Análise da utilização de testes alternativos para avaliação de segurança de produtos cosméticos

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1 ARTIGO DE REVISÃO Análise da utilização de testes alternativos para avaliação de segurança de produtos cosméticos ISSN Daisylea de Souza Paiva 1, Juliana Riguetti Vitalli 2, Maria Aparecida Lima Moreira 3 e Carla Aparecida Pedriali Moraes 4 RESUMO Atualmente observa-se uma crescente movimentação por parte de algumas agências regulatórias, organizações não governamentais (ONGs) e até mesmo indústrias de cosméticos no sentido de tentar diminuir o uso de animais de laboratório em ensaios biológicos. Este trabalho teve como objetivo a realização de uma breve revisão bibliográfica da descrição dos métodos de avaliação da segurança in vivo e a possível substituição por métodos alternativos in vitro e in silico pela indústria cosmética no âmbito nacional. Isto foi feito correlacionando a posição de diversos órgãos reguladores referente ao uso de técnicas alternativas. Constatou-se que ainda não é possível substituir totalmente o uso de animais para determinação de novos ativos ou formulações cosméticas, mas os testes alternativos estão contribuindo para reduzir o número de animais utilizados na pesquisa científica. Palavras-chave: Testes alternativos, segurança, produtos cosméticos. 1. Farmacêutica Especialista em Cosmetologia Pesquisa e Desenvolvimento de Produtos Cosméticos, Instituto Racine São Paulo SP e Doutoranda em Neurociências pela Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP); 2. Farmacêutica Especialista em Cosmetologia Pesquisa e Desenvolvimento de Produtos Cosméticos, Instituto Racine São Paulo - SP; 3. Química Especialista em Administração Industrial, docente do Instituto Racine São Paulo - SP; 4. Doutora e farmacêutica em Ciências na área de Produção e Controle Farmacêuticos USP São Paulo, docente da Fatec de Diadema Luigi Papaiz, Diadema, SP e SENAC São Paulo - SP. Autor para Correspondência: Carla Aparecida Pedriali Moraes. capedriali@hotmail.com Data Recebimento: 30/03/2014 Aceito para p Publicação: 18/05/ introdução O Brasil é o terceiro maior mercado no mundo em consumo de cosméticos e, como consequência, houve um aumento na variedade de matérias- -primas de diferentes origens e pureza disponíveis para este fim. Com isso, os fabricantes têm a obrigação de garantir a segurança e a eficácia dos cosméticos aos consumidores, fazendo com que os riscos de aparecimento das reações adversas (irritação, sensibilização e efeitos sistêmicos) a algum produto seja cada vez menor. Por outro lado, nos últimos anos várias metodologias que não utilizam animais como modelo experimental vêm sendo validadas e recebendo aprovação regulatória na União Europeia, e há incentivo em sua substituição por métodos alternativos in vitro 1, conforme a introdução da Sétima Alteração às Diretrizes de Cosméticos (do inglês, Seventh Amendment to the Cosmetics Directive) 2,3. Uma vez havendo a utilização de animais, o uso de técnicas bioestatísticas é crucial para determinação do cálculo da amostra a ser utilizada, no planejamento do desenho experimental apropriado, na deteminação da hipótese estatística a ser testada e na escolha do método para análise de dados 4. O Comitê Coordenador Interagência na Validação de Métodos Alternativos (ICCVAM) (do inglês, Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) é responsável pela validação dos testes in vitro desenvolvidos, que são posteriormente aprovados pelo Laboratório de Referência da União Europeia para Alternativas aos Testes em Animais (EURL ECVAM, do inglês, European Union Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing). Nos Estados Unidos, o Programa Nacional de 52 RESBCAL, São Paulo, v.3 n.1, pg , 2015

2 Daisylea de Souza Paiva, Juliana Riguetti Vitalli, Maria Aparecida Lima Moreira e Carla Aparecida Pedriali Moraes Toxicologia (NTP, do inglês National Toxicology Program) do Departamento de Saúde e Serviços Humanos, por meio do Centro Interagências para Avaliação de Métodos Toxicológicos Alternativos (NICEATM, do inglês NTP Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods) trabalha em conjunto com o ICCVAM e aceita as validações feitas pelo mesmo. Dessa forma, as metodologias criadas pela comunidade científica são validadas pelo ICCVAM e publicadas como de guia ou TG (do inglês, Test Guidelines) pela OECD (do inglês Organisation for Economic Co- -operation and Development, Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico). A partir desse contexto, realizamos neste artigo uma breve exposição sobre os métodos convencionais utilizados para determinar segurança de produtos cosméticos, bem como revisamos os principais e recentes métodos alternativos publicados em revistas científicas, e se estes podem vir a substituir o uso de animais estritamente na área cosmética, tendo como base os aspectos éticos, eficiência e harmonização de resultados. 2. Métodos in silico de análise de novas moléculas O termo in silico refere-se aos métodos de análise baseados em modelos computacionais. São capazes de predizer as características de moléculas e a interação destas com proteínas conhecidas, além de dados toxicológicos. O uso de ferramentas computacionais para prever respostas biológicas vem sendo usado desde meados de Incluídos nos métodos in silico, temos o SAR 6 (do inglês, Structure-activity Relationship, Correlação estrutura-atividade e identifica grupos reativos), QSAR 2D (do inglês, Quantitative Structure-activity Relationship, Correlação quantitativa estrutura-atividade), QSAR 3D (considera a tipologia tridimensional) e QSAR 4D (considera as dinâmicas de interações). Os métodos QSAR são os mais utilizados atualmente, principalmente no ramo da toxicologia in silico, chamados QSTR (do inglês, Quantitative Structure-toxicity Relationship, Correlação quantitativa estrutura-toxicidade). Esses modelos podem predizer endpoints contínuos (doses letais) ou categóricos (genotóxico ou não genotóxico) 6,7. Uma nova abordagem in silico denominada CADD (do inglês Computer-Aided Drug Design, Desenho de Drogas Feito por Computador) leva em conta a ligação da molécula ao receptor, pode prever ou melhorar o metabolismo, farmacocinética e toxicidade 5,8. O sucesso de um método in silico vai depender da infraestrutura químico-informática que combine diversas fontes de dados para compreender melhor a atividade biológica dos compostos. Esses sistemas preditivos estão em constante mudança, o que implica que novos dados devem ser continuamente incorporados ao sistema na medida em que novos conhecimentos estejam disponíveis. Assim, a validação desses métodos apresenta dificuldades, uma vez que o sistema está em constante mudança Utilização de técnicas in vitro e in vivo para análise de ingredientes e formulações cosméticas Irritação Ocular O teste proposto por Draize 10 ainda é padrão quando se trata de irritação ocular, pois vários estudos de validação concluíram que nenhum teste in vitro sozinho é capaz de substituí-lo, uma vez que ainda seria incapaz de modelar toda a resposta imunológica, bioquímica e celular à irritação ocular. No entanto, quando utilizados em conjunto fornecem valiosas informações sobre irritação ocular 11. No teste ICE (do inglês, Isolated Chicken Eye test ou Teste de olho de galinha isolado) desenvolvido por Prinsen e Koeter 12 os efeitos tóxicos causados por uma substância são medidos pela análise qualitativa da opacidade, pela retenção de fluoresceína e danos macroscópicos na morfologia RESBCAL, São Paulo, v.3 n.1, pg ,

3 Análise da utilização de testes alternativos para avaliação de segurança de produtos cosméticos da superfície do olho, além da determinação quantitativa do aumento da espessura da córnea 12,13. A proposta do teste BCOP (do inglês, Bovine Corneal Opacity and Permeation test ou Teste de Permeabilidade e opacidade de córnea bovina) 14 é avaliar o potencial de risco para o olho de uma substância teste medida pela habilidade em induzir a opacidade e aumentar a permeabilidade em córnea bovina, sendo que a medição é feita pela diminuição na transmissão da luz 15. O Teste do Ovo de Hen - Membrana Corioalantoide (HET-CAM, do inglês, Hen s Egg Test - Chorioallantoic Membrane) é um modelo organotípico utilizado para avaliar os efeitos das substâncias (visualização de reações irritantes como hemorragia, lise e coagulação) nos tecidos conjuntivais do olho, uma vez que a membrana corioalantóide do ovo embrionado (Leghorn com 10 dias de fecundação) de galinha possui tecidos de mucosa vascularizados semelhantes aos encontrados nos olhos humanos e de coelhos 16,17. Os métodos in vitro ICE e o BCOP são validados pela União Europeia (ICCVAM e aprovados pelo ECVAM) e preconizados pelo Programa Nacional de Toxicologia, nos Estados Unidos, para predição de irritação ocular severa 13,15, e também para distinguir substâncias irritantes de categoria 1 e 2. Os ensaios de citoxicidade têm como objetivo determinar a porcentagem de morte celular por meio de corantes vitais como o MTT (ou 3-(4,5 dimethyl thiazole-2yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) ou vermelho neutro, que são incorporados pelas células vivas. A adição de solvente solubiliza os cristais e a mudança na coloração para púrpura é quantificada por meio de medição da absorbância 17,18. No Brasil, a ANVISA aceita este teste 18. Existe ainda vários novos protocolos, como o EpiOcular e o SkinEthic, que estão em fase de validação e utilizam tecidos humanos reconstituídos para avaliação de toxicidade ocular. Dentre eles, o sistema EpiOcular utiliza epitélio corneal humano e consiste na exposição do epitélio à substância a ser testada, verificando-se a diminuição na viabilidade celular por meio do método MTT 3. Corrosividade Cutânea A corrosividade cutânea refere-se à produção de dano irreversível (necrose visível) à pele, causado pela aplicação de uma determinada substância num período de 4 horas. O teste in vivo consiste em colocar um patch semi-oclusivo em contato com a pele de coelhos albinos e verificar as reações manifestadas 19. Apesar da corrosividade não ser um fator de risco para cosméticos, pode acontecer após algum erro na fabricação ou mal uso de consumidores. Nos últimos anos algumas metodologias in vitro já foram validadas pelo ICCVAM e são aceitas como substitutas para o teste de Draize. Dentre elas, podemos citar o TER, EpiSkin, EpiDerm, Skin Ethic, Corrositex e EST O Teste de Resistência Elétrica Transcutânea (do inglês Transcutaneous Electrical Resistance Test Method, conhecido como TER) é validado pela OECD e diferencia substâncias e misturas corrosivas e não corrosivas à pele 20. O método utiliza discos de pele acoplados a um sistema de dois compartimentos, onde o disco é a separação entre compartimentos. O potencial corrosivo é testado aplicando-se uma substância por 24 horas para verificar a perda da integridade do estrato córneo, que é medida como uma redução na TER para abaixo de 5Ω 20. Outros métodos para avaliação da corrosividade de substâncias são baseados em Epiderme Humana Reconstituída (RhE), sendo denominados comercialmente como SkinEthic, EpiSkin e EpiDerm 21,22. Tais modelos se baseiam na premissa de que substâncias corrosivas penetram no estrato córneo por difusão e que são tóxicas para as células. Dessa forma, a viabilidade celular é medida por adição de corante MTT e identificadas pela capacidade de reduzir em 50% a viabilidade celular 2,21,22. Um outro modelo que utiliza epiderme reconstituída é o Teste de Epiderme 1000 (do inglês Epidermal Skin Test 1000, EST-1000). A camada submersa de queratinócitos humanos encontra-se em uma interface ar-líquido, que estimula a dife- 54 RESBCAL, São Paulo, v.3 n.1, pg , 2015

4 Daisylea de Souza Paiva, Juliana Riguetti Vitalli, Maria Aparecida Lima Moreira e Carla Aparecida Pedriali Moraes renciação das células. O protocolo é baseado na TG , que é o mesmo utilizado para os testes EpiDerm, EpiSkin e SkinEthic 23. Para avaliação do potencial de corrosividade de ácidos, bases e derivados ácidos utiliza-se o ensaio Corrositex. Tal ensaio consiste em colocar a substância teste em um tubo contendo solução indicadora de ph separada por uma membrana semipermeável composta de queratina, de forma que, se a substância atravessar a membrana, ocorrerá a alteração no ph da solução 24,25,26. Irritação Dérmica Irritação dérmica é caracterizada pelo aparecimento de dano reversível à pele em decorrência da aplicação de uma determinada substância por mais de 4 horas. Para determinação de irritação dérmica, os testes de epiderme humana reconstituída (RHE) validados pela ECVAM (TG 439) 27 são: EpiDerm SIT (EPI-200), SkinEthic RHE e EpiSkin. O EpiSkin foi validado como um método que pode ser utilizado sozinho para distinguir substâncias não irritantes de irritantes, substituindo o tradicional teste in vivo de Draize 10 para irritação dérmica. Além destes últimos, os testes EpiDerm e SkinEthic também pode ser utilizados para identificação de substâncias irritantes. O teste de Epiderme Humana reconstituída (RHE) é feito com base na formação de edema e eritema, como resultado de uma cascata de eventos de irritação da pele, começando pela penetração pelo estrato córneo 27. Sensibilização cutânea Para determinação da sensibilização dérmica não existe nenhum teste in vitro validado pela ECVAM como alternativa para os testes em animais, devido à complexidade e diversidade dos mecanismos biológicos de sensibilização e a grande quantidade de substâncias disponíveis 28. No teste de Maximização em Guinea pig (conhecido como porquinho-da-índia) 28, a sustância-teste é injetada intradermicamente na região dorsal com um adjuvante em cobaias, e a duração do teste é de aproximadamente 35 dias. Para o teste de oclusão de Buehler não é necessária a utilização de adjuvantes e, nesse caso, o processo de sensibilização ocorre quando a pele fica em contato com um patch oclusivo que contém a substância teste 18,29. No intuito de diminuir o número de animais utilizados, foi desenvolvido o teste LLNA descrito na TG Tal método é baseado no princípio de que os agentes sensibilizadores induzem proliferação de linfócitos no local de aplicação e é proporcional à concentração da substância analisada 30. O Ensaio de Reatividade Direta de Peptídeo (DPRA, do inglês Direct Peptide Reactivity Assay) foi desenvolvido pela Procter & Gamble. Verifica o processo de haptenação, que é a ligação de substâncias de baixo peso molecular (haptenos) à proteínas da pele consideradas iniciadoras dos processos de sensibilização dérmica 31. Já o teste KeratinoSens avalia a ativação da via dependente do elemento de resposta antioxidante (ARE) em queratinócitos, um mecanismo-chave conhecido na sensibilização dérmica. KeratinoSens é uma linhagem celular que contém a sequência ARE do gene envolvido com a ativação dessa via, e o resultado do teste é dado pela determinação da ativação da enzima luciferase 32. Adicionalmente, o teste RBC (Sistema de células vermelhas, do inglês Red Blood Cell System) é aceito pela Anvisa e permite quantificar e avaliar os efeitos de substâncias sobre a membrana plasmática de hemácias, bem como a consequente liberação da hemoglobina (hemólise) e ainda, o índice de desnaturação da hemoglobina que são quantificados por espectrofotometria 33. Fototoxicidade A fototoxicidade ou fotoirritação é definida como uma resposta tóxica induzida após a primeira exposição da pele ou administração sistêmica de uma substância química e subsequente exposição à luz 18. No teste de fototoxicidade, o produto é aplicado na pele do animal, seguido por exposição à radiação UVA e UVB. Após RESBCAL, São Paulo, v.3 n.1, pg ,

5 Análise da utilização de testes alternativos para avaliação de segurança de produtos cosméticos 48 horas, são feitas observações macroscópicas comparando-se com a área controle onde não houve exposição 18. O 3T3 NRU PT (Teste de Fototoxicidade pela captação de Vermelho Neutro pela linhagem de células 3T3, do inglês Neutral Red Uptake Phototoxicity Test) é o teste de fototoxicidade in vitro validado e publicado na TG T3 é uma linhagem de células obtidas a partir do tecido de embrião de camundongo. Esse teste é realizado após a exposição a uma dose de radiação UVA em comparação com a ausência de exposição. A citotoxicidade é expressa com uma redução da concentração da captação do corante vermelho neutro 35. Apesar de utilizar uma linhagem de células de camundongos, o uso de animais foi diminuído drasticamente após a adoção desse teste. Vermelho neutro (NR, do inglês Neutral Red) é um corante catiônico que se difunde rapidamente através das membranas celulares e acumula-se nos lisossomas celulares. Uma vez no meio ácido do lisossoma, o NR é oxidado, tornando-se carregado positivamente e preso dentro do lisossoma. A menos que a célula ou o lisossoma seja danificado, o corante vermelho permanece preso 35. Toxicocinética A Anvisa define toxicocinética como os processos de resposta do nosso organismo frente a uma substância química, em função da dose e do tempo, em termos de ADME (Absorção, Distribuição, Metabolismo e Excreção) 36. De todos os mecanismos ADME, apenas a absorção dérmica pode ser avaliada in vitro, conforme a TG O método consiste em um aparato de difusão constituído por uma câmara doadora e um compartimento receptor, entre os quais a pele é posicionada. Aplica-se a substância na pele por um período de até 24 horas. Durante esse período, a pele é lavada e o líquido dos dois compartimentos é recolhido para determinar o quanto de substância penetrou na pele 34. Este teste é muito difícil de ser mensurado in vitro. Encontra-se em fase de desenvolvimento um teste que tenta mimetizar a metabolização in vitro. No entanto, como os sistemas de metabolização em humanos e animais são diferentes, desenvolver métodos alternativos torna-se um desafio. Nos Estados Unidos, o FDA recomenda a avaliação metabólica em humanos. Devido a essas limitações, tem crescido o uso de ferramentas in silico para predição da toxicocinética. Um dos modelos in silico utilizados é o Toxicocinética Fisiologicamente Fundamentada (PBTK, do inglês Physiologically-Based ToxicoKinetics), que avalia os parâmetros físico-químicos das substâncias e prediz como será o comportamento nos processos ADME. O posiciomento das agências regulatórias quanto aos métodos alternativos in vitro A ANVISA determina que sejam utilizados métodos alternativos sempre que for possível, mas não impõe restrição quanto ao uso de animais. Nos Estados Unidos, o FDA exige, para produtos que contenham substâncias em escala nano, que sejam feitos testes em animais. Já na União Europeia, os testes em animais para avaliar a segurança cosmética são proibidos. Porém, na China, o uso de animais em testes de segurança e eficácia em cosméticos é obrigatório. Dessa forma, um outro aspecto que deve ser levado em conta é se existe no briefing do produto a intenção de venda em algum país onde é obrigatório o uso de animais para determinação de segurança, como na China. Essa decisão deve ser tomada antes mesmo de escolher uma substância nova como ingrediente de um produto cosmético. 4. considerações finais A comunidade científica, no Brasil e no exterior, na maioria de seus membros, vem declarando que, devido à complexidade em representar em culturas de células o funcionamento de um sistema, e até mesmo em obter de forma alternativa um organismo completo, não é possível substituir totalmente o uso de animais para determinação de alguns atributos (Toxicocinética, por exemplo). 56 RESBCAL, São Paulo, v.3 n.1, pg , 2015

6 Daisylea de Souza Paiva, Juliana Riguetti Vitalli, Maria Aparecida Lima Moreira e Carla Aparecida Pedriali Moraes Por outro lado, a partir dos dados apresentados, podemos inferir que para a pesquisa de desenvolvimento em cosméticos, foco deste artigo, existem várias alternativas validadas e aceitas pela ANVISA, FDA e COLIPA para diminuir ou até mesmo eliminar o uso de animais, dependendo da complexidade da nova molécula apresentada. Embora ainda existam vários desafios a serem cumpridos, a capacidade de predizer o risco de determinada substância sem a utilização de novos testes em animais provavelmente será possível nos próximos anos, principalmente se houver um grande esforço das empresas e da comunidade científica mundial. Analysis of the use of alternative tests for cosmetic products safety evaluation Currently there has been a growing movement by regulatory agencies, non- -governmental agencies and even cosmetics industries in order to reduce the use of laboratory animals in biological tests. This study aimed to hold a brief literature review of methods for the assessment of in vivo safety and the possible use of in vitro and in silico alternative methods by the national cosmetic industry. This was done to correlate the position adopted by the various regulatory agencies concerning the use of alternative methods. It was found that still can not completely replace the use of animals for determination of new actives or cosmetic formulations, but the alternative tests contributed to reduce the number of animals used in scientific research. ABSTRACT Keywords: Alternative tests, safety, cosmetics products. 1. Baumans V. Ethical aspects of the use of animals in experimental research. In: Tufik MLAS, editors. Animal Models as Tools in Ethical Biomedical Research. São Paulo; p Alepee N, Bessou-Touya S, Cotovio J, de Smedt A, de Wever B, Faller C, et al. Cosmetics Europe multi-laboratory pre-validation of the SkinEthic TM reconstituted human corneal epithelium test method for the prediction of eye irritation. Toxicol. In Vitro 2013; 27(5): Pfannenbecker U, Bessou-Touya S, Faller C, Harbell J, Jacob T, Raabe H, et al. Cosmetics Europe multilaboratory pre-validation of the EpiOcular TM reconstituted human tissue test method for the prediction of eye irritation. Toxicol. In Vitro 2013; 27(2): Puopolo M. Biostatistical approaches to reducing the number of animals used in biomedical research. Ann Ist Super Sanita. 2004; 40(2): Kien GA, Heller FN. Simulation of biologic systems by digital computer. Arch Phys Med Rehabil. 1967; 48(9): Hartung T, Hoffmann S. Food for thought... on in silico methods in toxicology. Altex. 2009; 26(3): Winkler DA, Mombelli E, Pietroiusti A, Tran L, Worth A, Fadeel B, et al. Applying quantitative structure-activity relationship approaches to nanotoxicology: current status and future potential. Toxicology. 2013; 313(1): Sliwoski G, Kothiwale S, Meiler J, Lowe EW, Jr. Computational methods in drug discovery. Pharmacol Rev. 2014; 66(1): Vedani A, Smiesko M. In silico toxicology in drug discovery - concepts based on three-dimensional models. Altern Lab Anim. 2009; 37(5): Draize JH, Woodard G, Calvery HD. Methods for study of irritation and toxicology of substances applied topically to the skin and mucous REFERêNCias RESBCAL, São Paulo, v.3 n.1, pg ,

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