OTIMIZAÇÃO DE PROCESSO ENZIMÁTICO ATRAVÉS DO MONITORAMENTO DE PARÂMETROS CINÉTICOS

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1 OTIMIZAÇÃO DE PROCEO ENZIMÁTICO ATRAVÉ DO MONITORAMENTO DE PARÂMETRO CINÉTICO Fabana Jung Noel Mestre em Engenhara, ULBRA, R; Pesqusadora do Pólo de Inovação Tecnológca do Paranhana FACCAT/CT, R Márco Rcardo A. Kzner Acadêmco Bolssta de Pesqusa do Curso de Engenhara de Produção FACCAT, R. Mchael Crstano de ouza Técnco em Eletrotécnca, CIMOL; Acad. Bolssta de Pesqusa do Curso de Engenhara de Produção FACCAT, R Waldemr antago Júnor Pós-Doutor em Engenhara de Almentos, UFRG; Pesqusador do Pólo de Inovação Tecnológca do Paranhana FACCAT, R REUMO A pesqusa Produção de Enzmas a partr do oro de Lete, fo desenvolvda no Laboratóro de Químca Botecnológca do Curso de Engenhara de Produção das Faculdades de Taquara FACCAT, através de convêno com a CT ecretara de Cênca e Tecnologa do Estado do Ro Grande do ul. Neste trabalho, descreve-se um dos objetvos da pesqusa que fo a otmzação do processo pela adaptação de software de controle do fermentador, acoplado a cromatógrafo a gás para análse de etanol, um subproduto da obtenção da enzma. Palavras-chave: Otmzação, processo botecnológco, soro de lete, lactase. ABTRACT - The research "Enzyme Producton from the Mlk whey", was developed n the Botechnologcal Chemstry laboratory of the Course of Engneerng of Producton of the Faculdades de Taquara - FACCAT, through accord wth the CT - ecretarat of cence and Technology of the tate of the Ro Grande do ul. In ths work, descrbes one of the objectves of the research that was the otmzaton of the process for the adaptaton of software of control of the fermentador, connected to chromatograph the gas for analyss of etanol, a by-product of the attanment of the enzyme. Key-words: Otmzaton, botechnologcal process, mlk whey, lactase. INTRODUÇÃO A obtenção de um produto de valor agregado, através da utlzação de um resíduo, fo um dos objetvos deste trabalho. Estudou-se um processo vável de utlzação do soro de quejo das ndústras de latcínos da regão do Vale do Paranhana, a fm de transformá-lo em um produto, evtando que seja descartado no meo ambente. A utlzação de soro de quejo produzdo pela ndústra de latcínos representa uma mportante fonte de matéra-prma barata para a produção de extratos de leveduras, já que este produto mutas vezes é descartado, gerando um efluente de grande potencal poluente devdo sua alta carga de materal orgânco[ben- HAAN, 1994]. O soro de quejo, obtdo em grandes quantdades como resíduo da ndústra de latcínos, consste na parte líquda conseqüente à precptação da caseína e é composto bascamente de 5% de lactose, 1 % de proteínas, 0.8 % de sas, 0.5% de ácdo látco, com ph 4.0 [RECK, 1998]. O descarte do soro tem ncdênca expressva no custo da ndústra de quejos. A pressão ambental crescente faz com que a projeção deste custo seja ascendente. A demanda bológca de oxgêno (DBO) do soro é de

2 aproxmadamente a mg/l, fazendo deste um dos mas potentes efluentes orgâncos [DOMINGUE, Estma-se que cerca de 100 kg de soro de quejo representa o equvalente ao esgoto produzdo por 45 pessoas por da [MATO, 2005]. O nteresse no estudo da otmzação de processos fermentatvos resulta da crescente utlzação de mcroorgansmos em produção ndustral, a mnmzação do consumo de matéras prmas e do tempo de produção, podem ser ctados, como estratégas econômcas da otmzação de processos botecnológcos [CARVALHO, 1993]. A determnação de uma estratéga ótma de operação baseada em um modelo matemátco do processo que represente o conhecmento obtdo acerca do comportamento de um tpo de mcroorgansmo pode aumentar consderavelmente a lucratvdade de uma planta ndustral. A partr do fornecmento de condções para forçar o mcroorgansmo a apresentar uma maor produtvdade e do melhoramento da reprodutbldade da operação do fermentador, a estratéga de otmzar o processo é alcançada. As técncas de otmzação e controle podem ser mplementadas no processo de produção de pequenas empresas mesmo que estas não dsponham de automação ndustral. Isto é possível desde que essas empresas utlzem as técncas desenvolvdas neste projeto através do uso de programa de computador (software) que ndque qual a melhor forma de operar o processo, sendo a mplementação prátca executada manualmente na undade ndustral. As leveduras capazes de produzr a lactase (ntracelular) são: Kluyveromyces marxanus Kluyveromyces lacts Cândda pseudotropcals Brettanomyces anomalus Wngea robersts Entre elas as mas expressvas são as leveduras Kluyveromyces marxanus (ou fragls) e K. lacts. O mecansmo de absorção e hdrólse da lactose ocorre após seu transporte através da parede celular, medado pelo sstema lactose permease. Dentro da célula, o dssacarídeo é desdobrado em glcose e galactose pela lactase. Estes açúcares são, então, metabolzados através da va glcolítca normal [GEKA, 1985]. METODOLOGIA - O mcrorgansmo utlzado no cultvo, fo o Kluyveromyces marxanus, cuja cultura fo obtda por processo de batelada almentada com alta densdade celular. O expermento fo realzado em fermentador modelo MA-502/A marca MARCONI (Fgura 1). Este fermentador é uma adaptação do modelo dsponível, construído em vdro borosslcato, com aberturas na tampa para acoplamento de acessóros tas como: agtação, adção substrato, base, ácdo, sondas de medção de temperatura, oxgêno dssolvdo e ph, aerador, cuba de vdro borosslcato encamsada sem saída de fundo, chcana de PTFE para elmnar agtação tpo vortex. Fo utlzada uma freqüênca de rotação de 300 RPM e o dâmetro do mpeldor é de 6,5 cm. O Volume do vaso do fermentador varou de 1 L a 5 L na operação em batelada almentada. O controle do processo vsa obter uma maor produtvdade de lactase [JENO, 2001]. O substrato de almentação fo 1 L de oro de Lete Elegê 70 g/l (na fase de Batelada) e 4 L à 360g/L (na fase de Batelada Almentada). Para controle dos produtos formados e do desaparecmento do substrato oferecdo, faz-se necessáro à realzação de análses químcas off-lne; Densdade de células,

3 Concentração de Lactose (Método Fenolsulfúrco), Atvdade Enzmátca (Método ONPG) [AQUARONE, 2001; DUBOI, 1956; VILLELA, 1972]. Cromatógrafo à Gás modelo 3537R, com dos detetores (FID e TCD), marca CG, fo utlzado na detecção de CO 2, O 2, N 2 e etanol. O sstema é acoplado ao fermentador, com válvulas automátcas de amostragem, com aconamento por software Peakmple (Fgura 2). Fo utlzada a lsoenzma (L-6876 Lysozyme/EC ) para romper a parede celular do mcroorgansmo e possbltar a análse da lactase. Realzouse uma lgação em paralelo com colunas do tpo penera molecular e Porapak de forma a utlzar o detector de condutvdade térmca para análse smultânea de O 2, N 2 e CO 2. O etanol fo analsado no detector de onzação de chama. O software utlzado fo o Vsual Desgner, (Fgura 3) com a função de montorar as varáves do processo, estmar os parâmetros cnétcos e controlar a taxa de almentação do substrato. Este software atua conjuntamente no controle do fermentador e fo modfcado para o objetvo do expermento (Fgura 4). Fo adaptado um smulador em EXCEL orgnalmente utlzado para produção de Penclna-G-aclase desenvolvdo no GBF (Gesellschaft Für Botechnologsche Forschung, Alemanha). Além do smulador em EXCEL, também fo desenvolvdo um smulador equvalente no Vsual Desgner para ser executado com o programa de controle do fermentador. O modelo utlzado é o segunte: dx X f d Y dx m X X m X f Y X 1 t X 1e Onde X é o produto (saída) e é a almentação (entrada). REULTADO O cultvo em batelada almentada apresenta algumas vantagens como a melhora da produtvdade de proteínas homólogas e heterólogas em cultvos de alta densdade celular e a superação de mecansmos regulatóros celulares: efeto Crabtree, repressão catabólta e nbção por produto. A almentação exponencal proposta, basea-se na almentação contínua com um perfl exponencal fxo, permtndo, teorcamente o crescmento celular exponencal por almentação com soro de quejo de acordo com a demanda de crescmento. A almentação exponencal com controle automátco de retroalmentação procura compensar as varações da taxa de crescmento específca ( ) devdo a perturbações do processo, por exemplo, mudanças na matéra-prma e produto fnal obtdo, mudanças de temperatura e vazão, restrções operaconas e outras. K. marxanus exbe o efeto Crabtree, causando a fermentação ndesejável da lactose para etanol devdo à alta concentração de lactose no meo de cultura, mesmo sob condções altamente aeróbcas. A produtvdade volumétrca de lactase em culturas de alta densdade celular fo maxmzada utlzando a estratéga de controle com otmzação onlne para regular o suprmento de lactose.a taxa de produção enzmátca mas alta obtda, fo aquela onde, utlzouse a estratéga de almentação batelada exponencal. Esta estratéga de controle otmzante para cultvo aeróbo, maxmzou o crescmento da bomassa e a produtvdade volumétrca de lactase

4 (enzma), o controle da produção requer apenas o montoramento do nível de etanol (subproduto) no gás de saída do fermentador, em culturas com alta densdade celular a estratéga de controle com otmzação on-lne para regular o suprmento de lactose é a mas ndcada. REFERÊNCIA AQUARONE, E.; BORZANI, W.; LIMA, U. de A.; CHMIDELL, W. Botecnologa Industral v. 2: Engenhara Boquímca. 1ª ed. ão Paulo: Edgard Blücher LTDA, 2001 BEN-HAAN, R. M.; GHALY, A. E. Contnuous propagaton of Kluyveromyces fragls n cheese whey for polluton potental reducton. Appled Bochemstry and Botechnology, v. 47, p , CARVALHO, A. P. Cênca e Tecnologa no Brasl: Uma Nova Polítca para um Mundo Global. Ro de Janero: UFRJ, DUBOI,M. et all. Colormetrc Method for Determnaton of sugars and Related ubstances. Dvson of Bochemstry, Vol. 28, nº3. Unversty of Mnnesota: GEKA,V., LÓPEZ L. M. Hydrolss of lactase: A lteraturerevew. In: Process Bochem, 20(1), p. 2-3, HARRI, D. Análse Químca Quanttatva. 5ª ed. Ro de Janero:LTC, p. 447 JENO M.; JERVI, E.J.; MOO-YOUNG, M.; NOR, Z.M.; TAMER, M.I.; Automated Fed-Batch Culture of Kluyveromyces fragls Based on A Novel Method for On-Lne Estmaton of Cell pecfc Growth Rate. Bochemcal Engneerng Journal 9, p , 16 de agosto de MATO, A. T. Tratamento de resíduos agrondustras. Vçosa: AEAGRI, p. (ére. Cadernos Ddátcos no. 31) RECH, R. Aprovetamento do oro de Quejo para a Produção de Lactase por Kluyveromyces marxanus f. Dssertação (mestrado em Engenhara Químca) Unversdade Federal do Ro Grande do ul, Porto Alegre, VILLELA, G.G.; BACILA, M. e TATALDI, H. Técncas e Expermentos de Boquímca. Ro de Janero : Guanabara Koogan, 1972, 522 p. Fgura 1 Fermentador MA-502/A adaptado ao expermento Fgura 2 Bolssta Pesqusador Mchael Crstano de ouza, operando o Cromatógrafo CG 3537 e software Peaksmple

5 Fgura 3 oftware orgnal Vsual Desgner Fgura 4 - oftware otmzado Vsual Desgner