudos utilizando Hibridização reversa. Essa metodologia apresenta como principal vantagem 94 FEMINA Março/Abril 2013 vol 41 nº 2

3 Identificação molecular do HPV em infecções do colo uterino no Brasil: revisão 37 artigos identificados no portal MEDLINE e Bireme População masculina: 3 Selecionados Excluídos 6 trabalhos completos indisponíveis Leitura de 27 artigos na integra Dados dos tipos de HPV indisponíveis: 8 Estudos retrospectivos: 1 Comparativo de técnica: 1 Selecionados Excluídos Estudos experimentais: 1 Estudos variantes dos genótipos: 1 16 artigos incluídos na análise final Figura 1 - Representação gráfica do processo de seleção dos artigos científico. Tabela 1 - Distribuição das publicações em relação a regiões do Brasil Regiões n % Norte 0 0,0 Nordeste 4 25,0 Centro Oeste 2 12,5 Sudeste 7 43,7 Sul 3 18,7 Total a possibilidade de identificação de infecções múltiplas em uma única reação, além de requerer uma pequena quantidade de produto da PCR para sua realização. Entretanto, trata-se de uma técnica de custo elevado e uma das quais atualmente identificam menor número de genótipos (40 devido às sondas utilizadas pelos fabricantes dos kits). Outra limitação se deve ao fato de sua utilização basear-se apenas no 1º round da PCR, o que limita infecções com uma baixa carga viral ou material biológico degradado ou escasso 23 (B). FEMINA Março/Abril 2013 vol 41 nº 2 95

4 Nunes JDC, Monteiro SCM, Vidal FCB, Brito UMO Tabela 2 - Distribuição das publicações de acordo com locais, número amostrale técnicas de genotipagem Estudo Ano da publicação Local Tipo de estudo Número amostral Técnicas genotipagem Rocha et al. 6 (B) 2012 Belo Horizonte, MG Transversal 23 PCR alelo específica Barros et al. 7 (B) 2012 Goiânia, GO Transversal 131 Hibridização Reversa Zonta et al. 8 (B) 2012 São Paulo, SP Transversal 409 PCR-RFLP Nascimento et al. 9 (B) 2012 Macéio, Al Transversal 34 PCR-RFLP Calil et al. 10 (B) 2011 Porto Alegre, RS Transversal 86 PCR alelo específica Corrêa et al. 11 (B) 2011 Belo Horizonte, MG Transversal 288 PCR alelo específica Ribeiro et al. 12 (B) 2011 Goiâna, GO Transversal 198 Hibridização Reversa Oliveira et al. 13 (B) 2010 Niterói, RJ Transversal 241 PCR-RFLP Bringhenti et al. 14 (B) 2010 Nonoai, RS Transversal 22 PCR alelo específica Fernandes et al. 15 (B) 2010 Natal, RN Transversal 206 Hibridização Reversa Paesi et al. 16 (B) 2009 Caxias do Sul, RS Transversal 256 PCR-RFLP Brandão et al. 17 (B) 2009 Recife, PB Caso-Controle 147 Hibridização Reversa Fernandes et al. 18 (B) 2009 Natal, RN Transversal 258 PCR alelo específica Freitas et al. 19 (B) 2007 Belo Horizonte, MG Transversal 174 PCR alelo específica Terra et al. 20 (B) 2007 Uberaba, MG Transversal 79 PCR Alelo específico Paulo et al. 21 (B) 2007 São Paulo, SP Transversal 30 PCR-RFLP Tabela 3 - Prevalência de HPV identificados através da técnica de PCR Alelo específica Estudo HPV 16 HPV 18 HPV 31 Prevalência dos tipos de HPV Rocha et al. 6 (B) 13 (43) 11 (37) 3 (10) 2 (7) 0 (0) 0 (0) 1 (3) Calil et al. 10 (B) 35 (50) 8 (12) 27 (38) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) Corrêa et al. 11 (B) 110 (37) 13 (43) 31 (10) 56 (19) 89 (30) 0 (0) 0 (0) Bringhenti et al. 14 (B) 3 (37) 2 (25) 2 (25) 1 (13) 0 (0) 0 (0) 0 (0) Fernandes et al. 18 (B) 62 (91) 6 (9) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) Freitas et al. 19 (B) 15 (79) 4 (21) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) Terra et al. 20 (B) 23 (60) 5 (13) 0 (0) 0 (0) 5(13) 5(13) 23 (60) Total 261 (47) 45 (8) 63 (11) 59 (10) 94 (17) 5 (1) 24 (4) HPV 33 HPV 35 HPV 39 HPV 45 Tabela 4 - Prevalência de HPV identificados através da técnica de Hibridização Reversa Estudo HPV 16 HPV 18 HPV 31 Prevalência dos tipos de HPV Barros et al. 7 (B) 51 (71) 6 (8) 11 (15) 1 (1) 3 (4) 0 (0) 0 (0) Ribeiro et al. 12 (B) 40 (70) 0 (0) 8 (14) 9 (16) 0 (0) 0 (0) 0 (0) Fernandes et al. 15 (B) 110 (76) 11 (7) 11 (7) 9 (6) 0 (0) 0 (0) 4 (3) Brandão et al. 17 (B) 17 (48) 11 (31) 7 (21) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) Total 218 (70) 28 (9) 37 (12) 19 (6) 3 (1) 0 (0) 4 (1) HPV 33 HPV 35 HPV 39 HPV 45 Tabela 5 - Prevalência de HPV identificados através das técnicas de PCR-RFLP Estudo HPV 16 HPV 18 HPV 31 Prevalência dos tipos de HPV Zonta et al. 8 (B) 4 (50) 2 (25) 1 (12) 1 (12) 0 (0) 0 (0) 0 (0) Nascimento et al. 9 (B) 5 (50) 1 (10) 2 (20) 2 (20) 0 (0) 0 (0) 0 (0) Oliveira et al. 13 (B) 15 (50) 2 (6) 10 (33) 1 (3) 0 (0) 2 (7) 0 (0) Paesi et al. 16 (B) 25 (55) 7 (15) 1 (2) 8 (18) 0 (0) 2 (4) 2 (4) Paulo et al. 21 (B) 1 (100) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) Total 50 (53) 12 (12) 14 (7) 12 (6) 0 (0) 4 (2) 2 (4) HPV 33 HPV 35 HPV 39 HPV FEMINA Março/Abril 2013 vol 41 nº 2

5 Identificação molecular do HPV em infecções do colo uterino no Brasil: revisão A fim de reduzir os custos de tal metodologia, somado a sua vantagem na identificação de infecções múltiplas, essa ferramenta poderia ser utilizada quando o resultado da PCR para o HPV for indeterminado, fato esse que possibilitaria a identificação precisa dos tipos de HPV. A técnica de PCR-RFLP possui dentre as suas limitações à impossibilidade de identificação de múltiplas infecções em um único tubo reacional, tratando-se de um método laborioso tanto para a sua realização quanto para a interpretação dos resultados dos fragmentos digeridos por meio das enzimas de restrições (PstI, HaeIII, DdeI e RsaI). Outra limitação dessa ferramenta, assim como na hibridização reversa, seria a utilização de apenas 1º round da PCR, tornando a detecção menos sensível (mesma observação, explica no paragrafo anterior e aqui não precisa). Dentre as vantagens, encontra-se a possibilidade de identificação de mais de 50 genótipos de HPV, sendo nesse aspecto uma técnica mais eficiente que a PCR alelo específica e a de hibridização reversa 24 (B). Essa revisão demonstrou uma predominância do HPV 16 independentemente da técnica utilizada para sua identificação, sendo esse resultado confirmando na literatura mundial 25. Porém, o segundo genótipo mais prevalente indicado na literatura é o HPV 18, fato esse que somente foi observado no presente artigo na técnica de PCR-RFLP, enquanto às técnicas de PCR alelo específica e de hibridização reversa identificou como os segundo mais prevalentes o tipos 35 e 31, respectivamente. Conclusão Nas últimas décadas houve uma expansão das pesquisas em HPV que utilizam a reação em cadeia de polimerase (PCR). Essa apresenta de forma geral uma vantagem auxiliar para a confirmação diagnóstica e da persistência viral em relação a métodos puramente clínicos e histopatológicos. Porém, é fundamental compreender que embora existam diversas técnicas moleculares para a identificação do HPV, todas possuem vantagens e desvantagens para sua realização, sendo necessário estabelecer a necessidade para a utilização de cada uma. Deve-se ainda, sempre que necessário e possível, associar diversas metodologias, principalmente quando ocorrer dúvidas quanto ao tipo de HPV. Apesar dos estudos envolvendo os aspectos moleculares do vírus terem expandido, ocorre ainda uma predominância destes estudos na região Sudeste do país, ou, quando ocorre em outras regiões, há uma concentração em certos estados, o que pode ocassionar uma interpretação equivocada da real prevalência de tal vírus no Brasil. Nessa revisão, observou-se que o segundo tipo de HPV mais frequente variou em relação a técnica utilizada entre o 18, 31 e 35. Dessa forma, é necessário o estabelecimento dos tipos de HPV que predominam na população brasileira, possibilitando uma melhor compreensão epidemiológica e da dinâmica da transmissão viral, além do desenvolvimento de adequadas medidas preventivas. Leituras suplementares 1. Parkim DM. Global cancer statistics in year Lancet Oncol. 2001;2(1): Freitas AC, Gurgel AP, Chagas BS, Coimbra EC, do Amaral CM. Susceptibility to cervical cancer: an overview. Gynecol Oncol. 2012;126(2): Ministério da Saúde (Brasil). Controle dos Cânceres do Colo do Útero e da Mama. Cadernos de Atenção Básica. Brasília, Guimarães R. Pesquisa em saúde no Brasil: contexto e desafios. Rev Saúde Pública. 2006;(N. Esp.): Barreto ML. Crescimento e tendência da produção científica em epidemiologia no Brasil. Rev Saúde Pública. 2006;40(N. Esp.): Rocha MGL, Faria FL, Gonçalves L, Souza MdCM, Fernandes PA, Fernandes AP. 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6 Nunes JDC, Monteiro SCM, Vidal FCB, Brito UMO 20. Terra AP, Murta EF, Maluf PJ, Caballero OL, Brait M, Adad SJ. Aberrant promoter methylation can be useful as a marker of recurrent disease in patients with cervical intraepithelial neoplasia grade III. Tumori. 2007;93(6): Paulo M, Borges AB, Duarte G, Quintana SM, Montes MB, Toloi MR. The environmental cofactors in carcinogenesis in high risk HPV/HIV-positive women. Braz J Infect Dis. 2007;11(2): Hirata MH, Tavares V, Hirata RDC. Da biologia molecular à medicina: métodos comumente utilizados em farmacogenética. Medicina, Ribeirão Preto. 2006;39(4): RAMOS KS. Estudo do HPV e variáveis sócio-comportamentais em mulheres com lesão intra-epitelial de alto grau. São Paulo. [Tese Doutorado em Ciências]- Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, Nobre RJ, Almeida LP, Martins TC. Complete genotyping of mucosal human papillomavirus using a restriction fragment length polymorphism analysis and an original typing algorithm. J Clin Virol. 2008;42(1): Tabora N, Bakkers JMJE, Quint WGV, Massuger LFAG, Matute JA, Melchers WJG, et al. Human papillomavirus infection in Honduran women with normal cytology. Cancer Causes Control. 2009;20: FEMINA Março/Abril 2013 vol 41 nº 2