COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, version 2.0

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1 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, version 2.0 PARA UTILIZAÇÃO EM DIAGNÓSTICO IN VITRO. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HI2CAP 48 Tests P/N: HIV-1 Test, v2.0 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan PG WR 5.1 Liters P/N: Wash Reagent UTILIZAÇÃO PRETENDIDA O Teste COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, versão 2.0 (v2.0) é um teste de amplificação de ácidos nucleicos in vitro destinado à quantificação do ARN do Vírus da Imunodeficiência Humana Tipo 1 (HIV-1), no plasma humano, utilizando o Equipamento COBAS AmpliPrep para processamento automatizado das amostras e do Analisador COBAS TaqMan ou Analisador COBAS TaqMan 48 para amplificação e detecção automatizadas. O teste permite determinar quantitativamente o ARN do HIV-1 numa concentração de 20 a cópias/ml (33 a 1,67 x 10 7 Unidades Internacionais/ml). Uma cópia de ARN do HIV-1 é equivalente a 1,67 Unidades Internacionais (UI), com base no 1 º Padrão Internacional da OMS para o ARN do HIV-1 para técnicas baseadas no ácido nucleico (NAT) (NIBSC 97/656) 36. Este teste destina-se a ser utilizado em conjunto com a apresentação clínica e com outros marcadores laboratoriais indicadores da progressão da doença, para o tratamento clínico de doentes infectados pelo HIV-1 grupo M e HIV-1 grupo O. O teste pode ser utilizado para avaliar o prognóstico do doente, determinando o nível de ARN do HIV-1 da linha de base, ou para monitorizar os efeitos da terapêutica antiretroviral, determinando as alterações dos níveis de ARN do HIV-1 em plasma EDTA durante o tratamento antiretroviral. O Teste COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 não se destina a ser utilizado como um teste de rastreio para a presença do HIV-1 no sangue ou em produtos derivados do sangue, nem como um teste de diagnóstico para confirmar a presença de infecção pelo HIV-1. RESUMO E EXPLICAÇÃO DO TESTE O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) é o agente etiológico do Síndroma de Imunodeficiência Adquirida (SIDA) 1-3. A infecção por HIV pode ser transmitida por contacto sexual, exposição a sangue infectado ou a produtos derivados do sangue infectados, ou por uma mãe infectada ao feto 4. Três a seis semanas após a exposição ao HIV, os indivíduos infectados desenvolvem geralmente um síndroma agudo e de curta duração, caracterizado por sintomas do tipo gripal e associado a elevados níveis de viremia no sangue periférico 5-8. Na maioria dos indivíduos infectados, isto é seguido por uma resposta imunitária específica do HIV e por um declínio da viremia plasmática, geralmente quatro a seis semanas após o início dos sintomas 9,10. Após a seroconversão, os indivíduos infectados entram tipicamente numa fase assintomática e clinicamente estável, que pode ter a duração de vários anos O período assintomático caracteriza-se por níveis de viremia plasmática baixos e persistentes 14 e por uma depleção gradual dos linfócitos T CD4 +, o que acaba por originar uma imunodeficiência grave, desenvolvimento de várias infecções oportunistas, de doenças malignas e a morte 15. Embora os níveis de vírus no sangue periférico sejam relativamente baixos durante a fase assintomática da infecção, a replicação e depuração virais são aparentemente processos dinâmicos, nos quais as taxas elevadas de produção de vírus e de infecção de células CD4 + são contrabalançadas por taxas igualmente elevadas de depuração de vírus, morte das células infectadas e reabastecimento das células CD4 +, traduzindo-se em níveis relativamente estáveis de viremia plasmática e de células CD A secção Informação de Revisão do Documento encontra-se no final deste documento PT 1 Doc Rev. 10.0

2 As determinações quantitativas de viremia por HIV no sangue periférico mostraram que níveis de vírus elevados se podem correlacionar com um aumento do risco de progressão clínica da doença por HIV, e que reduções dos níveis plasmáticos de vírus se podem associar a uma diminuição do risco de progressão clínica Os níveis de vírus no sangue periférico podem ser quantificados através da determinação do antigénio p24 do HIV no soro, por cultura quantitativa do HIV plasmático ou por determinação directa do ARN viral no plasma, utilizando tecnologias de amplificação de ácidos nucleicos ou de amplificação de sinal O antigénio p24 é a principal proteína do núcleo do HIV, sendo detectado no soro, livre ou fixo ao anticorpo anti-p24. O antigénio p24 livre pode ser determinado por intermédio de imuno-ensaios enzimáticos (IEE) disponíveis no mercado, embora a utilidade do antigénio p24 como marcador de carga viral seja limitada em virtude do facto deste antigénio só ser detectável em apenas 20% dos doentes assintomáticos e em apenas 40 a 50% dos doentes sintomáticos. A utilização de procedimentos para dissociar os complexos antigénio-anticorpo melhoram a sensibilidade dos testes do antigénio p24, mas a proteína viral permanece indetectável na maioria dos doentes assintomáticos 22. O HIV infeccioso presente no plasma pode ser cultivado por inoculação em células mononucleares activadas do sangue periférico (PBMC) de dadores normais. A quantificação é conseguida inoculando PBMC com diluições sucessivas da amostra plasmática. A cultura quantitativa apresenta uma utilidade limitada para monitorização dos níveis de vírus em indivíduos infectados, dado que só uma pequena fracção das partículas virais é infecciosa in vitro. O vírus infeccioso é frequentemente indetectável em indivíduos assintomáticos 22. No plasma, o ARN do HIV pode ser quantificado através de tecnologias de amplificação de ácidos nucleicos, como é o caso da Reacção de Polimerização em Cadeia (PCR - Polymerase Chain Reaction) O Teste COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 utiliza a tecnologia de PCR para atingir uma sensibilidade e limites dinâmicos máximos na detecção quantitativa do ARN do HIV-1 em plasma anticoagulado com EDTA. PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO O Teste COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 é um teste de amplificação de ácidos nucleicos destinado à quantificação do ARN do Vírus da Imunodeficiência Humana Tipo 1 (HIV-1) no plasma humano. O Teste COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 baseia-se em três processos principais: (1) preparação da amostra para isolar ARN do HIV-1; (2) transcrição reversa do ARN alvo para produzir ADN complementar (cadn); e (3) amplificação simultânea por PCR do cadn alvo e detecção de sonda de detecção oligonucleotídica duplamente marcada e clivada específica do alvo. O Teste COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 permite a preparação automatizada das amostras, seguida de transcrição reversa, amplificação por PCR e detecção automatizadas do ARN alvo do HIV-1 e do Armored RNA do Padrão de Quantificação (PQ) do HIV-1. O reagente de Mistura Principal contém iniciadores e sondas específicos para o ARN do HIV-1 e para o ARN do PQ do HIV-1. A Mistura Principal foi desenvolvida para assegurar a quantificação equivalente dos subtipos do grupo M do HIV-1 e grupo O do HIV-1. A detecção de ADN amplificado é efectuada utilizando sondas oligonucleotídicas duplamente marcadas específicas do alvo e do PQ, que permite a identificação independente do amplicon do HIV-1 e do amplicon do PQ do HIV-1. A quantificação do ARN viral do HIV-1 é realizada utilizando o Padrão de Quantificação (PQ) do HIV-1. Compensa os efeitos de inibição e controla os processos de preparação e amplificação, permitindo uma quantificação mais rigorosa do ARN do HIV-1 presente em cada amostra. O PQ do HIV-1 é uma estrutura de Armored RNA não infecciosa que contém as sequências de HIV com locais de ligação ao iniciador idênticos aos do ARN alvo do HIV-1 e uma região única de ligação da sonda que permite que o amplicon do PQ do HIV-1 se distinga do amplicon alvo do HIV PT 2 Doc Rev. 10.0

3 O PQ do HIV-1 é incorporado em cada amostra a um número conhecido de cópias e é submetido aos passos subsequentes de preparação da amostra, transcrição reversa, amplificação por PCR simultânea e detecção das sondas de detecção oligonucleotídicas duplamente marcadas e clivadas. O Analisador COBAS TaqMan ou o Analisador COBAS TaqMan 48 calcula a concentração de ARN do HIV-1 presente nas amostras de teste comparando o sinal do HIV-1 com o sinal do PQ do HIV-1 em cada amostra e controlo. Selecção do alvo A selecção da sequência de ARN alvo do HIV-1 depende da identificação de regiões dentro do genoma do HIV-1 que apresentam uma conservação máxima da sequência entre as amostras dos vários subtipos de HIV-1 do grupo M e amostras de HIV-1 do grupo O. De modo a considerar a alta variabilidade genética do vírus, são visadas simultaneamente duas regiões do genoma do HIV para amplificação e detecção pelo Teste COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0. Sondas oligonucleotídicas duplamente marcadas, das quais duas são específicas para o alvo e uma é específica para o PQ, permitem a identificação independente do amplicon do HIV-1 e do amplicon do PQ do HIV-1. Por conseguinte, a selecção adequada dos iniciadores e da sonda de detecção oligonucleotídica duplamente marcada é essencial para que o teste tenha capacidade para amplificar e detectar os subtipos do grupo M do HIV-1 e grupo O do HIV-1. O Teste COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 utiliza transcrição reversa e iniciadores de amplificação por PCR para definir sequências dentro das regiões altamente conservadas do gene 32 gag do HIV-1 e da região LTR do HIV-1. Preparação de Amostras O Teste COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 utiliza a preparação de amostras automatizada com o Equipamento COBAS AmpliPrep através de uma técnica genérica de captura à base de sílica. O procedimento processa 850 μl de plasma. As partículas virais de HIV-1 são lisadas por incubação a temperatura elevada com uma protease e tampão caotrópico de lise/ligação, que liberta ácidos nucleicos e protege o ARN do HIV-1 libertado das RNases no plasma. Introduz-se a protease e um número conhecido de moléculas de Armored RNA do PQ do HIV-1 em cada amostra, em conjunto com o reagente de lise e partículas magnéticas de vidro. Subsequentemente, a mistura é incubada e o ARN do HIV-1 e o ARN do PQ do HIV-1 ligam-se à superfície das partículas de vidro. As substâncias não ligadas, como sais, proteínas e outras impurezas celulares, são removidas lavando as partículas magnéticas de vidro. Depois da separação das partículas de vidro magnéticas e conclusão dos passos de lavagem, os ácidos nucleicos adsorvidos são eluídos a uma temperatura elevada com uma solução aquosa. A amostra processada, contendo as partículas magnéticas de vidro, assim como o ARN do HIV-1 e o ARN do PQ do HIV-1 libertados, é adicionada à mistura de amplificação e transferida para o Analisador COBAS TaqMan ou o Analisador COBAS TaqMan 48. O ARN alvo do HIV-1 e o ARN do PQ do HIV-1 são depois sujeitos a transcrição reversa, amplificação e detecção simultâneas por clivagem de uma sonda oligonucleotídica duplamente marcada específica de dois alvos e específica do PQ. Transcrição Reversa e Amplificação por PCR A reacção de transcrição reversa e amplificação por PCR é efectuada com a enzima termoestável recombinante Thermus specie Z05 de Polimerase do ADN (Z05). Na presença de manganês (Mn 2+ ) e sob condições de tamponamento adequadas, a Z05 apresenta uma actividade simultaneamente de transcriptase reversa e de polimerase do ADN 30,31. Isto permite que a transcrição reversa e a amplificação por PCR ocorram em conjunto com a detecção em tempo real do amplicon. As amostras processadas são adicionadas à mistura de amplificação em tubos de amplificação (tubos-k) nos quais têm lugar a transcrição reversa e a amplificação por PCR. A mistura de reacção é aquecida para permitir que os iniciadores a jusante se liguem especificamente ao ARN alvo do HIV-1 e ao ARN do PQ do HIV-1. Na presença de Mn 2+ e de trifosfatos de desoxinucleósidos em excesso (dntps), incluindo trifosfatos de desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxicitidina e desoxiuridina, a polimerase Z05 alonga os iniciadores ligados, dando origem a cadeias de ADN complementares do ARN alvo PT 3 Doc Rev. 10.0

4 Amplificação do Alvo As amostras processadas são adicionadas à mistura de amplificação em tubos de amplificação (tubos-k) nos quais ocorre a amplificação por PCR. Após a transcrição reversa do ARN alvo do HIV-1 e do ARN do PQ do HIV-1, o Termociclador do Analisador COBAS TaqMan ou Analisador COBAS TaqMan 48 aquece a mistura de reacção para desnaturar os híbridos ARN:cADN e expor as específicas sequências alvo do iniciador. À medida que a mistura arrefece, os iniciadores ligam-se ao ADN alvo. Na presença de Mn 2+ e de trifosfatos de desoxinucleósidos em excesso (dntps), incluindo trifosfatos de desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxicitidina e desoxiuridina, a Z05 prolonga os iniciadores ligados ao longo do modelo alvo para produzir moléculas de ADN de dupla cadeia denominadas amplicons. O Analisador COBAS TaqMan ou o Analisador COBAS TaqMan 48 repete automaticamente este processo durante um determinado número de ciclos, com cada ciclo a duplicar a quantidade de ADN amplicon. O número requerido de ciclos é pré-programado no Analisador COBAS TaqMan ou Analisador COBAS TaqMan 48. A amplificação ocorre apenas nas duas regiões do genoma do HIV-1 que se encontram entre os iniciadores; não é amplificada a totalidade do genoma do HIV-1. Amplificação Selectiva No Teste COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0, a amplificação selectiva do ácido nucleico alvo da amostra é conseguida com a utilização da enzima AmpErase (uracil-n-glicosilase) e de trifosfato de desoxiuridina (dutp). A enzima AmpErase reconhece e catalisa a destruição de cadeias de ADN que contêm desoxiuridina 33, mas não de ADN contendo desoxitimidina. A desoxiuridina não se encontra em ADN existente na natureza, mas está sempre presente no amplicon, devido ao uso de trifosfato de desoxiuridina como um dos dntps do reagente de Mistura Principal; por conseguinte, o amplicon é o único que contém desoxiuridina. A deoxiuridina torna o amplicon contaminante susceptível à destruição pela enzima AmpErase antes da amplificação do ADN alvo. Igualmente, qualquer produto não específico formado após a activação inicial da Mistura Principal pelo manganês é destruído pela enzima AmpErase. A enzima AmpErase, que está incluída no reagente de Mistura Principal, catalisa a clivagem de ADN contendo desoxiuridina em resíduos de desoxiuridina, abrindo a cadeia de desoxiribose na posição C1. Quando aquecida no primeiro passo de ciclismo térmico, a cadeia de ADN do amplicon quebra-se na posição da deoxiuridina, tornando assim o ADN não amplificável. A enzima AmpErase permanece inactiva durante um longo período de tempo uma vez exposto a temperaturas acima dos 55 C, ou seja, durante os passos de ciclismo térmico, pelo que não destrói o amplicon alvo formado durante a amplificação. Detecção dos Produtos de PCR num Teste COBAS TaqMan O Teste COBAS AmpliPrep/CCOBAS TaqMan HIV-1, v2.0 utiliza tecnologia de PCR em tempo real 34,35. A utilização de sondas fluorescentes duplamente marcadas permite a detecção em tempo real da acumulação de produtos de PCR, ao monitorizar a intensidade de emissões de corantes sinalizadores fluorescentes libertados durante o processo de amplificação. As sondas consistem em sondas oligonucleotídicas específicas do HIV-1 e do PQ do HIV-1 com um corante sinalizador e um corante supressor. No Teste COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0, as sondas do HIV-1 e do PQ do HIV-1 estão marcadas com diferentes corantes sinalizadores fluorescentes. Quando estas sondas estão intactas, a fluorescência do corante sinalizador é suprimida pela proximidade do corante supressor devido aos efeitos de transferência de energia do tipo Förster. Durante a PCR, a sonda hibridiza-se a uma sequência alvo e é clivada pela actividade da nuclease 5' 3' da polimerase do ADN Z05 termoestável. Quando os corantes de sinalização e de supressão são libertados e separados, a supressão deixa de ocorrer, e é aumentada a actividade fluorescente do corante sinalizador. A amplificação do ARN do HIV-1 e do ARN do PQ do HIV-1 são determinadas independentemente, a diferentes comprimentos de onda. Este processo é repetido durante um número designado de ciclos, sendo a intensidade da emissão dos corantes sinalizadores individuais aumentada eficazmente com cada ciclo, permitindo a identificação independente do ARN do HIV-1 e do ARN do PQ do HIV-1. O ciclo de PCR onde uma curva de crescimento inicia um crescimento exponencial está relacionada com a quantidade de material iniciador no princípio da PCR PT 4 Doc Rev. 10.0

5 Bases Essenciais de Quantificação do Teste COBAS TaqMan O Teste COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 oferece resultados quantitativos precisos sobre um limite muito amplo e dinâmico, dado que a monitorização do amplicon é efectuada durante a fase exponencial de amplificação. Quando mais elevado for o título do HIV-1 de uma amostra, mais cedo a fluorescência do corante sinalizador das sondas do HIV-1 surge acima do nível de fluorescência da linha de base (ver a Figura 1). Dado que a quantidade de ARN do PQ do HIV-1 é constante entre todas as amostras, a fluorescência do corante sinalizador da sonda do PQ do HIV-1 deve aparecer num ciclo semelhante para todas as amostras (ver Figura 2). Nas amostras onde a fluorescência do PQ é afectada, a concentração é ajustada em conformidade. O aparecimento dos sinais fluorescentes específicos é referido como um valor de limite crítico (Ct). O Ct é definido como o número fraccionário de ciclo em que a fluorescência do corante sinalizador excede um limite predeterminado (Nível Atribuído de Fluorescência), e inicia a fase de crescimento exponencial deste sinal (ver a Figura 3). Um valor mais elevado de Ct indica um título mais baixo do material alvo do HIV-1 inicial. Um aumento duplicado (de 2 vezes) do título está correlacionado com uma redução de 1 Ct do ARN do HIV-1 alvo, enquanto que um aumento decuplicado (de 10 vezes) do título correlaciona-se com uma redução de 3,3 Ct. A Figura 1 apresenta as curvas de crescimento alvo de uma série de diluições abrangendo uma faixa de 5-log 10. À medida que a concentração do vírus aumenta, as curvas de crescimento desviam-se para ciclos anteriores. Consequentemente, a curva de crescimento mais à esquerda corresponde ao nível de título viral mais elevado, enquanto que a curva de crescimento mais à direita corresponde ao nível de título viral mais baixo. Figura 1 Curvas de crescimento do alvo para uma série de diluições abrangendo uma faixa de 5-Log 10 Fluorescência normalizada 10 5 Título mais elevado Título mais baixo Número de ciclo A Figura 2 apresenta as curvas de crescimento do Padrão de Quantificação de amostras a partir de uma série de diluições do vírus que abrange uma faixa de 5-log 10. A quantidade de Padrão de Quantificação acrescentada a cada amostra é constante para cada reacção. O valor Ct do Padrão de Quantificação é semelhante, independentemente do título viral PT 5 Doc Rev. 10.0

6 Figura 2 Curvas de crescimento do Padrão de Quantificação de uma série de diluições do vírus abrangendo uma faixa de 5-Log Fluorescência normalizada Título mais baixo Título mais elevado Número de ciclo A Figura 3 apresenta um exemplo de como os valores de fluorescência em cada ciclo são normalizados para cada curva de crescimento. O número fraccionário de ciclo (Ct) é calculado no ponto em que o sinal fluorescente atravessa o Nível Atribuído de Fluorescência. Figura 3 Valores de fluorescência em cada ciclo são normalizados para cada curva de crescimento 1,0 0,8 Fluorescência normalizada 0,6 0,4 0,2 0,0 Nível atribuído de fluorescência Valor de Ct = 28, ,2 Número de ciclo PT 6 Doc Rev. 10.0

7 Quantificação do ARN do HIV-1 O Teste COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 quantifica o ARN viral do HIV-1 utilizando uma segunda sequência alvo (Padrão de Quantificação do HIV-1) que é adicionada a cada amostra de teste numa concentração conhecida. O PQ do HIV-1 é uma estrutura de Armored RNA não infecciosa que contém fragmentos de sequências de HIV-1 com regiões de ligação para o iniciador idênticas às da sequência alvo do gag do HIV-1. O PQ do HIV-1 contém regiões de ligação dos iniciadores do HIV-1 e origina um produto de amplificação com o mesmo comprimento e composição básica do que o ARN alvo do gag do HIV-1. A região de ligação da sonda de detecção do PQ do HIV-1 foi modificada para permitir a distinção entre o amplicon do PQ dohiv-1 e o amplicon alvo do gag do HIV-1. Durante a fase de ligação da PCR no Analisador COBAS TaqMan ou no Analisador COBAS TaqMan 48, as amostras são iluminadas e excitadas através de luz filtrada e são recolhidos dados de fluorescência de emissões filtradas para cada amostra. As leituras de cada amostra são então corrigidas tendo em conta as flutuações de equipamentos. Estas leituras de fluorescência são enviadas pelo equipamento para o software AMPLILINK e armazenadas numa base de dados. Verificações prévias são utilizadas para determinar se os dados de ARN do HIV-1 e de ARN do PQ do HIV-1 representam conjuntos válidos, e são gerados indicadores de alarme quando os dados ficam fora dos limites predefinidos. Depois de concluídas e aprovadas todas as verificações prévias, as leituras de fluorescência são processadas para gerar valores de Ct para o ARN do HIV-1 e para o ARN do PQ do HIV-1. As constantes de calibragem específicas dos lotes fornecidas com o Teste COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 são utilizadas para calcular o valor do título das amostras e controlos com base nos valores Ct de ARN do HIV-1 e de ARN do PQ do HIV-1. O Teste COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 está normalizado de acordo com uma Norma Internacional da Organização Mundial de Saúde para o ARN do HIV-1. Os resultados dos títulos são reportados em cópias/ml (cp/ml) ou Unidades Internacionais/ml (UI/ml). O factor de conversão entre cópias/ml de ARN do HIV-1 reportadas e Unidades Internacionais/ml do HIV-1 foi determinado pela Roche Molecular Systems, Inc. como sendo de 0,6 cp/ui (1,67 UI/cp) PT 7 Doc Rev. 10.0

8 REAGENTES COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, v2.0 (P/N: ) HIV-1 v2.0 CS1 (Cassete de Reagente de Partículas Magnéticas de Vidro do HIV-1) Partículas magnéticas de vidro 93% de Isopropanol Xi 93% (p/p) de Isopropanol HI2CAP 48 Testes 1 x 48 testes Irritante F 93% (p/p) de Isopropanol Altamente inflamável HIV-1 v2.0 CS2 (Cassete de Reagente de Lise do HIV-1) Citrato de sódio dihidratado 42,5% de Tiocianato de guanidina < 14% de Polidocanol 0,9% de Ditiotreitol Xn 42,5% (p/p) de Tiocianato de guanidina 1 x 48 testes Nocivo N < 14% (p/p) de Polidocanol Perigoso para o ambiente HIV-1 v2.0 CS3 Cassete Multi-Reagente de HIV-1 contendo: Pase (Solução de Proteinase) Tampão Tris < 0,05% de EDTA Cloreto de cálcio Acetato de cálcio 7,8% de Proteinase Glicerol Xn 7,8% (p/p) de Proteinase 1 x 48 testes 1 x 3,8 ml Nocivo PT 8 Doc Rev. 10.0

9 EB (Tampão de Eluição) Tampão base Tris 0,2% de Metilparabeno HIV-1 v2.0 CS4 Cassete de Reagente Específica de Teste HIV-1 contendo: HIV-1 QS (Padrão de Quantificação do HIV-1) Tampão Tris-HCl EDTA < 0,005% de ARN de Poli ra (sintético) < 0,001% de estrutura de Armored RNA do HIV-1 contendo sequências de ligação do iniciador do HIV-1 e uma região única de ligação da sonda (ARN não infeccioso em bacteriófagos MS2) 0,05% de Azida sódica HIV-1 MMX (Mistura Principal HIV-1) Tampão de tricina Acetato de potássio Hidróxido de potássio 20% Dimetilsulfóxido Glicerol < 0,04% de datp, dctp, dgtp, dutp, dttp < 0,003% de iniciadores a montante e a jusante para o gag e a região LTR do HIV-1 < 0,003% de Aptâmero oligonucleotídico < 0,003% de sondas oligonucleotídicas de marcação fluorescente para o HIV-1 e para o Padrão de Quantificação do HIV-1 < 0,05% de Polimerase do ADN Z05 (de origem microbiana) < 0,1% AmpErase (uracil-n-glycosylase) enzyme (microbial) 0,09% de Azida sódica CAP/CTM Mn 2+ (Solução de Manganês CAP/CTM) < 0,5% de Acetato de manganês Ácido acético glacial 0,09% de Azida sódica 1 x 7,0 ml 1 x 48 testes 1 x 3,6 ml 1 x 2,5 ml 1 x 19,8 ml HIV-1 H(+)C, v2.0 4 x 1,0 ml (Controlo Positivo Alto do HIV-1, v2.0) < 0,001% de Armored RNA do HIV-1 contendo sequências de HIV-1 (ARN não infeccioso em bacteriófago MS2) Plasma humano negativo, não reactivo em testes para anticorpos contra HCV, anticorpos contra HIV-1/2, antigénio p24 do HIV e HBsAg; ARN do HIV-1, ARN do HCV e ADN do HBV não detectáveis por métodos de PCR 0,1% de conservante ProClin 300 Xi (3:1) mistura de 5-cloro-2-metil-2H-isotiazol-3-ona e 2-metil-2H-isotiazol-3-ona Irritante R36/38: Irritante para os olhos e pele. R43: Pode causar sensibilização em contacto com a pele PT 9 Doc Rev. 10.0

10 HIV-1 L(+)C, v2.0 4 x 1,0 ml (Controlo Positivo Baixo do HIV-1, v2.0) < 0,001% de Armored RNA do HIV-1 contendo sequências de HIV-1 (ARN não infeccioso em bacteriófago MS2) Plasma humano negativo, não reactivo em testes para anticorpos contra HCV, anticorpos contra HIV-1/2, antigénio p24 do HIV e HBsAg; ARN do HIV-1, ARN do HCV e ADN do HBV não detectáveis por métodos de PCR 0,1% de conservante ProClin 300 Xi (3:1) mistura de 5-cloro-2-metil-2H-isotiazol-3-ona e 2-metil-2H-isotiazol-3-ona Irritante R36/38: Irritante para os olhos e pele. R43: Pode causar sensibilização em contacto com a pele. CTM ( ) C 4 x 1,0 ml [Controlo Negativo (Plasma Humano) COBAS TaqMan ] Plasma humano negativo, não reactivo em testes para anticorpos contra HCV, anticorpos contra HIV-1/2, antigénio p24 do HIV e HBsAg; ARN do HIV-1, ARN do HCV e ADN do HBV não detectáveis por métodos de PCR 0,1% de conservante ProClin 300 Xi (3:1) mistura de 5-cloro-2-metil-2H-isotiazol-3-ona e 2-metil-2H-isotiazol-3-ona Irritante R36/38: Irritante para os olhos e pele. R43: Pode causar sensibilização em contacto com a pele. HIV-1 H(+)C, v2.0 Clip (Clipe de Códigos de Barras de Controlo Positivo Alto do HIV-1, v2.0) HIV-1 L(+)C, v2.0 Clip (Clipe de Códigos de Barras de Controlo Positivo Baixo do HIV-1, v2.0) HIV-1 ( ) C Clip (Clipe de Códigos de Barras de Controlo Negativo do HIV-1, v2.0) COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent Reagente de Lavagem COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan (P/N: ) PG WR (Reagente de Lavagem COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan ) Citrato de sódio dihidratado < 0,1% de N-Metilisotiazolona-HCl PG WR 1 x 4 Clipes 1 x 4 Clipes 1 x 4 Clipes 1 x 5,1 l ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES A. PARA UTILIZAÇÃO EM DIAGNÓSTICO IN VITRO. B. Este teste destina-se a ser utilizado com plasma humano colhido com o anticoagulante EDTA. C. Não efectue pipetagem com a boca PT 10 Doc Rev. 10.0

11 D. Não coma, não beba nem fume em áreas de trabalho laboratorial. Use luvas protectoras descartáveis, batas de laboratório e protecção para os olhos quando manusear amostras e reagentes do kit. Lave cuidadosamente as mãos após manusear amostras e reagentes do teste. E. Evite a contaminação microbiana e por ribonuclease dos reagentes quando remover as alíquotas dos frascos de controlo. F. Recomenda-se a utilização de pipetas esterilizadas descartáveis e de pontas de pipeta isentas de RNase. G. Não misture controlos de lotes diferentes nem de frascos diferentes do mesmo lote. H. Não misture cassetes de reagente ou controlos de kits diferentes. I. Não abra cassetes COBAS AmpliPrep nem troque, misture, retire ou acrescente frascos. J. Elimine os reagentes não usados, resíduos e amostras em conformidade com os regulamentos nacionais, federais, estaduais e locais. K. Não utilize os kits fora do prazo de validade. L. Encontram-se disponíveis Folhas de Dados de Segurança dos Materiais (MSDS, Material Safety Data Sheets) que podem ser solicitadas ao seu representante local da Roche. M. As amostras e controlos deverão ser manipulados como se estivessem infectadas, utilizando procedimentos de laboratório seguros, tais como os delineados em Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 37 e no Documento M29-A3 38 do CLSI. Limpe e desinfecte cuidadosamente todas as superfícies de trabalho com uma solução recentemente preparada de hipocloreto de sódio a 0,5 % em água desionizada ou destilada. Nota: A lixívia líquida doméstica contém habitualmente hipocloreto de sódio a uma concentração de 5,25 %. Uma diluição de lixívia doméstica de 1:10 irá dar origem a uma solução de hipocloreto de sódio a 0,5 %. N. ATENÇÃO: CTM ( ) C, HIV-1 L(+)C, v2.0 e HIV-1 H(+)C, v2.0 contêm plasma humano derivado do sangue humano. O material de origem foi submetido a testes e considerado como não reactivo para a presença de antigénio de superfície da Hepatite B (HBsAg), anticorpos contra o HIV-1/2 e o HCV, e antigénio p24 do HIV. Os testes de Plasma Humano Negativo através de métodos PCR não mostram nenhum ARN de HIV-1, ARN de HCV ou ADN de HBV detectáveis. Nenhum método de teste conhecido pode oferecer uma garantia completa de que os produtos derivados do sangue humano não transmitirão agentes infecciosos. Por conseguinte, todo o material de origem humana deverá ser considerado como potencialmente infeccioso. CTM ( ) C, HIV-1 L(+)C, v2.0 e HIV-1 H(+)C, v2.0 deverão ser manipulados como se estivessem infectados, utilizando procedimentos de laboratório seguros, tais como os delineados em Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 37 e no Documento M29-A3 38 do CLSI. Limpe e desinfecte cuidadosamente todas as superfícies de trabalho com uma solução recentemente preparada de hipocloreto de sódio a 0,5 % em água desionizada ou destilada. O. HIV-1 QS, CAP/CTM Mn 2+ e HIV-1 MMX contêm azida sódica. A azida sódica pode reagir com tubagens de chumbo e de cobre, produzindo azidas metálicas altamente explosivas. Ao eliminar soluções com azida sódica pela canalização do laboratório, lave os canos com água em abundância, de modo a evitar a acumulação de azidas. P. Use protecção para os olhos, batas de laboratório e luvas descartáveis quando manusear qualquer reagente. Evite o contacto destes materiais com a pele, olhos ou membranas mucosas. Caso ocorra o contacto, lave imediatamente com água em abundância. Caso não seja efectuado tratamento, podem surgir queimaduras. Caso ocorra derramamento destes reagentes, dilua com água antes de limpar. Q. Não permita que HIV-1 v2.0 CS2 e resíduos líquidos do Equipamento COBAS AmpliPrep, que contêm tiocianato de guanidina, entrem em contacto com a solução de hipoclorito de sódio (lixívia). Estas misturas podem produzir um gás altamente tóxico PT 11 Doc Rev. 10.0

12 R. Ao eliminar Unidades de Processamento de Amostra (SPUs) COBAS AmpliPrep já usadas e que contêm tiocianato de guanidina, evite qualquer contacto com a solução de hipoclorito de sódio (lixívia). Estas misturas podem produzir um gás altamente tóxico REQUISITOS DE ARMAZENAMENTO E MANUSEAMENTO A. Não congele reagentes ou controlos. B. Armazene HIV-1 v2.0 CS1, HIV-1 v2.0 CS2, HIV-1 v2.0 CS3 e HIV-1 v2.0 CS4 entre 2 e 8ºC. Se não forem usados, estes reagentes mantêm-se estáveis até ao fim do prazo de validade indicado. Uma vez usados, estes reagentes mantêm-se estáveis durante 28 dias entre 2 e 8 C, ou até ao fim do prazo de validade indicado, o que primeiro se verificar. HIV-1 v2.0 CS1, HIV-1 v2.0 CS2, HIV- 1 v2.0 CS3 e HIV-1 v2.0 CS4 podem ser usados durante um número máximo de 4 ciclos do equipamento, até um número máximo de 64 horas acumuladas a bordo do Equipamento COBAS AmpliPrep. Os reagentes devem ser armazenados entre 2 e 8ºC entre os ciclos do equipamento. C. Armazene HIV-1 H(+)C, v2.0, HIV-1 L(+)C, v2.0 e CTM ( ) C entre 2 e 8ºC. Os controlos mantêm-se estáveis até ao fim do prazo de validade indicado. Uma vez abertos, qualquer porção não utilizada destes reagentes tem de ser eliminada. D. Armazene os clipes de Códigos de Barras [HIV-1 H(+)C, v2.0 Clip, HIV-1 L(+)C, v2.0 Clip e HIV-1 ( ) C Clip] entre 2 e 30ºC. E. Armazene PG WR entre 2 e 30 C. PG WR permanece estável até ao fim do prazo de validade indicado. Uma vez aberto, este reagente mantém-se estável durante 28 dias entre 2 e 30 C, ou até ao fim do prazo de validade indicado, o que primeiro se verificar. MATERIAIS FORNECIDOS A. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, v2.0 (P/N: ) HIV-1 v2.0 CS1 (Cassete de Reagente de Partículas Magnéticas de Vidro do HIV-1) HIV-1 v2.0 CS2 (Cassete de Reagente de Lise do HIV-1) HIV-1 v2.0 CS3 (Cassete de Multi-Reagente do HIV-1) HIV-1 v2.0 CS4 (Cassete de Reagente Específico do Teste do HIV-1) HIV-1 H(+)C, v2.0 (Controlo Positivo Alto HIV-1, v2.0) HIV-1 L(+)C, v2.0 (Controlo Positivo Baixo HIV-1, v2.0) CTM ( ) C [Controlo Negativo (Plasma Humano) COBAS TaqMan ] HIV-1 H(+)C, v2.0 Clip (Clipe de Códigos de Barras de Controlo Positivo Alto do HIV-1, v2.0) HIV-1 L(+)C, v2.0 Clip (Clipe de Códigos de Barras de Controlo Positivo Baixo do HIV-1, v2.0) HIV-1 ( ) C Clip (Clipe de Códigos de Barras de Controlo Negativo do HIV-1) HI2CAP PT 12 Doc Rev. 10.0

13 B. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent Reagente de Lavagem COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan (P/N: ) PG WR PG WR (Reagente de Lavagem COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan ) MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS Equipamentos e Software Equipamento COBAS AmpliPrep Analisador COBAS TaqMan ou Analisador COBAS TaqMan 48 Opcional: Equipamento cobas p 630 Opcional: Estação de Ancoragem Software AMPLILINK, Versão Série 3.2 ou 3.3 Estação de dados para o software AMPLILINK, com impressora Manuais do software AMPLILINK, versão série 3.2 ou 3.3: Manual do Equipamento do equipamento COBAS AmpliPrep para utilização com o analisador COBAS TaqMan, o analisador COBAS TaqMan 48, o analisador COBAS AMPLICOR ou o equipamento cobas p 630 e o software AMPLILINK, versão série 3.2 e 3.3 Manual do Equipamento do analisador COBAS TaqMan (mais estação de ancoragem opcional) para utilização com o Manual de Aplicações do software AMPLILINK, versão série 3.2 e 3.3 Manual do Equipamento do analisador COBAS TaqMan 48 para utilização com o Manual de Aplicações do software AMPLILINK, versão série 3.2 e 3.3 Manual de Aplicações do Software AMPLILINK Versão Série 3.2 para utilização com o Equipamento COBAS AmpliPrep, o Analisador COBAS TaqMan, o Analisador COBAS TaqMan 48 e o Analisador COBAS AMPLICOR ou Manual de Aplicações do software AMPLILINK Versão Série 3.3 para utilização com o equipamento COBAS AmpliPrep, o analisador COBAS TaqMan, o analisador COBAS TaqMan 48, o analisador COBAS AMPLICOR e o equipamento cobas p Opcional: Manual do Operador do equipamento cobas p 630, Versão do software PT 13 Doc Rev. 10.0

14 Produtos descartáveis Unidades de processamento de amostras: SPUs Tubos de entrada de amostras (tubos-s) com clipes de código de barras Suportes de pontas-k Caixa de tubos-k de 12 x 96 OUTROS MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS Suporte de Amostras (24 Suportes SK) Suporte de Reagentes Suporte de SPU Aplicador de tampas em tubos-k, motorizado Aplicador de tampas em tubos-k Portador-K Transportador de portador-k Suporte de portador-k Pipetas com pontas com barreira para aerossóis ou de deslocamento positivo isentas de RNase (capacidade de 1000 μl)* Luvas descartáveis, sem pó Misturador de agitação forte * A precisão das pipetas deve estar dentro de 3% do volume declarado. Devem ser usadas pontas com barreira para aerossóis ou de deslocamento positivo e isentas de RNase sempre que tal for especificado, para impedir a contaminação cruzada da amostra e do amplicon. COLHEITA, TRANSPORTE E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS Nota: Manuseie todas as amostras e controlos tendo em conta a possibilidade de transmitirem agentes infecciosos. Nota: Este teste foi validado para utilização exclusiva com amostras de plasma humano colhidas no anticoagulante EDTA. A utilização de outro tipo de amostras pode dar origem a resultados imprecisos. A. Colheita de Amostras O Teste COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 destina-se a ser utilizado com amostras de plasma. O sangue deve ser colhido em tubos esterilizados com EDTA (topo lilás) como anticoagulante, e misturado adequadamente de acordo com as instruções do fabricante dos tubos. Armazene o sangue total entre 2 e 25 C durante um período não superior a 24 horas. Separe o plasma do sangue total durante as 24 horas subsequentes à colheita, por centrifugação a x g durante 20 minutos à temperatura ambiente. Transfira o plasma para um tubo de polipropileno esterilizado. A figura 4 apresenta dados de estabilidade de amostras de estudos de estabilidade de amostras efectuados utilizando o Teste COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 (P/N: ) PT 14 Doc Rev. 10.0

15 Figura 4 Estabilidade do HIV-1 em Sangue Total (colhido em tubos de plasma EDTA) Resultado médio do ARN do HIV-1 (n=4) log 10 em cópias/ml no ARN de HIV , , , , , ,0 Dador P1 Dador P2 Dador P3 ID da amostra < 1 hora (T0) 24 horas, C 24 horas, 2-8 C B. Transporte de Amostras O transporte de sangue total ou de plasma deve obedecer às regulamentações nacionais, federais, estatais e locais relativas ao transporte de agentes etiológicos 39. O sangue total deve ser transportado entre 2 e 25 C e centrifugado durante as 24 horas subsequentes à colheita. O plasma pode ser transportado entre 2 e 8 C ou congelado entre -20 C e -80 C. C. Armazenamento de Amostras As amostras de plasma podem ser armazenadas à temperatura ambiente (25 a 30 C) durante 1 dia ou entre 2 e 8 C durante um máximo de 6 dias. As amostras de plasma mostraram-se estáveis durante seis semanas, se congeladas entre -20 C e -80 C. Recomenda-se que as amostras sejam armazenadas em alíquotas de μl, em tubos de polipropileno esterilizados de 2,0 ml, com tampas de enroscar (tais como Sarstedt ). A figura 5 apresenta os dados de estabilidade de amostras de estudos de armazenamento de amostras efectuados utilizando o Teste COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 (P/N: ). Figura 5 Estabilidade do HIV-1 em Plasma EDTA Resultado médio do ARN do HIV-1 (n=4) log 10 em cópias/ml no ARN de HIV , , , , , ,0 Dador P4 Dador P5 Dador P6 ID da amostra T=0 24 h, 28 C 6 d, 2-8 C 6 s, -20 C 6 s, -80 C PT 15 Doc Rev. 10.0

16 As amostras de plasma podem ser congeladas e descongeladas até um número máximo de cinco vezes sem uma significativa perda de ARN do HIV-1. A figura 6 apresenta os dados de um estudo de congelamento-descongelamento efectuado utilizando o Teste COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 (P/N: ). Figura 6 Resultados do HIV-1 depois de um máximo de Cinco ciclos de Congelamento-Descongelamento (C-D) (Plasma EDTA) Resultado médio do ARN do HIV-1 (n=4) Log 10 em cópias/ml no ARN de HIV , , , , , ,0 INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO Dador P10 Dador P11 Dador P12 ID da amostra Controlo 3 C-D 5 C-D Nota: Para informações detalhadas sobre o funcionamento, uma descrição detalhada das configurações possíveis, a impressão de resultados e a interpretação de indicadores, comentários e mensagens de erro, consulte (1) o Manual do Equipamento do equipamento COBAS AmpliPrep para utilização com o analisador COBAS TaqMan, o analisador COBAS TaqMan 48, o analisador COBAS AMPLICOR, ou o equipamento cobas p 630 e o software AMPLILINK, versão série 3.2 e 3.3; (2) o Manual do Equipamento do analisador COBAS TaqMan (mais estação de ancoragem opcional) para utilização com o Manual de Aplicações do software AMPLILINK, versão série 3.2 e 3.3; (3) o Manual do Equipamento do analisador COBAS TaqMan 48 para utilização com o Manual de Aplicações do software AMPLILINK, versão série 3.2 e 3.3; (4) o Manual de Aplicações do Software AMPLILINK Versão Série 3.2 para utilização com o Equipamento COBAS AmpliPrep, o Analisador COBAS TaqMan, o Analisador COBAS TaqMan 48 e o Analisador COBAS AMPLICOR ou o Manual de Aplicações do software AMPLILINK Versão Série 3.3 para utilização com o equipamento COBAS AmpliPrep, o analisador COBAS TaqMan, o analisador COBAS TaqMan 48, o analisador COBAS AMPLICOR e o equipamento cobas p 630; (5) Opcional: Manual do Operador do equipamento cobas p 630, Versão do software 2.2. Tamanho do lote Cada kit contém reagentes suficientes para 48 testes, que podem ser executados em lotes de 12 a 24 testes. Em cada lote deve ser incluído pelo menos um de cada controlo [CTM ( ) C, HIV-1 L(+)C, v2.0 e HIV-1 H(+)C, v2.0] (ver a secção "Controlo de Qualidade"). Configuração A execução no Analisador COBAS TaqMan ou no Analisador COBAS TaqMan 48 tem que ser iniciada no prazo de 120 minutos após a conclusão da preparação de amostras e controlos. Nota: Não congele nem armazene amostras e controlos processados entre 2 e 8 C PT 16 Doc Rev. 10.0

17 Preparação de Amostras e Controlos Nota: Se estiver a utilizar amostras congeladas, coloque as amostras à temperatura ambiente até ficarem completamente descongeladas e misture com agitação forte durante 3 a 5 segundos antes de utilizar. Os controlos devem ser removidos do armazenamento entre 2 e 8 C e equilibrados à temperatura ambiente antes de utilizar. Configuração do Equipamento COBAS AmpliPrep Parte A. Manutenção e Purga A1. O Equipamento COBAS AmpliPrep está pronto para funcionar em modo de em espera (stand-by). A2. Ligue (ON) a estação de dados do software AMPLILINK. Prepare a estação de dados da seguinte maneira: a. Inicie sessão no sistema operativo Windows XP. b. Clique duas vezes no ícone do software AMPLILINK. c. Inicie sessão no software AMPLILINK introduzindo a identificação de utilizador e a palavra de passe. A3. Verifique a quantidade do PG WR através do ecrã Status e reponha, se necessário. A4. Realize toda a manutenção que está enumerada no separador Due. O Equipamento COBAS AmpliPrep purgará automaticamente o sistema. Parte B. Carga das Cassetes de Reagente Nota: Todas as cassetes de reagente devem ser retiradas do armazenamento entre 2 e 8 C, carregadas imediatamente no Equipamento COBAS AmpliPrep e deixadas equilibrar à temperatura ambiente no equipamento pelo menos 30 minutos antes da primeira amostra estiver para ser processada. Não deixe que as cassetes de reagente atinjam a temperatura ambiente fora do equipamento, dado que se pode formar condensação nas etiquetas de códigos de barras. Não limpe a condensação no caso da mesma aparecer nas etiquetas de códigos de barras. B1. Coloque HIV-1 v2.0 CS1 num suporte de reagentes. Coloque HIV-1 v2.0 CS2, HIV-1 v2.0 CS3 e HIV-1 v2.0 CS4 num suporte de reagentes diferente. B2. Carregue o suporte de reagentes contendo HIV-1 v2.0 CS1 na posição de suporte A do Equipamento COBAS AmpliPrep. B3. Carregue o suporte de reagentes contendo HIV-1 v2.0 CS2, HIV-1 v2.0 CS3 e HIV-1 v2.0 CS4 na posição de suporte B, C, D ou E do Equipamento COBAS AmpliPrep (ver a Tabela 1 para mais informações) PT 17 Doc Rev. 10.0

18 Parte C. Carga de Produtos Descartáveis Nota: Determine o número necessário de cassetes de reagente COBAS AmpliPrep, unidades de processamento de amostras (SPUs), tubos de entrada de amostras (tubos-s), pontas-k e tubos-k. Para cada amostra ou controlo são necessários uma SPU, um tubo-s de entrada, uma ponta-k e um tubo-k. São possíveis várias configurações para a utilização do Equipamento COBAS AmpliPrep com o Analisador COBAS TaqMan ou o Analisador COBAS TaqMan 48. Para referência, consulte a Tabela 1 mais adiante. Consoante a configuração utilizada, carregue o número adequado de suportes de cassetes de reagentes, suportes de amostra com tubos-s de entrada, suportes de SPU, suportes de pontas-k, suportes de tubos-k e portadores-k em suportes de portadores-k nas posições de suporte respectivas do Equipamento COBAS AmpliPrep (ver a Tabela 1 para mais informações). C1. Coloque as SPUs no suporte ou suportes de SPUs e carregue o suporte ou suportes na posição de suporte J, K ou L do Equipamento COBAS AmpliPrep. C2. Consoante a configuração utilizada, carregue o suporte ou suportes completos de tubos-k na posição de suporte M, N, O ou P do Equipamento COBAS AmpliPrep. C3. Carregue o suporte ou suportes de pontas-k na posição de suporte M, N, O ou P do Equipamento COBAS AmpliPrep. C4. Para a configuração 3 utilizando o Analisador COBAS TaqMan 48, carregue os portadores-k no suporte ou suportes de portadores-k na posição de suporte M & N ou O & P do Equipamento COBAS AmpliPrep PT 18 Doc Rev. 10.0

19 Tabela 1 Possíveis configurações para a utilização do Equipamento COBAS AmpliPrep com o Analisador COBAS TaqMan ou o Analisador COBAS TaqMan Configuração Equipamento COBAS AmpliPrep mais Estação de Ancoragem mais Analisador COBAS TaqMan Equipamento COBAS AmpliPrep mais Analisador COBAS TaqMan Equipamento COBAS AmpliPrep mais Analisador COBAS TaqMan 48 Modo de transferência para o Analisador COBAS TaqMan ou Analisador COBAS TaqMan 48 Transferência automatizada do portador-k Transferência manual de tubos-k em suporte ou suportes de amostras para o Analisador COBAS TaqMan Transferência manual de portador-k em suporte ou suportes de portador-k para o Analisador COBAS TaqMan 48 Suportes, portadores e descartáveis Tubos-K em suportes completos de tubos-k Pontas-K em suportes completos de pontas-k Tubos-S de entrada contendo amostras e controlos em suportes de amostra SPUs em suportes de SPUs CS1 no suporte de Cassete CS2, CS3, CS4 no suporte de Cassete Tubos-K em suportes completos de tubos-k Pontas-K em suportes completos de pontas-k Tubos-S de entrada contendo amostras e controlos em suportes de amostra SPUs em suportes de SPUs CS1 no suporte de Cassete CS2, CS3, CS4 no suporte de Cassete Após conclusão do processamento de amostra: Tubos-K em suportes de amostra (preparado para transferência manual) Tubos-K em suportes de amostra Pontas-K em suportes completos de pontas-k Tubos-S de entrada contendo amostras e controlos em suportes de amostra SPUs em suportes de SPUs CS1 no suporte de Cassete CS2, CS3, CS4 no suporte de Cassete Portador-K vazio com código de barras no suporte para portador-k Após conclusão do processamento de amostra: Tubos-K em portador-k no suporte de portador-k Posição no Equipamento COBAS AmpliPrep M P M P F H J L A B E M P M P F H J L A B E Idêntico ao de cima (F H) F - H M P F H J L A B E M P Idêntico ao de cima (M P) PT 19 Doc Rev. 10.0

20 Parte D. Carga e Pedido de Amostras D1. Prepare suportes de amostra da seguinte maneira: Prenda um clipe de etiqueta de código de barras a cada posição do suporte de amostras onde se deverá colocar uma amostra (tubo-s). Prenda um dos clipes de etiqueta de código de barras específicos para os controlos [CTM ( ) C, HIV-1 L(+)C, v2.0 e HIV-1 H(+)C, v2.0] a cada posição do suporte de amostras onde serão colocados os controlos (tubo-s). Os clipes de etiqueta de código de barras para os controlos devem ter o mesmo número de lote de controlo do que o número de lote presente nos frascos de controlo do kit. Use de precaução para atribuir o controlo adequado à posição com o clipe de código de barras de controlo adequado. Coloque um tubo-s de entrada em cada posição contendo um clipe de etiqueta de código de barras. D2. Utilizando o software AMPLILINK, crie pedidos de amostras para todas as amostras e controlos na pasta Sample da janela Orders. Seleccione o ficheiro de teste apropriado e conclua guardando. D3. Atribua pedidos de amostra e de controlo às posições do suporte de amostras na pasta Sample Rack da janela Orders. O número do suporte de amostras deve ser para o suporte preparado no Passo D1. D4. Imprima o relatório Sample Rack Order para utilizar como uma folha de trabalho. D5. Prepare suportes de amostra e de controlo na área designada para a adição de amostras e controlos, da seguinte maneira: Misture com agitação forte cada amostra e controlo [CTM ( ) C, HIV-1 L(+)C, v2.0 e HIV-1 H(+)C, v2.0] durante 3 a 5 segundos. Evite contaminar as luvas quando manipular as amostras e controlos. D6. Transfira 1000 a 1050 μl de cada amostra e controlo [CTM ( ) C, HIV-1 L(+)C, v2.0 e HIV-1 H(+)C, v2.0] para o adequado tubo-s de entrada com etiqueta de código de barras, utilizando uma micropipeta com uma ponta com barreira para aerossóis ou de deslocamento positivo isenta de DNase. Evite transferir partículas e/ou coágulos de fibrina da amostra original para o tubo-s de entrada. As amostras e controlos devem ser transferidos para posições de tubos, tal como determinado e registado na folha de trabalho no Passo D4. Os clipes de etiqueta de código de barras para os controlos devem ter o mesmo número de lote de controlo do que o número de lote presente nos frascos de controlo do kit. Atribua o controlo correcto à posição com o clipe de código de barras de controlo adequado. Evite contaminar a parte superior dos tubos-s com amostras ou controlos. Se estiver a utilizar o equipamento cobas p 630 para a preparação de amostras, consulte o Manual do Operador do equipamento cobas p 630. D7. Para as configurações 1 e 2, carregue o suporte ou suportes de amostra cheios com tubos-s de Entrada nas posições do suporte F, G ou H do Equipamento COBAS AmpliPrep. D8. Para a configuração 3 utilizando o Analisador COBAS TaqMan 48, carregue o suporte ou suportes de amostra com tubos-s de Entrada e tubos-k (um para cada tubo-s de Entrada, carregado na posição da direita adjacente aos tubos-s de entrada) na posição do suporte F, G ou H do Equipamento COBAS AmpliPrep. Parte E. Início da Execução no Instrumento COBAS AmpliPrep E1. Inicie o Equipamento COBAS AmpliPrep utilizando o software AMPLILINK PT 20 Doc Rev. 10.0

21 Parte F. Final da Execução no Equipamento COBAS AmpliPrep e Transferência para o Analisador COBAS TaqMan ou o Analisador COBAS TaqMan 48 (apenas para as configurações 2 e 3) F1. Verifique se existem indicadores de alarme ou mensagens de erro. F2. Retire as amostras e os controlos processados do Equipamento COBAS AmpliPrep em suportes de amostra (para o Analisador COBAS TaqMan sem Estação de Acoplagem) ou em suportes de portador-k (para o Analisador COBAS TaqMan 48), consoante a configuração (para mais pormenores, ver a Parte G). F3. Remova os resíduos do Equipamento COBAS AmpliPrep. Nota: Todas as amostras e controlos processados não devem ser expostos à luz depois da conclusão da preparação de amostras e controlos. Amplificação e Detecção Configuração do Analisador COBAS TaqMan ou Analisador COBAS TaqMan 48 A execução no Analisador COBAS TaqMan ou no Analisador COBAS TaqMan 48 tem que ser iniciada no prazo de 120 minutos após a conclusão da preparação de amostras e controlos. Nota: Parte G. Não congele nem armazene amostras e controlos processados entre 2 e 8 C. Carga de Amostras Processadas G1. Consoante a configuração, execute os passos adequados para transferir os tubos-k para o Analisador COBAS TaqMan ou Analisador COBAS TaqMan 48: Configuração 1: Configuração 2: Configuração 3: Transferência automatizada de portador-k através da estação de ancoragem para o Analisador COBAS TaqMan. Não é necessária intervenção manual. Transferência manual de tubos-k em suporte ou suportes para o Analisador COBAS TaqMan. Transferência manual de portador-k em suporte ou suportes de portador-k para o Analisador COBAS TaqMan 48. Transferência manual de portadores-k para o Analisador COBAS TaqMan 48 utilizando o transportador de portadores-k. Parte H. Início da Execução no Analisador COBAS TaqMan ou no Analisador COBAS TaqMan 48 H1. Inicie o Analisador COBAS TaqMan ou o Analisador COBAS TaqMan 48 utilizando uma das opções indicadas a seguir, consoante a configuração utilizada: Configuração 1: Não é necessária qualquer intervenção. Configuração 2: Arranque automático do Analisador COBAS TaqMan depois da introdução de suporte ou suportes de amostras. Configuração 3: Encha o portador-k com tubos-k vazios se existirem menos de 6 tubos-k no portador-k. O enchimento é orientado pelo software AMPLILINK. Abra o termociclador, carregue o portador-k no termociclador e feche a tampa. Inicie a execução no Analisador COBAS TaqMan PT 21 Doc Rev. 10.0