PADRONIZAÇÃO E VALIDAÇÃO DO MÉTODO DE RADIOIMUNOENSAIO PARA DOSAGEM DA TESTOSTERONA NO PLASMA, NO TESTÍCULO E NO FLUÍDO SEMINAL INTERSTICIAL.

Transcrição

1 ARS VETERINARIA, 15(2):74-78, PADRONIZAÇÃO E VALIDAÇÃO DO MÉTODO DE RADIOIMUNOENSAIO PARA DOSAGEM DA TESTOSTERONA NO PLASMA, NO TESTÍCULO E NO FLUÍDO SEMINAL INTERSTICIAL. A. A. M. ROSA E SILVA 1 SUMMARY A reliable method which permits the measurement of testosterone in plasma, testis homogenate and seminal intersticial fluid (SFI) of rats is described. After extraction of plasma and testicular homogenates with diethilic ether and no extraction of SFI, the radioimmunoassay (RIA) method of double antibody were performed. It utilizes testosterone labelled with 125 I and high antibody titres. The method described is at least five fold less expensive than available commercial Kits. KEY-WORDS: Radioimmunoassay, testosterone, plasma, testis, seminal intersticial fluid, rat. INTRODUÇÃO O método de radioimunoensaio de testosterona foi descrito pela primeira vez por Furuyama et al, Muitos procedimentos têm sido relatados desde então, nos quais a precisão, exatidão, especificidade e praticabilidade têm aumentado progressivamente. Os princípios gerais de radioimunoensaio de esteróides utilizados para a determinação de testosterona são encontrados na revisão de Moreno et al, Normalmente os métodos de dosagem desenvolvidos em laboratórios científicos utilizam como traçadores a 1,2 H 3 - testosterona ou a (1,2,6,7, - 3 H) testosterona que são disponíveis comercialmente. Por outro lado, o método do 2º anticorpo utiliza a testosterona, conjugada com o radical tirosina metil-éster, marcada com Na 125 I. Esta segunda metodologia demanda procedimentos de separação entre a fração livre da fração ligada que são menos trabalhosos, menos onerosos e mais rápidos na execução. Outra característica desta técnica é que o título do 1º anticorpo utilizado é mais alto e portanto economicamente mais vantajoso. Nós padronizamos e validamos em nosso laboratório o método de dosagem da testosterona no qual utilizamos o derivado 7α-butírico da testosterona para marcação com 125 I e o método do duplo anticorpo para RIE, descrito originalmente por Niswender et al, 1968, modificado por Bélanger et al, As etapas e as características do método foram estudadas em detalhes e são descritas pormenorizadamente. MATERIAL E MÉTODOS 1. Anticorpo antigamaglobulina de coelho produzido em cabras, pelo laboratório de Fisiologia da Reprodução - FMRP-USP. 2. Anticorpos antitestosterona desenvolvido em coelhos imunizados com testosterona 7α-butirato-BSA. 3. Na [ 125 I] cat IMS-30, Amersham International plc Inglaterra, HP79NA. 4. Gonadotrofina coriônica humana (hcg) (P-C5297) Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA. 5. LH-RH análogo (LH-RH A), des gly 10, [DTrp 6 ] - LHRH ethylamide, produto n.º L5386, Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA. 6. Sephadex-G25 stock n.º G25-80, 20-80μ, Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA. 7. Tampão para marcação e para o radioimunoensaio 1. Laboratório de Fisiologia da Reprodução, Departamento de Fisiologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP , Ribeirão Preto, SP

2 75 ARS VETERINARIA, 15(2):74-78, (TRIA): Tampão fosfato (Na 2 0.1M, ph 7.5, gelatina 0.1%, NaN 3 0.1%, NaCl 0.15M). 8. Tampão diluição do primeiro anticorpo: tampão fosfato (Na 2 0.1M, ph 7.5, gelatina 0.1%, NaN 3 0.1%, NaCl 0.15M). Soro de coelho normal 1%. 9. Testosterona para marcação derivado de tirosina metil ester (TME), testosterona 7a-butirato. Os ítens 2 e 9 foram gentilmente cedidos pelo Prof. Dr. Alain Bélanger, CHUL, Quebec, Canadá. 10. Testosterona utilizada como padrão é fornecida pela Sigma Catálogo n.º T1268 (Os outros reagentes são adquiridos da Merck S.A. ) Animais Utilizou-se ratos machos controles, submetidos à castração química com LH-RH A (250ng/rato Vickery e Nestor, 1987), ou ao efeito estimulador do hcg, na concentração de 10UI/100g de peso corporal administrada por via subcutânea. Neste último grupo de animais, o sangue foi colhido 2h após a administração de hcg/salina. Colheita de Sangue e Preservação do Plasma O sangue foi colhido em tubos crônicos heparinizados, após decapitação do animal. Todas as colheitas se procederam 3 minutos após o início do manuseio do animal. O horário das colheitas foi pré-estabelecido e fixo para todos os experimentos realizados. Após a colheita de sangue, sob gelo, este foi centrifugado a 2000 rpm durante 15 minutos, o plasma foi separado e estocado a 4ºC. Colheita e Preservação do Testículo O testículo de rato foi colhido após decapitação e mediante incisão do saco escrotal. Após retirado, foi pesado e imediatamente imerso em nitrogênio líquido e estocado à 70ºC. Colheita e Preservação do Fluído Seminífero Intersticial (FSI) O FSI do testículo de rato foi obtido por drenagem espontânea de testículo mantidos em repouso, durante 24 horas à 4ºC, suspensos em tubos cônicos, por fios de nylon. Na cápsula testicular do polo inferior foi feita pequena incisão que permitiu a drenagem. Seu volume foi medido por micropipeta graduada e o material mantido à 4ºC. Extração da Testosterona do Plasma e do Testículo Foram testados neste trabalho, volumes entre ml de plasma ao qual foi adicionado 4,0ml de éter etílico destilado. A seguir, os tubos de vidro (Klimax 15ml) foram mantidos em contínua agitação durante 1 minuto. O sobrenadante etéreo foi decantado e evaporado em banhomaria à 37ºC, sendo desprezado o precipitado. O extrato seco foi ressuspenso com 500ml de Tria. Após agitação em Vortex, a solução foi pipetada em duplicatas nos tubos do RIE. A eficiência da extração foi calculada adicionando-se 10μl de uma solução de recuperação contendo aproximadamente 2000 cpm de testosterona iodada em 20 tubos com 100μl de plasma. Após o processo de extração, descrito acima, 20μl da solução foi contado em contador gama. A eficiência da extração (EE) é definida como a razão entre o traçador obtido após o procedimento acima e o total de cpm colocado inicialmente. EE = traçador obtido (cpm) x fator de diluição x 100 total do traçador (cpm) Testículo Testículos foram homogenizados em 5ml de metanol e incubados durante horas à 4ºC, após centrifugação a 2000g por 10 minutos, o precipitado foi lavado com 5ml de metanol, recentrifugado e os sobrenadantes combinados, evaporados em banho-maria à 37ºC sob agitação. O resíduo foi ressuspenso em 1ml de água destilada e o hormônio extraído com 5 ml de éter etílico, conforme procedimento já descrito para o plasma. FSI Não foi necessário a realização de extração para dosagem de esteróides no FSI, pois resultados semelhantes são obtidos quer seja realizada ou não a extração (Sharpe et al, 1983). Iodação da Testosterona Utilizou-se o método da Cloramina T (Greenwood e Hunter, 1963) modificado (Bélanger et al, 1980) e submetido à modificações. O derivado L-tirosina da testosterona foi utilizado para a marcação: 1mg do derivado dissolvido em 10ml de etanol foi misturado com 25ml Na 2 (0,5M, ph 7.5) e com 1 mci Na [ 125 I]. Vinte e cinco ml de uma solução de Cloramina T (1mg dissolvida em 1μl de Na2HPO4 0.05M ph 7,6), foi adicionada a reação, que foi interrompida após 2 minutos à temperatura ambiente, com a adição de 25μl de metabissulfito de sódio (2mg/l ml Na 2 PO 4, 0.05M, ph 7.5). A mistura foi imediatamente transferida para coluna de Sephadex G25 (10cm x 1cm) e eluída com TRIA. Procedimentos do Radioimunoensaio O radioimunoensaio foi baseado no método de Bélanger et al, O procedimento é descrito a seguir: 500ml de tampão fosfato, contendo concentrações crescentes do esteróide padrão ou 300μl* de tampão mais 200μl do extrato do plasma desconhecido foram incubados com 200μl da solução de anticorpo, 100μl de testosterona

3 ARS VETERINARIA, 15(2):74-78, marcada (20000 cpm) e 250μl do segundo anticorpo diluídos em tampão fosfato. A incubação à 4ºC foi realizada durante 18 horas e, após centrifugação (2000 g x 15 min), a radioatividade do hormônio ligada ao anticorpo foi contada em um contador gama da LKB com 70% de eficiência. RESULTADOS Iodação: O 125 I livre é eluído nas primeiras frações seguido do hormônio marcado (tubos 10-15), quando a eluição é feita numa velocidade de 8 gotas/min e a coleta de 30 gotas/tubo. O tubo no qual a concentração do hormônio marcado é máxima (pico hormonal) é diluído em TRIA a cpm/100ml, estocado à 4ºC e utilizado por até 3 meses. Eficiência da Extração: A eficiência média da extração foi de 80,93%, variando entre 72% e 100%, com um coeficiente de variação de 9,96%. Volumes de Plasma Utilizados na Extração: Os volumes de plasma e homogenato testicular utilizados nas extrações e subsequentemente nos ensaios (inclusive os de SIF) foram escolhidos, levando-se em conta que o valor de B/Bo (ligado/ligado na concentração zero do padrão) correspondente a cada amostra neste volume, foi de aproximadamente 50%. Na Tabela 1 encontra-se representados os volumes supra-citados e os valores de B/Bo correspondentes. Pela análise desta Tabela e da Figura 1 verificase que é conveniente utilizar-se na extração do plasma de rato controle 200μl, para tratado com hcg 25μl e castrado 500μl (Figura 1), mantendo-se o B/Bo em torno de 50%. Do extrato testicular utilizamos volumes pequenos como 1μl no controle e 5μl no tratado com LH-RH A e 0,1μl no tratado com hcg (Figura 2). Também no SIF, a semelhança do testículo, a concentração de testosterona é alta, sendo necessária utilizar somente 1μl (direto no ensaio rato controle) para obter-se um valor de B/Bo de 50% (Tabela 1 e Figura 3). Título e Especificidade do Anticorpo: Quando se analisou a concentração do 1º anticorpo, verificou-se que os títulos 1:6250, 1:15625, 1:31250, 1:62500, 1:125000, 1:250000, 1:312500, 1:625000, 1: , 1: , correspondem a valores de Bo/T (ligação máxima/total traçador) que são 89%, 86%, 84%, 77%, 58%, 51%, 43%, 40%, 24%, 18% e 4%, respectivamente. Foi adotado o título 1/ por apresentar valor B/Bo entre 40 e 50%. O segundo anticorpo foi testado e sua diluição variou de acordo com o lote utilizado. A especificidade do anticorpo não foi determinada em nosso laboratório por ser um anticorpo bem caracterizado pelo laboratório de origem (Chul, Quebec, Canadá). A porcentagem de reação cruzada que apresenta com outros esteróides é < 0.1% com a pregnenolona, progesterona, 17 OH-progesterona, 3 α diol, dehidroepiandrosterona (DHEA), estradiol e estrona; < 0.5% com a androsterona; 21% com a dihidrostestosterona e 100% com a própria testosterona. Características do Ensaio: Utilizando-se por tubo do ensaio cpm de testosterona 125 I e o 1º anticorpo a 1/250000, observou-se que a contagem não específica foi em média de 3.63%, variando de 3.0 a 4.0%, com um coeficiente de variação de 10.02%. A concentração do padrão variou de pg/tubo, sendo a média da dose mínima detectável + erro padrão da média de pg/tubo. A média da dose observada quando B/Bo é igual a 50% foi de pg/tubo com coeficiente de variação ou erro interensaio de 13.5%. Os erros intra- Tabela 1 Volume de plasma (μl) utilizado na extração, volume de extrato de plasma (μl) utilizado no RIE, volume de extrato testicular diluído em g/ml e volume de SIF μl) utilizado no RIE de testosterona, em diferentes situações experimentais LH-RH A (castração química, - inibição da androgênese e hcg (estimulação da androgênese). Animal Plasma Extrato Extrato Volume (μ l) Extração Plasma Testicular SIF no (μ l) no RI E n o R I E RI E (1mg/1μ l) μ l - B /Bo% * ( μ l) - B/Bo%/* μ l - B/Bo%/* R a to C o n tro le (5 0 % ) 1 (5 0 % ) 1 (5 0 % ) R a to L H -R H A (5 0 % ) 5 (5 0 % ) --- R a to h C G (5 0 % ) 0,1 (5 0 % ) --- R a to C a stra d o (5 0 % ) * B/Bo (%) do ligado/ligado no padrão de concentração zero

4 77 ARS VETERINARIA, 15(2):74-78, ensaio foram em média de 5.3%, 7.1% e 4.25%, a nível de 25, 100 e 1000 pg/tubo. A exatidão do radioimunoensaio foi estimulada pelo paralelismo das curvas obtidas com diferentes volumes de extratos de plasma e de testículo e de FSI de ratos controles, submetidos à administração de LH-RH A (castração química) e estimulados com hcg (Tabela 1 e Figuras 1, 2 e 3). DISCUSSÃO Figura 1 - Radioimunoensaio de testosterona. Paralelismo plasma de ratos controles e tratados com LH- RH A e hcg. Figura 2 - Radioimunoensaio de testosterona. Paralelismo extrato de homogenato testicular de ratos controles e tratados com LH-RH A e hcg. Figura 3 - Radioimunoensaio de testosterona. Paralelismo FSI (fluído seminífero intersticial) de ratos controles. O ensaio descrito, para medida de testosterona no extrato de plasma, homogenato testicular e FSI é confiável, sensível e prático. O anticorpo utilizado é produzido pela imunização de coelhos com antígeno testosterona 7αbutirato-BSA que produz anticorpo altamente específico (Moreno et al, 1980). Este fato permite a dosagem de testosterona sem necessidade de cromatografia. No sistema de RIE de esteróides, normalmente utiliza-se o hormônio marcado com trítio ( 3 H), neste caso o RIE torna-se mais oneroso devido ao método de separação entre a fração livre da ligada, no qual utiliza-se carvão/dextrana seguida do líquido de cintilação de alto custo (Moreno et al, 1980). O método padronizado em nosso laboratório utiliza o Na 125 I como marcador do derivado da testosterona, um primeiro anticorpo e um segundo anticorpo, o que evita a utilização de líquido de cintilação, para as leituras barateando o custo da reação. Existe também, neste método um alto título do primeiro anticorpo utilizado por nós, conforme relata Moreno et al, 1980, o que diminui ainda mais o custo da reação. Há kits comerciais disponíveis no mercado, mas a estimativa do custo/amostra é pelo menos cinco vezes maior do que a amostra dosada pelo nosso método que ainda permite a repetição da dosagem da amostra, quando necessário. Em resumo, nosso método é sensível, exato, confiável, fato que pode ser observado pelas características do ensaio, similares às descritas em literatura (Moreno et al, 1980). Além do mais, o método de RIE proposto mostra um grande grau de exatidão, o que é verificado pelo paralelismo entre as curvas padrões e as diluições do plasma, homogenato testicular e SIF. Acrescido a todas estas vantagens, o método pode ser utilizado para determinação de concentração de testosterona em ratos tanto no plasma como em tecidos e outros fluídos biológicos, tanto no animal com a androgênese estimulada (hcg) ou inibida (castração química LH-RH A). Na literatura, considera-se o método de dosagem de testosterona, por RIE, uma ferramenta indispensável para o diagnóstico de desordens testiculares e doenças

5 ARS VETERINARIA, 15(2):74-78, como hiperandrogenismo (Nieshlag, 1978). AGRADECIMENTOS Externamos nossos agradecimentos a Katia Jacqueline Miguel, por serviços datilográficos prestados e Rogério Rosário Azevedo pelo apoio técnico. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BÉLANGER, A., CARON, S., Picard, V. Simultaneous radioimmunoassay of progestins, androgens na estrogens in rat testis. Journal Steroid. of Biochemistry, v. 13, p , BREMNER, W.J., VITIELLO, M.V., PRINZ, A.M. Loss of circadian rhythmicity in blood testosterone levels with aging in normal men. Journal of Clinical Endocrinology Metabolism, v. 56, p , ELLIS, G.B., DESJARDIN, C. Male rats secrete luteinizing hormones, and testosterone episodically. Endocrinology, v. 110, p: , FURUYAMA, S., MAYES, D.M., NUGENT, C.A. A radioimmunoassay for plasma testosterone. Steroids, v 16, p: , GREENWOOD, F.C., HUNTER, W.M. The preparation of 131 I labeled human growth hormone of high specific radioactivity. Biochemial Journal, v. 89, p , MORENO, M.C., WICKINGS, E.J., NIESCHLAG. Methodology of radioimmunoassay for testosterone. In: Gupta D. (Ed.) Radioimmunoassay of steroid hormones. Verlag Chimie, NIESCHLAG, E. (Ed.). Hormone diagnosis in reproductive medicine. Hormone Research, v. 9, p , NISWENDER, G.D., MIDGLEY, A.R., MONROE, S.E., REICHERT JR., L.E. Radioimmunoassay for rat luteinizing hormone anti-ovine LH serum and ovine LH 131 I. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, London, v. 128, p: , SHARPE, R.M., DOOGAN, D.G., COOPER, I. Direct effect of a luteinizing hormone-releasing hormone agonist on intratesticular levels of testosterone and intersticial fluid formation in intact male rats. Endocrinology, The Endocrinology Society, v 113, p , TUREK, F.W., VAN CAUTER, E. Rhythm in reproduction. In: Knobil, E., NEILL, J.D. The Physiology of Reproduction. New York, Raven, 1988, p VICHERY, B.H., NESTOR, J.J. Luteinizing hormonereleasing hormone analogs: development and mechanism of action. Seminars in Reproductive Endocrinology, v. 5, p , 1987.