CARLA ALBERTINA DEMARCHI BACK O-CARBOXIMETILQUITOSANA MAGNÉTICA CONTENDO NANOPARTÍCULAS DE PRATA: SÍNTESE, ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E TOXICIDADE

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1 CARLA ALBERTINA DEMARCHI BACK O-CARBOXIMETILQUITOSANA MAGNÉTICA CONTENDO NANOPARTÍCULAS DE PRATA: SÍNTESE, ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E TOXICIDADE Itajaí (SC) 2018

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3 UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS CARLA ALBERTINA DEMARCHI BACK O-CARBOXIMETILQUITOSANA MAGNÉTICA CONTENDO NANOPARTÍCULAS DE PRATA: SÍNTESE ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E TOXICIDADE Tese submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Doutora em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Clóvis Antonio Rodrigues Itajaí (SC) Agosto de 2018

4 Ficha Catalográfica B126 Back, Carla Albertina Demarchi, O-carboximetilquitosana magnética contendo nanopartículas de prata [Manuscrito ]: síntese atividade antimicrobiana e toxicidade. / Carla Albertina Demarchi Back.- Itajaí, SC f. ; il. ; tab. ; graf. ; fig. Bibliografias f (Cópia de computador (Printout(s)). Tese submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Doutora em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Clóvis Antonio Rodrigues. 1. O-carboximetilquitosana. 2. Nanopartículas de prata. 3. Farmacologia. I. Universidade do Vale do Itajaí. II. Título. CDU: Bibliotecária Eugenia Berlim Buzzi CRB - 14/963

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7 AGRADECIMENTOS A Deus pela proteção, força e iluminação que sempre me dá. À Universidade do Vale do Itajaí e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências farmacêuticas, pela estrutura e apoio para a realização do curso. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) pela concessão da bolsa de estudos. Ao professor Clóvis Antonio Rodrigues, pelos ensinamentos, pela amizade, orientação durante todos esses anos, incentivo e pela confiança. Aos professores Alexandre Bella Cruz, José Roberto Santin e Luisa Mota da Silva pela ajuda na realização de experimentos. As técnicas de laboratório Bruna Oliveira e Viviane pelo auxílio. Aos colaboradores externos Jacir Dal Magro e Anna Ślawska- Waniewska pela ajuda na caracterização dos materiais. Aos membros da banca avaliadora pelas importantes contribuições que deram a este trabalho. Aos meus pais Horácio e Cátia que sempre acreditaram nos meus sonhos. Pelo amor e carinho, sempre me apoiando, incentivando e mostrando a importância do conhecimento e de todo o esforço. Ao meu esposo Juarez por ser meu porto seguro, pelo amor, por ser paciente, compreensivo e me apoiar incondicionalmente. Aos meus demais familiares, em especial a minha irmã Carina, e a todos os meus amigos pelo carinho e amizade. Enfim, agradeço todos que direta ou indiretamente, estiveram juntos nessa caminhada e que, de alguma forma, contribuíram para a concretização desse sonho.

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9 O-CARBOXIMETILQUITOSANA MAGNÉTICA CONTENDO NANOPARTÍCULAS DE PRATA: SÍNTESE, ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E TOXICIDADE Carla Albertina Demarchi Back Agosto/2018 Orientador: Clóvis Antônio Rodrigues, Doutor. Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas Número de Páginas: 138. A prata possui potente ação antimicrobiana, e os micro-organismos dificilmente conseguem desenvolver resistências contra ela. Porém, sua utilização ainda é restrita devido a problemas de toxicidade e de agregação das partículas. O revestimento de nanopartículas de prata com biopolímeros, como a quitosana, e a presença de material magnético, são alternativas possíveis para solucionar estes problemas. Baseado neste contexto, esta tese teve como objetivos a síntese, caracterização, avaliação da atividade antimicrobiana e da toxicidade da O-Carboximetilquitosana (O-C) magnética contendo nanopartículas de prata. Na síntese foram utilizados diferentes agentes redutores (boro hidreto de sódio, sacarose e somente a O-C). Posteriormente os compostos foram caracterizados por diversas técnicas. A atividade antimicrobiana dos compostos foi avaliada através da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e cinética de crescimento microbiano. Também, foi avaliada citotoxidade in vitro com células L929 e a toxicidade contra Artemia salina e sementes de Cucumis sativus. Os resultados de caracterização dos nanocompósitos mostraram que as nanopartículas de prata preparadas sem agente redutor possuem menor

10 tamanho de partícula (~ 5 ±3 nm). As curvas de magnetização mostraram que as nanopartículas de maguemita transitam no estado superparamagnético. Os nanocompósitos submetidos a testes antimicrobianos mostraram boa atividade contra Staphylococcus aureus e Escherichia coli, e atividade moderada contra a levedura Candida albicans e estirpes resistentes de Staphylococcus aureus. O nanocompósito sintetizado com sacarose apresentou a melhor atividade antimicrobiana, com CIM de 15,6 μg/ml para E. coli e S. aureus e de 125 μg/ml para C. albicans. O comportamento antimicrobiano em função do tempo mostrou que o nanocompósito sintetizado sem agente redutor foi capaz de inibir completamente o crescimento microbiano por até 48 horas. Nenhum material induziu diminuição na viabilidade de células L929 no modelo in vitro. Nos estudos de nanoecotoxicidade, não foi observada toxicidade contra Artemia salina e foram observados efeitos deletérios leves contra Cucumis sativus, principalmente para os nanocompósitos com maior quantidade de prata. De maneira geral, os materiais sintetizados com sacarose em sem agente redutor se mostraram promissores, visto a elevada atividade antimicrobiana e reduzida toxicidade, bem como, devido a utilização de metodologias ecoamigáveis na síntese. Palavras-chave: O-carboximetilquitosana. Nanopartículas magnéticas. Nanopartículas de prata. Atividade antimicrobiana. Nanoecotoxicologia.

11 MAGNETIC O-CARBOXYMETHYL CHITOSAN CONTAINING SILVER NANOPARTICLES: SYNTHESIS, ANTIMICROBIAL ACTIVITY AND TOXICITY Carla Albertina Demarchi Back August 2018 Supervisor: Clóvis Antonio Rodrigues, Phd. Area of concentration: Natural Products and Bioactive Synthetic Substances Number of Pages: 138. Silver has potent antimicrobial action, and it is difficult for microorganisms to develop resistance against it. However, its use is still restricted because of toxicity and particle aggregation problems. Coating silver nanoparticles with biopolymers, such as chitosan, and the presence of magnetic material, are possible alternatives to resolve these problems. Based on this context, the purpose of this thesis is to synthisize, characterize, and evaluate the antimicrobial activity and toxicity of magnetic O-Carboxymethyl chitosan (O-C) containing silver nanoparticles. In the synthesis, different reducing agents (sodium borohydride, sucrose and O-C only) were used. Subsequently the compounds were characterized by different techniques. The antimicrobial activity of the compounds was evaluated by determining the minimum inhibitory concentration (MIC) and microbial growth kinetics. Also, in vitro cytotoxicity with L929 cells and toxicity against Artemia salina and Cucumis sativus seeds were evaluated. The results of nanocomposite characterization showed that silver nanoparticles prepared without reducing agent have a smaller particle size (~5±3 nm). The magnetization curves showed that the nanoparticles of maguemite transit in the superparamagnetic state. Nanocomposites submitted to antimicrobial tests showed good activity against Staphylococcus aureus and Escherichia coli and moderate activity

12 against yeast Candida albicans and resistant strains of Staphylococcus aureus. The nanocomposite synthesized with sucrose presented the best antimicrobial activity, with MIC of 15.6 μg/ml for E. coli and S. aureus and 125 μg/ml for C. albicans. The antimicrobial behavior as a function of time showed that the nanocomposite synthesized without reducing agent was able to completely inhibit microbial growth for 48 hours. No material induced a decrease in the viability of L929 cells in the in vitro model. In the nanoecotoxicity studies, no toxicity was observed against Artemia salina, and slight deleterious effects were observed against Cucumis sativus, especially for the nanocomposites with greater amounts of silver. In general, the materials synthesized with sucrose and without reducing agent have were shown to be promising, due to the high antimicrobial activity and reduced toxicity, as well as the use of "eco-friendly" methodologies in the synthesis. Keywords: O-carboxymethyl chitosan. Magnetic nanoparticles. Silver nanoparticles. Antimicrobial activity. Nanoecotoxicology.

13 LISTA ABREVIATURAS AgNPs Nanopartículas de prata. CAT Catalase. CAg O-carboximetilquitosana magnética contendo nanopartículas de prata sintetizadas sem agente redutor. CAgN O-carboximetilquitosana magnética contendo nanopartículas de prata sintetizadas com o agente redutor NaBH 4. CAgS O-carboximetilquitosana magnética contendo nanopartículas de prata sintetizadas com o agente redutor sacarose. CIM Concentração inibitória mínima. CLSI Instituto de Normas Clínicas e Laboratoriais. DMSO Dimetilsufóxido. DNA Ácido desoxirribonucleico. DO Densidade optica. EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético. EDX Espectrometria de energia dispersa de Raios-X. ERO Espécies reativas de oxigênio FC Field cooling. FDA Food and Drug Administration. Hc Coercitividade. GI Índice de germinação. GSH Glutationa reduzida. GST Glutationa S-transferase. HRTEM Microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução. LOOH Lipoperoxidos. MAg Partículas magnéticas contendo nanopartículas de prata sintetizadas sem agente redutor.

14 MAgN Partículas magnéticas contendo nanopartículas de prata sintetizadas com o agente redutor NaBH 4. MAgS Partículas magnéticas contendo nanopartículas de prata sintetizadas com o agente redutor sacarose. MET Microscopia eletrônica de transmissão. MEV Microscopia eletrônica de varredura. MEV-BSE Microscopia eletrônica de varredura com detector de elétrons retroespalhados. MEV-SE Microscopia eletrônica de varredura com detectores de sinal de elétrons secundários. Mr Magnetização remanescente. MRSA Staphylococcus aureus resistentes a meticilina. Ms Magnetização de saturação. MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio. NPMs Nanopartículas magnéticas. O-C O-carboximetilquitosana. OCM O-carboximetilquitosana magnética. PBS Tampão fosfato de sódio. SFB Soro fetal bovino. TG Termogravimetria. SEI Inibição do alongamento da plântula. SOD Superóxido dismutase. STEM/HAADF Microscopia eletrônica de varredura por transmissão em campo escuro de alto ângulo. Tb Temperatura de bloqueio. TTC 2, 3, 5-trifenil tetrazólio. TRIS tris-hidroximetilaminometano. ZFC Zero field cooling.

15 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Estruturas moleculares da quitina e quitosana Figura 2. Estrutura molecular do principal monômero da Figura 3. Esquema exemplificando um tratamento vetorizado utilizando NPM Figura 4. Representação da estrutura cristalina da magnetita Figura 5. Representação esquemática da reação de síntese da O- carboximetilquitosana Figura 6. (a) TEM imagem das NPM; (b) Transformada de Fourier da imagem; (c) Histograma da distribuição de tamanho de partícula e ajuste para função log-normal (linha contínua) Figura 7. (a) STEM/HAADF imagem da amostra MAgS; (b) imagem ampliada e filtrada pela transformada de Fourier vista na direcção <112> da nanopartícula γ-fe 2O 3 mostrada na estrutura destacada em (a) Figura 8. (a) Imagem MET do nanocompósito CAg e perfil EDX das áreas selecionadas: (b) área 1 e (c) área Figura 9. (a) Imagem MET da amostra MAg e (b) Espectro EDX da área Figura 10. Imagens HRTEM das morfologias mais comuns da prata encontradas nas amostras estudadas: (a) monocristalina, (b) decaédrica, (c) retorcida simples e (d) retorcido de múltiplas formas Figura 11. Curvas de magnetização em função do campo magnético aplicado nas temperaturas de 4 K (a) e 300 K (b)... 74

16 Figura 12. Curvas de magnetização em função da temperatura ZFC/FC. Medidas com 50 Oe para as amostras sem O-C (a) e com O-C (b) Figura 13. Espectros de infravermelho com transformada de Fourier (IV-FT) dos nanomateriais OCM (1), MAgN (2), CAgN (3), MAgS (4), CAgS (5), MAg (6) e CAg (7) Figura 14. Curvas TG dos nanomateriais NPM (1), CM (2), MAg (3), MAgN (4), MAgS (5), CAg (6), CAgN (7) e CAgS (8)...80 Figura 15. Curvas de crescimento para S. aureus (a), E. coli (b) e C. albicans (c) expostos ao nanocompósito CAgN...86 Figura 16. Curvas de crescimento para S. aureus (a), E. coli (b) e C. albicans (c) expostos ao nanocompósito CAgS Figura 17. Curvas de crescimento para S. aureus (a), E. coli (b) e C. albicans (c) expostos ao nanocompósito CAg Figura 18. Imagens de MEV-SE da E. coli: não tratada (a) e tratada (b) com CAgS Figura 19. Imagem MEV-BSE de células de E. coli tratadas com CAgS (a); mapeamento elementar de raios-x da imagem (a) para carbono (b) e para ferro (c). Espectro de EDX da bactéria A Figura 20. Viabilidade celular de fibroblastos (L929) expostos 24 h aos nanomateriais NPM (a), OCM (b), MAg (c), MAgS (d), MAgN (e), CAg (f), CAgS (g), CAgN (h) em ensaio de MTT Figura 21. Influência das nanopartículas na inibição do crescimento das plântulas de Cucumis sativus...98 Figura 22. Influência das nanopartículas sobre o índice de germinação das sementes de Cucumis sativus Figura 23. Teor de clorofila presente nas folhas de Cucumis sativus expostas as nanopartículas

17 Figura 24. Avaliação da citotoxicidade na Cucumis sativus. (A) Ensaio de absorção do corante azul de Evans pelas raízes, (B) Extravasamento de íons nas raízes, (C) Efeito na atividade mitocondrial através da coloração TTC. Plântulas expostas a 1000 mg/l de nanopartículas Figura 25. Micrografias dos náuplios de Artemia salina obtidas por fluorescência (preto/verde) e por transmissão (cinza) após 48 h de exposição ao nanocompósito CAgS (500mg/L) (a) e (d), controle negativo (b) e zoom da imagem a (c) Figura 26. Efeito da exposição por 48 h de suspensões de nanopartículas (500 mg/l) nas atividades das enzimas antioxidantes da Artemia salina. Superóxido dismutase (A), catalase (B) e glutationa S- transferase (C). *Diferenças significativas (P<0,05) vs grupo controle de acordo com o teste de Dunnett

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19 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Quantidade de prata presente nos nanocompósitos Tabela 2. Parâmetro magnéticos obtidos a partir das curvas de histereses e ZFC/FC Tabela 3. CIM dos nanocompósitos para E. coli, S. aureus e C. albicans. 82 Tabela 4. CIM dos nanocompósitos para cepas resistentes de S aureus, n 1 (MRSA), n 2 e n 3 (multirresistência, sendo sensíveis apenas a vancomicina) Tabela 5. Peso seco (g) das plântulas de Cucumis sativus expostas as nanopartículas normalizado para o número de sementes germinadas (Média ± desvio padrão) Tabela 6. Quantidade de prata e ferro acumulados em Cucumis sativus expostas a uma suspensão contendo 1000 mg/l das nanopartículas Tabela 7. Efeitos nos parâmetros oxidativos das plântulas de Cucumis sativus expostas aos nonomateriais. (Média±desvio padrão). *Diferenças significativas (P <0,05) versus grupo controle de acordo com o teste de Dunnett Tabela 8. Taxa de mortalidade (%) dos náuplios de Artemia salina após 24 e 48h de incubação com os nanomateriais

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21 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos REVISÃO DA LITERATURA Nanopartículas de prata Utilização de nanopartículas de prata como agente antimicrobiano Quitosana Nanopartículas magnéticas (NPM) Utilização de sistemas magnéticos contendo nanopartículas de prata e quitosana Nanoecotoxicologia MATERIAL E MÉTODOS Síntese da O-Carboximetilquitosana (O-C) Síntese das nanopartículas magnéticas (NPM) Incorporação das NPM na O-C Síntese das nanopartículas de prata Síntese com NaBH Síntese com sacarose Síntese sem adição de agente redutor Caracterização das nanopartículas Espectroscopia de infravermelho Termogravimetria (TG) Determinação do teor de prata Microscopia eletrônica de transmissão (MET)... 50

22 4.5.5 Caracterização magnética Atividade antimicrobiana Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) Curva de crescimento microbiano Microscopia eletrônica de varredura da E. coli Citotoxicidade in vitro Linhagem celular e condições de cultivo Ensaio de viabilidade celular (MTT) Ensaio de fitotoxicidade com Cucumis sativus Testes de germinação das sementes Determinação da quantidade de prata e ferro acumulados nas plântulas Determinação da quantidade de clorofila Avaliação da morte celular usando o corante azul de Evans Efeito na atividade metabólica - coloração com TTC Extravasamento de eletrólitos Avaliação dos indicadores de estresse oxidativo Ensaio de toxicidade aguda com Artemia salina Taxa de mortalidade Microscopia dos náuplios de Artemia salina Determinação da atividade enzimática RESULTADOS E DISCUSSÃO Síntese dos nanomateriais Caracterização das nanopartículas Quantidade de prata presente nos nanocompósitos Caracterização estrutural Comportamento magnético Espectroscopia na região do infravermelho Análises termogravimétricas (TG)...80

23 5.3 Ensaios de atividade antimicrobiana Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) Curvas de crescimento microbiano Microscopia Eletrônica de varredura (MEV) da bactéria Citotoxicidade in vitro com células L Ensaios de avaliação de fitotoxicidade Inibição do alongamento da plântula (SEI) Índice de germinação (GI) Peso seco Determinação da acumulação de prata e ferro Teor de clorofila Ensaios de citotoxicidade com Cucumis sativus Avaliação dos níveis de antioxidantes Ensaio de Toxicidade aguda com Artemia salina Taxa de mortalidade Avaliação dos indicadores de extresse oxidativo REFERÊNCIAS

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25 23 1 INTRODUÇÃO O surgimento de micro-organismos resistentes representa uma grande ameaça para os setores de saúde pública e de tecnologia alimentar. Infecções bacterianas resistentes resultam na utilização de maiores doses de medicamentos, combinação de antibióticos diferentes, tratamentos com maior toxicidade, maior tempo de internação e aumento da mortalidade, além de custo elevado (LARA et al., 2010; RILEY et al., 2012). Atualmente, a nanotecnologia vem florescendo como uma ferramenta extremamente poderosa e versátil para combater estes microorganismos resistentes. Os micro-organismos têm dificuldade em adquirir resistência contra as nanopartículas que tem como alvos vários componentes bacterianos, ao contrário da ação mecanicista dos antibióticos comumente utilizados na clínica (MATAI et al., 2014). No que diz respeito aos nanomateriais, partículas nano-híbridas com morfologias distintas, especialmente metal-óxido nanocompósitos, têm chamado a atenção, pois combinam as propriedades dos elementos constitutivos exercendo um efeito mais pronunciado (COZZOLI; PELLEGRINO; MANNA, 2006). Entre as várias nanopartículas metálicas existentes, a prata é sempre a candidata mais interessante e promissora a ser investigada, devido às suas propriedades antimicrobianas conhecidas desde os tempos antigos (KIM et al., 2007; MOHLER et al., 2018; MORONES et al., 2005). No entanto, a prata está associada a problemas de agregação com a redução no seu tamanho, o que afeta consideravelmente a sua atividade, e a problemas de toxicidade. Para superar estes problemas, a prata pode ser revestida com polímeros naturais, como a quitosana, que é biodegradável e não tóxica, formando nanocompósitos poliméricos biocompatíveis (KUMAR-KRISHNAN et al., 2015; SANPUI et al., 2008).

26 24 A incorporação de nanopartículas de óxido de ferro, que possuem propriedades magnéticas, em materiais contendo prata, traz várias vantagens ao sistema, como separabilidade, recuperação das partículas do meio e possibilidade de tratamento vetorizado com alto nível de acumulação no tecido-alvo ou órgão específico (MAHMOUDI et al., 2011; SHARIFI et al., 2018). Entre os vários materiais magnéticos desenvolvidos, a magnetita (Fe 3O 4) e a maguemita (γ-fe 2O 3) são as únicas nanopartículas magnéticas aprovadas pelo FDA como suporte para aplicações biológicas (MERCANTE et al., 2012) e já foram amplamente investigadas por causa de sua biocompatibilidade, não toxicidade e alta magnetização. No entanto, a maguemita é preferida devido à sua estabilidade ambiental relativamente maior (KALOTI; KUMAR, 2016). Baseado neste contexto, o presente trabalho tem como objetivos a síntese e caracterização de nanocompósitos à base de O- carboximetilquitosana (O-C) contendo nanopartículas magnéticas e nanopartículas de prata (AgNPs), para posterior utilização como agente antimicrobiano, bem como avaliação da toxicidade.

27 25 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral Sintetizar, caracterizar e avaliar a atividade antimicrobiana e toxicidade de partículas de O-carboximetilquitosana magnéticas contendo nanopartículas de prata. 2.2 Objetivos específicos Sintetizar a O-carboximetilquitosana magnética e as nanopartículas de prata com diferentes tipos de agentes redutores. Caracterizar os materiais obtidos através de quantificação de prata, espectroscopia no infravermelho, termogravimetria, microscopia eletrônica de transmissão e comportamento magnético. Avaliar a atividade antimicrobiana dos materiais através da determinação da concentração inibitória mínima e curva de crescimento microbiano. Avaliar a citotoxicidade in vitro dos materiais sintetizados. Investigar a nanoecotoxicidade em sementes de Cucumis sativus e contra Artemia salina.

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29 27 3 REVISÃO DA LITERATURA 3.1 Nanopartículas de prata Os últimos anos têm sido marcados por uma expansão sem precedentes em pesquisa e desenvolvimento de nanotecnologia e nanomateriais. A nanotecnologia pode ser descrita como a ciência que manipula a matéria em uma escala de 0,1 e 100 nm, utilizando princípios da física, química e da biotecnologia, com o intuito de: i) sintetizar novos materiais que possuam novas propriedades; ii) modificar e manipular superfícies, e iii) elaborar microestruturas em duas ou três dimensões, objetivando uma determinada aplicação (DREXLER; MINSKY, 1990; MULVANEY, 2015). As nanopartículas metálicas possuem funcionalidade e utilidade ampla para numerosas aplicações industriais e de consumo, incluindo tratamento de água, produção de energia, medicamentos e novos sistemas terapêuticos de administração de medicamentos, eletrodomésticos, eletrônicos, suplementos alimentares e equipamentos esportivos (HANSEN, 2010). Nanopartículas de prata (AgNPs), em particular, têm atraído muita atenção em pesquisas científicas devido à sua versatilidade em diferentes áreas como engenharia, medicina, química e física (JANA; PAL, 2007; MARAMBIO-JONES; HOEK, 2010). Algumas propriedades físico-químicas das AgNPs, incluindo tamanho, forma, carga de superfície, revestimento, aglomeração e taxa de dissolução são particularmente importantes para a determinação de seu impacto e interações biológicas. Partículas menores têm uma maior área superficial e, portanto, maior potencial tóxico (JOHNSTON et al., 2010). É bem conhecido que a forma das nanoestruturas de prata pode afetar dramaticamente as suas propriedades físicas e químicas.

30 28 Frequentemente, as nanoestruturas de prata mais utilizadas na área biomédica incluem nanopartículas esféricas, nanofios, nanobastões, nanopratos e nanocubos (RYCENGA et al., 2011). Estudos mostram que os efeitos biológicos das AgNPs dependem das diferentes cargas superficiais dos seus revestimentos, pois podem afetar a interação das AgNPs com sistemas vivos (POWERS et al., 2011). A aglomeração geralmente ocorre com nanopartículas mais modificadas. Foi demonstrado que a aglomeração das AgNPs pode ocorrer em meios de cultura, bem como, dentro do citoplasma e núcleo das células humanas HepG2 (KIM et al., 2009). A dissolução das AgNPs como um resultado da oxidação de superfície leva à produção de prata iônica. A taxa de dissolução depende das propriedades químicas e de superfície da partícula, bem como do seu tamanho e é ainda afetada pelo meio em que se encontra (MISRA et al., 2012). Muitas rotas foram introduzidas para a síntese de nanoestruturas de prata, que podem ser classificadas como métodos químicos, físicos e biológicos. Entre os métodos relatados os preferidos são os métodos químicos devido à facilidade de síntese em solução. Os métodos químicos para a síntese de nanoestruturas de prata podem ser subdivididos em redução química, técnicas de eletroquímica, assistidos por irradiação e pirólise (WEI et al., 2015). A síntese de AgNPs em solução geralmente contém três componentes principais: metal precursor, agente redutor e agente estabilizante/protetor. Os agentes redutores mais utilizados incluem boro-hidreto, citrato de sódio, ácido ascórbico, álcool e compostos de hidrazina (SOTIRIOU; PRATSINIS, 2010). A redução de íons de prata (Ag + ) em solução aquosa produz geralmente uma solução coloidal com partículas com diâmetros na escala nanométrica. Inicialmente, a redução de vários complexos com íons Ag +, conduz à formação de átomos de prata (Ag 0 ), a qual é seguida por

31 29 aglomeração em clusters oligoméricos. Estes aglomerados eventualmente conduzem à formação de partículas de prata coloidal (KAPOOR et al., 1994). Recentemente, métodos biossintéticos (química verde) que empregam agentes de ocorrência natural, tais como, açúcares redutores, quitosana, celulose, bicho da seda, peptídeos e extratos de plantas e microorganismos (fungos e bactérias) têm emergido como uma alternativa simples e viável para a síntese de AgNPs (EL-NOUR et al., 2010) Utilização de nanopartículas de prata como agente antimicrobiano A propriedade antibacteriana da prata é conhecida desde muito tempo. Os gregos antigos cozinhavam em recipientes de prata para conservar a comida por mais tempo. Alexandre, o Grande, costumava beber somente em copos de prata. O primeiro registro de uso medicinal da prata remonta ao século VIII. Em 980 depois de Cristo Avicenna usava a prata como um purificador do sangue, para o mau hálito e para palpitações cardíacas. O interesse em sais de prata ou soluções de sal de prata no tratamento de pacientes com queimaduras desapareceram completamente depois da segunda guerra mundial, devido a descoberta da penicilina e sulfonamidas (KLASEN, 2000). O interesse pela prata (nitrato) voltou muitos anos depois sob o estímulo de uma publicação de Moyer et al. em Foi demonstrado que a utilização de solução aquosa de AgNO 3 0,5%, em conjunto com as técnicas já utilizadas, era eficaz no tratamento de queimaduras, visto que somente com os antibióticos da época os pacientes acabavam morrendo devido ao desenvolvimento de resistência pelos micro-organismos. (KLASEN, 2000; MOYER et al., 1965). Atualmente as AgNPs são amplamente utilizadas como agentes antibacterianos pela indústria farmacêutica, no armazenamento de alimentos,

32 30 em revestimentos têxteis e em um número de aplicações ambientais. É importante salientar que, apesar de décadas de utilização, a evidência da não toxicidade da prata ainda não é clara, apesar de que muitos produtos feitos com AgNPs são aprovados por órgãos reguladores, incluindo o Food and Drug Administration (FDA) e a Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (BHATTACHARYA; MUKHERJEE, 2008). A prata é utilizada como um biocida para prevenir infecção em queimaduras, feridas traumáticas e úlceras diabéticas (SILVER; PHUNG; SILVER, 2006). Outros usos incluem revestimento de cateteres e outros dispositivos médicos implantados. É também usada como um desinfectante de água. Atualmente o padrão ouro para o tratamento de queimaduras é a sulfadiazina de prata (ATIYEH et al., 2007). Devido a prata possuir potente atividade contra bactérias Grampositivas e Gram-negativas e baixa toxicidade para células de mamíferos em baixas concentrações, as AgNPs são uma alternativa para superar o problema de resistência dos micro-organismos aos antibióticos. AgNPs têm um alto potencial de solucionar o problema das bactérias multirresistentes pois os micro-organismos tem dificuldade de desenvolver resistência contra a prata, como acontece com os outros antibióticos, pois a prata possui vários alvos de ataque contra a célula microbiana (DOS SANTOS et al., 2014). Além disso, AgNPs possuem, também, a capacidade de romper a formação de biofilme (KALISHWARALAL et al., 2010). Os biofilmes são formados devido à fixação das bactérias em superfícies sólidas resultando em um conglomerado de células bacterianas. Os biofilmes aumentam a resistência à terapia medicamentosa e desinfetante e auxiliam o agente patogênico a fugir das respostas imunes do hospedeiro e a estabelecer infecções crônicas (JEFFERSON; CERCA, 2006).

33 31 Embora o efeito antibacteriano das AgNPs venha sendo extensivamente estudado, os mecanismos envolvidos em sua ação foram apenas parcialmente elucidados, com várias hipóteses sendo propostas. Muitos estudos relataram o dano direto na membrana celular como mecanismo principal da ação das AgNPs; de fato, a sua aderência sobre a parede celular microbiana pode causar mudanças estruturais na membrana celular e aumentar a sua permeabilidade conduzindo a um poderoso efeito tóxico (MORONES et al., 2005). Interações eletrostáticas estão eventualmente envolvidas na ligação entre a membrana da célula bacteriana, que possui carga negativa, e as nanopartículas. Estas interações e seu efeito sobre a integridade da membrana são diretamente dependentes do tamanho (YEN; HSU; TSAI, 2009), forma (PAL; TAK; SONG, 2007) e concentração (ASHARANI; HANDE; VALIYAVEETTIL, 2009) das AgNPs. As AgNPs têm a habilidade de interferir no processo de replicação da bactéria pois se aderem no seu DNA ou RNA. O íon Ag + interage fortemente com os grupamentos tiol presentes em enzimas vitais e com bases fosforiladas do DNA. A interação com as bases de DNA pode inibir a divisão celular e a replicação do DNA, levando a morte celular. Porém, esta hipótese é controversa nos trabalhos científicos publicados, Hwang et al. (2008) não evidenciaram dano ao DNA, enquanto que Klueh et al., (2000) sugerem que a atividade bactericida seja devido a entrada dos íons de prata nas células e a sua intercalação entre as bases purina e pirimidina do DNA, levando a sua desnaturação. Shrivastava et al. (2007) propuseram que as AgNPs modulam o perfil de fosfotirosina dos peptídeos putativos da bactéria, o que pode afetar a sinalização celular, gerando inibição do crescimento da bactéria. Klueh et al. (2000) sustentam a hipótese de interação entre a prata e os grupamentos tiol nas enzimas.

34 32 As interações entre os nanomateriais e as células, a captação celular e a resposta tóxica subsequente da célula estão entre as questões mais importantes relativas à toxicidade induzida por AgNPs. Para a maioria das células, a captação de AgNPs se dá principalmente através de endocitose, que é dependente do tempo, da dose e de energia, e as principais organelas alvo são endossomos e lisossomos (ZHANG et al., 2014a). As nanopartículas podem induzir a formação direta de espécies reativas de oxigênio (ERO) depois de serem expostas ao ambiente ácido dos lisossomos (CHANG et al., 2012). Além disso, também pode ocorrer a acumulação de Ag + nos lisossomos (SINGH; RAMARAO, 2012). As ERO são altamente reativas e provocam dano oxidativo em proteínas e no DNA e induzem disfunção mitocondrial. AgNPs e Ag + podem, também, escapar dos lisossomos, induzindo ainda mais o aumento intracelular de ERO. AgNPs e Ag + liberados interagem preferencialmente com os grupamentos tiol de moléculas presentes no citoplasma, membrana celular e da membrana interior da mitocôndria, o que pode gerar peroxidação lipídica e aumentar a permeação da membrana celular e dos sistemas mitocondriais (ZHANG et al., 2014a). Os danos na membrana celular resultam em vazamento do conteúdo citoplasmático e eventual necrose, enquanto a ruptura da membrana lisossomal ativa a apoptose celular. Além disso, os danos à mitocôndria prejudicam a transferência de elétrons, ativando, também, a apoptose (ARORA et al., 2008). 3.2 Quitosana A utilização de agentes protetores é importante para estabilizar a dispersão de nanopartículas. A estratégia mais comum é a de proteger as AgNPs com estes agentes, geralmente polímeros, que podem ser absorvidos ou se ligam à superfície da nanopartícula, evitando a sua aglomeração. Os

35 33 polímeros mais comumente utilizados são o poli(vinilpirolidona) (PVP), poli(etilenoglicol) (PEG), ácido poli(metacrilico) (PMAA) e polimetilmetacrilato (PMMA) (BAI et al., 2007). A quitosana, um polímero natural, apresenta vantagens em relação aos outros, devido à sua versatilidade, biocompatibilidade, funcionalidade, segurança, biodegradabilidade (pela ação de enzimas como lisoenzimas ou quitinases) e sua ação bactericida e bacteriostática (CALERO et al., 2010; DI CORATO et al., 2011; RAVI KUMAR, 2000). A quitina é o polissacarídeo mais difundido em organismos vivos e o segundo polissacarídeo mais abundante na natureza (MUZZARELLI, 1983). A quitosana é obtido por desacetilação das unidades de N-acetilglucosamina da quitina (Figura 1), geralmente por hidrólise sob condições alcalinas a uma temperatura elevada. Como essa desacetilação é parcial, a cadeia polimérica da quitosana possui tanto monômeros acetilados quanto desacetilados. Sendo, portanto, considerado um polímero heterogêneo. (RINAUDO, 2006).

36 34 Figura 1 - Estruturas moleculares da quitina e quitosana Fonte: Adaptado de Tran et al. (2011) Um aspecto importante para a aplicação da quitosana é o seu destino no organismo após absorção ou injeção. Geralmente, a quitosana é eliminada através de depuração renal, mas, se o peso molecular for grande demais uma degradação enzimática será necessária. Acredita-se que a quitosana seja degradada em vertebrados predominantemente pela lisozima e por enzimas bacterianas no cólon. Além disso, oito quitinases humanas já foram identificados, três destas (quitinase ácida de mamíferos, di-n-acetilquitobiase e quitotriosidase) demonstraram atividade enzimática (KEAN; THANOU, 2010). No entanto, a taxa de degradação depende do peso molecular e do grau de acetilação do material de partida, sendo que quanto maior o grau de acetilação maior será a biodegradação (YANG et al., 2007).

37 35 A quitosana é um polímero reativo susceptível à muitas modificações químicas (MUZZARELLI, 1983). A fim de melhorar ou conferir novas propriedades, modificações químicas nas cadeias da quitosana, em geral, por um enxerto de pequenas moléculas ou outras cadeias de polímeros ou por quaternização dos grupos amino, tem sido investigadas. Cadeias de quitosana possuem três sítios reativos químicos para modificação: dois grupos hidroxila e uma amina primária (RIVA et al., 2011). A O-carboximetilquitosana (O-C) (Figura 2) é um derivado da quitosana solúvel em água no qual o grupamento o-hidroxila é substituído por um grupamento carboximetil através da formação de uma ligação éter, conferindo para o polímero solubilidade em meio básico e ácido (ZHU et al., 2005). Sua segurança foi analisada em ratos albinos. Os ratos receberam ração revestida com O-C (1,3 % (p/p)) e também 1 ml de uma solução aquosa contendo 2 % de O-C, foram avaliadas a alteração do peso corporal, peso dos órgãos vitais, parâmetros histopatológicos e hematológicos, não demonstrando alterações significativas nas características estudadas e sendo considerado biocompatível (RAMESH; VISWANATHA; THARANATHAN, 2004). Figura 2 Estrutura molecular do principal monômero da O-carboximetilquitosana

38 36 Há na literatura alguns estudos empregando a quitosana e seus derivados como agente protetor e/ou redutor em sistemas contendo AgNPs. Yang e Li (2014) utilizaram a vitamina C como agente redutor e a quitosana como agente protetor, obtiveram nanopartículas esféricas com tamanho de 35 nm (preparadas em ph 2,34) e de 18 nm (preparadas em ph 9,32), com elevada ação antimicrobiana contra Escherichia coli e Staphylococcus aureus, com zona de inibição de 25mm e de 20 mm, respectivamente. Outro estudo empregou apenas a quitosana e o nitrato de prata na síntese. Neste caso, a quitosana foi o agente redutor e estabilizador das AgNPs. A irradiação UV foi utilizada para melhorar a eficiência da síntese. As nanopartículas formadas possuíam forma esféricas, com tamanho médio de 27,1 nm (LOU et al., 2014). A síntese utilizando apenas nitrato de prata e quitosana foi relatada também, por Kang e colaboraboradores (2014) empregando na síntese temperatura de 70 C seguida de resfriamento a -85 C e por Lee et al. (2014a) empregando electrospinning na síntese das AgNPs. Mohamed e Sabaa (2014) utilizaram a O-C como agente redutor e estabilizador de AgNPs. Os autores sintetizaram um hidrogel contendo AgNPs esféricas e com tamanho de partícula de 9-16 nm. O hidrogel demonstrou atividade contra as bactérias Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria gonorrhoeaee, Staphylococus aureus, Bacillus subtilis e Enterococcus faecalis e contra a levedura Candida albicans. 3.3 Nanopartículas magnéticas (NPM) Os compostos que contém nanopartículas de prata possuem muitas vantagens no campo dos antimicrobianos devido sua alta potência e amplo espectro de ação. No entanto, o uso direto de nanopartículas de prata como desinfectante de água para consumo humano ou outros líquidos pode trazer

39 37 alguns riscos potenciais, pois a nanoprata é tão pequena que não pode ser eliminada por filtração ou centrifugação e a prata residual em alta concentração na água pode ser tóxica (LEVARD et al., 2012; VAN DER ZANDE et al., 2012). Portanto é necessário encontrar uma maneira efetiva de eliminar a nanoprata residual da solução depois que as bactérias forem inativadas. Recentemente nanopartículas híbridas de Ag/Fe 3O 4, combinam as vantagens do material magnético com a nanoprata, proporcionando a separação magnética do antimicrobiano e evitando a contaminação ambiental (FANG et al., 2014). Além disso, as NPM podem trazer outras vantagens para o sistema, como aumento da capacidade antimicrobiana através da aplicação de um campo magnético externo e tratamento vetorizado (DURMUS; WEBSTER, 2013). Os medicamentos quando são administrados no corpo agem sobre ele como um todo, resultando, muitas vezes, em efeitos colaterais indesejados devido a não especificidade e alta dosagem, bem como, efeito terapêutico reduzido devido à baixa acumulação do medicamento no órgão ou tecido alvo. O carreamento de fármacos (drug delivery) ou tratamento vetorizado utilizando sistemas nanoparticulados magnéticos seria uma solução para estes problemas, pois as NPM podem levar o fármaco até uma determinada região do corpo, guiadas através de um campo magnético externo (KARIMI et al., 2016). Para exemplificar, temos a Figura 3, onde um determinado fármaco incorporado a um sistema contendo NPM é guiado por um campo magnético externo até o local onde se encontra a infecção do animal, gerando uma acumulação do fármaco o local.

40 38 Figura 3 Esquema exemplificando um tratamento vetorizado utilizando NPM. Fonte: (CORCHERO; VILLAVERDE, 2009) Entre as nanopartículas magnéticas, nanopartículas de óxido de ferro como a magnetita (Fe 3O 4) ou sua forma oxidada, a maghemita (γ- Fe 2O 3), são as mais comumente utilizadas em aplicações biomédicas, devido as suas características de alta magnetização de saturação, alta susceptibilidade magnética, não toxicidade, estrutura quimicamente estável, não carcinogenicidade, biodegradabilidade, biocompatibilidade, facilidade de síntese, ser facilmente funcionalizada e ter menor sensibilidade à oxidação. Outros materiais altamente magnéticos, tais como o cobalto e o níquel são tóxicos e susceptíveis à oxidação e, portanto, são de pouco interesse (CHEN et al., 2008; GUBIN et al., 2005; SOUZA et al., 2008). A magnetita é uma espécie mista de óxido de ferro (FeO-Fe 2O 3) cuja estrutura é semelhante a do mineral espinélio (MgAl 2O 4), com distribuição catiônica invertida. Na sua estrutura (Figura 4) metade dos íons Fe 3+ são coordenados de forma tetraédrica e a outra metade dos íons Fe 3+ e

41 39 todos os íons Fe 2+ são ordenados de forma octaédrica. Cada sítio octaédrico apresenta seis íons O 2- vizinhos nas extremidades do octaedro, enquanto cada sítio tetraédrico apresenta quatro íons O 2- dispostos nas extremidades do octaedro. Suas propriedades magnéticas são decorrentes da transferência de elétron entre os íons Fe 3+ e Fe 2+ nos sítios octaédricos. A γ-fe 2O 3 apresenta somente íons Fe 3+ divididos igualmente entre sítios tetraédricos e octaédricos e apresenta menor saturação magnética do que a magnetita (SANTANA; RAMOS; FABRIS, 2008; YAN et al., 2009). Figura 4 - Representação da estrutura cristalina da magnetita Fonte: Adaptado de Teixeira et al. (2012) Normalmente, a síntese de nanopartículas magnéticas de óxido de ferro produz inicialmente magnetita, que depois vai lentamente se oxidando para maghemita. O teor relativo de magnetita e de maghemita, bem como, a distribuição do tamanho das partículas, são definidos pelas condições da síntese (SUN et al., 2004). O método mais comum e econômico para a obtenção sintética de nanopartículas magnéticas de óxido de ferro é o método Massart, onde uma definida proporção estequiométrica dos sais de Fe(II) e Fe(III) é co-precipitada em meio aquoso básico para se obter γ-fe 2O 3 nanopartículas (MASSART, 1981).

42 40 Nanopartículas magnéticas de óxidos de ferro são normalmente modificadas através da formação de camadas atômicas com polímeros/tensoativos, metais inorgânicos (por exemplo, ouro) ou superfícies de óxidos (por exemplo, sílica ou alumina), o que evita a aglomeração das partículas e também permitir a funcionalização adicional anexando várias biomoléculas (BERRY; CURTIS, 2003; FERREIRA et al., 2009). Existem na literatura vários estudos utilizando nanopartículas híbridas de prata e óxido de ferro (magnéticas). Zhang et al. (2014b) sintetizaram e avaliaram a atividade antimicrobiana de nanopartículas de prata imobilizadas em um nanocompósito de magnetita e polidopamina. A síntese das nanopartículas de prata foi in situ e sem a adição de agente redutor, o nanocompósito obtido foi formado por partículas esféricas com tamanho médio de 50 nm. O sistema apresentou atividade antimicrobiana, com CIM de 15,6 mg/l para E. coli e S. aureus. Ghazanfari, Johar e Yazdani (2014) demonstraram a síntese de nanopartículas magnéticas cobertas por nanopartículas de prata, formando uma estrutura denominada núcleo-casca (do termo em inglês core-shell ). Na síntese foi utilizado solução etanólica de nitrato de prata e o agente redutor foi a butilamina. As nanopartículas obtidas tiveram tamanho médio de 28 nm. A síntese de um nanocompósito Ag/Fe 3O 4 no estilo núcleo-casca também foi relatado por Fang et al. (2014); porém neste caso, ao contrário do estudo de Ghazanfari, Johar e Yazdani (2014), a nanopartícula de prata é o núcleo e as nanopartículas magnéticas é que fazem o revestimento externo. O nanocompósito foi sintetizado por reação solvotérmica, empregando solução contendo nitrato de prata, Fe(NO 3) 3, PVP e NaOAc e aquecimento em autoclave de 200 C por 6 horas. O material obtido foi composto por nanopartículas esféricas e porosas com tamanho médio de 100 nm. Apresentou atividade antimicrobiana contra E. coli (CIM de 30 µg/ml) e

43 41 contra Bacillus subtilis (CIM de 40 µg/ml) e devido ao alto poder de magnetização do material, as nanopartículas podem ser removidas da solução após a morte dos micro-organismos e reutilizadas. Prucek et al. (2011) reportaram a síntese de um nanocompósito parecido, porém, utilizando um método diferente. Primeiramente foi realizada a síntese das partículas magnéticas e depois a síntese das nanopartículas de prata, utilizando ácido poliacrílico e como agente redutor a maltose. O nanocompósito obtido teve tamanho de partícula de nm. O ácido poliacrílico serviu como uma espécie de espaçador entre as nanopartículas de prata e de óxido de ferro. O material obtido possui atividade antimicrobiana, com valores de CIM variando de 15,6 125 mg/l para bactérias e de 1,9 31,3 mg/l para leveduras. Não foi observado citotoxicidade contra fibroblastos embrionários de ratos na concentração inibitória mínima do composto. 3.4 Utilização de sistemas magnéticos contendo nanopartículas de prata e quitosana Com o intuito de gerar sistemas com características superiores de estabilidade, biocompatibilidade, segurança, vetorização e/ou fácil remoção têm surgido na literatura pesquisas de compósitos de prata e partículas magnéticas revestidos ou estabilizados pela quitosana. Garza-Navarro et al. (2010) sintetizaram um biocompósito de AgNPs/partículas magnética e quitosana. Neste estudo a quitosana foi utilizada como agente redutor da prata e como matriz do sistema. Os autores não mostraram nenhuma possível utilização para o sistema. A quitosana também foi utilizada para a síntese de um sistema parecido, porém os autores utilizaram o ácido ascórbico como agente redutor da prata. Neste trabalho o

44 42 biocompósito foi utilizado como agente catalisador (MOHAMMADI et al., 2014). Han et al. (2013) sintetizaram um composto contento nanopartículas magnética e de prata revestido por sílica e quitosana para utilização na remoção de pequenos contaminantes e sua detecção por espectroscopia RAMAN. Outro estudo mostra a utilização de microesferas de quitosana magnéticas (3,6 µm) decoradas com nanopartículas de prata (2,5 nm) para a descontaminação de efluentes. O material sintetizado removeu 99,99% dos contaminantes microbianos e 99,5% dos corantes presentes no meio aquoso, além de ser facilmente separado da água tratada utilizando um campo magnético externo e poder ser regenerado para reutilização (RAMALINGAM et al., 2015). Markova et al. (2012) sintetizaram um nanocompósito contendo nanopartículas magnéticas biogênicas revestidas por quitosana contendo nanopartículas de prata. As partículas magnéticas foram obtidas do isolamento de magnetossomas da bactéria Magnetospirillum gryphiswaldense e as nanopartículas de prata foram formadas utilizando a quitosana como agente redutor. Como resultado o nanocompósito preparado revelou ação antimicrobiana contra várias bactérias e fungos, com valores de CIM de 15,6 mg/l para S. aureus e E. coli e de 3,9 mg/l para C. albicans. Kaloti e Kumar (2016) desenvolveram AgNPs revestidas com quitosana e recobertas com γfe 2O 3. Foi utilizada a glicose como agente redutor e obtido nanopartículas com tamanho de 75,5 nm. O compósito apresentou elevada eficiência catalítica para a redução do corante laranja de metila, atividade antibacteriana contra E. coli com CIM de 1,1 µg/ml e CBM de 4,2 µg/ml de Ag e atividade SERS para o modelo corante p-atp com um

45 43 limite de detecção em 10 pm, sugerindo um ótimo potencial ambiental e biomédico. Outro estudo similar a este mostra a síntese de um nanocompósito de prata, partículas magnéticas e quitosana (Ag/Fe 3O 4-CS). O agente redutor utilizado foi o NaBH 4 e as nanaopartículas resultantes tiveram tamanho variando de 20 a 50 nm. O nanocompósito apresentou atividade antibacteriana, com zona de inibição de 24 mm, contra Pseudomonas aeruginosa, bem como, se mostrou útil para ser utilizado como sementes térmicas para hipertermia localizada no tratamento do câncer (NGUYEN et al., 2015). Em um estudo mais recente a quitosana e a O-carboximetilquitosana foram enxertadas na superfície de nanopartículas magnéticas revestidas com sílica. Os resultados mostraram que a presença de grupos carboxilato na O- carboximetilquitosana não só aumentou a atividade antimicrobiana, mas também proporcionou a capacidade de quelação de íons Ag para induzir a formação in situ de nanopartículas de Ag (AgNPs). Apesar da baixa atividade antimicrobiana (CIM de 1500 mg/l para E. coli), o nanocompósito se mostrou um transportador muito eficaz para entregar agentes bactericidas e erradicar biofilmes sob a orientação de um campo magnético aplicado e também, pode ser facilmente recuperado e reutilizado como agente antimicrobiano (VO; SABRINA; LEE, 2017). 3.4 Nanoecotoxicologia A produção de nanomateriais e seu uso em produtos de consumo estão aumentando rapidamente. Atualmente há mais de produtos listados no Consumer Products Inventory. O dióxido de titânio, o dióxido de silício e o óxido de zinco são os nanomateriais mais produzidos em todo o mundo (em massa) e a produção anual global de nanopartículas de prata

46 44 representa apenas 2% do TiO 2. No entanto, as nanopartículas de prata são o nanomaterial anunciado mais popular, presente em 438 produtos (24%) (JUGANSON et al., 2015). Estima-se que 63-91% das mais de mil toneladas de nanomateriais produzidos no mundo terminam em aterros, com o saldo liberado em solos de 8-28%, corpos d'água de 0,4-7% e atmosfera de 0,1-1,5% (KELLER et al., 2013). Devido à enorme produção e ao uso inadvertido de nanomateriais, todo o ambiente é afetado. Embora, muitos deles sejam úteis, alguns são tóxicos para plantas, animais, algas e microorganismos. Eles podem, portanto, representar um risco potencial para o meio ambiente (SIDDIQI; HUSEN, 2017). O termo ecotoxicologia foi criado por René Truhaut em 1969, que o definiu como "o ramo da toxicologia preocupado com o estudo de efeitos tóxicos, causados por poluentes naturais ou sintéticos, para os constituintes dos ecossistemas, animais (incluindo humanos), vegetais e microbianos, em um contexto integral". Com o advento da nanotecnologia o termo foi incorporado à palavra nano. A pesquisa em nanoecotoxicologia começou no início da década de 1990, como demonstrado pelos primeiros trabalhos científicos registrados na Thomson Reuters Web of Science, sendo que os primeiros trabalhos com o termo nanoecotoxicologia foram publicados em 2006 (KAHRU; DUBOURGUIER, 2010). Um trabalho de 2015 chamado de NanoE-Tox database mostrou que os principais organismos vivos utilizados em estudos de nanoecotoxocologia são crustáceos (26%), bactérias (17%), peixes (13%), algas (11%) e plantas (9%). Com base nos valores médios de toxicidade dos artigos científicos publicados na área (dados derivados de três ou mais artigos), a ordem de

47 45 toxicidade dos nanomateriais é Ag> ZnO> CuO> CeO 2> CNTs> TiO 2> FeOx (JUGANSON et al., 2015). Uma série de estudos demonstraram a fitotoxicidade de nanopartículas causada pela produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), que posteriormente resultam em estresse oxidativo, peroxidação lipídica, danos nas proteínas e no DNA em plantas (MA et al., 2015a). Após a acumulação nas plantas as nanopartículas podem causar vários efeitos deletérios para as culturas, como diminuição na taxa de germinação das sementes, diminuição da fração fresca e da biomassa seca, diminuição do comprimento das raízes e brotos, alterações no processo de fotossíntese, danos ao DNA, reduzindo a taxa de transpiração, aumentando a peroxidação lipídica, regulação ascendente e descendente de vários genes relacionados ao estresse e, finalmente, apoptose (HOSSAIN; MUSTAFA; KOMATSU, 2015; YANG; CAO; RUI, 2017). Quanto à ecotoxicidade aquática dos nanomateriais, a maioria dos dados disponíveis referem-se a espécies de água doce, principalmente Daphnia magna, e há notavelmente menos informações sobre espécies marinhas (JUGANSON et al., 2015). Entre estes, o crustáceo zooplâncton Artemia sp. (Crustacea, Branchiopoda: Anostraca) foi reconhecido como um modelo biológico adequado em nanoecotoxicologia (LIBRALATO, 2014) devido ao amplo conhecimento de sua biologia e ecologia e a possibilidade de fornecer vários tipos de informações relacionadas a efeitos tóxicos dos materiais em estudo. Além disso, os testes com Artemia sp. podem ser realizados sem a reprodução prévia dos animais adultos no laboratório (os náuplios são incubados como cistos latentes disponíveis no mercado), que também permite a determinação da idade exata dos náuplios utilizados para os experimentos (KOS et al., 2016). Além de baixo custo, fácil manipulação

48 46 e manutenção em condições de laboratório e alta adaptabilidade a várias condições de teste (NUNES et al., 2006).

49 47 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Síntese da O-Carboximetilquitosana (O-C) Inicialmente 67,5 g de hidróxido de sódio foram dissolvidos em 50 ml de água destilada e 450 ml de isopropanol. Em seguida foi adicionado 50 g de quitosana (lote H0512-A2, adquirida da Purifarma Distribuidora Química e Farmacêutica Ltda, peso molecular de 265 g/mol, com grau de desacetilação de 80%). Esta mistura ficou em agitação durante uma hora a temperatura de 0 C e foi armazenada na mesma temperatura por 24 horas. Posteriormente uma solução de 75 g de ácido monocloroacético em 100 ml de isopropanol foi gotejada sobre a mistura anteriormente preparada, mantendo a temperatura em 0 C. A reação foi mantida nessa temperatura por aproximadamente 48 horas e então foi interrompida pela adição de 400 ml de etanol 70%. A mistura formada foi então filtrada, lavada com etanol 70 90% e seca em dessecador em temperatura ambiente (CHEN; PARK, 2003). 4.2 Síntese das nanopartículas magnéticas (NPM) Separadamente foram dissolvidos 17 g de FeCl 3 e 20 g de (NH 2)SO 4.6H 2O com 150 ml de água destilada cada. Posteriormente a solução de FeSO 4(NH 2)SO 4.6H 2O foi vertida lentamente na solução de FeCl 3 sob agitação vigosora, mantendo o ph em aproximadamente 9,0 pela adição de uma solução aquosa concentrada de NaOH. As partículas formadas foram filtradas, lavadas com água destilada e acetona e secas em dessecador (MA et al., 2007). 4.3 Incorporação das NPM na O-C A O-C previamente preparada (40 g) foi solubilizada em 3 L de água destilada e à esta solução foi adicionado 10 g de NPM anteriormente

50 48 preparadas e a mistura ficou sob agitação por 10 minutos. Separadamente foi preparada uma mistura de hexano (450 ml), vaselina líquida (50 ml) e tween 80 (3 ml), esta mistura foi adicionada na dispersão de O-C e NPM e ficou sob agitação por 15 minutos. Em seguida foi adicionado glutaraldeído 25% (6 ml) aos poucos e após 60 minutos foi adicionado mais 6 ml e a mistura ficou sob agitação over night. Para finalizar a mistura foi lavada com etanol 95% e acetona e seca em dessecador (DENKBAŞ et al., 2002). O nanocompósito resultante deste procedimento foi nomeado de OCM. 4.4 Síntese das nanopartículas de prata As nanopartículas de prata foram sintetizadas com diferentes metodologias: variando o agente redutor (NaBH 4, sacarose e sem adição de agente redutor) e suas concentrações e a concentração inicial de prata Síntese com NaBH 4 A OCM (2,0 g) foi dispersada em 50 ml de água destilada. O AgNO 3 (0,08, 0,17, 0,34 e 0,68 g) foi solubilizado em quantidade mínima necessária de água destilada e adicionado à esta dispersão e agitado por 10 minutos. O NaBH 4 (0,047, 0,095, 0,19 e 0,38 g), respectivamente, foi adicionado e a mistura ficou em agitação por 60 minutos sob o abrigo da luz. Para finalizar a mistura foi filtrada, lavada com água destilada e acetona e seca em dessecador. O nanocompósito resultante deste procedimento foi nomeado de CAgN. Este mesmo procedimento foi realizado utilizando como material de partida as NPM (sem O-C). O nanocompósito resultante foi nomeado de MAgN.

51 Síntese com sacarose A OCM (2,0 g) foi dispersada em 50 ml de água destilada. O AgNO 3 (0,08, 0,17, 0,34 e 0,68 g) foi solubilizado em quantidade mínima necessária de água destilada e adicionado à mistura e agitado por 10 minutos. Posteriormente foi adicionada a sacarose (1,8, 3,6, 7,2 e 14,4 g), respectivamente, previamente solubilizada em quantidade suficiente de água destilada. foi adicionado também, 0,06 ml de hidróxido de amônia e o ph foi ajustado para 11,0 com solução aquosa concentrada de hidróxido de sódio e a mistura ficou em agitação por 120 minutos sob o abrigo da luz com aquecimento de 80 C. Para finalizar a mistura foi filtrada, lavada com água destilada e acetona e seca em dessecador (ZHANG et al., 2011). O nanocompósito resultante deste procedimento foi nomeado de CAgS. Este mesmo procedimento foi realizado utilizando como material de partida as NPM (sem O-C). O nanocompósito resultante foi nomeado de MAgS Síntese sem adição de agente redutor Foi dispersa a O-C magnética (1,0 g) em 50 ml de água destilada. O AgNO 3 (0,08, 0,17, 0,34 e 0,68 g) foi solubilizado em quantidade mínima necessária de água destilada e adicionado à mistura, agitando por 10 minutos. Em seguida o ph foi ajustado para 11,0 com solução aquosa concentrada de hidróxido de sódio e a mistura ficou em agitação por 120 minutos sob o abrigo da luz com aquecimento de 80 C. Para finalizar a mistura foi filtrada, lavada com água destilada e acetona e seca em dessecador (MARKOVA et al., 2012). O nanocompósito resultante deste procedimento foi nomeado de CAg. Este mesmo procedimento foi realizado utilizando como material de partida as NPM (sem O-C). O nanocompósito resultante foi nomeado de MAg.

52 Caracterização das nanopartículas Espectroscopia de infravermelho Os espectros no infravermelho foram obtidos com Espectrômetro de Infravermelho Prestige-21, Shimadzu (Japan). O material seco foi pulverizado com KBr para posterior análise através de reflectância difusa (DRS) Termogravimetria (TG) As análises de TG foram realizadas no equipamento Netzsch modelo STA 449 F3 Jupiter numa faixa de temperatura de 30 a 700 ºC, com uma taxa de aquecimento de 10 ºC/min, empregando cerca de 7,0 mg de amostra, em célula de alumina, com vazão de gás nitrogênio de 30 ml/min Determinação do teor de prata A concentração de prata foi determinada por espectrofotometria de absorção atómica (AAS Perkin Elmer modelo Analyst 800). A curva de calibração foi preparada por diluições em série de uma solução estoque 1000 mg/l (Padrão SPEX CertiPrep ). As análises foram realizadas em colaboração com pesquisadores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais da Universidade Comunitária da Região de Chapecó Microscopia eletrônica de transmissão (MET) As micrografias de MET foram obtidas em colaboração com pesquisadores do Instituto de Física da Academia Polonesa de Ciências, utilizando um instrumento Titan Cubed FEI Cs equipado com um espectrometro de energia dispersiva de raios-x (EDX).

53 Caracterização magnética A análise do comportamento magnético das partículas foi realizada em colaboração com pesquisadores do Instituto de Física da Academia Polonesa de Ciências, utilizando um Magnetômetro de Amostra Vibrante de PPMS (Physical Property Measurement System) da Quantum Design, numa faixa de temperatura de 5 a 300 K. 4.6 Atividade antimicrobiana Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) As concentrações inibitórias mínimas (CIM) dos materiais para Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans e para estirpes resistentes de Staphylococcus aureus foram realizadas em placas de microdiluição de 96 poços utilizando metodologia padrão das Diretrizes do Instituto de Normas Clínicas e Laboratoriais (CLSI, 2012). As cepas resistentes foram isolados clínicos coletados em Itajaí, Brasil. De acordo com o perfil de resistência aos antimicrobianos realizado por ensaio de difusão radial em ágar, conforme recomendado pelo CLSI (2012) a cepa n 1 apresentou resistência do tipo MRSA (S. aureus resistentes a meticilina), e as cepas n 2 e n 3 apresentaram resistência do tipo MRSA e sensibilidade apenas a vancomicina. As diluições em série do material antibacteriano foram realizadas em caldos Mueller-Hinton (bactérias) e Sabouraud (levedura), que foram inoculados com um número padronizado de organismos (1,5 x 10 5 UFC/mL) e incubados durante a noite a 37 C. As concentrações testadas variaram de 1000 a 1,95 μg/ml. O crescimento celular foi determinado observando a turvação da cultura. Foi considerado que a concentração mais baixa dos materiais nos quais não se observava turbidez visual como a CIM.

54 Curva de crescimento microbiano Foram prepardas suspensões com volume de 50 ml dos microorganismos E. coli, S. aureus e C. albicans (1,5 x 10 6 UFC/mL) em caldos Mueller-Hinton (bactérias) e Sabouraud (levedura) contendo concentrações crescentes dos nanocompósitos magnéticos (0 μg/ml, 20 μg/ml, 40 μg/ml, 80 μg/ml e 120 μg/ml). As suspensões foram incubadas a 37 C com agitação contínua de 120 rpm. Após os tempos de incubação predeterminados a eficácia antimicrobiana foi avaliada através da leitura da densidade optica (DO) em espectrofotometro com comprimento de onda de 600 nm (SONG et al., 2012) Microscopia eletrônica de varredura da E. coli O processo de preparação da suspensão microbiana para análise foi o mesmo que o utilizado no ensaio de atividade antibacteriana. Uma alíquota de 1,0 ml de uma suspensão de E. coli tratada com o nanocompósito CAgS e outra não tratada foram centrifugadas e lavadas três vezes com tampão fosfato de sódio (PBS). As células bacterianas foram então fixadas com 2,5% de glutaraldeído durante 30 min e lavadas duas vezes com tampão PBS. Após a fixação, as células de E. coli foram concentradas por centrifugação a 4000 rpm durante 10 min, seguido por duas lavagens com tampão PBS. As células foram desidratadas gradualmente com etanol 50%, 70%, 80%, 90% e 100% durante 5 min, respectivamente (MA et al., 2011). As células das bactérias foram investigadas usando microscopia eletrônica de varredura de alta resolução (Zeiss-Auriga) com uma pistola de emissão de campo (FEG) acoplada a um Espectrômetro de energia dispersa de Raios-X (EDX). As imagens foram registradas com elétrons secundários (SE) e detectores de elétrons espalhados (BSE). Estas análises foram

55 realizadas em colaboração com pesquisadores do Departamento de Geologia da Universidade de Varsóvia Citotoxicidade in vitro Linhagem celular e condições de cultivo As células utilizadas foram adquiridas do banco de células do Rio de Janeiro, fibroblastos murino linhagem NCTC clone 929 [L CELL, L-929], de origem de tecido conectivo adiposo. No cultivo celular in vitro, células de fibroblasto murino L929 desenvolveram-se como culturas aderentes cultivadas em garrafas plásticas (poliestireno) estéreis da Techno Plastic Products (TPP). O meio de cultura DMEM (Vitrocell ) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB) (Gibco ) foi adicionado às garrafas. As células foram mantidas em estufa sob atmosfera contendo 5% de CO 2 à temperatura de 37 C. A subcultura foi realizada de acordo com a confluência das células na garrafa, utilizando-se a solução de tripsina-edta para desprender as células aderidas. Para o armazenamento das linhagens, as células, foram suspensas em meio de cultura suplementado com 10% SFB e 10% de DMSO e armazenadas em nitrogênio líquido Ensaio de viabilidade celular (MTT) As culturas celulares foram mantidas em estufa a 37 C com 5% de CO 2. As células L929 foram plaqueadas ( células/poço) em microplacas de 96 poços (TTP) e mantidas a 37 C com 5% de CO 2. Após 2 horas, foram adicionados 10 μl das suspensões de nanopartículas (1, 10, 100 μg/ml). Como controle positivo de citotoxicidade foi empregado dimetilsufóxido a 10% (DMSO). O crescimento celular foi revelado pelo

56 54 ensaio de redução do MTT (Sigma Inc.). Após 21 horas de incubação a 37 C com 5% CO 2 foram adicionados 10 μl de MTT (5 mg/ml) e a placa mantida mais 3 horas em estufa a 37 C e com 5% CO 2. Ao término desse período, o sobrenadante foi retirado, e para a dissolução dos cristais de formazan formados pela redução do MTT foi adicionado 100 μl de DMSO. A densidade óptica (DO) de cada poço foi determinada em espectrofotômetro de microplacas em 570 nm (Asxys Expert Plus, Microplate Reader G , Eugendorf, Salzburg, ÁUSTRIA) 4.8 Ensaio de fitotoxicidade com Cucumis sativus Testes de germinação das sementes As sementes de Cucumis sativus foram incubadas em placas de Petri contendo filtro de papel. Dez sementes, geometricamente distribuídas, foram incubadas com 5 ml de água destilada (controle) e com suspensões dos nanomateriais com concentrações de 1, 10, 100 e 1000 mg/l durante 120 h em temperatura ambiente sob o abrigo da luz. Os experimentos foram realizados em triplicado. O número de sementes germinadas foi registrado e medido o comprimento das raízes e brotos das plântulas. Posteriormente as plântulas foram secas a 60 C durante 48 h para determinação do peso seco. Elas foram agrupadas e pesadas juntas em cada repetição e os resultados foram normalizados para o número de sementes germinadas. A germinação das sementes e o alongamento das raízes foram combinados para gerar o índice de germinação (GI), de acordo com a equação (BELTRAMI; ROSSI; BAUDO, 1999): GI (%) = (G A L A G c L c ) 100

57 55 Onde, G A e L A são o número de sementes germinadas (%) e o alongamento das raízes (mm) para as amostras e G C e L C são os valores correspondentes ao controle. O índice de inibição do alongamento da plântula (SEI%) fornece informações sobre a inibição (valores positivos) e estimulação (valores negativos) na germinação da semente. SEI (%) pode ser calculada pela equação: SEI (%) = L c L A L c 100 onde L c e L A são os valores de alongamento das raízes (mm) do controle e das amostras, respectivamente Determinação da quantidade de prata e ferro acumulados nas plântulas Para a determinação do teor de Ag uma quantidade exata de plântulas secas tratadas com as suspensões dos nanomateriais (1000 mg/l) foi digerida com ácido nítrico até se obter uma solução transparente. A quantidade de prata foi estimada por espectrometria de absorbância atômica de chama (AAS Perkin Elmer modelo Analyst 800) Determinação da quantidade de clorofila As sementes foram incubadas com as nanopartículas na concentração de 1000 mg/l para germinação durante 120 h no escuro e depois durante 48 h na presença de luz. Depois 300 mg de folhas frescas foram coletadas e colocadas em contato com 10 ml de etanol 95% durante 48 h sob o abrigo da luz. Em seguida foi feita a leitura da absorbância das amostras em espectrofotômetro UV-vis nos comprimentos de onda de 648 e

58 nm. As quantidades de clorofila a, clorofila b e clorofila total foram determinadas através das equações (LICHTENTHALER, 1987): CflA = 13,36A 664 5,19A 648 CflB = 27,43A 648 8,12A 664 Clorofila total = CflA + CflB Onde A 664 e A 648 são os valores de absorbância das amostras lidos em 664 e 648 nm, respectivamente Avaliação da morte celular usando o corante azul de Evans A viabilidade celular foi estudada utilizando o método de coloração azul de Evans. Quatro pontas de raiz com 1 cm de comprimento do controle e das sementes tratadas com os nanomateriais na concentração de 1000 mg/l foram coradas com 2 ml de solução aquosa a 0,25% (p/v) de azul de Evans durante 15 min e depois lavadas com água destilada. Subsequentemente, as amostras foram incubadas 1 h a 50 C com uma solução de lauril sulfato de sódio em metanol-água (50:50) e a absorvância foi medida em espectrofotômetro a 595 nm (IANNONE et al., 2016) Efeito na atividade metabólica - coloração com TTC Após a exposição à nanopartículas (1000 mg/l), quatro pontas de raiz de 1 cm foram imersas em 0,5% de cloreto de 2, 3, 5-trifenil tetrazólio (TTC) e mantidas a 37 C durante 15 min no escuro. Triton-X e água foram utilizados como controles positivo e negativo, respectivamente. Em seguida, as raízes foram enxaguadas com água destilada. O complexo colorido trifenil formazan foi extraído das raízes com etanol 95% e a absorbância foi medida em 490 nm (GHOSH et al., 2015)

59 Extravasamento de eletrólitos As amostras de raízes e brotos (aproximadamente cerca de 500 mg) foram cuidadosamente lavadas com água destilada e mantidas em frascos fechados com 10 ml de água ultrapura. Para estimar o extravasamento de íons, a condutividade das amostras não tratadas e tratadas foi medida no tempo inicial e após aquecimento a 100 C durante 1 h. Os resultados foram expressos como condutividade relativa (IANNONE et al., 2016) Avaliação dos indicadores de estresse oxidativo Cinco raízes e brotos frescos de Cucumis sativus foram separados, pesados e homogeneizados com 1 ml de tampão fosfato de potássio 200 mm (ph 6,5). O homogenato foi utilizado para determinar o teor de glutationa reduzida (GSH) e de lipoperoxidos (LOOH). Em seguida, o homogenato foi centrifugado a 9000 rpm durante 20 min (4ºC) e o sobrenadante foi utilizado para determinar a atividade das enzimas glutationa S-transferase (GST), superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT). As concentrações de proteína foram determinadas pelo método de Bradford utilizando albumina de soro bovino como padrão (1,0 0,0625 mg/kg) e realizada de acordo com as instruções do fabricante Quantificação dos níveis de glutationa reduzida (GSH) Em 50 μl de homogenato foram adicionados 40 μl de ácido tricloroacético (ATC) 12,5% e após agitação as amostras foram centrifugadas por 15 min a 4000 rpm em microcentrífuga de alta velocidade refrigerada. Posteriormente, alíquotas de 10 μl do sobrenadante foram adicionadas a 280 μl de tampão TRIS 0,4 M (ph 8,9) em placa de 96 poços. A reação foi iniciada com a adição de 10 μl de DTNB (5,5 -ditiobis 2-ácido nitrobenzóico) 1 mm, e após 10 min a absorbância foi determinada

60 58 espectrofotometricamente em comprimento de onda de 415 nm. Os procedimentos foram realizados a 4 ºC e os valores individuais interpolados em uma curva padrão de GSH (0,375 3 μg), com os valores expressos em μg de GSH/mg de tecido (SEDLAK; LINDSAY, 1968) Determinação do teor de lipoperoxidos (LOOH) O teor de LOOH foi determinado utilizando o método de oxidação férrea do xilenol laranja (FOX2) (JIANG; HUNT; WOLFF, 1992). Uma alíquota de 10 μl de metanol 90% foi misturado com 50 μl de homogenato e centrifugado a 9000 rpm durante 20 minutos a 4 C. Em seguida, o sobrenadante foi misturado com o reagente FOX2 (FeSO mm, H 2SO2 25 mm, hidroxitolueno butilado (BHT) 44 mm e xilenol laranja 100 mm) e após 30 min a absorbância foi determinada em 560 nm. Os resultados foram expressos em mmol/mg de tecido utilizando o coeficiente de extinção de 43,6/M/cm Determinação da atividade da enzima glutationa-s-transferase (GST) A atividade específica da GST foi determinada pela conjugação do dicloro-nitro-benzeno (CDNB) com GSH, formando um tioéter que pode ser mensurado pelo aumento de absorbância em 340 nm. Alíquotas de sobrenadante das amostras (100 μl) foram adicionadas a uma mistura reacional contendo CDNB 1 mm, GSH 1 mm e tampão fosfato de potássio 100 mm (ph 6,5) à temperatura ambiente. O aumento da absorbância em 340 nm foi medida durante de 90s. Os resultados foram expressos em mmol/mg de proteína/min (HABIG; PABST; JAKOBY, 1974)

61 Determinação da atividade da enzima superoxido dismutase (SOD) A atividade da SOD foi determinada com base na capacidade da enzima inibir o processo de autoxidação de pirogalol. O sobrenadante das amostras (20 μl) foram misturados com 442,5 μl de tampão Tris HCl 200 mm com EDTA 2 mm (ph 8,5). Em seguida foram adicionados 25 μl de pirogalol 1 mm e depois de 20 min a reação foi interrompida com 12,5 μl de HCl 1N. Os eppendorfs foram centrifugados a 4000 rpm durante 4 min a 4 C em microcentrífuga de alta velocidade refrigerada e depois 300 μl do sobrenadante obtido foi pipetado em microplaca para leitura em espectrofotômetro a 405 nm. Os resultados foram comparados com os controles (Tampão Tris-EDTA com pirogalol sem incubação com e sem a amostra).os resultados foram expressos em U de SOD/mg de proteína (MARKLUND; MARKLUND, 1974) Determinação da atividade enzima catalase (CAT) Foi preparada uma mistura reacional que continha tampão Tris HCl- EDTA 200 mm (ph 8,5), H 2O 2 20 mm e 40 μl do sobrenadante das amostras em um volume final de 1 ml. A atividade da CAT foi medida pelo consumo de H 2O 2 através da leitura da absorbância das misturas em 240 nm durante o período de 120 s de Os resultados foram expressos em μmol/mg de proteína/min (AEBI, 1984) 4.9 Ensaio de toxicidade aguda com Artemia salina Taxa de mortalidade Os testes foram realizados conforme protocolo desenvolvido e validado por Kos et al. (2016). Os cistos desidratados de Artemia salina (de alta eclosão Maramar Aquacultura Com. Imp. Exp. Ltda.) foram eclodidos

62 60 em meio salino (sal marinho 38 g/l) com ph 8,0. Os cistos (200 mg) foram dispersos em 200 ml de meio e ficaram incubando durante 24 h sob luz e aeração. Os náuplios de 24 h foram transferidos para placas de 24 poços, sendo que em cada poço foram colocados 10 náuplios que ficaram em contato com as suspensões dos nanomateriais (2 ml) nas concentrações de 25, 50, 75, 100 e 125 mg/l. Foram utilizados 10 réplicas para cada tratamento. Como controle negativo foi usado o meio salino e para controle positivo uma solução de K 2Cr 2O 7 60 mg/l. As placas ficaram em incubação sob abrigo da luz e temperatura de 24 C. A quantidade de náuplios mortos foi avaliada nos tempos de 24 e 48 h, sendo que os náuplios imóveis eram considerados mortos Microscopia dos náuplios de Artemia salina Aproximadamente 100 náuplios de Artemia salina expostos ao nanocompósito CAgN (500 mg/l) e outros expostos ao controle negativo (água salina) durante 48 h, conforme metodologia apresentada anteriormente, foram lavados três vezes com tampão PBS ph 6,5. Posteriormente os náuplios foram fixadas com 2,5% de glutaraldeído durante 30 min e lavadas duas vezes com tampão PBS. Após a fixação foram desidratados gradualmente com etanol 50%, 70% e 95% durante 5 min, respectivamente (MA et al., 2011). As amostras foram analisadas por microscopia confocal de varredura de ponto inverso ZEISS LSM 710, e as micrografias obtidas operando nos modos de transmissão e de fluorescência Avaliação dos indicadores de extresse oxidativo Cerca de 500 náuplios de Artemia salina com 24 h de vida, eclodidos como foi descrito anteriormente, foram transferidos para placas de

63 61 6 poços contendi 10 ml de suspensões de nanopartículas com concentração de 500 mg/l em cada poço. As placas foram incubadas ao abrigo da luz e temperatura de 24 C durante 48 h. Após este tempo os náuplios foram removidos das suspensões, lavados com água destilada e homogeneizados com 0,75 ml de tampão fosfato de potássio 200 mm (ph 6,5). Em seguida, o homogenato foi centrifugado a 9000 rpm por 20 min (4ºC) e o sobrenadante foi utilizado para determinar as atividades enzimáticas. A atividade enzimática foi calculada em termos do teor de proteína da amostra (BRADFORD, 1976). A atividade da glutationa S-transferase (GST) foi determinada numa mistura reacional contendo 1 mm de GSH, 1 mm de l-cloro-2,4- dinitrobenzeno (CDNB) e 100 mm de tampão de fosfato de potássio (ph 6,5) à temperatura ambiente. O aumento da absorbância e 340 nm foi medido durante 90 segundos. A atividade específica para GSH foi calculada usando um coeficiente de extinção de 9,6/mM/cm (HABIG; PABST; JAKOBY, 1974). A atividade da superóxido dismutase (SOD) foi determinada pelo método do pirogalol. As amostras foram misturadas com solução tampão (200 mm Tris HCl-EDTA, ph 8,5) e pirogalol (1 mm). Após 20 min, a reação foi interrompida com adição de HCl 1 N e centrifugada por 4 min a rpm. A absorbância do sobrenadante resultante foi medida a 405 nm (MARKLUND; MARKLUND, 1974). A atividade da catalase (CAT) foi medida a 240 nm durante 120 segundos. A mistura reacional continha 200 mm de Tris-HCl-EDTA (ph 8,5), 20 mm de H 2O 2 e 40 µl de sobrenadante em um volume de 1 ml (AEBI, 1984).

64 62

65 63 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 Síntese dos nanomateriais A O-C foi sintetizada através do mecanismo de reação do tipo S N2 (substituição nucleofílica bimolecular), o esquema da síntese está representado na Figura 5: Figura 5. Representação esquemática da reação de síntese da O- carboximetilquitosana. Fonte: Adaptado de (ABREU, 2002).

66 64 A carboximetilação pode ocorrer tanto no grupamento amino quanto na hidroxila dependendo das condições empregadas. O grupo OH alcoólico da quitosana é um nucleófilo mais fraco que o NH 2 e, portanto, para que a reação que dá origem a O-C ocorra em extensão razoável, é necessário que estes grupos sejam ativados com o uso de um álcali, o hidróxido de sódio. Desta forma, quando ocorre a reação entre a quitosana e o ácido monocloroacético, na presença de hidróxido de sódio, o produto principal obtido é o O-substituído (ABREU; CAMPANA-FILHO, 2009). Outro fator que interfere é a temperatura, sendo que o aumento desta favorece a N-substituição (CHEN; PARK, 2003), por conta disso a síntese foi realizada em temperaturas próximas a 0 C. A O-C sintetizada em sua forma sólida se apresentou solúvel em água (ph 7,0), o que indica a introdução dos grupos CH 2OO - Na + na quitosana, originando um polieletrólito anfiprótico que contém grupos COO - e NH 3+ ao longo das cadeias poliméricas. O grau de carboximetilação, determinado através de titulação condutivimétrica, foi de 14,6 %. Para a síntese das nanopartículas magnéticas foi utilizada a metodologia de coprecipitação dos íons férricos (Fe 3+ ) e ferrosos (Fe 2+ ) em meio básico na razão 2:1. Em valores de ph acima de 9,0, os íons Fe 3+ e Fe 2+ são convertidos aos seus respectivos hidróxidos, que se cristalizam lentamente para formação da Fe 3O 4 e de água (MENG et al., 2005). A oxidação da Fe 3O 4 pode apresentar dois produtos: a maguemita (γ- Fe 2O 3), que apresenta propriedades magnéticas, e a hematita (α- Fe 2O 3), não magnética. Em altas temperaturas o principal produto formato é α- Fe 2O 3, enquanto que a γ-fe 2O 3 é obtida, preferencialmente, pela oxidação em temperaturas mais baixas (CORREA et al., 2006). Neste trabalho as nanopartículas magnéticas foram sintetizadas em temperatura ambiente, pois a intenção foi obter a γ-fe 2O 3 e evitar a formação de material não magnético.

67 65 Para a obtenção da O-C magnética (OCM) foi utilizada a metodologia de incorporação, que se baseia na reticulação do polímero em emulsão com glutaraldeído e adição das NPM previamente preparadas. O glutaraldeído é um agente reticulante, que promove a formação de ligações entre as cadeias poliméricas da O-C, via adição nucleofílica da amina da quitosana à carbonila do agente. As nanopartículas de prata foram sintetizadas in situ na OCM e nas NPM. O agente precursor (AgNO 3) foi utilizado em quantidades diferentes (0,08, 0,17, 0,32 e 0,68 g). Como agentes redutores foram empregados o NaBH 4 e a sacarose. Além disso, como os grupos amino livres da O-C, o meio alcalino e a temperatura de 80 C, proporcionam condições para a formação de AgNPs (MARKOVA et al., 2012), também foram sintetizas AgNPs sem adição de agente redutor. Visto a grande quantidade de materiais sintetizados, apenas a determinação da quantidade de prata e a CIM foram realizados com todos. Os demais testes foram realizados apenas com os nanocompósitos sintetizados com a maior quantidade de AgNO 3 (0,68 g). Desta forma, quando não estiver especificado após a abreviatura do nanocompósito a quantidade de AgNO 3, subentende-se que se trata da maior quantidade. 5.2 Caracterização das nanopartículas Quantidade de prata presente nos nanocompósitos A Tabela 1 mostra a quantidade de prata presente nos nanocompósitos sintetizados. É possível observar que a quantidade final de prata encontrada não foi proporcionalmente igual à quantidade inicial de AgNO 3 empregada na síntese. No entanto, em todos os casos quando foi empregada a quantidade inicial de 0,68 g um produto com quantidade mais elevada de prata foi obtido.

68 66 A maior quantidade de prata encontrada nos nanocompósitos foi para CAg (208,32 mg/g) e MAg (269,98 mg/g). Mas como na síntese sem O- C foi empregado, proporcionalmente, o dobro de AgNO 3, não é possível fazer uma comparação com os demais materiais. Comparando CAgS e CAgN a melhor eficiência redutora foi da sacarose. Mas quando é comparado MAgN e MAgS, este comportamento é invertido, mostrando que a O-C aumenta a capacidade de redução de prata pela sacarose. Quando o AgNO 3 é misturado com a solução de OCM, os íons Ag + ligam-se as macromoléculas de quitosana, provavelmente por meio de interações eletrostáticas, uma vez que os átomos de oxigênio ricos em elétrons dos grupos hidroxila e carboxila da O-C podem interagir com os cátions do metal de transição (HUANG; YUAN; YANG, 2004).

69 67 Tabela 1. Quantidade de prata presente nos nanocompósitos. Nanocompósito Concentração de prata (mg/g) CAgN 0,08 3,50±0,10 CAgN 0,17 3,41±0,34 CAgN 0,34 84,76±0,62 CAgN 0,68 132,65±0,84 CAgS 0,08 17,96±0,20 CAgS 0,17 45,27±0,35 CAgS 0,34 30,95±0,35 CAgS 0,68 206,31±1,54 CAg 0,08 66,65±0,72 CAg 0,17 20,24±0,09 CAg 0,34 80,76±0,20 CAg 0,68 208,32±2,40 MAgN 207,62±2,90 MAgS 163,17±1,72 MAg 269,98±1, Caracterização estrutural A morfologia e dispersibilidade das nanopartículas preparadas e dos nanocompósitos sintetizados foram estudados com técnicas de microscopia eletrônica de transmissão (MET), microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução (HRTEM), Microscopia eletrônica de varredura por transmissão em campo escuro de alto ângulo (STEM/HAADF) e espectroscopia de energia dispersa de raios X (EDX). A Figura 6a mostra as NPM sintetizadas, elas possuem forma esférica bastante uniforme e apresentam boa cristalinidade. A amplitude da transformada de Fourier desta

70 68 imagem (Figura 6b) apresenta anéis concêntricos que correspondem com as distâncias entre os planos cristalográficos da maghemita (γ-fe 2O 3). O histograma com a distribuição dos tamanhos das partículas é mostrado na Figura 6c. Como pode ser observado a distribuição lognormal e diâmetro médio das partículas foram de 9,2±2,8 nm. Figura 6. (a) TEM imagem das NPM; (b) Transformada de Fourier da imagem; (c) Histograma da distribuição de tamanho de partícula e ajuste para função log-normal (linha contínua). A incorporação das NPM na O-C e a preparação dos nanocompósitos contendo prata não alteram a natureza e o tamanho das NPM. Como exemplo, a imagem STEM/HAADF da amostra MAgS é mostrada na Figura 7 (a, b) e confirma que as NPM preservam uma boa estrutura cristalina com bordas bem definidas, como das γ-fe 2O 3 inicialmente sintetizadas.

71 69 Figura 7. (a) STEM/HAADF imagem da amostra MAgS; (b) imagem ampliada e filtrada pela transformada de Fourier vista na direcção <112> da nanopartícula γ- Fe2O3 mostrada na estrutura destacada em (a). As amostras contendo somente γ-fe 2O 3 e Ag (MAg, MAgS, MAgN), bem como aquelas que estão embebidas na matriz de O-C (CAg, CAgS, CAgN), contém aglomerados ricos em ferro e aglomerados ricos em prata. Como exemplo temos a imagem de MET da amostra CAg (Figura 8a) com a análise elementar realizada pela técnica de EDX das áreas selecionadas, Figura 8b área 1 rica em ferro e Figura 8c área 2 rica em prata. Estas observações confirmam a tendência conhecida das nanopartículas de Ag em formar aglomerados através de forças de van der Waals ou forças de Coulomb (SHU; WU, 2011).

72 70 Figura 8. (a) Imagem MET do nanocompósito CAg e perfil EDX das áreas selecionadas: (b) área 1 e (c) área 2. O estado de agregação e o tamanho de partícula das AgNPs dependem das condições de preparação. Verificou-se que nas amostras preparadas sem agente de redutor (CAg e MAg), os aglomerados de Ag não são densos e as partículas dentro deles podem ser consideradas (pelo menos parcialmente) partículas de superfície livres (ver Figura 9a). Além disso, nestas amostras, as nanopartículas de Ag são as menores (~5±3nm). O tamanho médio das AgNPs preparadas com os agentes redutores é maior, na ordem de 5-15 nm para amostras preparadas com NaBH 4 e nm para amostras preparadas com sacarose. Sabe-se que partículas menores têm uma maior área de superfície disponível para interação e por isso apresentam maior atividade antimicrobiana do que partículas com tamanhos maiores (RAI; YADAV; GADE, 2009). Além disso, partículas de menor tamanho (~ 5 nm) apresentam efeitos eletrônicos (definidos como mudanças na estrutura eletrônica local da superfície devido ao tamanho), que aumentam sua reatividade (MORONES et al., 2005). Portanto, pode-se esperar que entre as

73 amostras estudadas, MAg e CAg sejam os mais promissores do ponto de vista de atividade antimicrobiana. 71 Figura 9. (a) Imagem MET da amostra MAg e (b) Espectro EDX da área 1. As análises de MET das nanopartículas de prata mostram que em todas as amostras estudadas, certos números de partículas são livres, o que aumentará a sua reatividade em comparação com os que permanecem no interior dos aglomerados. Uma melhor percepção da microestrutura das AgNPs é fornecida por imagens HRTEM. A Figura 10 mostra que as nanopartículas de prata têm forma esférica, com superfícies lisas. As margens transparentes e uniformes vistas nesta micrografia confirmam que as partículas são altamente cristalizadas. O espaçamento da rede observado de ~0,235 nm corresponde ao plano (111) da prata. Além das nanopartículas monocristalinas mostradas na Figura 10a, também se pode distinguir partículas com outras estruturas: decaédricas (b), retorcidas simples (c) e retorcidas de múltiplas formas (d). Todas essas morfologias apresentam principalmente superfícies (111) que são consideradas as mais reativas (MORONES et al., 2005).

74 72 Figura 10. Imagens HRTEM das morfologias mais comuns da prata encontradas nas amostras estudadas: (a) monocristalina, (b) decaédrica, (c) retorcida simples e (d) retorcido de múltiplas formas Comportamento magnético As propriedades magnéticas das amostras foram estudadas com um magnetômetro PPMS (Quantum Design) na faixa de temperatura de K e intervalo de campo ±90 koe. Os valores de magnetização de saturação obtidos são mostrados na Tabela 2. Os valores encontrados nas duas temperaturas são próximos, sendo que em 4 K são um pouco mais elevados. A magnetização de saturação (63,34 uem/g) das NPM em temperatura ambiente (300K) está de acordo com o valor típico da maghemita (CORNELL; SCHWERTMANN, 2003). As curvas de magnetização registradas em campo reduzido a 300 K (± 10 koe) e a 4 K (± 4 koe) para as amostras são mostrados na Figura 11. Pose ser observado que em baixas temperaturas, todas as amostras exibiram coercitividade de cerca de 200 Oe (Tabela 2) enquanto que a 300 K, o loop

75 73 das histereses são praticamente reversíveis (Figura 11b), indicando que as NPM (maguemitas) transitam em um estado superparamagnético. Assumindo que nas outras amostras, as nanopartículas de γ-fe 2O 3 não mudam no decurso do tratamento químico adicional e que são a única fonte da contribuição magnética, foi estimada a quantidade da fração maguemita em cada amostra (Tabela 2).

76 74 Figura 11. Curvas de magnetização em função do campo magnético aplicado nas temperaturas de 4 K (a) e 300 K (b).

77 75 O comportamento magnético das amostras foi caracterizado pela medida das magnetizações em função da temperatura realizados com magnetômetro PPMS (Quantum Design). Estas medidas foram realizadas através dos processos ZFC ( zero field cooling ) e FC ( Field cooling ) de 2 a 300 K e campo magnético de 50 Oe. No processo ZFC as medidas foram registradas no aquecimento das amostras e no processo FC o registro das medidas foi realizado durante o resfriamento. A Figura 12 mostra as curvas ZFC/FC. Como os materiais que possuem O-C tem valores menores de momento magnético, os resultados destes estão apresentados separados dos demais (Figura 12b). O comportamento das curvas ZFC/FC é típico de nanopartículas com transição de um estado bloqueado para um estado superparamagnético. A posição do máximo na curva ZFC pode ser considerada como a temperatura de bloqueio (Tb) das partículas. Temperatura de bloqueio é denominada como, a temperatura que separa os dois regimes magnéticos, ou seja, representa o limite para a ocorrência da perda do comportamento superparamagnético. Para temperaturas menores que Tb as partículas se encontram no regime bloqueado (havendo área histérica), caso contrário, encontra-se no regime superparamagnético. Os valores de Tb obtidos para as amostras estudadas são apresentados na Tabela 2. A temperatura de bloqueio das NPM é a mais alta, e está relacionada com o acoplamento dipolar mais forte entre as nanopartículas. A temperatura de bloqueio das outras amostras é menor devido as suas estruturas internas e formação de aglomerados que provocam a redução da Tb. A fraca dependência da curva FC com a temperatura indica forte acoplamento, devido as interações entre as partículas, o que leva a um momento magnético quase constante sobre o intervalo de temperatura total.

78 76 A partir das curvas de magnetização obtidas a 4 K (Figura 11), observa-se o aparecimento de histerese na curva, resultando em valores de Mr e Hc (Tabela 2) diferentes de zero. Este comportamento é esperado, pois a perda do comportamento superparamagnético ocorre quando a temperatura está abaixo da Tb.

79 Figura 12. Curvas de magnetização em função da temperatura ZFC/FC. Medidas com 50 Oe para as amostras sem O-C (a) e com O-C (b). 77

80 78 Tabela 2. Parâmetro magnéticos obtidos a partir das curvas de histereses e ZFC/FC. 4 K 300 K Tb(ZFC) γ- Ms (uem/g) Hc (0e) Mr (uem/g) Ms (uem/g) (K) Fe 2O 3 fração (%) NPM 73,45 231,70 16, MAg 53,83 203,47 9, MAgN 63,29 264,16 15, MAgS 63,43 225,08 13, OCM 14,28 223,53 2, CAg 10,22 215,83 1, CAgN 12,03 209,17 2, CAgS 11,14 228,42 2, Espectroscopia na região do infravermelho Os espectros de infravermelho com transformada de Fourier (IV-FT) dos nanocompósitos preparados utilizando diferentes agentes redutores não diferem um dos outros (Figura 13). O espectro IV-FT da OCM apresenta uma banda alargada na região de 3500 cm 1 característica de deformação axial das ligações N-H e O-H. As bandas em 2900 e 2800 cm -1 são características de deformação axial das ligações C-H de alcano. As bandas de absorção em 1100 e 1027 cm -1 são das deformações axiais da ligação C-O. As bandas em 1400 e 1640 cm -1 são atribuídas as deformações axiais simétricas e assimétricas das ligações do grupamento COO. A banda em 594 cm -1 corresponde a deformação axial da ligação Fe-O. Possívelmente as interações/ligações da prata com os grupamentos NH 2 e OH nos espectros CAgN, CAgS e CAg ocasionaram a diminuição na intensidade das bandas de absorção na região de 3500 cm -1. A divisão nas bandas dos grupos amino e

81 79 hidroxil em 1600 e 1400 cm -1 também indicam a ligação entre a prata e os grupos OH e NH 2 (WEI; QIAN, 2008). Os espectros na MAgN, MAgS e MAg mostram apenas a banda de absorção na região de 590 cm -1 correspondente a deformação axial dos grupos Fe-O. Figura 13. Espectros de infravermelho com transformada de Fourier (IV-FT) dos nanomateriais OCM (1), MAgN (2), CAgN (3), MAgS (4), CAgS (5), MAg (6) e CAg (7).

82 Análises termogravimétricas (TG) Para investigar a estabilidade térmica, os experimentos de TG foram realizados aquecendo os materiais até 600 C (Figura 14). As curvas 2, 6, 7 e 8 mostram uma perda de peso de 10% a 110 C devido à evaporação da umidade presente. Outro declínio acentuado aparece entre 200 e 320 C, que pode ser atribuído à degradação das cadeias de quitosana. As perdas de peso das nanopartículas CM, CAg, CAgN e CAgS a 600 C foram de 56, 35, 44 e 44%, respectivamente. Assim, a incorporação de AgNPs em CAg foi de cerca de 21%, enquanto que em CAgN e CAgS, foi de cerca de 12%. As curvas 1, 3, 4 e 5 mostram os materiais sem O-C. As perdas de peso das NPM, MAg, MAgN e MAgS a 600 C foram de 18, 5, 8 e 12%, respectivamente. Assim, a presença de AgNPs foi de cerca de 13% em MAg, 10% em MAgN e 6% em MAgS. Este método não fornece um resultado quantitativo tão preciso quanto a análise de absorção atômica, mas os resultados de TG estão de acordo com aqueles encontrados por absorção atômica (Tabela 1), quando se compara a quantidade de prata entre as amostras. Figura 14. Curvas TG dos nanomateriais NPM (1), CM (2), MAg (3), MAgN (4), MAgS (5), CAg (6), CAgN (7) e CAgS (8).

83 Ensaios de atividade antimicrobiana Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) A CIM dos compostos para E. coli, S. aureus e C. albicans foi determinada utilizando o método da microdiluição em caldo. Os materiais com valores de CIM menores que 100 μg/ml foram considerados com boa atividade antimicrobiana, os com valores de CIM de 100 a 500 μg/ml foram considerados com atividade moderada, de 500 a 1000 μg/ml foram considerados com fraca atividade e acima de 1000 μg/ml foram considerados inativos (PRETTO et al., 2004). Os resultados de crescimento das estirpes microbianas na presença de concentrações variadas dos materiais estão apresentados na Tabela 3. Como pode ser observado a OCM não apresentou atividade antibacteriana e antifúngica contra os micro-organismos testados. Este mesmo resultado foi relatado na literatura para a O-carboximetilquitosana e tal achado foi atribuído à neutralização dos grupos NH 3+ pelos grupos COO - (MOHAMED; SABAA, 2014). Os valores de CIM (Tabela 3) encontrados para os nanomateriais preparados sem O-C (MAgN, MAgS e MAg) foram maiores do que os preparados com o polímero (CAgN, CAgS e CAg). Este resultado pode ser atribuído à função dupla da O-C como agente redutor e estabilizador de nanopartículas de prata durante a formação do nanocompósito (MOHAMED; SABAA, 2014). Comparando os valores de CIM com a quantidade de AgNO 3 utilizada na síntese, observa-se que quanto maior a quantidade melhor foi a atividade antimicrobiana. Devido a isso, a discussão que se segue refere-se aos nanocompósitos sintetizados com a maior quantidade de AgNO 3.

84 82 Tabela 3. CIM dos nanocompósitos para E. coli, S. aureus e C. albicans. MIC (µg/ml) E. coli S. aureus C. albicans OCM >1000 >1000 >1000 CAgN 0, >1000 CAgN 0, >1000 CAgN 0, CAgN 0, CAgS 0, CAgS 0, >1000 CAgS 0,34 62,5 62,5 500 CAgS 0, CAg 0, >1000 CAg 0,17 62, CAg 0,34 15,6 62,5 250 CAg 0, MAgN >1000 MAgS >1000 MAg Os nanocompósitos CAg e CAgS apresentaram boa atividade antimicrobiana contra as bactérias e moderada atividade contra a levedura. O composto CAgN apresentou atividade moderada contra bactérias e fraca atividade contra C. albicans. Estes resultados são muito positivos, porque o NaBH 4 é extremamente reativo e prejudicial ao meio ambiente. Assim, é

85 83 possível com o uso de agentes redutores brandos, tais como sacarose e O-C, sintetizar agentes antimicrobianos eco-amigáveis. Os compostos sem O-C exibiram atividade antimicrobiana reduzida. MAgN e MAgS apresentaram atividade antibacteriana fraca e não apresentaram atividade antifúngica. O composto MAg mostrou boa atividade contra bactérias e atividade moderada contra C. albicans. MAg teve uma atividade melhor do que MAgN e MAgS porque possui uma quantidade maior de prata. Foi observado que a associação entre o material magnético, o polímero e a prata melhora a atividade antimicrobiana. Individualmente, os materiais mostraram baixa atividade, mas os nanocompósitos preparados com todos os componentes tiveram alta atividade antimicrobiana. CAgS foi o nanocompósito com a melhor atividade antimicrobiana. Em comparação com outros compósitos relatados na literatura, CAgS apresentou CIM igual (15,6 μg/ml) para as bactérias E. coli e S. aureus ao compósito Fe 3O4-PDA-Ag (ZHANG et al., 2014b). A CAgS apresentou uma atividade melhor que o nanocompósito quitosana-ag sintetizado por AN et al. (2011) que teve CIM de 150 μg/ml para E. coli e 200 μg/ml para S. aureus e o de outro de mesma natureza que foi sintetizado por ARJUNAN et al. (2016) que apresentou CIM de 16 μg/ml para E. coli. A atividade também foi melhor do que o Ag-Fe 2O 3-óxido de grafeno que teve CIM de 43,03 mg/ml para E. coli (GAO; CHEN; JIANG, 2013). Um nanocompósito semelhante ao estudado neste trabalho, Fe 2O 3-quitosana-prata, apresentou valores de CIM para S. aureus de μg/ml, para E. coli de μg/ml e para C. albicans de 2-5 μg/ml, sendo que a atividade foi maior no composto com maior quantidade de prata (MARKOVA et al., 2012). Outro estudo descreveu nanocompósitos magnéticos com AgNPs (γ-fe 2O 3-Ag e Fe 3O 4- Ag) que apresentaram CIM para ambos os nanocompósitos de 15,6 e 125

86 84 μg/ml para bactérias e de 1,9-31,3 μg/ml para leveduras (PRUCEK et al., 2011). A atividade da CAgN, CAgS e CAg foi menor quando comparada com um nanocompósitos de quitosana-prata, que apresentou CIM para E. coli de 0,68 μg/ml e para S. aureus de 2,71 μg/ml (DAVOODBASHA et al., 2016). No entanto, os nanocompósitos que possuem propriedades magnéticas como CAgN, CAgS e CAg tem vantagens em relação a outros tipos de materiais, como a facilidade de remoção do meio, que reduz a toxicidade e pode proporcionar a sua reutilização, bem como a administração vetorizada. Novos agentes antimicrobianos capazes de combater bactérias resistentes são atualmente um dos principais focos da pesquisa na área médica e uma das maiores preocupações da Organização Mundial de Saúde. Dentre as cepas resistentes, a do S. aureus é uma das mais preocupantes, pois é um patógeno extraordinariamente adaptável, com alta capacidade de desenvolver e propagar mecanismos de resistência (CHAMBERS; DELEO, 2009). A atividade antimicrobiana dos nanomateriais foi avaliada frente a cepas resistentes de S. aureus provenientes de isolados clínicos. Os resultados de CIM (Tabela 4) mostraram a mesma tendência anterior: maior atividade para os nanocompósitos contendo O-C e sintetizados com agentes de redução brandos. CAgS e CAg mostraram boa atividade contra as estirpes resistentes. A CIM de 125 μg/ml destes dois nanocompósitos é igual a relatada para γ- Fe 2O 3-Ag contra a cepa de S. aureus (4591MRSA) (PRUCEK et al., 2011).

87 85 Tabela 4. CIM dos nanocompósitos para cepas resistentes de S aureus, n 1 (MRSA), n 2 e n 3 (multirresistência, sendo sensíveis apenas a vancomicina). CIM (µg/ml) n 1 n 2 n 3 OCM >1000 >1000 >1000 CAgN CAgS CAg MAgN >1000 >1000 >1000 MAgS MAg Curvas de crescimento microbiano O perfil de crescimento dos micro-organismos S. aureus, E. coli e C. albicans frente a concentrações variáveis de CAgN, CAgS e CAg é mostrado na Figura 15. A cinética de crescimento bacteriano foi determinada em caldo Mueller-Hinton (bactérias) e Sabouraud (levedura) e os resultados foram avaliados pela densidade óptica (DO) em 600 nm. As Figuras 15 a, b e c mostram as curvas de crescimento de S. aureus, E. coli e C. albicans, respectivamente, com concentrações de CAgN variando de 20 até 120 mg/l. Em todas as concentrações o nanocompósito foi incapaz de impedir o crescimento de S. aureus e E. coli. O crescimento de C. albicans foi retardado (50% até 48 horas) apenas na concentração de 120 mg/l. Estes resultados estão de acordo com os apresentados na determinação da CIM, que também mostrou baixa atividade antimicrobiana para este composto.

88 86 O.D. (600 nm) D.O. (600 nm) O.D. (600 nm) Figura 15. Curvas de crescimento para S. aureus (a), E. coli (b) e C. albicans (c) expostos ao nanocompósito CAgN. O.D. (600 nm) O.D. (600 nm) 0,30 0,4 0,25 0,3 0,20 0,2 0,15 0,10 0,05 D.O. (600 D.O. nm) (600 nm) 0,5 0,6 (a) 0,4 0,5 0,3 0,4 0,2 0,3 0,1 0,2 0,0 0 mg/l 20 mg/l 40 mg/l 80 mg/l 0 mg/l 20 mg/l 120 mg/l 40 mg/l 80 mg/l 120 mg/l 0 mg/l mg/l 20 mg/l 40 mg/l 80 mg/l 80 mg/l 120 mg/l 120 mg/l 0,00 0 0, Time (h) Time (h) -0,05 0,0 0,6 (a) Time Time (h) 0,5 Tempo (h) (h) 0,35 (b) D.O. (600 nm) 0,35 (b) 0,4 0,30 0,30 0,35 0,6 0,25 (b) (a) 0,3 0 mg/l 0,30 0,20 20 mg/l 0,25 0,5 40 mg/l 0,2 0,25 80 mg/l 0,15 0,20 1,0 (c) 120 mg/l 0,4 0,20 0,10 0 mg/l 0,1 0,15 0,3 20 mg/l 0 mg/l 0,15 0,05 40 mg/l 20 mg/l 80 mg/l 0,8 40 mg/l 120 mg/l 0,2 80 mg/l 0,100,0 0,10 0, mg/l 0 mg/l mg/l 40 0,1 40 mg/l -0,05 80 mg/l 0,60, mg/l mg/l mg/l 0,00 0,0 Time 0,00 Time (h) (h) O.D. D.O. (600 O.D. nm) (600 nm) 0,4-0, ,05 Time (h) 0 mg/l Tempo Time 30(h) (h) mg/l 0,2 0,35 40 mg/l (b) Time (h) 80 mg/l 120 mg/l 0,30 1,0 0,35 (b)(c) 0,6 (a) 0,0 O.D. (600 nm) 0,30 0,25 0,5 0,8 0 1,0 0,25 10 (c) ,20 0,4 Time (h) 0,6 0,20 0,8 0,15 0,3 0 mg/l 1,0 (c) 0,15 20 mg/l 0,4 40 mg/l 0,6 0,2 80 mg/l 0,10 0, mg/l mg/l 0 mg/l 0 mg/l 20 mg/l mg/l mg/l 0,8 40 mg/l 0,2 0,1 0, mg/l 0,05 80 mg/l 0,4 80 mg/l 120 mg/l 0, mg/l 0,0 0 mg/l 0,00 0,0 20 mg/l 0,6 0,2-0,05 40 mg/l mg/l , mg/l 50 Time (h) 0, Time Time (h) 0,4 (h) O.D. (600 O.D. nm) D.O. (600 nm) Tempo (h) Time (h) 0 mg/l mg/l Time (h)

89 87 O.D. (600 nm) O.D. (600 nm) O.D. (600 D.O. nm) (600 nm) D.O. (60 0,1 0,0 Figura 16. Curvas de crescimento para S. aureus (a), E. coli (b) e C. albicans (c) expostos ao nanocompósito CAgS. 0,3 0 mg/l 0,2 0,5 20 mg/l 40 mg/l 80 mg/l 0,6 (a) 0,5 0,35 (b) 0,4 0,30 0,3 0,25 0,2 0,20 0,15 0,10 0,0 0,05 0,00-0,05 0,30 0,25 0,20 0,10 0,8 0,05 0,6 0,00-0,05 0,4 0,2 0,0 0, , ,35 (b) 1,0 0,15 (c) O.D. D.O. (600nm) Time (h) 0,35 0,8 (b) 0,6 (a) 0,30 0,7 0 mg/l 0,5 0,25 20 mg/l 0,6 40 mg/l mg/l 0,4 30 0, mg/L mg/l 0,5 Time (h) 0,15 0,3 0,4 0,10 0, ,330 0, O.D. D.O. O.D. (600 (600 nm) nm) 0,2 0,2 Time (h) 0,6 (a) 0,4 0,1 0,00 0,2 120 mg/l 0 mg/l ,0 0 mg/l Time (h) 20 mg/l mg/l mg/l Time (h) 120 mg/l Tempo (h) 0,0-0,05 0,1 (b) ,0 Time (h) Time (h) Tempo Time (h) (h) Time Tempo Time (h) (h) 1,0 (c) Time (h) 0,1 0,35 2,0 (b) 20 mg/l 40 mg/l 80 mg/l 120 mg/l 1,8 0,6 0,30 (a) 0 mg/l 1,0 (c) 1,6 20 mg/l 0,25 40 mg/l 0,5 1,4 80 mg/l 0,8 0, mg/l 0,4 1,2 0,15 0,6 0,3 1,0 0 mg/l 0,10 20 mg/l 0 mg/l , mg/l 20 mg/l 0,2 0,4 80 mg/l 40 mg/l 0, mg/l 80 mg/l Time 0 mg/l 0,6 (h) 120 mg/l 0 mg/l 20 mg/l 0,1 0,00 20 mg/l 0,2 40 mg/l 40 mg/l 0,4 (c) 80 mg/l 80 mg/l -0, mg/l 0,0 120 mg/l 0, ,0 0, Time 30 (h) Time 20 (h) O.D. D.O. (600 O.D. (600 nm) (600 nm) nm) 0,5 0,3 0,1 0,0 0 mg/l 20 mg/l 40 mg/l 80 mg/l 120 mg/l 0 mg/l 20 mg/l 40 mg/l 0 mg/l 80 mg/l 20 mg/l 120 mg/l 40 mg/l 80 mg/l 120 mg/l (a)

90 88 Figura 17. Curvas de crescimento para S. aureus (a), E. coli (b) e C. albicans (c) expostos ao nanocompósito CAg. 0,7 0 mg/l 20 mg/l 40 mg/l 80 mg/l 120 mg/l 0,6 0,6 (a) 0,5 0,5 0 mg/l 20 mg/l 40 mg/l 80 mg/l 120 mg/l 0, Time (h) D.O. (600 nm) O.D. (600 nm) 0,3 0,3 0,2 0,2 0,1 5 (b) 0,1 0,0 0 0, ,35 (b) 0,30 0,6 0,30 (a) 0 0 mg/l 0,5 0,25 20 mg/l 40 mg/l 5 0,20 80 mg/l 0,4 0, mg/l 0 0,15 0,3 0,15 0, ,2 30 0, ,10 Time (h) 0,1 0,00 O.D. D.O. (600 O.D. (600 nm) (600 nm) nm) 0 mg/l 20 mg/l 40 mg/l 80 mg/l 120 mg/l Time (h) -0, Tempo Time (h) 0 mg/l 20 mg/l 0 mg/l 40 mg/l 20 mg/l 80 mg/l 40 mg/l 120 mg/l 80 mg/l 120 mg/l -0, ,00 Time 30 (h) Time (h) (a) (b) (c) 0,35 (b) Tempo Time (h) O.D. (600 nm) D.O. O.D. (600 (600 O.D. nm) nm) (600 nm) 1,2 0,30 1,0 (c) 0,6 0,25 (a) 1,0 0,8 0,20 0,5 0,15 0,8 0,6 0,4 0,10 0,3 0,4 0,6 0,05 0,2 0,2 0,00 0,4 0,1-0,05 0,0 0,2 0,0 0 mg/l 20 mg/l 40 mg/l 80 mg/l 120 mg/l 0 mg/l 20 mg/l 0 mg/l 40 mg/l 20 mg/l 0 mg/l 80 mg/l 40 mg/l 0 mg/l 20 mg/l 80 mg/l 120 mg/l 20 mg/l 120 mg/l 40 mg/l 40 mg/l 80 mg/l 80 mg/l 120 mg/l 120 mg/l Time (h) , Time (h) Time (h) Time (h) 0,35 1,0 (b)(c) 0, Time Tempo (h) (c)

91 89 A Figura 16 mostra que o nanocompósito CAgS nas concentrações mais elevadas inibiu o crescimento dos micro-organismos testados durante 24 h. Após este tempo, observa-se um aumento acentuado da densidade óptica. Conforme mostra a Figura 17, nas concentrações de CAg de 80 mg/l e 120 mg/l, o crescimento de S. aureus, E. coli e C. albicans foi completamente inibido até o tempo avaliado de 48 h. Resultados semelhantes foram encontrados para nanopartículas de prata modificadas com citrato (DAS et al., 2013), nano-prata em sílica mesoporosa (WAN et al., 2016) e para Ag-γ-Fe 2O 3-quitosana (KALOTI; KUMAR, 2016) Microscopia Eletrônica de varredura (MEV) da bactéria Para complementar os ensaios antimicrobianos foram realizadas análises por microscopia de bactérias tratadas como as AgNPs. Foi utilizando MEV com detectores de sinal de elétrons secundários (SE) e de elétrons retroespalhados (BSE) bem como espectroscopia EDX. Este experimento foi realizado apenas com o nanocompósito CAgS (que apresentou melhores resultados de CIM), sendo testado contra Escherichia coli. A micrografia MEV da E. coli não tratada (Figura 18a) demonstra que as células bacterianas exibem uma forma alongada típica desta bactéria e superfície lisa. Por sua vez, para E. coli tratada com CAgS (Figura 18b), são observados danos parciais à membrana celular. A alteração na integridade estrutural ou alterações físico-químicas na parede celular bacteriana, podem gerar alteração na osmorregulação da célula bacteriana, que pode causar a extrusão do material intracelular e, em última instância, causar a morte celular. Os resultados da MEV-SE mostraram que o nanocompósito CAgS causou uma série de mudanças similares na E. coli. A parede celular enrugada pode indicar vazamento de conteúdo citoplasmático para fora da célula bacteriana.

92 90 Resultados semelhante já foram relatados na literatura (AGNIHOTRI; MUKHERJI; MUKHERJI, 2014; LI et al., 2010). Figura 18. Imagens de MEV-SE da E.coli: não tratada (a) e tratada (b) com CAgS. A análise da presença de nanopartículas de γ-fe 2O 3 e Ag na E. coli foi continuada através da análise de MEV-BSE, juntamente com a análise de EDX. A imagem (Figura 19a) contém pouca informação topográfica das células, mas exibe regiões mais brilhantes (sinalizadas com setas), geradas a partir de áreas com números atômicos médios superiores que podem ser correlacionadas com nanopartículas magnéticas e/ou de prata. A distribuição espacial dos elementos selecionados, criada para a mesma área da Figura 19a, é apresentada em dois mapas de pontos: Figura 19b para o carbono (em azul) e Figura 19c para o ferro (em vermelho). Verifica-se que a concentração de carbono corresponde bem ao formato das células bacterianas apresentadas na Figura 19a. Por sua vez, o mapa do ferro mostra duas regiões ricas em ferro - uma pequena (seta 2) que pode estar relacionada a uma única partícula de maguemita e uma grande (seta 1) que pode indicar a presença de um aglomerado de nanopartículas. A composição elementar da célula A selecionada foi determinada por análise de EDX, e o espectro obtido é mostrado na Figura 19d. A presença de nanopartículas de Ag e γ-fe 2O 3 na

93 célula é confirmada por um pico a ~ 2,9 kv, característico de Ag, e outro a ~ 6,4 kv típico de Fe. 91 Figura 19. Imagem MEV-BSE de células de E. coli tratadas com CAgS (a); mapeamento elementar de raios-x da imagem (a) para carbono (b) e para ferro (c). Espectro de EDX da bactéria A. A literatura contém muitos artigos de revisão que discutem o mecanismo de ação das AgNPs. O efeito antimicrobiano das nanopartículas de prata pode ser atribuído a uma série de fatores, tais como alteração da morfologia celular, inativação de enzimas e proteínas celulares vitais, condensação do DNA, perda de replicação do DNA, depleção de ATP, desnaturação proteica, inibição da interação ribossômica, acúmulo em

94 92 concentrações letais a célula, geração de espécies reativas de oxigênio e modulação da sinalização celular (DUBEY et al., 2015; KITTLER et al., 2010). Não está claro se o componente tóxico da nanopartícula de prata está na forma de Ag + ou Ag 0. A maioria dos mecanismos propostos envolve a entrada de prata na célula onde ela causa os danos. Acredita-se que os átomos de prata se ligam aos grupos tiol em enzimas, levando à sua desativação. A prata forma ligações S-Ag estáveis com compostos contendo tiol na membrana celular, que estão envolvidos na geração de energia transmembranar e transporte de íons. Outro mecanismo sugerido da atividade antimicrobiana da prata é baseado no fato de que a Ag + entra na célula e se intercala entre os pares de bases de purina e pirimidina, rompendo as ligações de hidrogênio entre as duas cadeias antiparalelas e desnaturando a molécula de DNA (DAKAL et al., 2016). Recentemente, Nguyen et al. (2015) assumiram que a presença de nanopartículas magnéticas contribui para o efeito inibitório da prata sobre o micro-organismo Gram negativo (E. coli), pois a nanoestrutura híbrida gera um material mais reativa para danificar as membranas bacterianas. Outro mecanismo possível para a ação antimicrobiana seria a interação eletrostática entre AgNPs/Ag + e as moléculas das membranas celulares bacterianas, que poderia resultar em despolarização da membrana, seguida pela morte bacteriana (MAHMOUDI; SERPOOSHAN, 2012; MISHRA; FERREIRA; KANNAN, 2015). 5.4 Citotoxicidade in vitro com células L929 Para avaliar o efeito citotóxico dos nanomateriais foram realizados ensaios in vitro com células de fibroblastos L929. Os fibroblastos são células constituintes do tecido conjuntivo e possui a função de formar a substância fundamental amorfa (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2013). A viabilidade

95 93 celular foi determinada pelo ensaio MTT, que avalia a capacidade das células viáveis reduzirem o brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazólio, formando cristais de formazan de cor púrpura. A Figura 20 mostra os gráficos de viabilidade (%) das células expostas aos nanomateriais nas concentrações de 1, 10 e 100 µg/ml durante 24 h. Para nenhum deles foi observada diferença significativa entre os tratamentos e o controle, mostrando que as nanopartículas de prata sintetizadas neste trabalho não apresentam efeito citotóxico. Resultados contrários a estes foram encontrados por Lee et al. (2014b), onde as AgNPs reduziram a viabilidade de células NIH 3T3 (fibroblastos) de uma maneira dependente da concentração. As células tratadas com uma concentração de 30 µg/ml tiveram aproximadamente 60% de morte celular. Um estudo recente avaliou a influência do tamanho de partícula das AgNPs e do tempo de exposição na viabilidade de células L929. Os resultados mostraram que todos os tamanhos (10, 50, 100 e 200 nm) de AgNP induziram uma redução na viabilidade celular após tratamento com 50 µg/ml. No entanto, as células incubadas com AgNPs de 10 nm mostraram a resposta mais citotóxica (75% de diminuição da viabilidade celular) em comparação com 50, 100 e 200 nm (cada uma induziu uma redução aproximada de 40-50% na viabilidade celular) (WILDT et al., 2016).

96 94 Figura 20. Viabilidade celular de fibroblastos (L929) expostos 24 h aos nanomateriais NPM (a), OCM (b), MAg (c), MAgS (d), MAgN (e), CAg (f), CAgS (g), CAgN (h) em ensaio de MTT. Outro estudo mostrou efeito citotóxico das AgNPs contra células L929, com efeito dose dependente entre as concentrações de 15 a 100 µg/ml, sendo que na maior concentração ocorreu quase 100% de morte celular e na

97 95 concentração de 15 µg/ml aproximadamente 60% de morte celular. Não houve diferença entre os tempos de exposição de 24 e 48 h (TAKAMIYA et al., 2016). Archana et al. (2015) avaliaram o efeito tóxico contra células L929 de filmes de quitosana e PVP contendo AgNPs. Os resultados mostraram que a quitosana não reduz a viabilidade celular, porém que quanto maior a concentração de AgNPs nos filmes maior a morte celular, sendo que no filme com maior concentração de prata (proporção 1:1:0,01 (quitosana:pvp:agnps)) a viabilidade celular foi de 60%. 5.5 Ensaios de avaliação de fitotoxicidade Inibição do alongamento da plântula (SEI) Para avaliar o efeito que as nanopartículas têm sobre o crescimento de Cucumis sativus, as sementes foram germinadas em contato com suspensões contendo concentrações crescentes de cada material. Após incubação de cinco dias foi medido o comprimento das raízes e calculado o valor de inibição do crescimento da plântula (%) (SEI), cujos resultados estão apresentados na Figura 21. Os valores positivos representam inibição e os negativos a estimulação do crescimento. As NPM tiveram efeito de estimulação do crescimento, sem uma relação entre concentração e SEI e sem diferença significativa (p < 0,05) entre as concentrações, tendo uma maior estimulação na concentração de 100 mg/l (-23,7±2,5%). A OCM não apresentou efeito sobre o crescimento nas concentrações de 1, 10 e 100 mg/l e na concentração de 1000 mg/l apresentou estimulação (-11,3±5,9%). As nanopartículas MAg apresentaram inibição em todas as concentrações sem tendência de dose dependência e sem diferença significativa (p < 0,05) entre elas, sendo que na concentração de

98 mg/l foi observada inibição de 21,7±13,6%. As CAg nas concentrações de 1, 10 e 100 mg/l estimularam o crescimento e na concentração de 1000 mg/l houve uma grande e significativa (p > 0,05) inibição (38,6±3,1%). Para a MAgN foi observado efeito de estimulação com tendência de quanto maior a concentração maior a estimulação, não foi observada diferença significativa (p < 0,05) entre as concentrações e a estimulação máxima foi de -18,2±6,1% em 1000 mg/l. As nanopartículas CAgN nas concentrações de 1, 10 e 100 mg/l não tiveram influência sobre o crescimento. Já na concentração de 1000 mg/l provocou grande estimulação (-43,0±9,8%), diferindo significativamente (p > 0,05) das outras concentrações. A MAgS apresentou efeito de estimulação em todas as concentrações e sem diferença significativa (p < 0,05) entre elas, com efeito máximo na concentração de 100 mg/l (-21,6±0,8%). Não foi observada relação entre concentração e SEI. Para a CAgS foi observado efeito inverso, com inibição máxima em 100 mg/l (18,3±9,3%) e sem diferença significativa (p < 0,05) entre as concentrações. Também não foi observado relação de dose e efeito. De maneira geral pode ser dito que o revestimento com OC não proporcionou redução na toxicidade, visto que as nanopartículas CAg e CAgS ocasionaram SEI. Em relação ao agente redutor empregado na síntese, surpreendentemente as partículas sintetizadas com NaBH 4 ocasionaram estimulação no crescimento das plântulas. Ao que tudo indica a presença de NPM estimula o crescimento, explicando o notável efeito de estimulação das nanopartículas sintetizadas com NaBH 4 que possuem maior quantidade de NPM. Ao passo que a maior quantidade de prata pode explicar a toxicidade das nanopartículas CAg e CAgS. A MAgN apesar de possuir grande quantidade de prata não apresentou toxicidade devido à alta concentração de NPM.

99 97 Outros estudos já demonstraram o efeito positivo da γ-fe 2O 3 no crescimento de Spinacea oleracea (JEYASUBRAMANIAN et al., 2016), 2016), Zea mays (LI et al., 2016) e Solanum lycopersicum (SHANKRAMMA et al., 2015). Sabe-se que a deficiência de Fe altera a estrutura do cloroplasto e a taxa fotossintética em plantas superiores. A deficiência de ferro é geralmente reconhecida por áreas amareladas em folhas novas, e pode reduzir severamente os rendimentos das culturas e até mesmo gerar a falha completa da cultura (BRIAT; DUBOS; GAYMARD, 2015; SIDDIQI; HUSEN, 2017).

100 98 Figura 21. Influência das nanopartículas na inibição do crescimento das plântulas de Cucumis sativus.

101 Índice de germinação (GI) Para avaliar o efeito que os nanomateriais têm sobre a germinação e crescimento na fase inicial de desenvolvimento da planta Cucumis sativus, foi determinado o índice de germinação (GI) em cada tratamento (Figura 22). O GI pode assumir valores maiores ou menores que 100%, onde um valor igual a 100% significa que o comprimento médio da plântula e a taxa de germinação entre um tratamento específico e controle negativo são exatamente os mesmos. Se os valores estiverem entre 80% e 120% os efeitos são semelhantes ao controle. Já valores superiores a 120% indicam bioestimulação e inferiores a 80% efeitos de inibição (LIBRALATO et al., 2016). As NPM apresentam tendência geral de estimulação, visto que apenas na concentração de 100 mg/l o efeito foi maior que 120% (123±2,5%). A MAg apresentou efeito negativo sobre a germinação e crescimento, com valores de GI menores que 80%, exceto na menor concentração. A MAgN nas concentrações de 100 e 1000 mg/l apresentou valores de GI maiores que 120% (estimulação), com efeito dose dependente. As partículas MAgS e COM apresentaram desenvolvimento semelhantes ao do controle, com valores de GI próximos a 100%. A CAg na maior concentração apresentou efeito inibidor (63±3%). Já a CAgN apresentou efeito contrário, com GI de 153±14% na concentração de 1000 mg/l. A CAgS mostra tendência de inibição, com os valores de GI todos próximos a 80%. Os resultados de GI mostram a mesma tendência apresentada pela SEI, porém com uma variabilidade menor. As nanopartículas MAg foram as únicas que tiveram efeito negativo, com significância (P < 0,05), sobre a germinação. Nos demais tratamentos os valores baixos de GI são devido a inibição do crescimento das raízes.

102 100 Figura 22. Influência das nanopartículas sobre o índice de germinação das sementes de Cucumis sativus

103 Peso seco O peso seco das plântulas após cinco dias de incubação com os nanomateriais foi normalizado ao número de sementes germinadas de C. sativus (Tabela 5). Não foi evidenciado diferença significativa (p <0,05) entre os tratamentos e entre tratamentos e controle negativo para todas as nanopartículas em todas as concentrações. Este resultado mostra que o desenvolvimento de raízes mais espessas é favorecido em resposta a um fator de estresse produzido por algumas nanopartículas. Os dados de peso seco mostraram uma variabilidade muito baixa entre as repetições, por isso podem ser considerados como um ponto final de avaliação adequado. Tabela 5. Peso seco (g) das plântulas de Cucumis sativus expostas as nanopartículas normalizado para o número de sementes germinadas (Média ± desvio padrão). 0 mg/l 1 mg/l 10 mg/l 100 mg/l 1000 mg/l NPM 0.212±0,01 0,191±0,01 0,207±0,002 0,194±0,01 0,212±0,01 OCM 0,218±0,004 0,211±0,004 0,214±0,01 0,215±0,01 0,222±0,004 MAg 0,206±0,02 0,216±0,03 0,201±0,01 0,199±0,03 0,219±0,002 MAgS 0,224±0,01 0,222±0,01 0,216±0,01 0,216±0,01 0,232±0,01 MAgN 0,200±0,01 0,208±0,001 0,211±0,005 0,207±0,004 0,209±0,001 CAg 0,213±0,01 0,208±0,002 0,203±0,006 0,204±0,02 0,206±0,003 CAgS 0,209±0,02 0,201±0,01 0,209±0,02 0,206±0,01 0,220±0,01 CAgN 0,222±0,02 0,218±0,003 0,211±0,003 0,196±0,02 0,216±0,003

104 Determinação da acumulação de prata e ferro A fim de verificar se ocorreu a absorção e acumulação de nanopartículas pela Cucumis sativus, foi realizado a quantificação de ferro e de prata presentes nas plântulas que foram expostas a concentração de 1000 mg/l dos nanomateriais, os resultados estão apresentados na Tabela 6. O ferro é um nutriente mineral naturalmente presente em espécies vegetais como Cucumis sativus (ZHAO et al., 2016). Comparando o resultado do controle com o dos demais tratamentos foi observado diferença significativa (P <0,05) apenas no MAgN, com redução de 32% na concentração de ferro. Para os outros nanomateriais a concentração de ferro foi estatisticamente semelhante a do controle, evidenciando que não houve absorção do NPM (fontes de ferro) pelas plântulas. A acumulação de prata foi maior nos nanocompósitos que contêm O-C. Este comportamento está provavelmente relacionado ao fato de que o revestimento com O-C provoca uma redução na aglomeração das partículas e, consequentemente, um aumento na absorção das nanopartículas de prata pela planta.

105 103 Tabela 6. Quantidade de prata e ferro acumulados em Cucumis sativus expostas a uma suspensão contendo 1000 mg/l das nanopartículas. Ag (mg/g) Fe (mg/g) Controle 0,026±0,006 0,652±0,039 NPM 0,012±0,003 0,696±0,053 OCM 0,019±0,009 0,518±0,124 MAg 0,076±0,059 0,751±0,208 MAgS 0,064±0,011 0,552±0,108 MAgN 0,109±0,006 0,444±0,115 CAg 0,144±0,018 0,499±0,111 CAgS 0,188±0,132 0,515±0,131 CAgN 0,202±0,005 0,562±0, Teor de clorofila A clorofila é um pigmento fotossintético importante, de modo que seus níveis podem ser um indicador significativo de toxicidade para as plantas. A clorofila A é o pigmento principal e a clorofila B é um pigmento acessório. Ambas as clorofilas são componentes genuínos das membranas fotossintéticas e ocorrem numa razão (A/B) de aproximadamente 3 para 1 (LICHTENTHALER, 1987). O teor de clorofila nas folhas de Cucumis sativus que ficaram expostas a suspensões contendo 1000 mg/l dos nanomateriais durante 7 dias (Figura 23) mostra uma diferença significativa (p <0,05) para as sementes tratadas com CAg (redução de 31%) e CAgS (redução de 23%) em relação ao controle. Danos oxidativos podem ocorrer no cloroplasto dentro das células vegetais através de interações com as nanopartículas metálicas e, consequentemente, interromper a síntese de clorofila ou causar a degradação da clorofila nas folhas (MA et al., 2015a). Os nanocompósitos CAg e CAgS

106 104 apresentaram alterações na atividade de algumas enzimas antioxidantes (Tabela 7), o que poderia justificar a diminuição do teor de clorofila. Uma das causas da redução no crescimento das plantas é a redução na fotossíntese. A clorofila é considerada um dos componentes mais importantes da fotossíntese, capaz de transformar a energia da luz em fonte de carbono para a planta (TRIPATHI et al., 2017). A redução no teor de clorofila presente nas plantas expostas aos nanocompósitos CAg e CAgS pode então, ser uma das causas da redução no crescimento das plântulas observada na Figura 21. Figura 23. Teor de clorofila presente nas folhas de Cucumis sativus expostas as nanopartículas 0.6 Clorofila A Clorofila B. Clorofila total (mg/g) ** Controle MNP OCM MAg MAgS MAgN CAg CAgS CAgN Ensaios de citotoxicidade com Cucumis sativus O azul de Evans é absorvido por células mortas como resultado da perda na integridade da membrana plasmática, portanto esse corante pode ser usado como marcador de integridade da membrana (LOYOLA-VARGAS; VÁZQUEZ-FLOTA, 2006). As raízes de C. sativus expostas a uma *

107 105 suspensão contendo 1000 mg/l de nanopartículas mostraram, na maioria dos casos, uma absorção de corante semelhante a do controle. Apenas CAg causou maior captação de azul de Evans, com diferença significativa (P <0,01) (Figura 24A), indicando a citotoxicidade desse nanocompósito. Os danos na membrana também podem aumentar a permeabilidade da membrana das células da planta, induzindo o vazamento de material intracelular (IANNONE et al., 2016). Em relação ao extravasamento de íons, não foram observados sinais de danos nas raízes das plântulas nas condições testadas (Figura 24B). A incapacidade de reduzir o cloreto de trifeniltetrazólio (TTC) para trifenil formazan (TF) (vermelho insolúvel) indica uma diminuição da atividade da cadeia respiratória mitocondrial das células da planta (LOYOLA-VARGAS; VÁZQUEZ-FLOTA, 2006). No ensaio de TTC, as raízes expostas a nanopartículas apresentaram pequena diminuição na atividade mitocondrial em relação às raízes controle, sendo que uma diminuição significativa (P <0,05) foi observada apenas para NPM (Figura 24C). É esperado que as interações entre as nanopartículas e as células vegetais induzam danos na membrana e, subsequentemente, promovam a morte celular. Porém, de maneira geral, os resultados obtidos demonstram que estas interações não provocaram danos significativos na membrana celular das plântulas e tão pouco, morte celular.

108 106 Figura 24. Avaliação da citotoxicidade na Cucumis sativus. (A) Ensaio de absorção do corante azul de Evans pelas raízes, (B) Extravasamento de íons nas raízes, (C) Efeito na atividade mitocondrial através da coloração TTC. Plântulas expostas a 1000 mg/l de nanopartículas. 0.6 A ** O.D. 595 nm Extravasamento de eletrólitos (%) Controle MNP Controle MNP OCM MAg MAgS B OCM MAg MAgS MAgN C MAgN CAg CAgS CAgN CAg CAgS CAgN O.D. 490 nm * Controle NPM OCM MAg MAgS MAgN CAg CAgS CAgN

109 Avaliação dos indicadores de extresse oxidativo O conteúdo de GSH e lipoperóxidos e as atividades de GST, SOD e CAT foram determinadas. O conteúdo de GSH presente nas plântulas de Cucumis sativus foi afetado somente pela CAg, aumentando os níveis deste antioxidante não enzimático em até 36,62%, sendo que não houve diferenças entre os outros grupos (Tabela 7). O GSH é amplamente distribuído nas células das plantas e desempenha um papel importante na desintoxicação de xenobióticos. Assim, sob o estresse causado pela CAg, podem ser produzidas espécies reativas de oxigênio, especialmente ânions superóxido (O -2 ) e peróxido de hidrogênio (H 2O 2). Devido à toxicidade direta das espécies reativas de oxigênio nas células vegetais, os ciclos redox GSH são frequentemente ativados para defesa da planta (MA et al., 2015b). Além da atividade de eliminação de radicais livres, o GSH também facilita a atividade das defesas antioxidantes enzimáticas, incluindo o GST e a glutationa peroxidase. Para fins de desintoxicação, as enzimas GST compreendem uma família de enzimas metabólicas capazes de conjugar o GSH com os xenobióticos (ALSCHER, 1989). Em contraste com o aumento dos níveis de GSH verificados no grupo CAg, a atividade de GST foi reduzida neste grupo (Tabela 7). Este achado sugere que após a exposição ao CAg, a desintoxicação da planta pela via GST foi prejudicada o que justifica o aumento na disponibilidade de GSH, porque essa molécula antioxidante não está sendo exigida por essas enzimas. No entanto, apesar do impacto da exposição a CAg na atividade de GST, é possível verificar se esse efeito foi abolido após a adição dos agentes redutores nas partículas de CAg. De fato, na Tabela 7, é possível verificar que após a exposição ao CagS ou CAgN os níveis de GSH ou GST não mudam; no entanto, a atividade da CAT aumentou 41,29% e 31,84%, respectivamente, em comparação com o grupo controle. A CAT é uma oxidoredutase universal que decompõe H 2O 2 em água e

110 108 oxigênio molecular que é um dos principais mecanismos de eliminação de espécies reativas de oxigênio (MITTLER, 2002). Além deste resultado, um aumento na atividade da catalase também foi verificado no grupo OCM (Tabela 7). Embora o aumento da atividade da catalase não tenha sido acompanhado de alterações nos níveis de atividade da superóxido dismutase, essas duas enzimas antioxidantes são importantes para o metabolismo dos xenobióticos e serão insultadas e inativas sob condições de estresse oxidativo (SUN et al., 2008). Assim, o aumento da atividade da catalase pela exposição a OCM, CAgS e CagN pode favorecer a luta contra os radicais livres na planta e, portanto, implicar em um efeito benéfico. O estresse ambiental tem sido associado ao aumento dos níveis de lipoperóxidos (PANDA; SINGHA; KHAN, 2003), que são um produto final do estresse oxidativo e, portanto, marcadores clássicos de lesão oxidativa que reflete o estresse da planta. Curiosamente, nenhuma das intervenções experimentais empregadas neste estudo aumentou os níveis de lipoperóxidos (Tabela 7), sugerindo que as plantas estavam em estado normal de estresse oxidativo após todas as exposições.

111 109 Tabela 7. Efeitos nos parâmetros oxidativos das plântulas de Cucumis sativus expostas aos nanomateriais. (Média±desvio padrão). *Diferenças significativas (P <0,05) versus grupo controle de acordo com o teste de Dunnett. GSH LOOH GST SOD CAT (µg/mg (µmol/g (mmol/min/mg (U/mg (µmol/min/mg tecido) tecido) proteína) proteína) proteína) Controle 0.71± ± ± ± ±1.5 NPM 0.72± ± ± ± ±5.8 OCM 0.78± ± ± ± ±3.6* MAg 0.79± ± ± ± ±1.8 MAgS 0.60± ± ± ± ±5.1 MAgN 0.78± ± ± ± ±4.2 CAg 0.97±0.2* 5.58± ±7.7* 0.31± ±3.0 CAgS 0.76± ± ± ± ±1.3* CAgN 0.79± ± ± ± ±3.1* 5.6 Ensaio de Toxicidade aguda com Artemia salina Taxa de mortalidade A utilização da Artemia salina como modelo animal para avaliação de toxicidade aguda vem se expandindo, pois, este micro-crustáceo distinguese na área por sua alta sensibilidade, facilidade no manuseio, baixo custo e sua visualização a olho nu. Os resultados da mortalidade dos náuplios de Artemia salina após 24 horas de incubação estão apresentados na Tabela 8 e após 48 horas na

112 110 Tabela 9. Os náuplios expostos ao K 2Cr 2O 7 (controle positivo) tiveram uma mortalidade de 100% já no tempo de 24 h. O experimento foi considerado válido, pois no controle negativo a mortalidade foi menor que 10%. Para todas as nanopartículas, em todas as concentrações testadas, em 24 h a mortalidade foi semelhante ao controle negativo, com valores próximos a 0%, demonstrando a não toxicidade dos nanomateriais. Após 48 h de exposição, não foi observada mortalidade em concentrações até 125 mg/l. Na concentração de 500 mg/l, o nanocompósito CAg apresentou mortalidade de 44±10,7%, MAg de 23±4,8%, CAgN de 16±9,6% e MAgN de 14±6,7%. Os outros tiveram uma mortalidade menor ou igual a 10%. Na concentração de 1000 mg/l observa-se um aumento na taxa de mortalidade. No entanto, mesmo esta concentração sendo muito alta, os valores ficaram abaixo de 50%. Foi possível calcular a DL 50 apenas para o nanocompósito CAg, sendo esta de 902,1 mg/l. Para todos os outros, o valor foi superior à maior concentração testada. Este resultado é muito positivo, pois em todos os outros trabalhos relatados na literatura as AgNPs apresentaram toxicidade contra Artemia salina. Os valores de DL 50 relatados foram de 55 µg/l (BECARO et al., 2015), 7,3 µg/l (FALUGI et al., 2013) e de 1,0 µg/l (ARULVASU et al., 2014; KUMAR et al., 2012). Comparando esses valores com o nanocompósito CAg, que possui uma quantidade de prata de 208,3 mg/g (Tabela 1), a DL 50 das AgNPs, proporcionalmente, seria de 187,9 mg/l, valor 50 vezes maior que o maior resultado encontrado na literatura.

113 111 Tabela 8. Taxa de mortalidade (%) dos náuplios de Artemia salina após 24 e 48h de incubação com os nanomateriais C+ C- 25 mg/l 50 mg/l 75 mg/l 100 mg/l 125 mg/l 500 mg/l 1000 mg/l 24 h CAgS 100±0.0 1±3.1 0±0.0 1±3.1 0±0.0 0±0.0 0±0.0 0±0.0 0±0.0 CAgN 100±0.0 0±0.0 0±0.0 0±0.0 0±0.0 0±0.0 0±0.0 0±0.0 0±0.0 CAg 100±0.0 0±0.0 0±0.0 2±4.2 1±3.1 0±0.0 1±3.1 1±3.1 6±6.9 MAgS 100±0.0 0±0.0 0±0.0 1±3.1 2±4.2 0±0.0 0±0.0 1±3.1 1±3.1 MAg 100±0.0 1±3.1 0±0.0 0±0.0 0±0.0 1±3.1 2±4.2 1±3.1 12±4.2 MAgN 100±0.0 1±3.1 1±3.1 0±0.0 0±0.0 1±3.1 0±0.0 1±3.1 0±0.0 OCM 100±0.0 0±0.0 0±0.0 0±0.0 0±0.0 0±0.0 1±3.1 1±3.1 0±0.0 NPM 100±0.0 1±3.1 1±3.1 0±0.0 0±0.0 1±3.1 0±0.0 2±6.3 2± h CAgS 100±0.0 3±4.8 1±3.1 2±4.2 1±3.1 0±0.0 1±3.1 10±6.6 25±10.8 CAgN 100±0.0 1±3.1 0±0.0 2±4.2 2±4.2 1±3.1 1±3.1 16±9.6 36±11.7 CAg 100±0.0 1±3.1 1±3.1 2±4.2 1±3.1 0±0.0 1±3.1 44± ±11.7 MAgS 100±0.0 0±0.0 0±0.0 1±3.1 8±11.3 3±4.8 3±4.8 5±5.2 34±6.9 MAg 100±0.0 2±4.2 0±0.0 0±0.0 0±0.0 1±3.1 2±4.2 23±4.8 46±9.7 MAgN 100±0.0 4±6.9 3±4.8 0±0.0 2±4.2 1±3.1 2±4.2 14±6.7 22±9.2 OCM 100±0.0 0±0.0 0±0.0 0±0.0 0±0.0 0±0.0 1±3.1 1±3.1 7±8.2 NPM 100±0.0 1±3.1 1±3.1 0±0.0 0±0.0 1±3.1 0±0.0 9±8.7 17±11.6 A Figura 25a mostra um náuplio de Artemia salina exposto ao nanocompósito CAgS. É possível observar a presença de partículas acumuladas no seu trato digestivo. A análise em fluorescência mostra que a maioria destas é material inorgânico, sendo, então, o CAgS que a Artemia

114 112 salina ingeriu. No controle (Figura 25b) não há o acumulo de material no interior do náuplio. Na imagem com zoom (Figura 25c), é observado um aglomerado de partículas, sendo impossível distinguir AgNPs de Fe 2O 3. Porém, na imagem em fluorescência nota-se a presença de áreas claras entre os aglomerados, correspondentes, possivelmente, a O-C. As nanopartículas são observadas principalmente dentro do tubo digestivo da Artemia salina, mas podem ser vistas também na superfície externa do seu corpo (Figura 25d). O hábito alimentar da Artemia salina é filtrador, alimenta-se basicamente de bactérias, algas unicelulares, pequenos protozoários e detritos dissolvidos no meio. A filtração do alimento ocorre nos toracópodos encarregados de conduzir as partículas em direção ao trato digestivo (SOUTO; WATANABE; ROCHA, 2000). Porém, a Artemia salina é um filtrador não seletivo, tem um comportamento muito primitivo de ingestão em comparação com outros crustáceos. Partículas suspensas (não importa qual a sua natureza) com tamanho menos que 50 µm são continuamente ingeridos por ela (WANG et al., 2017). A ingestão é considerada a principal via de absorção de nanopartículas e a principal causa de toxicidade na maioria dos organismos aquáticos, como peixes, micro e macro-crustáceos e zooplânctons (WARD; KACH, 2009). Porém, apesar de as nanopartículas serem capturadas pela Artemia salina, a taxa de mortalidade foi bem reduzida, mostrando que os náuplios são capazes de eliminar as partículas, sem que estas lhes causem danos.

115 Figura 25. Micrografias dos náuplios de Artemia salina obtidas por fluorescência (preto/verde) e por transmissão (cinza) após 48 h de exposição ao nanocompósito CAgS (500mg/L) (a) e (d), controle negativo (b) e zoom da imagem a (c) 113