Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

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1 Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Avaliação do efeito de três protocolos hormonais de sincronização da ovulação na eficiência reprodutiva de vacas de alta produção em explorações leiteiras do Norte de Portugal Dissertação de Mestrado em Medicina Veterinária Carla Maria Lopes de Azevedo Orientador: Prof. Doutor João Carlos Caetano Simões Co-orientador: Prof. Doutor Nuno Figueira Boavida Canada VILA REAL, 2014

2 Não tentes superar os outros, supera-te a ti mesma. II

3 Ao meu Pai. III

4 Agradecimentos Agradeço de forma sincera a todos os que, directa ou indirectamente, contribuíram para a concretização desta dissertação: Ao professor Doutor João Simões pelo privilégio que me concedeu ao aceitar orientar esta dissertação e pelo inigualável processo de aprendizagem que me proporcionou e que me enche de orgulho do mérito científico e dedicação dos docentes desta instituição que me formou. Ao Doutor Nuno Canada pelo precioso enquadramento profissional inicial que me proporcionou e pela constante disponibilidade para apoiar e orientar os diferentes projectos profissionais a que me proponho, facto que agradeço e prezo. À Isabel, companheira de luta na MPLvet, pela colaboração imprescindível para a execução deste estudo de campo. Um agradecimento especial pela dedicação e espírito de sacrifício, que partilhamos, e que tem feito crescer este projecto em comum. À Carla Oliveira pelo imprescindível apoio administrativo e pela sua dedicação à MPLVET. À Zoetis, nas pessoas da Dr.ª Deolinda Silva e Engª Catarina Teixeira, pela disponibilidade e interesse com que apoiaram a execução deste estudo desde o início. Aos clientes que, confiando no nosso trabalho, colocaram as suas explorações e animais à nossa disposição para levar a cabo este estudo. Aos meus pais, pelos preciosos valores que me incutiram e que sempre pautaram o meu percurso pessoal e profissional. Espero ser sempre merecedora do brilho de orgulho nos seus olhos. Ao Diogo, o homem fantástico que me escolheu para ser sua mulher e com quem criei as duas mais perfeitas obras de arte, os nossos filhos Tomás e Gonçalo. Pela motivação, compreensão e amor incondicional que sempre me dedicam e pelo tempo que lhes tirei e que lhes pertencia por direito. IV

5 Resumo O principal objectivo do presente trabalho foi comparar os efeitos do protocolo COsynch-64 + CIDR, normalmente usado em vacadas de carne, com outros 2 protocolos (Ovsynch- 64 e Ovsynch-64 + CIDR) na taxa de gestação (TG) à 1ª e/ou 2ª inseminação artificial (IA), retorno regular ao estro e intervalo entre partos (IEP) de vacas leiteiras de alta produção, em 6 explorações leiteiras comerciais Portuguesas. Entre Abril de 2009 e Março de 2010, foram usadas vacas da raça Holstein-Frísia, sem doença aparente do foro reprodutivo. As fêmeas (n=266) foram aleatoriamente distribuídas a partir do 40º dia após o parto pelos grupos B (Ovsynch-64; n = 66), C (Ovsynch-64 + CIDR; n = 70) e D (COsynch-64 + CIDR; n = 62). O grupo A (grupo controlo; n = 68) foi constituído por animais aos quais se realizou a IA, após cio natural, durante o intervalo quinzenal ou mensal das visitas de controlo reprodutivo. As vacas, cujo retorno ao estro foi observado 18 a 24 dias após a 1ª IA, foram re-inseminadas (2ª IA). A TG 1ªIA foi similar entre os grupos A (39,7%; 27/68), B (33,3%; 22/66), C (34,3%; 24/70) e D (40,3%; 25/62; P = 0,78). Foi observada uma tendência para uma maior taxa de retorno ao estro do grupo D (59,4%; 22/37) relativamente ao grupo B (38,6%; 17/44; P = 0,06). O somatório das vacas gestantes à 1ª IA e das que retornaram ao estro após aquela inseminação foi maior no grupo D (75,8%; 47/62) do que grupo B (59.1%; 39/66; P = 0,04). Também foi observada uma tendência para uma maior TG 2ªIA do grupo D (45,5%; 10/22) do que nos grupos A (20,0%; 4/20; P = 0,08) ou B (17,6%; 3/17; P = 0,07). Observou-se uma menor TG global no grupo B (37,9%; 25/66; P = 0,04) ou uma tendência para uma menor TG global no grupo C (41,4%; 29/70; P = 0,09) do que no grupo D (56,5%; 35/62). O IEP, mas não o intervalo parto-1ªia, foi menor no grupo D (425,9 ± 78,8 dias; n = 49; P = 0,003) do que nos grupos B (475,3 ± 83,7 dias; n = 43) e C (468,6 ± 80,6 dias; n = 51). Concluímos que embora se tenha observado uma TG 1ªIA similar entre os grupos, o protocolo COsynch-64 + CIDR demonstrou ser uma alternativa viável e potencialmente superior aos restantes protocolos hormonais na melhoria da eficiência reprodutiva de vacas altas produtoras. Palavras-Chave: COsynch-64 + CIDR; Fertilidade; Inseminação artificial; Ovsynch; Vacas leiteiras V

6 Abstract The main aims of the present study were to compare the pregnancy rate (PR) at 1 st and 2 nd AI, regular returns to estrus and calving interval of a COsynch-64 + CIDR, commonly used to synchronize ovulation in beef cows, with Ovsynch-64 and Ovsynch-64 + CIDR protocols in high-producing dairy cows from six commercial Portuguese dairy herds. Holstein-Friesian cows (n = 266), 40 days postpartum and without reproductive tract disease, were randomly assigned to groups B (Ovsynch-64; n = 66), C (Ovsynch-64 + CIDR; n = 70) or D (COsynch CIDR; n = 62). Cows inseminated after natural estrus were the control group (group A; n = 68). Non-pregnant cows with return to estrus between 18 and 24 days after 1 st AI were reinseminated (2 nd AI). The PR at 1 st AI was similar between groups A (39.7%; 27/68), B (33.3%; 22/66), C (34.3%; 24/70) and D (40.3%; 25/62; P = 0.78). However, a tendency for a higher regular return to estrus rate was observed in group D (59.4%; 22/37) than in group B (38.6%; 17/44, P = 0.06). The sum of cows pregnant at 1 st AI and non-pregnant cows with regular returns to estrus was higher in group D (75.8%; 47/62) than B (59.1%; 39/66; P = 0.04). A tendency for a higher PR at 2 nd AI was also observed in group D (45.5%; 10/22) than in A (20.0%; 4/20; P = 0.08) or B (17.6%; 3/17; P = 0.07). We observed that group D (56.5%; 35/62) had a higher or a tendency for a higher global PR (1 st + 2 nd AI) than groups B (37.9%; 25/66; P = 0.04) and C (41.4%; 29/70; P = 0.09), respectively. The calving interval, but not the calving to 1 st AI interval, was lower in group D (425.9 ± 78.8 days; ± SD; n=49; P= 0.003) than groups B (475.3 ± 83.7 days, n = 43) and C (468.6 ± 80.6 days; n = 51). The COsynch-64 + CIDR protocol was reliable to use in dairy herds and provided reproductive advantages when compared to the others protocols. Keywords: Artificial insemination; COsynch + CIDR; Dairy cattle; Fertility; Ovsynch. VI

7 Trabalhos elaborados no âmbito da presente dissertação 1- Azevedo, C.; Canada, N; Maia, I; Comparison between different synchronization protocols and their reproductive efficiency on dairy cattle- a field study. XXVII World Buiatric Congress, 3 a 8 de Junho de 2012, Lisboa, Portugal 2- Azevedo, C.; Maia, I.; Canada, N.; Simões, J Comparison of fertility, regular returns to estrus and calving interval between Ovsynch, Ovsynch + CIDR and COsynch + CIDR protocols in dairy cows. Submetido a revista científica internacional com revisão por pares. VII

8 Índice geral Agradecimentos... IV Resumo... V Abstract... VI Índice geral... VIII Índice de figuras... X Índice de tabelas... XI Lista de siglas e abreviaturas... XII 1. Introdução Estratégias de sincronização da ovulação usando combinações de PGF2α e GnRH: o protocolo Ovsynch Evolução e modificações recentes do protocolo hormonal Ovsynch Taxa de sincronização Manipulação dos padrões de desenvolvimento folicular antes da GnRH-1 (Presynch-Ovsynch, Doublesynch, PG3G e G6G) Optimização do ambiente hormonal periovulatório (Heatsynch, HPG e GPH) Optimização do intervalo de tempo entre a PGF2α e a GnRH-2 e o momento da IA após a GnRH-2 (COsynch) Suplementação com progesterona antes da IA (Ovsynch+P4 e COsynch+P4) Redução do período de dominância folicular e aumento do proestro (COsynch 5d, COsynch +CIDR 5d) Controlo do crescimento folicular após a IATF (Resynch) A eficiência reprodutiva no contexto Português Objectivos Material e Métodos Caracterização das explorações e natureza da amostra Tratamentos efectuados e desenho do estudo Definições e classificação das variáveis Análise estatística Resultados Taxas de gestação, retorno regular ao estro e intervalo entre partos Outros efeitos observados sobre a taxa de gestação VIII

9 Intervalo entre o Parto e a IA Efeitos das estações do ano e dos meses Taxa de retenção do CIDR e corrimento vaginal Discussão Taxa de gestação à 1ª IA Retorno regular ao estro e taxa de gestação à 2ª IA Taxa de gestação global e intervalo entre partos Efeito dos meses na TG1ªIA Taxa de retenção do CIDR Efeito do corrimento vaginal após remoção do CIDR Conclusões e perspectivas futuras Referências..42 IX

10 Índice de figuras Fig. 1. Representação esquemática do protocolo Ovsynch 3 Fig. 2. Representação esquemática dos protocolos de pré-sincronização Presynch-Ovsynch (A), G6G (B), PG3G (C) e Double-Ovsynch (D)... 6 Fig. 3. Representação esquemática dos protocolos Heatsynch (A), HPG (B) e GPH (C)... 9 Fig. 4. Representação esquemática do protocolo COsynch Fig. 5. Dispositivo intravaginal libertador de progesterona em forma triangular e helicoidal, respectivamente Fig. 6. Dispositivo intravaginal libertador de progesterona em forma de T Fig. 7. Representação esquemática dos protocolos Ovsynch + CIDR (A) e COsynch + CIDR (B) Fig.8. Desenho experimental para os tratamentos B, C e D Fig. 9. Percentagem do somatório de animais gestantes à 1ª IA e com retorno regular ao estro e TG global de acordo com os tratamentos em estudo Fig. 10. Correlação entre o intervalo parto-1ª IA e a taxa de gestação à 1ª IA Fig. 11. Correlação entre o intervalo parto-ia e a taxa de gestação, após 2ª IA Fig. 12. Taxa de gestação à 1ª IA e temperaturas mensais distribuídas pelos meses do ano X

11 Índice de tabelas Tabela 1. Causas de eliminação de animais (n = 22) durante o ensaio 25 Tabela 2. Idade, paridade, produção leiteira, TG 1ª IA, intervalo entre parto e 1ª IA, taxa de refugos e intervalo médio entre partos de acordo com cada exploração Tabela 3. Idade, paridade, produção leiteira, intervalo entre parto e 1ªIA, taxa de refugos e intervalo médio entre partos de acordo com cada grupo em estudo XI

12 Lista de siglas e abreviaturas BRSV- Vírus sincicial respiratório bovino (do inglês, bovine respiratory syncytial virus ) BVD- Diarreia vírica bovina (do inglês, bovine viral diarrhea ) CIDR- Dispositivo intravaginal de libertação controlada de progesterona (do inglês, controlled internal drug release ) CL- Corpo lúteo E2- Estradiol g- Grama GnRH- Hormona libertadora de gonadotrofina (do inglês, gonadotropin releasing hormone ) h- Horas hcg- Gonadotrofina coriónica humana (do inglês, Human corionic gonadotropin ) IA- Inseminação artificial IATF- Inseminação artificial a tempo fixo IBR- Rinotraqueíte infecciosa bovina (do inglês, infectious bovine rhinotracheitis ) IEP- Intervalo entre partos im- Intramuscular IPV- Vulvo vaginite pustular infecciosa (do inglês, infectious pustular vulvo vaginites ) IP3- Vírus de parainfluenza bovina tipo 3 Kg- Quilograma LH- Hormona luteinizante (do inglês, luteinizing hormone ) mg- Miligrama mg/ml- Miligrama por mililitro MHz- Megahertz XII

13 ml- Mililitro ng/ml- Nanograma por mililitro º C- Graus centígrados P4- Progesterona PGF2α- Prostaglandina F2 alfa PRID- Dispositivo intravaginal libertador de progesterona (do inglês, progesterone release internal device ) RTM- Ração total misturada TC- Taxa de concepção TG- Taxa de gestação TG 1ª IA - Taxa de gestação à primeira inseminação TG 2ª IA - Taxa de gestação à segunda inseminação TG Global - Taxa de gestação global TR- Taxa refugo TR Infertilidade - Taxa de refugo por infertilidade TR Total - Taxa de refugo total TS- Taxa de sincronização μg/ml- Micrograma por mililitro XIII

14 1. Introdução A eficiência reprodutiva continua a ser um dos mais importantes factores a influenciar a rentabilidade das explorações de bovinos leiteiros. Nas últimas décadas, o aumento no consumo alimentar de matéria seca e na produção de leite por vaca tem sido concomitante com um declínio dramático na fertilidade de explorações leiteiras comerciais (Cutullic et al., 2012; Kawashima et al., 2012). Além disso, observa-se uma relação negativa entre a concentração circulante de progesterona (P4) e o consumo de matéria seca em vacas de leite (Rabiee et al., 2001, 2002), o qual por si origina um aumento de metabolismo hepático da P4 (Wiltbank et al., 2011). Esse reflexo negativo também se tem expressado por um período de maior inactividade ovulatória. Moreira et al. (2001) observaram que 23% das vacas de alta produção tinham níveis de P4 <1,0 ng/ml (animais em anestro) por volta dos 2 meses após o parto. A P4, e a sua manipulação, desempenham um papel fundamental na fertilidade das explorações leiteiras onde se pretende usar a inseminação artificial a tempo fixo (IATF), precedida de protocolos hormonais de indução e sincronização da ovulação (Wiltbank et al., 2011). Por outro lado, em efectivos leiteiros de alta produção e maneio intensivo, observa-se também uma associação negativa entre a alta produção de leite e a expressão comportamental do estro (Crowe e Williams, 2012; Cutullic et al., 2009, 2012). Todos estes factos, associados à produção moderna de leite de vacas altas produtoras, evidenciam a importância da utilização de protocolos hormonais eficazes na sincronização da ovulação associados à IATF como parte das estratégias envolvidas nos programas de controlo reprodutivo das explorações. Nesta revisão de literatura pretendeu-se sumarizar a evolução da aplicação de protocolos hormonais de sincronização da ovulação para IATF e o seu impacto na eficiência reprodutiva em explorações de bovinos leiteiros de alta produção.

15 1.1. Estratégias de sincronização da ovulação usando combinações de PGF2α e GnRH: o protocolo Ovsynch A nova geração de ferramentas de maneio reprodutivo sofreu desenvolvimentos recentes de forma a eliminar a detecção de estro e aumentar a eficiência de manipulação animal, concentrando-se no controlo do corpo lúteo (CL), em animais cíclicos, e da dinâmica folicular, resultando em protocolos económicos e práticos para sincronizar a ovulação (Lamb et al., 2010). O controlo do desenvolvimento folicular e da função lútea pode ser obtido mediante a administração combinada de prostaglandina F2α (PGF2α) e hormona libertadora de gonadotrofina (GnRH). Foram os estudos compreensivos de Pursley (Pursley et al., 1997a, 1997b) que permitiram o desenvolvimento do programa Ovsynch, que estaria na base da maioria dos programas de sincronização para IATF que surgiram desde então. No entanto, Macmillan (2010) lançou recentemente, através de um artigo de revisão, controvérsia sobre este assunto ao referir os estudos iniciais e trabalho de revisão conduzidos por Thatcher et al. (1989), como estando na base do desenvolvimento do programa Ovsynch. De facto, estes autores fazem referência a dados não publicados sobre a administração de GnRH, 7 dias antes da administração de PGF2α como forma de aumentar a precisão da sincronização do estro 2 a 3 dias após a administração da PGF2α, destacando a importância de controlo do CL e da dinâmica folicular ovárica num programa de sincronização de estro. Contudo, e tal como é referido num artigo de revisão muito recente por Wiltbank e Pursley (2014), a administração de GnRH antes e após a administração de PGF2α, nunca tinha sido antes combinada num protocolo completo de sincronização de ovulação. Em vacas de aptidão leiteira este protocolo sincroniza o desenvolvimento folicular, a regressão do CL e o momento da ovulação, permitindo a IATF sem recorrer a detecção do cio (Pursley et al., 1995, 1997a, 1997b). O programa Ovsynch (Fig. 1) assenta na combinação de três administrações hormonais em tempos predeterminados e com três objectivos predefinidos: a primeira administração de GnRH (GnRH-1) visa conseguir a ovulação do folículo dominante (presente em aproximadamente 70% dos casos) e emergência de uma nova onda folicular 1,5 a 2 dias depois (no caso desta primeira administração coincidir com os primeiros três dias de uma onda folicular 2

16 Aplicação do protocolo COsynch-64 + CIDR em vacass leiteiras espontânea, a ovulação não ocorre e a onda folicular segue o seu desenvolvimentoo normal com selecção de um folículo dominante nos 7 dias seguintes); a administração de PGF2α, 7 dias depois, tem como objectivo a indução de luteólise, permitindo o crescimento e maturação do folículo dominante; a administração de GnRH 48 horas depois (GnRH-2) (LH) resultando na ovula- permite cumprir o terceiro objectivo: a indução de um pico de hormona luteinizante ção do folículo dominante (pré-ovulatório) cerca de 28 horas após a administração da GnRH- et al., 2. A IATF é recomendada 16 a 20 horas após a administraçã ão de GnRH-2 (Pursley 1995). Fig. 1. Representação esquemática doo protocolo Ovsynch. Pursley et al. (1997b)) não encontraram diferenças estatisticamente significativas na taxa de gestação (TG) entre as vacas tratadas com Ovsynch e as vacas inseminadas após de- foi tecção do cio natural (38,9% e 37,8%, respectivamente; P> 0,05). 0 A mesma conclusão obtida por Rabiee et al. (2005) através dee uma meta-análise a 535 artigos publicados para ava- Os liar a eficácia do programa Ovsynch na performance reprodutiva de explorações leiteiras. resultados de ambos os estudos reforçaram a possibilidade da realização r de IATF sem neces- sidade de detecção do cio recorrendo ao protocolo Ovsynch Evolução e modificaçõess recentes do protocolo hormonal Ovsynch Desde o seu desenvolvimento, o protocolo hormonal Ovsynch O foii adoptado rápida e amplamente como ferramenta de programas de gestão reprodutiva com o objectivo de optimia zar a eficiência reprodutiva de explorações leiteiras. No entanto, embora aoo contornar neces- 3

17 sidade de detecção do cio este protocolo permita aumentar a taxa de submissão, a sua TG é similar à encontrada para inseminações artificiais (IA) após aquela detecção, não resultando numa melhoria directa da fertilidade (Pursley et al., 1997b; Rabiee et al., 2005). Desde o surgimento do Ovsynch, vários estudos foram realizados tentando aumentar a eficiência reprodutiva e originando diferentes protocolos (Moreira et al., 2001; Pancarci et al., 2002; Portaluppi e Stevenson, 2005): 1) Os que tentam manipular os padrões de desenvolvimento folicular antes da primeira administração de GnRH denominaram-se Presynch ; 2) Os que incluem a utilização de estradiol em substituição da GnRH-2 para aumentar a expressão do estro foram denominados Heatsynch, e se a IA coincide com a segunda administração de GnRH recebe a denominação de COsynch. Na sua meta-análise, em 2005, Rabiee et al. (2005) não encontraram, contudo, diferenças estatisticamente significativas na TG entre o Ovsynch clássico e as restantes variações do protocolo. De igual forma, e segundo Macmillan (2010) nenhum dos melhores programas de sincronização disponíveis tem alcançado consistentemente taxas de concepção (TC) que excedam os 40%. Estratégias de optimização do desenvolvimento folicular e da sincronização da ovulação têm sido desenvolvidas recentemente tentando melhorar a fertilidade destes protocolos face à IA após detecção do cio (Wiltbank et al., 2011). De facto, recentemente (McArt et al., 2010), surgiu o protocolo Ultrasynch em que a administração de PGF2α depende da prévia avaliação ecográfica (tamanho e eventualmente ecotextura) do CL quando presente. De destacar, no entanto, que a associação do protocolo Ovsynch, ou de alguma das suas variações, à IA após detecção do cio ( Select synch ) tem sido paralelamente investigada, principalmente em explorações onde aquela detecção seja mais eficiente (Rudolph et al., 2011). Mas para se compreender, exaustivamente, as modificações do protocolo Ovsynch e consequente melhoria da eficiência reprodutiva, torna-se necessário realçar a importância do conceito de taxa de sincronização (TS). 4

18 Taxa de sincronização No programa Ovsynch, a TS é definida como a percentagem de vacas tratadas onde a administração da GnRH-2 resulta na indução da ovulação. Em estudos iniciais foi observada uma TS após a administração da GnRH-2 de 100% (Pursley et al., 1995) enquanto em estudos posteriores foram observadas TS de 87% (Vasconcelos et al., 1999) e 81,1% (Galvão e Santos, 2010), sendo a elevada variabilidade da TS uma das principais limitações do protocolo. Esta variabilidade foi atribuída à fase do ciclo éstrico em que o protocolo é iniciado, sendo as principais causas de falha de sincronização: (1) inexistência de resposta ovulatória à administração da GnRH-1; (2) atrésia do folículo dominante antes da administração de PGF2α (como consequência da inexistência da resposta ovulatória inicial); e (3) luteólise espontânea entre a administração da GnRH-1 e a administração de PGF2α (Vasconcelos et al., 1999). Na realidade, a TS depende essencialmente da resposta ovulatória à administração da GnRH-1 e consequente emergência de uma nova onda folicular, sendo este o elemento crítico primário dos protocolos para IATF (Wiltbank et al., 2010) Manipulação dos padrões de desenvolvimento folicular antes da GnRH-1 (Presynch-Ovsynch, Doublesynch, PG3G e G6G) A primeira administração de GnRH a vacas de aptidão leiteira em fases aleatórias do ciclo éstrico resulta na ovulação de apenas 50 a 70% das vacas tratadas (Pursley et al., 1995; Galvão e Santos, 2010). As diferentes fases do ciclo éstrico possuem diferentes respostas ovulatórias, sendo mais elevada nos dias 5 a 9 do ciclo éstrico e mais reduzida na fase inicial e final do mesmo. Com base nesta premissa, vários estudos tentaram desenvolver estratégias de pré-sincronização tentando assegurar um folículo dominante maduro na primeira administração do protocolo. Um estudo publicado por Moreira et al. (2001) da Universidade da Florida serviu de base ao desenvolvimento do protocolo Presynch-Ovsynch (Fig. 2) que envolve a administração de duas doses de PGF2α com 14 dias de diferença e a iniciação do Ovsynch 12 dias 5

19 Aplicação do protocolo COsynch-64 + CIDR em vacass leiteiras depois. Ao aumentar o número de animais situados entre os diass 5 e 12 do ciclo éstrico (maior resposta ovulatória) à primeira administração de GnRH do protocolo ovsynch, este protocolo de pré-sincronização aumentou a TG dos animais pré-sincroni zados em comparaçãoo com os que apenas foram tratados com ovsynch como demonstraram os o trabalhoss de El-Zarkouny et al. (2004) (TG de 46,8% vs. 37,5%; P < 0,01) e de Moreira et al. (2001) em animais cíclicos (TG de 46.9 % vs. 34,4%; P <0,01). Num outro estudo (Navanukraw et al.., 2004), o intervalo i entre a segunda administração de PGF2αα e a primeira dose de GnRH G do Ovsynch foii aumen- pré- tado para 14 dias (Presynch-14), mantendo-se o impacto positivo sobre a TG nos animais sincronizados (49,6% vs. 37,3% para os animais tratados e não tratados comm Presynch respec- tivamente; P <0,05). A B C D Fig. 2. Representação esquemática dos protocolos de pré-sincronizaçãoo Presynch- Ovsynch (A), G6G (B), PG3G (C) e Double-Ovsynch (D). 6

20 Embora esta modificação ao Presynch-Ovsynch, ao permitir a administração das primeiras doses hormonais no mesmo dia da semana, seja mais popular entre os agricultores, Galvão et al. (2007) observaram uma melhoria na fertilidade ao reduzir o intervalo de 14 para 11 dias (Presynch-11). Contudo, num estudo subsequente, Stevenson (2011) não observou qualquer diferença (P> 0,05) no que concerne a luteólise (100% vs. 93%), a ovulação à GnRH-1 (61% vs. 62%), a ovulação à GnRH-2 (88% vs. 78%) ou TS (88% vs. 76%), os pontos-chave para uma melhoria na fertilidade das vacas tratadas com Presynch-COsynch em comparação com o grupo controlo (COsynch). Num estudo muito recente, Youssefi et al. (2013) associaram o uso do Presynch- Ovsynch a uma alteração no ratio de género dos fetos, com um aumento do número de machos nascidos de vacas tratadas (P <0,05). Essa alteração contudo, parece estar relacionada com o momento da inseminação após a administração da GnRH-2 (24 horas) que difere do grupo controlo (12 horas após a detecção de cio), não sendo resultado do efeito da présincronização. De facto, estes resultados vão de encontro aos observados por Pursley et al. (1998) para vacas sincronizadas com o protocolo Ovsynch, com um aumento do número de fêmeas nascidas de vacas cuja IATF foi realizada às 0 e 32 horas após a administração da GnRH-2, comparativamente com as vacas cuja IATF foi realizada às 8, 16 e 24 horas. Bello et al. (2006), da Universidade do Michigan, desenvolveram um novo protocolo de pré-sincronização com o objectivo de aumentar a percentagem de animais com resposta ovulatória à GnRH-1 do protocolo Ovsynch, ao qual atribuíram a designação G6G. Este protocolo consiste no uso combinado de uma administração de PGF2α seguida de uma administração de GnRH 2 dias depois, e 6 dias antes do início do Ovsynch, aumentando para 85% a percentagem de animais que ovulam após a GnRH-1 e consequentemente a TG comparativamente a animais não pré-sincronizados (vide Fig. 2). Num estudo recente, Ribeiro et al. (2011) avaliaram o uso do Presynch e G6G, e não encontram, de uma forma geral, melhoria na TS comparativamente ao grupo controlo. Stevenson e Pulley (2012) avaliaram uma modificação deste protocolo que denominaram PG3G (vide Fig. 2), o qual aumenta em um dia o intervalo entre a administração de PGF2α e GnRH e entre esta e o início do Ovsynch. Esta modificação aumentou a TG comparativamente aos animais com IA após detecção do cio nos meses mais frescos (46,8% vs. 7

21 35,8%; P <0,05) e comparativamente a um Presynch-10 (início do Ovsynch 10 dias após a segunda administração de PGF2α) nos meses de stress térmico (35,9% vs. 26,7%; P <0,05). Mais recentemente (Souza et al., 2008), surgiu um novo protocolo de présincronização denominado Double-Ovsynch que envolve a execução de dois protocolos Ovsynch consecutivos com um intervalo de 7 dias (vide Fig. 2), resultando numa superior TG comparativamente ao Presynch-Ovsynch (49,7% vs. 41,7%, P = 0,03). Estudos subsequentes (Giordano et al., 2012; Herlihy et al., 2012; Ayres et al., 2013) reportaram um aumento da TG para este protocolo devido a uma maior TS associada a dois factores: disponibilidade de um folículo dominante que ovulará após a terceira administração de GnRH e aumento dos níveis de progesterona anterior à administração de PGF2α. Também recentemente, um estudo levado a cabo por Astiz e Fargas (2013) em Espanha comparou os dois últimos métodos de pré-sincronização, G6G e Double-Ovsynch, reportando uma TG superior para o Double-Ovsynch em vacas primíparas comparativamente às multíparas (44,3% vs. 34,8%; P <0,05) e uma TG similar entre primíparas e multíparas para o protocolo G6G (34,7% vs. 34,8%; P> 0,05), sugerindo o protocolo Double-Ovsynch como mais adequado para primíparas e o protocolo G6G mais adequado para multíparas, uma vez que implica um menor número de dias até à IATF Optimização do ambiente hormonal periovulatório (Heatsynch, HPG e GPH) Segundo Dias et al. (2010), a administração exógena de GnRH induz uma libertação de LH de duração muito inferior à libertação endógena durante um estro natural. Já a substituição da GnRH-2 por uma formulação sintética de estradiol (E2) resulta numa libertação de LH de duração comparável à que ocorre durante o estro natural (Dias et al., 2010) e está na base de um Ovsynch modificado. Este protocolo recebeu o nome de Heatsynch (Fig. 3) uma vez que uma percentagem superior de animais demonstra cio em comparação com o Ovsynch, apesar de não haver um aumento consistente da TG nos estudos publicados (Pancarci et al., 2002; Stevenson et al., 2004; Blevins et al., 2006). O protocolo Heatsynch é apenas referido no contexto da presente dissertação, uma vez que o uso de estradiol em vacas de aptidão leiteira é proibido na União Europeia. Contudo, a 8

22 Aplicação do protocolo COsynch-64 + CIDR em vacass leiteiras observação de respostas semelhantes para as formas natural e sintética s de e estradiol no proto- muito colo Heatsynch, encontrada por investigadores da Universidade e de Utrecht num estudo recente (Andringa et al., 2013), chama a atenção para o possível uso destaa última formulação de estradiol, a qual não está associada a riscos para a saúde pública. Por outro lado, De Rensis et al. (2010) descreveram recentemente, num artigo de revisão, os benefícios da inclusão de uma outra hormona, a Gonadotrofina Coriónica Humana (hcg) em protocolos de sincronização dee ovulação em vacas emm lactação. Ao actuar nas célu- ao las ováricas independentemente da glândula pituitária com umm efeito de duração superior provocado pela libertação endógena de LH, a sua utilização na subfertilidade de vacas de alta produção parece promissora. A inclusão de hcg em substituição da primeira ou da segunda administração de GnRH do protocolo Ovsynch recebeu a denominação de HPG ou GPH respectivamente (vide Fig. 3), havendo no entanto alguma inconsistência de resultados entre os artigos referenciados por aqueles investigadores. A B C Fig. 3. Representação esquemática dos protocolos Heatsynch (A), HPG (B) e GPH (C). 9

23 Aplicação do protocolo COsynch-64 + CIDR em vacass leiteiras Optimização do intervalo de tempo entre a PGF2α e a GnRH-2 e o momento da IA após a GnRH-2 (COsynch) Após o desenvolvimento do Ovsynch, um estudo foi desenhado (Pursley et al., 1998) com o objectivo de investigarr o intervaloo de tempo óptimo, neste protocolo, entre a adminis- tração da GnRH-2 e a IATF. Fazendo variar esse intervalo entre as 0 e as 32 h, os resultados sugeriram um intervalo ideal de 16 h entre a GnRH-2 (administrada 48 h após a PGF2α) e a IATF. Com o objectivo de maximizar a rentabilização do tempo e mão-de-obra, foram reali- de zados estudos por DeJarnette e Marshalll (2003) para avaliar o impacto da administração GnRH-2 em simultâneo com a IATF em vacas em lactação. Embora, segundo estes investiga- quando a dores, estes estudos iniciais pudessem sugerir a possibilidad de de TG inferiores GnRH-2 e IATF eram realizadas h após a PGF2α, um estudo posterior (Portaluppi e Stevenson, 2005) em 665 vacas em lactação pré-sincronizadas, indicou quee atrasar a GnRH-2, fazendo-a coincidir com a IATF poderiaa optimizar a maturidade do folículo dominante pré- de ovulatório resultando numa melhor TG. A este protocolo foi f atribuída a designação COsynch (Fig. 4), recebendo uma designação numérica diferente consoante o número de horas de intervalo entre a administração de PGF2α e a IATF (ex.: COsynch-48, COsynch-72, etc.). Fig. 4. Representação esquemática doo protocolo COsynch. Num estudo posterior, Sterry et al. (2007) não encontraram diferenças na taxaa de ges- tação/ia entre um COsynch-48 (29%) e um COsynch-72 (33%;; P> 0,05). Rabiee et al. (2005) 10

24 também concluíram, na sua meta-análise, não existirem diferenças na TG para este protocolo em comparação com o Ovsynch clássico. Considerando a rentabilização de tempo e mão-deobra que pode permitir, o COsynch assume-se como uma alternativa prática ao Ovsynch. Adicionalmente, investigadores da Universidade do Wisconsin (Brusveen et al., 2008) encontraram evidências de uma vantagem clara em administrar a GnRH-2 56 horas após a administração de PGF2α (TG de 38,6%), provavelmente devido a uma optimização da sincronização da ovulação em relação à IATF Suplementação com progesterona antes da IA (Ovsynch +P4 e COsynch +P4) Vários estudos (Inskeep, 2004; Wiltbank et al., 2011) têm documentado uma relação entre a concentração circulante de P4 pré-iatf e a fertilidade subsequente, sendo necessário assegurar altos níveis circulantes de progesterona antes da IA para maximizar a fertilidade da vaca de leite. Com base no conhecimento de que vacas alta produção leiteira apresentam baixas concentrações circulantes de P4 (Pursley e Martins, 2011; Hutchinson et al., 2012), a utilização de dispositivos intravaginais apresenta-se como uma forma prática e simples de suplementação desta hormona. Existem actualmente no mercado três tipos de dispositivo intravaginal libertador de P4 que variam na forma e quantidade que libertam: (1) PRID (forma helicoidal, 1,55 g de progesterona, CEVA; França; Fig. 5); (2) PRID-Delta (forma triangular, 1,55 g de progesterona, CEVA; França; vide Fig. 5); e (3) CIDR (forma de T, 1,38 g de progesterona, ZOETIS; Bélgica; Fig. 6). Estes dispositivos apresentam uma taxa de retenção intravaginal que oscila entre 88 e 97% (Roche, 1976; Walsh et al., 2007b, 2008), e apesar de poderem provocar vaginite com corrimento purulento copioso em 5-8% das vacas tratadas (Walsh et al., 2007b, 2008), não existe evidência de que esta reacção vaginal tenha um impacto negativo sobre a fertilidade subsequente (Villarroel et al., 2004; Walsh et al., 2007b). 11

25 Aplicação do protocolo COsynch-64 + CIDR em vacass leiteiras Fig. 5. Dispositivo intravaginal libertador l dee progesterona em formaa triangular e helicoidal, respectivamente. (Fonte: fotografias gentilmente cedidas pela CEVA, Santé Animale). A Fig. 6. Dispositivo intravaginal libertador de progesterona a em forma de T. (Fonte: Estratégias recentes incluem a suplementação de P4 intravaginal como parte de proto- (Me- colos de sincronização clássicos para IATF, como o Ovsynch (Fig. 7). Vários estudos lendez et al., 2006; Stevensonn et al., 2006, 2008; Colazo et al., 2013) têm m demonstrado o seu efeito no aumento da eficiência reprodutiva em efectivos leiteiros. A suplementação de P4 durante um protocolo Ovsynch (Ovsynchh + CIDR; Fig. 7) resulta numa melhoria da TG com- parativamente ao Ovsynch clássico, quando existe um número elevado dee vacas não cíclicas (El-Zarkouny et al., 2004) ou naquelas vacas com níveis baixos de P4 circulante antes da ad- ministração de PGF2α (Stevenson et al.., 2006). De facto, ao aumentar os níveis de P4 em vacas com baixos níveis desta hormona,, anteriores à administração de PGF2α, é observado um efeito positivo sobre a fertilidade naa inseminação subsequente. Estes níveis elevados de 12

26 Aplicação do protocolo COsynch-64 + CIDR em vacass leiteiras P4 durante o desenvolvimento folicular reduzem a selecção de d folículos co-dominantes e a dupla ovulação, resultando numa melhoria da fertilidade (Wiltbank et al., 2010). Recentemente, Lima ett al. (2011) observaram que novilhas da raça Holstein apresenta- ram TG similares quando era ou não administrada a GnRH-1 (49,8% vs. 50%, P> 0,05), sugepode não rindo o seu estudo que, pelo menos em vacas leiteiras nulíparas, aquela 1ª aplicação ser de todo necessária mesmo quando o CIDR permanece somente durante 5 dias. A B Fig. 7. Representação esquemática dos protocolos Ovsynch + CIDR (A) e COsynch + CIDR (B). A adição de um dispositivo intravaginal de P4 ao protocolo COsynch também resultou em melhores TG em vacas de carne não cíclicas (Lamb et al., 2010; Echternkamp e Thallman, 2011). Este protocolo exige uma menor manipulação das vacass em comparação com o Ovsy- Ao nch, aumentando assim a eficiência do trabalho e reduzindo o risco de incumprimento. aumentar a complexidade de um programa de sincronização para p IATF, aumenta também o risco de incumprimento da totalidade do programa. Um dos principais factores que afectam o sucesso de um programa é a taxa de cumprimento que pode, por vezes, ser inferior a 70% 13

27 (Macmillan, 2010). O COsynch + CIDR é o protocolo de IATF recomendado para uso em vacas de carne pela American Beef Reproduction Task Force (Lamb et al., 2010). Embora, estudos recentes tenham avaliado o impacto do protocolo COsynch + CIDR em vacas de aptidão leiteira (Bartolome et al., 2009; Chebel et al., 2010; McDougall, 2010; Stevenson, 2011; Denicol et al., 2012), nenhum estudo comparou ainda a eficiência reprodutiva deste protocolo com a do protocolo Ovsynch + CIDR em vacas estabuladas de aptidão leiteira. Ao conjugar (1) a não necessidade de detecção do cio; (2) a maximização da eficiência do trabalho e minimização do risco de incumprimento com um máximo de três manipulações do animal; e (3) a eficiência em vacas cíclicas e não cíclicas; este protocolo assume-se como promissor para optimizar a eficiência reprodutiva das vacas de aptidão leiteira Redução do período de dominância folicular e aumento do proestro (COsynch 5d e COsynch +CIDR 5d) Recentemente (Bridges et al., 2008), a redução do período de dominância folicular em vacas de carne foi avaliada como estratégia para aumentar a eficiência reprodutiva. A redução de 7 para 5 dias do intervalo entre a primeira administração de GnRH e a administração de PGF2α do protocolo Ovsynch associada a um aumento do proestro (correspondente a um aumento do intervalo entre PGF2α e a segunda administração de GnRH para 72h) resultou numa melhoria da fertilidade, com diferenças de TG superiores a 9% (P <0,05). Mais recentemente, um estudo similar (Santos et al., 2010) em vacas de aptidão leiteira apresentou resultados promissores evidenciando uma melhoria significativa na TG para o protocolo de 5 dias (COsynch 5d) comparativamente ao protocolo de 7 dias (37,9% vs. 30,9%; P <0,05). Num estudo publicado em 2013 (Yilmazbas-Mecitoglu et al., 2013), a redução do intervalo para 6 dias resultou num aumento da TS mas numa inesperada redução da TG. Apesar de parecer provável que protocolos que combinem uma redução na duração da dominância folicular e pró-estro mais longo resultem numa melhoria da fertilidade em vacas em lactação, estudos adicionais são necessários para confirmar a consistência destes resultados (Wiltbank et al., 2010). 14

28 De destacar que, recentemente, a suplementação de progesterona num COsynch-72 5d (COsynch + CIDR 5d) foi testada em novilhas de aptidão leiteira, apresentando maior fertilidade (TG) face ao Ovsynch-56 + CIDR 5d (Lima et al., 2011), ou mesmo a um COsynch + CIDR (Lopes et al., 2013) ou a um COsynch + CIDR modificado (Mellieon et al., 2012) Controlo do crescimento folicular após a IATF (Resynch) Para manter a eficiência reprodutiva, é essencial que as vacas não gestantes ao primeiro serviço sejam re-inseminadas o mais rapidamente possível. A ressincronização da ovulação para vacas determinadas como não gestantes após a IATF recebe o nome de Resynch e pode envolver qualquer um dos protocolos acima referidos, sendo o objectivo principal reduzir o intervalo entre inseminações (Galvão et al., 2007). O intervalo entre a 1ª e 2ª IATF pode variar entre 3 a 8 semanas dependendo do método disponível para diagnóstico de gestação (método químico, ecografia ou palpação transrectal) e da rapidez do programa de ressincronização (Silva et al., 2009; Green et al., 2010). As estratégias de ressincronização mais recentes incluem métodos químicos de diagnóstico de gestação precoce (i.e., serum pregnancy-associated glycoprotein e serum pregnancy-specific protein B) combinados com programas de ressincronização rápidos e eficientes, normalmente envolvendo a primeira administração de GnRH, 7 dias antes do diagnóstico de gestação. De facto, recentemente, investigadores da Universidade do Missouri (Green et al., 2010) concluíram que é possível programar a ressincronização da IATF 21 dias após a primeira IATF, combinando um teste químico de diagnóstico de gestação aos 18 dias e um programa rápido de ressincronização. Contudo, estes mesmos investigadores referem que a complexidade do procedimento para diagnóstico de gestação limita a sua aplicação prática. Este estudo, apesar de promissor, apresentou várias limitações: (1) foi efectuado em novilhas e não em vacas em lactação; (2) não avaliou a relação custo-eficácia do procedimento; e (3) não incluiu a inexactidão do método de diagnóstico na determinação de vacas não gestantes. O valor económico de qualquer teste de diagnóstico de gestação deve depender da sua precisão em identificar com fiabilidade animais não gestantes e do seu custo. Um estudo realizado por investigadores da Universidade de Wisconsin (Giordano et al., 2013) comparou as 15

29 perdas económicas resultantes da inexactidão do diagnóstico de gestação em estratégias de ressincronização que incluíram um método químico (serum pregnancy-associated glycoprotein) de diagnóstico precoce de gestação, com os métodos clássicos de diagnóstico: palpação e ultra-sonografia transrectal. Estes investigadores observaram diferenças económicas inferiores para o método químico em comparação com o diagnóstico de gestação precoce pelos métodos clássicos A eficiência reprodutiva no contexto Português Dados disponíveis sobre índices de eficiência reprodutiva no norte de Portugal (Rocha et al., 2001) apontam uma taxa de detecção de cio muito baixa (38%) como o principal problema impedindo um aumento na eficiência reprodutiva. Num estudo posterior realizado na mesma região (Rocha et al, 2010), onde foi avaliada a evolução temporal de diversos parâmetros de fertilidade para vacas nascidas entre 1992 e 2002, os resultados demonstraram uma diminuição trimestral de 0,3% (P <0,05) da taxa de não retorno (ao estro) aos 90 dias assim como da taxa de partos após a 1ª IA. Também a taxa de detecção de cio diminui 0,13% ao ano e os intervalos parto-concepção à 1ª IA e parto-concepção aumentaram 0,17 e 0,07 dias por ano, originando uma deterioração lenta, mas significativa dos parâmetros de eficiência reprodutiva. Em contraste com os países do norte da Europa (Refsdal, 2007), em países de clima temperado do sul da Europa, como Portugal, a função ovárica e a fertilidade são prejudicadas de forma dramática pelo stress térmico nos períodos quentes (García-Ispierto et al., 2007; Yániz et al., 2008). Além disso, outros factores ambientais, incluindo o mau maneio alimentar e estabulação em piso de cimento poderão contribuir, nesses países, para a alta incidência de doenças de produção, tais como claudicação grave, mastite e infecções uterinas que afectam negativamente os parâmetros reprodutivos (Barros et al, 2012). Na verdade, o efeito adverso sobre a fertilidade associado com a selecção genética para a produção de leite não está apenas relacionado com a alta produção de leite, mas também com o aumento da incidência de doenças induzidas pelo stress associado a essas altas produções (Crowe and Williams, 2012). 16

30 A implementação de programas de sincronização para IATF como parte de práticas de maneio reprodutivo programado é apontada como solução para superar as baixas taxas de detecção do cio e aumentar a eficiência do trabalho (Rocha et al., 2010). Estando bem documentado o efeito negativo do stress térmico sobre os níveis de progesterona circulante (De Rensis e Scaramuzzi, 2003) e sobre a expressão de estro (Collier et al., 2006), é lógico pensar que a suplementação intravaginal de progesterona em protocolos de sincronização para IATF nos meses quentes melhoraria a performance reprodutiva de vacas de aptidão leiteira em países com clima temperado como Portugal, facto que tem sido comprovado em estudos recentes na Península Ibérica (Garcia-Ispierto et al., 2013). Contudo, a escassez de dados publicados em publicações internacionais reconhecidas sobre a utilização destes protocolos de sincronização para IATF, não permite tirar conclusões sobre a mais-valia da sua implementação na especificidade das explorações leiteiras comerciais Portuguesas. 17

31 2. Objectivos O principal objectivo deste trabalho foi determinar a influência de um protocolo hormonal de indução de estro/ovulação (COsynch + CIDR), usado em bovinos de aptidão de carne, em diversos parâmetros reprodutivos de vacas de alta produção leiteira; e compará-lo com outros 2 protocolos (Ovsynch e Ovsynch + CIDR) comummente usados neste tipo de explorações. Especificamente, para cada protocolo/grupo em estudo, pretendeu-se determinar e comparar: 1- A TG à 1ª e 2ª IA, assim como a TG global (1-2ª IA); 2- A taxa de retorno regular ao estro dos animais não gestantes; 3- O intervalo entre partos. Secundariamente, pretendeu-se: 1- Estimar a taxa de fertilidade à 1ª IA e global a partir do intervalo parto-ia, nas explorações em estudo. 2- Determinar a influência do intervalo parto-ia, das estações do ano e dos meses nas taxas de gestação; 3- Determinar a ocorrência de descargas vaginais por colocação dos dispositivos intravaginais e a taxa de retenção do mesmo. 18

32 3. Material e Métodos 3.1. Caracterização das explorações e natureza da amostra O estudo foi realizado no período compreendido entre Abril de 2009 e Março de 2010, em seis explorações leiteiras comerciais situadas no noroeste de Portugal, constituídas na totalidade por vacas da raça Holstein-Frísia. Nestas vacarias, e durante o período em estudo, ocorreu uma variação entre 60 a 80 vacas, as quais eram ordenhadas duas vezes ao dia. A produção leiteira aos 305 dias variou aproximadamente de a Kg, entre as seis explorações, de acordo com os dados obtidos pela Associação Nacional para o Melhoramento dos Bovinos Leiteiros (ANABLE; Os animais encontravam-se confinados em regime de semi-estabulação durante todo o ano, e cujas estruturas, cobertas, eram constituídas por piso em cimento riscado. O arejamento era facilitado pelo tecto em chaminé e por ventiladores que ligavam automaticamente a partir dos 24ºC. A alimentação base, distribuída duas vezes ao dia sob forma de ração total misturada (RTM) com recurso a sistema Unifeed, era composta por palha de trigo, silagem de milho e concentrado a maior parte do ano, assim como silagem de erva durante o inverno e início da primavera. Globalmente, nas seis explorações, a RTM consistiu em 61,8 ± 0,9% (± DP; n=6) de foragem e 38.2 ± 0.9% de alimento concentrado, ambos medidos em percentagem de matéria seca, a qual estava balanceada para uma produção leiteira diária entre 26 a 28 Kg de leite. A RTM era distribuída ad libitum. Vacas com produção leiteira diária acima dos 28 Kg foram individualmente suplementadas com alimento concentrado de acordo com o diferencial de produção apresentado. O plano vacinal, nas seis explorações, incluiu a vacinação semestral para prevenção da diarreia vírica bovina (BVD), rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR), parainfluenza (IP3), vulvovaginite pustular infecciosa (IPV) e vírus sincicial respiratório bovino (BRSV) com a administração de uma vacina tetravalente (HipraBovis 4; HIPRA, Espanha). 19

33 3.2. Tratamentos efectuados e desenho do estudo Um total de 288 vacas sem alterações clínicas ao exame ecográfico do trato reprodutivo, e a partir do dia 40º pós-parto, foram aleatoriamente seleccionadas para receber um dos três tratamentos (Fig. 8). Vacas seleccionadas para o grupo A (grupo controlo; n = 72) não receberam qualquer tratamento e foram inseminadas após a detecção de cio. Durante a visita de rotina seguinte, a última vaca inseminada (IA) após a detecção de cio natural foi escolhida para este grupo. Vacas seleccionadas para o grupo B (tratamento Ovsynch-64; n = 72) receberam o protocolo Ovsynch. Este protocolo foi constituído por duas administrações de 10 μg (i.m.) de acetato de buserelina, análogo sintético da GnRH (2,5 ml; Receptal, MSD Saúde Animal, Alemanha) administradas 7 dias antes e 48 horas depois de uma administração (i.m.) correspondente a 25 mg de PGF2α (5 ml de dinoprost trometamina a 5mg/ml - Dinolitic ; Zoetis; Bélgica; ou 2,5 ml de cloprostenol de sódio a 263 μg/ml - Estrumate ; MSD Saúde Animal; Alemanha), seguida de IATF 16 horas após a segunda administração de GnRH. Grupo B GnRH PG2α GnRH 48 h h IATF Grupo C GnRH PG2α GnRH 48 h 0 7 CIDR (1.38 g) 9 16 h IATF Grupo D GnRH PG2α GnRH + IATF 64 h 0 7 CIDR (1.38 g) Fig.8. Desenho experimental para os tratamentos B, C e D. 20

34 Vacas seleccionadas para o grupo C (tratamento Ovsynch-64 + CIDR; n = 72) receberam o protocolo Ovsynch ao qual se adicionou um dispositivo intravaginal de libertação controlada contendo 1,38 g de progesterona (CIDR dispositivo intravaginal para bovinos, 1,38 g de progesterona, Zoetis, Bélgica) inserido durante 7 dias, aplicado no momento da primeira administração de GnRH. O dispositivo intravaginal foi removido imediatamente antes da administração de PGF2α. Vacas seleccionadas para o grupo D (tratamento COsynch-64 + CIDR; n = 72) receberam o protocolo COsynch + CIDR. Este protocolo é muito semelhante ao protocolo C, mas a GnRH-2 é administrada no momento da IATF, i.e., 64 horas após a remoção do CIDR e administração de PGF2α. A validação de qualquer dos tratamentos requereu a conclusão da totalidade do protocolo. Sempre que o protocolo não foi concluído, o tratamento não foi considerado válido e as vacas retiradas do estudo. De igual forma, foram retirados do estudo os animais cujo refugo (venda ou morte) tenha acontecido antes do registo de retorno ao cio ou da realização do diagnóstico de gestação. A colocação do dispositivo era precedida da aplicação de uma solução cutânea de iodopovidona a 4% (Betadine Espuma, Meda Pharma, Portugal) sobre o mesmo e sobre a vulva, servindo simultaneamente os propósitos de desinfecção e lubrificação. A retenção do dispositivo intravaginal durante os 7 dias do protocolo hormonal foi registada para os animais dos grupos C e D que concluíram o protocolo hormonal. No momento da retirada do dispositivo intravaginal foi registado, em cada vaca dos grupos C e D, a presença ou ausência de corrimentos vaginais presumivelmente provocados por aquele. As inseminações foram realizadas por inseminadores experientes (n = 3) da cooperativa local (Proleite- Coop.Agricola Produtores de Leite do Centro Litoral, C.R.L) a pedido de cada produtor. Foi realizada uma rotação semanal dos seus percursos, resultando num processo aleatório na escolha das explorações para cada inseminador. Em nenhuma das explorações existia touro para cobrição natural, dependendo na totalidade de IA. 21