CONSELHO REGIONAL DE QUÍMICA - IV REGIÃO (SP)

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1 CONSELHO REGIONAL DE QUÍMICA - IV REGIÃO (SP) Conceitos fundamentais de Cromatografia a líquido de Alto Desempenho (HPLC) Ministrante: Ayrton Argenton CEP Curso Contatos: ayrtonargenton@hotmail.com Apoio São José do Rio Preto, 29 de maio de 2010 Observação: A versão original desta apresentação, com slides coloridos, no formato PDF, está disponível na seção downloads do site do CRQ-IV (

2 CONCEITOS DE CROMATOGRAFIA A LÍQUIDO DE ALTO DESEMPENHO(HPLC) AYRTON ARGENTON Prof. Ayrton Argenton: Químico formado pela USP. Pesquisador Sênior pela REPUSA Petrobrás, Chefe do Centro de Pesquisa da Oxiteno, Chefe de Pesquisas e Laboratório da CGS Instrumentação Ltda. Ministrou treinamentos técnicos para centenas de empresas brasileiras. Mais de 20 anos de experiência e especialização em treinamento de Cromatografia a Líquido e a Gás em Inds. Químicas, Farmacêuticas, Alimentícias, Destilarias e Usinas de Açúcar e Álcool e Empresas relacionadas. Atualmente aplica Treinamentos e Consultoria pelo CEP CURSOS Centro de Educação Profissional

3 Nas indústrias químicas, farmacêuticas, alimentícias, refinarias, petroquímicas, laboratórios de análises clínicas, ambiental e forense entre outras, frequentemente é necessário separar, isolar, purificar, identificar e quantificar os componentes de misturas muitas vezes bastante complexas.

4 SEPARAÇÃO Operação pela qual uma mistura é dividida em pelo menos duas frações com diferentes composições. É obtida por meios físicos embora reações químicas podem ser envolvidas no processo. Os métodos físico-quimicos de separação são baseados na utilização de alguma propriedade física das substâncias a serem separadas. Exemplos: TIPO DE SEPARAÇÃO Destilação fracionada Extração com solvente Cromatografia PROPRIEDADE FÍSICA Diferença de ponto de ebulição Diferença na constante de distribuição (partição) dos componentes em dois solventes Diferença de afinidade das substâncias por um material ativo ou adsorvente

5 IMPORTÂNCIA DA CROMATOGRAFIA Velocidade Minicursos CRQ-IV Poder de resolução Manuseio de pequenas quantidades de amostra ( g) Simplicidade da técnica

6 EXEMPLOS DE CROMATOGRAMAS Minicursos CRQ-IV

7 EXEMPLOS DE CROMATOGRAMAS Minicursos CRQ-IV

8 VISÃO GERAL DE CROMATOGRAFIA O objetivo da cromatografia é separar individualmente os diversos constituintes de uma mistura de substâncias seja para identificação, quantificação ou obtenção da substância pura para os mais diversos fins. Tal separação dá-se através da migração da amostra através de uma fase estacionária por intermédio de um fluido (fase móvel). Após a introdução da amostra no sistema cromatográfico, os componentes da amostra se distribuem entre as duas fases e viajam mais lentamente que a fase móvel devido ao efeito retardante da fase estacionária. O equilíbrio de distribuição determina a velocidade com a qual cada componente migra através do sistema.

9 COLUNA CROMATOGRÁFICA FLUXO DETECTOR CROMATOGRAMA SINAL TEMPO

10 COLUNA CROMATOGRÁFICA FLUXO DETECTOR CROMATOGRAMA SINAL TEMPO

11 COLUNA CROMATOGRÁFICA FLUXO DETECTOR CROMATOGRAMA SINAL TEMPO

12 COLUNA CROMATOGRÁFICA FLUXO DETECTOR CROMATOGRAMA SINAL TEMPO

13 COLUNA CROMATOGRÁFICA FLUXO DETECTOR CROMATOGRAMA SINAL TEMPO

14 CLASSIFICAÇÃO DOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS CROMATOGRAFIA TÉCNICA PLANAR EM COLUNA FASE MÓVEL LÍQUIDO GÁS FLUIDO SUPERCRÍTICO LÍQUIDO FASE ESTACIONÁRIA LÍQUIDO SÓLIDO FASE LIGADA LÍQUIDO SÓLIDO FASE LIGADA SÓLIDO FASE LIGADA LÍQUIDO SÓLIDO FASE LIGADA

15 High Performance Liquid Chromatography CLAD = Cromatografia a Líquido de Alto Desempenho CLAE = Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência DESCRIÇÃO GERAL DE HPLC A amostra é dissolvida em um solvente e introduzida na coluna cromatográfica preenchida com a fase estacionária (FE) Um solvente (FM) é bombeado com vazão constante e desloca os componentes da mistura através da coluna. Esses se distribuem entre as duas fases de acordo com suas afinidades As substâncias com maior afinidade com a FE movem-se mais lentamente. Já as substâncias com pouca afinidade com a FE movem-se mais rapidamente. Ao sair da coluna, os componentes passam por um detector que emite um sinal elétrico o qual é registrado, constituindo um cromatograma.

16 EXEMPLOS DE CROMATOGRAMA HPLC Mistura de aminoácidos

17 High Performance Liquid Chromatography APLICAÇÃO HPLC é utilizada em análises de compostos não voláteis ou instáveis termicamente onde a cromatografia a gás não pode ser utilizada. Como cerca de 80% dos compostos apresentam essas características, o campo de aplicação de HPLC é extremamente vasto. ALGUNS EXEMPLOS DE APLICAÇÕES E ANALITOS Indústria Alimentos Tintas Química Clínicas Farmacêutica Analitos Açúcares, ácido ascórbico, ácido benzóico, parabenos, vitaminas, proteínas, peptídeos, aminoácidos Resinas, Tensoativos, biocidas Polímeros Metabólitos, proteínas, peptídeos, aminoácidos Princípios ativos

18 COMPARATIVO HPLC / CG Fator CG HPLC Requisitos da amostra Tipo de Amostra Amostra ou derivado volátil estável termicamente na temperatura de trabalho Gases, líquidos e sólidos baixo peso molecular Amostra solúvel na fase móvel Líquidos e sólidos Iônicos ou covalentes Baixo e alto peso molecular Tempo de análise relativo Em geral mais rápidas que HPLC Em geral mais lentas que CG Pratos teóricos por coluna Até Até Capacidade preparativa Pobre Boa Sensibilidade g (DIC / DCE) 10-9 g (UV) g (coulométrico)

19 INSTRUMENTAÇÃO EM HPLC DIAGRAMA DE UM CROMATÓGRAFO A LÍQUIDO RESERVATÓRIO FASE MÓVEL INJETOR COLUNA DETECTOR BOMBA AQUISIÇÃO DE DADOS O cromatógrafo a líquido é constituído dos seguintes componentes: 1. Reservatório e sistema de bombeamento da fase móvel 2. Sistema de introdução de amostra 3. Sistema analítico: coluna cromatográfica e termostato 4. Sistema de detecção (um ou mais detectores) 5. Sistema de registro e tratamento de dados.

20 DIAGRAMA DETALHADO DE UM HPLC Minicursos CRQ-IV

21 FOTO ILUSTRATIVA DE UM HPLC Minicursos CRQ-IV

22 RESERVATÓRIO DA FASE MÓVEL A figura abaixo ilustra o reservatório da fase móvel e seus componentes: tampa de teflon

23 CONSIDERAÇÃO IMPORTANTE 1: Minicursos CRQ-IV A fase móvel não pode conter partículas para evitar danos à bomba, injetor e coluna, logo é necessário filtração antes de armazenar a fase móvel no reservatório. A figura abaixo ilustra um filtro para HPLC: A escolha do filtro é função da natureza da fase móvel. Usualmente utiliza-se membranas de nylon (0,20 e 0,45 m), celulose (0,22 m) ou TEFLON (1 e 1,5 m)

24 CONSIDERAÇÃO IMPORTANTE 2: A fase móvel deve ser degaseificada para evitar a formação de bolhas no processo de separação o que pode interferir no desempenho da análise. As técnicas de degaseificação são: Ultrasom Refluxo com resistência de aquecimento Vácuo (trompa d água) Purga com Hélio Uso de membrana semipermeável e vácuo online.

25 BOMBA CARACTERÍSTICAS PRINCIPAIS Minicursos CRQ-IV Leva a fase móvel desde o reservatório até a coluna Alta reprodutibilidade e exatidão Vazão contínua sem pulso de 0,01ml /min - 10ml /min Vazão constante independentemente da pressão Alta resistência à corrosão inércia química a solventes comuns Opera a altas pressões (6000 psi) CONSIDERAÇÕES IMPORTANTES Vazão constante é essencial para qualquer separação por HPLC. Alta pressão é necessária para impulsionar o solvente através da coluna cromatográfica vencendo a enorme resistência imposta pela fase estacionária. Normalmente se utiliza bombas recíprocas com um ou preferencialmente dois pistões o que minimiza pulsação. Preferencialmente devem operar com programação de vazão e deve ser possível a interrupção do processo em pressões fora dos limites máximos e mínimos pré-estabelecidos. É importante introduzir fatores de correção de compressibilidade para a fase móvel utilizada ainda que os líquidos tenham baixa compressibilidade. Caso contrário, a vazão real pode diferir da selecionada.

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27 BOMBEAMENTO ISOCRÁTICO OU POR GRADIENTE BOMBEAMENTO ISOCRÁTICO A composição da fase móvel é mantida constante durante toda análise cromatográfica. Nesse caso utiliza-se apenas uma bomba. A figura abaixo ilustra o equipamento necessário para uma análise isocrática.

28 BOMBEAMENTO POR GRADIENTE Alguma análises necessitam alteração da composição da fase móvel, sem alteração da vazão total, com a finalidade de diminuir tempo de análise e/ou melhorar a separação dos componentes da amostra. O bombeamento por gradiente pode ocorrer à baixa pressão ou a alta pressão. No caso de baixa pressão utiliza-se uma única bomba e a seleção do solvente a ser utilizado dá-se através de válvula de multiplas vias controladas pelo software do sistema. Já no caso do bombeamento de alta pressão, cada solvente tem uma bomba específica. A figura abaixo ilustra o equipamento necessário para o a análise por gradiente a baixa e alta pressão.

29 BOMBEAMENTO POR GRADIENTE BAIXA PRESSÃO BOMBEAMENTO POR GRADIENTE ALTA PRESSÃO

30 BOMBEAMENTO ISOCRÁTICO OU POR GRADIENTE A figura abaixo ilustra dois cromatogramas obtidos por análises isocrática e por gradiente. ISOCRÁTICA GRADIENTE

31 INJETOR SISTEMA DE INTRODUÇÃO DE AMOSTRA Minicursos CRQ-IV Em HPLC, a injeção de amostra é realizada com auxílio de válvulas especiais que permitem introdução com grande precisão e exatidão de volumes que variam, em geral, de 5 a 20 l. A figura abaixo, mostra um esquema de uma válvula típica nas posições de carga e de injeção. A amostra é introduzida na válvula com auxílio de uma microseringa com agulha sem ponta e a injeção é efetuada pela rotação da válvula da posição de carga para a posição de injeção.

32 COLUNAS CROMATOGRÁFICAS COLUNAS ANALÍTICAS E PRE-COLUNAS Minicursos CRQ-IV A separação é efetuada nas colunas cromatográficas, feitas em aço e resistentes a altas pressões(até 500 atm) Os tubos das colunas são preenchidos com a fase estacionária conveniente, geralmente sílica ou seus derivados, com granulometria de 3, 5, 7 ou 10 m (em alguns casos, até de 1 m) de diâmetro médio. Devido a queda de pressão elevada nos tubos, as colunas são relativamente curtas e de paredes espessas. COMPRIMENTO: 3 60 cm DIÂMETRO INTERNO: 0,2 8 mm As colunas normais apresentam diâmetro interno variando de 4 6 mm e comprimento que depende da granulometria da fase estacionária como mostra a tabela abaixo. Granulometria ( m) Comprimento (cm) Até 25 cm (em casos especiais, até 60 cm)

33 COLUNAS CROMATOGRÁFICAS COLUNAS ANALÍTICAS CONSIDERAÇÕES IMPORTANTES: Como o tempo de retenção depende da temperatura, as colunas devem ser mantidas termostatizadas em um forno onde pode-se selecionar a temperatura apropriada para a separação. Para reduzir os custo dos solventes e aumentar sua eficiência, estão sendo introduzidas colunas de diâmetro interno de 1 3 mm, de forma que possa operar-se com fluxos menores o que resulta em diminuição substancial do custo de operação e aumento de sensibilidade como ilustrado na figura abaixo.

34 COLUNAS CROMATOGRÁFICAS PRÉ-COLUNAS (GUARD COLUMNS) SEMPRE USE PRÉ-COLUNAS PARA PROTEGER E AUMENTAR A VIDA DA COLUNA ANALÍTICA CARACTERÍSTICAS PRINCIPAIS: Protege a coluna analítica contra contaminações químicas Mesmo material de empacotamento da coluna Comprimento Típico: 25 mm Descartáveis O uso de pré-colunas é de importância vital para a vida útil da coluna analítica. A filtração da fase móvel e da amostra nem sempre são suficientes para a eliminação de impurezas prejudiciais à coluna. Dependendo das características da fase estacionária e da natureza da amostra, pode acontecer o que se chama de retenção irreversível, ou seja, a afinidade do contaminante pela coluna é tão grande que ele não elui, ficando retido nos primeiros centímetros do empacotamento. Retido na cabeça da coluna, o contaminate pode provocar perda da eficiência, aumento de pressão e cauda nos picos. Com o uso da pré-coluna, o contaminante não atingirá a coluna analítica. Ao perceber os sintomas de contaminação (os mais comuns são aumento de pressão e elevação no nível de ruído), o analista substitui a pré-coluna, que em média custa 10 vezes menos que a coluna analítica.

35 DETECTORES O detector é um dispositivo conectado na saída da coluna que percebe a presença de componentes e emite um sinal elétrico a ser registrado na forma de um pico cuja área é proporcional a quantidade do componente analisado. Um detector ideal deve possuir as seguintes características: Alta Sensibilidade Estabilidade Mudanças de temperatura e vazão de fase móvel não devem alterar o sinal Reprodutibilidade Resposta Linear A resposta do detector deve variar linearmente com a concentração do analito numa de concentração Resposta rápida aos analitos Não contribuir para o alargamento do pico O volume da cela do detector deve ser o menor possível para evitar a perda de eficiência Celas de baixo volume, contribuem positivamente com a sensibilidade. Confiabilidade Facilidade de manuseio Não destrutivo Condição necessária para cromatografia preparativa Seletividade Habilidade relativa de um detector medir um composto e não outro. extensa faixa do sistema.

36 DETECTORES TIPOS DE DETECTORES Os principais detectores utilizados em HPLC são: Índice de refração Espectrofotometira UV-Visível Fluorescência Eletroquímico Espectrometria de massa LC/MS

37 DETECTORES ÍNDICE DE REFRAÇÃO No momento da passagem do analito pelo detector, pode ocorrer uma alteração do índice de refração. Essa alteração em relação ao valor da fase móvel livre de analito é detectada. A detecção só é possível quando o índice de refração do analito é diferente do IR da fase móvel. Esse detector é normalmente utilizado quando os analitos não absorvem na região de comprimento de onda do UV-VIS. Apresenta as seguintes desvantagens: baixa sensibilidade não permite a utilização em análises por gradiente (pois o IR varia com a composição da fase móvel) temperatura deve ser constante (pois o IR varia com a temperatura) APLICAÇÃO Análises de carbohidratos e açúcares em geral.

38 DETECTORES ESPECTROFOTÔMETRO UV-Visível (UV-VIS) Minicursos CRQ-IV Baseia-se na absorbância da luz pelo analito ao passar pelo detector. É um detector seletivo pois só detecta os compostos que absorvem no comprimento de onda em que o detector for ajustado. É o detector mais utilizado em HPLC pois grande maioria das substâncias absorvem radiação UV. Exemplos de substâncias são: olefinas, aromáticos, compostos contendo ligações C=O, C=S, N=O. CONSIDERAÇÕES IMPORTANTES: A fase móvel utilizada não pode absorver no comprimento de onda selecionado A pureza da fase móvel é extremamente importante (traços de impurezas podem absorver intensamente no comprimento de onda utilizado): UTILIZAR SOLVENTES GRAU HPLC TIPOS DE DETECTORES UV-VIS: Fotométricos comprimento de onda fixo: 254nm e 280nm Espectrofotométricos comprimento de onda variável: 00nm a190nm

39 DETECTORES ESPECTROFOTÔMETRO UV-Visível (UV-VIS) TIPOS DE DETECTORES UV-VIS: Espectrofotométricos O comprimento de onda é variável entre 190nm e 800nm selecionado através do monocromador (UV = lâmpada de deutério e VIS = lâmpada de tungstênio). Possui maior aplicação pois permite selecionar o comprimento de onda mais adequado para os componentes a serem analisados. Maior sensibilidade: escolha do comprimento de onda de maior absorbância. Maior seletividade: escolha do comprimento de onda onde o soluto de interesse absorve e outros não. Permite a utilização de análise por gradiente: escolha do comprimento de onda onde os constituintes da fase móvel não apresentam variação de absorbância. Permite obter o espectro de absorbância de cada componente separado interrompendo o fluxo da fase móvel e assim selecionar o melhor comprimento de onda.

40 DETECTORES ESPECTROFOTÔMETRO UV-Visível (UV-VIS) Minicursos CRQ-IV Como mostra o esquema do detector, o comprimento de onda é selecionado através do monocromador do feixe de luz emitido pela lâmpada de deutério ou tungstênio e incide na cela por onde passam os componentes da amostra que absorve parte da luz dependendo de sua absortividade molar e concentração. A quantidade de luz não absorvida é detectada pela fotomultiplicadora.

41 DETECTORES TIPOS DE DETECTORES UV-VIS: Espectrofotométricos (REDE DE DIODOS DIODE ARRAY) Nesse tipo de detector, toda luz passa pela cela. A luz emergente é dispersada em uma grade holográfica e os comprimentos de onda resultantes são focalizados em uma rede de fotodiodos (256 a 1024). Assim, todo o espectro do componente pode ser armazenado. Com o auxílio de um computador, pode-se reproduzir um cromatograma para um determinado comprimento de onda ou produzir uma série de espectros em intervalos de tempo fixos. 40

42 DETECTORES REDE DE DIODOS: VANTAGENS EM RELAÇÃO AO DETECTOR UV-VIS No detector UV-VIS, seleciona-se o comprimento de onda que pode não ser o mais adequado para todos os componentes da amostra. Isso resulta na perda de sensibilidade de alguns componentes da amostra. A figura ao lado ilustra a diferença de intensidade do pico para um composto em função do comprimento de onda. Com o DAD, pode-se selecionar o melhor comprimento de onda para cada um dos componentes, otimizando dessa forma a sensibilidade. Isso é extremamente importante na determinação de impurezas nas sínteses e controle de qualidade de princípios ativos de produtos farmacêuticos.

43 DETECTORES ELETROQUÍMICOS Baseia-se na possibilidade de muitos compostos serem oxidados ou reduzidos quando se aplica um potencial elétrico. Em um processo eletroquímico, um par de eletrodos é colocado na cela e um potencial suficientemente elevado é aplicado provocando uma reação de oxidação ou redução gerando uma corrente que é medida em um detector eletroquímico. A corrente gerada é proporcional a concentração do composto. TIPOS DE DETECTORES Amperométrico O elemento flui pela superfície do eletrodo onde uma fração das espécies eletroativas é oxidada ou reduzida (15-20%). Coulométrico O elemento flui através de um eletrodo de grafite poroso onde praticamente 100% das espécies eletroativas são oxidadas ou reduzidas e portanto a sensibilidade é muito maior (10-15 mol = fentomol).

44 DETECTORES ELETROQUÍMICOS COULOMÉTRICO A figura abaixo representa um esquema de uma cela coulométrica:

45 DETECTORES ELETROQUÍMICOS COULOMÉTRICO COULARRAY É possível montar um conjuntos de detectores coulométricos em série o que permite aplicar um potencial crescente em cada cela de forma a oxidar ou reduzir seletivamente cada componente em cada uma das celas. Assim, compostos que eluem juntos podem ser quantificados apesar de não terem sidos separados. É possível o arranjo de 4 a 16 celas eletroquimicas obtendo-se cromatogramas tridimensionais. Tais detectores tem grande aplicação na análise de produtos farmacêuticos, bebidas e alimentos, análises ambientais e em neurociência (neurotransmissores, drogas).

46 DETECTORES ELETROQUÍMICOS COULOMÉTRICO COULARRAY

47 COMPARAÇÃO DE DETECTORES HPLC Índice de Refração Espectrofotometria UV- VIS Fluorescência Eletroquímico Princípio de operação Mudança do IR da fase móvel Absorbância de luz UV- VIS Excitação com luz produz emissão fluorescente Oxidação ou redução em um potencial fixo Tipo Universal Seletivo Seletivo Seletivo Quantidade mínima detectável Micrograma Nanograma < picograma Fentograma Faixa de linearidade Volume da cela (microlitro) Sensibilidade a temperatura Alta Baixa Baixa Média Aplicações Geral Compostos que absorvem na região UV- VIS Compostos ou derivados que fluorescem Espécies que oxidam ou reduzem

48 ELSD EVAPORATIVE LIGHT SCATTERING DETECTOR Detector universal para compostos não voláteis. Baseado na habilidade das partículas causarem espalhamento(scattering) de fótons, quando elas atravessam um feixe de luz policromática. O líquido efluente do HPLC é primeiro nebulizado e a mistura aerosol resultante contendo as partículas dos analitos é dirigida a um feixe de luz. As partículas causam espalhamento da luz. É gerado um sinal, que é proporcional à massa presente, e independe da presença ou ausência de grupos cromóforos, fluoróforos ou eletroativos. Qualquer analito não volátil pode ser detectado. Pode ser usado acoplado a um espectrômetro de massa, para fornecer uma análise completa da amostra. Aplicações para o elsd: Lípidios, acidos graxos, carbohidratos, polímeros, esteroides, aminoácidos, aditivos de plásticos, produtos farmacêuticos, etc.

49 ELSD EVAPORATIVE LIGHT SCATTERING DETECTOR

50 CHARGED AEROSOL DETECTOR CORONA Este detector oferece os benefícios de desempenho que cada um dos detectores: índice de refração, UV de baixo comprimento de onda, ELS de quimiluminescência de nitrogênio num único detector. O eluente é primeiro nebulizado com nitrogênio, e as gotas são secas para remover a fase móvel, produzindo as partículas dos analitos. Uma corrente secundária de nitrogênio passa por um sistema de alta voltagem e é carregado positivamente. Esta carga é transferida para as partículas do analíto, que flue em sentido oposto. A carga é transferida para um coletor onde é medida por um eletrômetro altamente sensível, gerando um sinal que é diretamente proporcional à quantidade de analito presente. O fator de resposta do analito é independente da estrutura química. Aplicações do CAD: Ideal para uma larga faixa de aplicações de compostos não voláteis e semi-voláteis: drogas, carbohidratos, lipídios, esteróides, peptídios, proteínas, polímeros. Indústrias farmacêuticas, alimentícias, químicas, pesquisa life science,etc.

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52 QUADRO COMPARATIVO DE DETECTORES Sensibilidade Faixa Dinâmica Consistência de Resposta Aplicabilidade Reprodutibilidade Compatibilidade Cromatográfica Facilidade de Uso Charged Aerosol UV Evaporative Light Scattering Chemiluminescence Nitrogen Refractive Index

53 AQUISIÇÃO DE DADOS Atualmente utilizam-se softwares que permitem: Processar os dados de cromatograma Armazenar e registrar Controlar a composição da fase móvel (isocrática e por gradiente), vazão da bomba, amostrador automático, temperatura da coluna Realizar cálculos para System Suitability Test (SST)

54 SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA Em função da fase estacionária utilizada tem-se os seguintes mecanismos de separação: Adsorção Partição Troca iônica Exclusão Bioafinidade

55 SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA ADSORÇÃO A fase estacionária é um sólido contendo grupos (sítios ativos) que podem adsorver certas substâncias. Na adsorção tem-se o seguinte equilíbrio: K ads = [adsorvido na FE] [desorvido na FM] Compostos com diferentes constantes de adsorção são separados. FM FE

56 SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA Minicursos CRQ-IV PARTIÇÃO A fase estacionária é um líquido depositado ou quimicamente ligado a um suporte sólido. As moléculas dos componentes a serem separados se distribuem entre a fase estacionária ligada e a fase móvel líquida de acordo com sua afinidade relativa: K part = [dissolvido na FE] [dissolvido na FM] Compostos com diferentes constantes de partição são separados.

57 SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA Minicursos CRQ-IV PARTIÇÃO FM FE A FM carrega as moléculas nela dissolvidas. Para reestabelecer o equilíbrio, moléculas na FE passam para a FM e são arrastadas. Tem-se um equilíbrio dinâmico em cada segmento da coluna. Como a FM está em contínuo movimento, esta acaba retirando todas as moléculas da coluna.

58 SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA Minicursos CRQ-IV TROCA IÔNICA A fase estacionária é uma resina catiônica ou aniônica. O esquema abaixo ilustra o processo:

59 SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA Minicursos CRQ-IV POR EXCLUSÃO O esquema abaixo ilustra o processo: A separação é efetuada de acordo com o tamanho das moléculas. A fase estacionária tem poros de tamanho controlado Moléculas pequenas podem penetrar na maioria dos poros e apresentam um maior tempo de retenção Moléculas grandes movem-se rapidamente através da coluna pois não entram nos poros A técnica é utilizada na análise de compostos de alta massa molecular O mecanismo da exclusão forma a base da cromatografia gel (permeação de gel e filtração de gel) utilizada na determinação de distribuição de peso molecular de polímeros e proteínas

60 SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA Minicursos CRQ-IV BIOAFINIDADE O esquema abaixo ilustra o processo: Nessa técnica somente componentes que possuem bioafinidade com a fase estacionária são retidos.

61 PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS Minicursos CRQ-IV Uma série de parâmetros cromatográficos são importantes para serem utilizados na identificação dos compostos separados, avaliar o desempenho cromatográfico e auxiliar na otimização do processo de separação. Os parâmetros cromatográficos a serem discutidos são: TEMPO DE RETENÇÃO FATOR DE RETENÇÃO FATOR DE SEPARAÇÃO NÚMERO DE PRATOS RESOLUÇÃO

62 PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS TEMPO DE RETENÇÃO Minicursos CRQ-IV Por definição chamamos de TEMPO DE RETENÇÃO, tr, de uma substância ao tempo decorrido do instante em que a amostra foi introduzida até o instante do máximo do pico. Na análise cromatográfica, mantido constantes a vazão da fase móvel e a temperatura da coluna, o tempo de retenção é constante.

63 PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS Minicursos CRQ-IV A partir da figura acima, definimos os seguintes parâmetros cromatográficos de acordo com as equações abaixo: Parâmetro Cromatográfico Definição Fator de retenção k = t r / to Fator de separação = t r2 / t r1 Número de pratos N = 16 ( tr / Wb ) 2 Resolução Rs = 2 ( tr2 - tr1 )/(Wb1 + Wb2)

64 PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS NÚMERO DE PRATOS N = 16 ( tr / Wb ) 2 Minicursos CRQ-IV Número indicativo da performance da coluna. É a medida da largura do pico em relação ao seu tempo de retenção. É o parâmetro que mais precisamente define a qualidade de um sistema cromatográfico. Outra medida da eficiência da coluna é dada pela altura do prato, H (altura equivalente a um prato teórico. onde L = comprimento da coluna H = L N N = número de pratos

65 PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS RESOLUÇÃO Rs = 2 ( tr2 - tr1 )/(Wb1 + Wb2) Fornece uma medida quantitativa da habilidade da coluna em separar duas substâncias.

66 EFICIÊNCIA DA COLUNA Minicursos CRQ-IV A introdução da amostra na coluna leva menos de 1 segundo. Como o equilíbrio entre FE e FM é muito rápido, a largura dos picos também deveria ser aproximadamente 1 segundo. Entretanto, isso não ocorre devido a processos de transporte de massa que altera a velocidade das moléculas de um mesmo composto dentro da coluna. Estatisticamente algumas moléculas viajam mais rapidamente e outras mais lentamente que a média das moléculas, atingindo o detector em tempos diferentes. Consequentemente, o pico registrado é alargado. Além dos processos de transporte de massa, causas externas à coluna, também contribuem para o alargamento dos picos. Quanto maior o valor de N maior a eficiência da coluna. A altura equivalente a um prato teórico é outra maneira de considerar a eficiência da coluna. Quanto menor H, maior a eficiência da coluna. H é o resultado da somatória das contribuições de cada um dos processos de alargamento intra-coluna(hi) e extra-coluna(he).

67 EFICIÊNCIA DA COLUNA Minicursos CRQ-IV Os seguintes processos intra-coluna contribuem para o alargamento dos picos: 1-Difusão caótica(eddy diffusion) caminhos preferenciais diferentes H=Ce.dp, onde Ce é uma constante do processo e dp o diâmetro da particula. 2- Transferência de massa na fase móvel ao passar no interstício das partículas, as moléculas que viajam perto das paredes da FE terão velocidades menores das que viajam no centro H= Cm.dp2.u/Dm, onde u é a velocidade da fase móvel, Dm é o coeficiente de difusão da substância na fase móvel. 3- Contribuição da FM estagnada.dentro dos poros das partículas, algumas moléculas são mais retidas do que outras. H = Csm.dp2.u/Dm 4- Influência de transferência de massa com a FE após a difusão das moléculas dentro dos poros, elas penetram na FE. As que penetram mais profundamente dentro da FE, também demorarão mais para sair e se atrasarão em relação a outras, consequentemente, o pico se alargará. H = s.u.df2/ds, onde df é a espessura do filme e Ds o coeficiente de difusão da substância da fase estacionária.

68 EFICIÊNCIA DA COLUNA Minicursos CRQ-IV Os seguintes processos intra-coluna contribuem para o alargamento dos picos (cont.): 5- Difusão longitudinal na fase móvel H = Cd.Dm/u A somatória desses fatores contribuem para aumentar o valor de H e portanto diminuição da eficiência da coluna. De modo geral as seguintes variáveis contribuem para o alargamento do pico: Substância i, FM, FE, u, Dm. Ds, 1/u, dp, dp2, df2, diâmetro do poro, área superficial, Tcoluna). A velocidade da fase móvel tem efeito prejudicial para alguns fatores e benéficos para outros. Portanto, a avaliação de H em função da velocidade da FM passa por um mínimo. Entre as causas externas, podemos citar: comprimento e diâmetro interno dos tubos que ligam a válvula de introdução da amostra à coluna, volume das conexões envolvidas, volume da cela do detector, etc.

69 EFICIÊNCIA DA COLUNA

70 EFICIÊNCIA DA COLUNA OTIMIZANDO EFICIÊNCIA DA COLUNA Os seguintes fatores devem ser considerados na otimização da eficiência da coluna: Tamanho de partícula Viscosidade da fase móvel Temperatura Empacotamento A equação de Van Deemter mostra que quanto menor a partícula, menor H e menor a influência da vazão na eficiência da coluna: 10 H 5 3 Vazão

71 FASES ESTACIONÁRIAS As FE são constituídas de material sólido, granulado, finamente dividido e densamente empacotado dentro de um tubo feito de material inerte, normalmente aço. O material sólido pode estar revestido ou ligado quimicamente a um líquido. TIPOS DE FASES ESTACIONÁRIA FE SÓLIDA FE POR EXCLUSÃO FE POR TROCA IÔNICA FE POR BIOAFINIDADE FE QUIMICAMENTE LIGADA NORMAL REVERSA

72 FASE ESTACIONÁRIA SÓLIDA Separação realizada por mecanismo de adsorção Utiliza partículas porosas em geral de 5 micra ou 10 micra Indicada para compostos com peso molecular menor que 2000 Daltons Solventes mais utilizados são de média e baixa polaridade Adsorventes mais utilizados: alumina e principalmente sílica SÍLICA A sílica possui grupos siloxano, Si-O-Si e grupos silanol, Si- OH vicinal e germinal. Os grupos silanol são os mais importantes devido a sua polaridade. Quanto mais polar o composto, maior a retenção. A ordem de eluição em sílica é: hidrocarbonetos saturados < olefinas < aromáticos < éteres< ésteres < aldeídos cetonas < álcoois < aminas < amidas < ácidos carboxílicos. Dependendo do procedimento de produção da sílica, suas características, como volume de poro, diâmetro de poro, área superficial, número de grupos silanol, variam resultando em retenção variável.

73 FASE ESTACIONÁRIA POR EXCLUSÃO Minicursos CRQ-IV A separação baseia-se no tamanho das moléculas dos componentes da amostra em relação ao diâmetro dos poros da fase estacionária. As fases estacionárias podem ser sílica ou polímeros de poliestireno-divinilbenzeno, poliacrilamidas e outros, com distribuição de diâmetro dos poros controlada. Moléculas pequenas entram nos poros pequenos enquanto as moléculas grandes não conseguem entrar nos poros. Desta forma elas são permeadas seletivamente. A técnica é denominada cromatografia de exclusão por tamanho.

74 FASES ESTACIONÁRIAS FASE ESTACIONÁRIA POR EXCLUSÃO A figura abaixo ilustra o processo de separação: Minicursos CRQ-IV

75 FASES ESTACIONÁRIAS FASE ESTACIONÁRIA POR EXCLUSÃO APLICAÇÕES: Minicursos CRQ-IV PERMEAÇÃO EM GEL (FM orgânica) Resinas alquídicas Epóxidos Poliestirenos Borracha natural Silicones FILTRAÇÃO EM GEL (FM aquosa) Peptídeos Proteinas Enzimas Ácidos Nucleicos Lipídios Colunas de permeação de gel fabricadas com sais de cálcio ou chumbo de resinas sulfônicas com diâmetro de poro controlado, são usadas nas análises de dextrana, oligossacarídeos e açúcares.

76 FASES ESTACIONÁRIAS FASE ESTACIONÁRIA POR TROCA IÔNICA Minicursos CRQ-IV A separação baseia-se na interação eletrostática dos componentes da amostras com grupos iônicos da FE. A FE é normalmente uma resina de poliestireno-divinilbenzeno a qual estão ligados grupos iônicos, ou a FE é sílica recoberta com uma fina camada de poliestirenodivinilbenzeno onde grupos iônicos estão ligados. Os grupos quimicamente ligados presentes em todo tipo de material de troca iônica são: SO 3- : trocadores fortes de cátions CO 2- : trocadores fracos de cátions NR 3+ : trocadores fortes de ânions NH 2 R + : trocadores fracos de ânions

77 FASES ESTACIONÁRIAS FASE ESTACIONÁRIA POR TROCA IÔNICA Minicursos CRQ-IV

78 FASES ESTACIONÁRIAS Minicursos CRQ-IV FASE ESTACIONÁRIA QUIMICAMENTE LIGADA São as fases mais importantes da cromatografia líquida Obtidas pela reação dos grupos silanois da sílica com compostos contendo grupos polares(fase Normal) ou nao polares(fase Reversa). Na Fase Quimicamente Ligada, a sílica gel, através dos grupamentos Si - OH, se liga quimicamente a um grupo funcional que lhe confere grande estabilidade química. A Cromatografia de Fase Ligada é subdividida em Fase Normal e Fase Reversa de acordo com a polaridade dos grupos funcionais ligados à sílica gel. As notáveis propriedades deste tipo de material fazem da Cromatografia de Fase Ligada a mais utilizada em todo o mundo.

79 FASES ESTACIONÁRIAS FASE ESTACIONÁRIA QUIMICAMENTE LIGADA -Si-O-Si- (R) -Si-O-Si- (R) -Si-OH -Si-OH -Si-OH -Si-O-Si- (R) -Si-O-Si- (R) Grupos silanóis são responsáveis por retenções não específicas que provocam alargamento dos picos.

80 FASES ESTACIONÁRIAS FASE ESTACIONÁRIA QUIMICAMENTE LIGADA Para a produção das Fases Quimicamente Ligadas, a sílica gel é submetida a um processo de hidrólise formando grupos silanóis SiOH, grupo quimicamente ativo no qual se ligará o grupo funcional através de reações de silanização, utilizando organosilanos(ex. dimetilcloroocatadecilsilano), mono, di ou trifuncionais, dependendo do numero de grupos no silano que pode reagir. Obtem-se fase monomérica ou polimérica. Infelizmente, devido a efeitos estéricos, muitos grupos SiOH não reagem permanecendo ativos e provocando encaudamento dos picos. Ligação química tradicional usando silano monofuncional alcança um máximo de 50% ou uma densidade de ligante de ~4µmol/m2. Para atenuar este problema, emprega-se um processo conhecido como Endcapping.

81 FASES ESTACIONARIAS ENDCAPPING Para minimizar o efeito dos grupos silanol residuais é necessário um passo secundário de ligação para cobrir esses grupos ainda presentes na sílica. O processo denominado endcapping efetua-se em geral com trimetilclorosilano(tms). Ainda assim restam grupos silanol livres As sílicas usuais só podem ser utilizadas na faixa de ph 2 8, pois os grupos TMS sofrem hidrolise a ph menor que 2 e a sílica se dissolve em fase móvel contendo água em ph maior que 8. Muitos desses problemas: cauda nos picos de analitos básicos, limitação de ph, baixo tempo de vida da coluna, tem sido resolvidos ou minimizados através de desenvolvimentos mais recentes, tais como: sílica de alta pureza, partículas hibridas, sílica tipo C(sílica hidreto) e novas quimicas ligantes.

82 ENDCAPPING

83 FASES ESTACIONÁRIAS - NOVOS DESENVOLVIMENTOS SÍLICA DE ALTA PUREZA(sílica tipo B) maior que %, com menos de 50ppm de metais, (metais causam caudas pois tornam os silanols extremamente ácidos). PARTÍCULAS HÍBRIDAS desenvolvido pela Waters, essas partículas são um híbrido orgânico/inorgânico.contém ambos sílica e organosiloxane.ë produzida pela mistura de dois monomeros de alta pureza: (RO)4Si + (RO)3SiR. O produto da reação contém unidades de SiO2 e unidades RSiO1.5 combinados a nível molecular. O teor de carbono é cerca de 7%, antes de modificações da superfície. Colunas Xterra são produzidas com essas partículas. Permitem uso na faixa de ph 1 a 12, sem perda de eficiência ou capacidade e devido ao teor reduzido de grupos silanol, fornecem excepcional forma de picos para analitos básicos. sílica TIPO C sílica HIDRETO desenvolvida pela Microsolv. Produzida a partir de sílica ultra pura(baixo teor de metais), através de uma tecnologia própria, a sílica tipo B é convertida em sílica tipo C, hidreto de silicio, livre de carbono, contém menos de 3% de grupos SiOH. Por isso não forma ligações fortes com água o que permite utiliza-la como fase Normal com solventes Hexano/Acetato de etila e até Agua/Acetonitrila com excelente precisão.

84 FASES ESTACIONARIAS NOVOS DESENVOLVIMENTOS SÍLICA MONOLÍTICA MONOLITHIC sílica GRUPOS ESTERICAMENTE IMPEDIDOS Grupos di-isopropil e di-isobutil incorporados aos reagentes ligantes para proteger as ligações Si-O contra hidrólise ácida. QUÍMICA SILANO POLIFUNCIONAL O uso de silanos di-funcional ou tri-funcional para criar grupos ligados com dois ou tres pontos conduzindo a fases com maior estabilidade em baixo e alto ph e menor sangramento para LC/MS. Porém os silanos polifuncionais são de controle mais difícil. GRUPOS POLARES EMBEBIDOS A incorporação de um grupo polar( ex. Carbamato, amida, urea, eter, sulfonamida) na cadeia hidrofílica de reagentes ligantes tem conduzido a uma nova classe de fases populares com diferente seletividade e melhor forma de pico para analitos básicos devido a blindagem dos silanois pelo grupo polar embebido. Essas colunas são geralmente menos retentivas do que as C18 e C8 comuns, para analitos neutros e básicos. Estão se tornando muito populares para o desenvolvimento de métodos de difíceis separações.

85 SÍLICA DE ALTA PUREZA

86 PARTICULAS HIBRIDAS

87 SÍLICA MONOLITICA MONOLITHIC SÍLICA

88 SÍLICA FUSED CORE PARTICLE Tecnologia de partícula fused core, desenvolvida para cromatografia hiper rápida. Uma camada de sílica porosa é fundida na superfície de sílica sólida. A particula tem diametro total de 2.7µm e a camada porosa 0.5µm, área superficial de 150m2/g, diametro de poro: 90a e pode ser usada na faixa de ph: 2 9. As ligações da fase estacionária são monoméricas e endcapped maximinizado. Como o passo de difusão é de apenas 0.5µm, reduz a dispersão axial e minimiza o alargamento de pico. Possui eficiência de particulas sub-2µm sem a queda de pressão que estas particulas apresentam e portanto não necessita de equipamento uhplc pb.hmtl Site da sigmaaldrich supelco the report volume 25.2 Colunas ascentis express particle e colunas halo

89 GRUPOS ESTERICAMENTE IMPEDIDOS

90 ADSORVENTES DE HPLC E CARACTERÍSTICAS

91 FASES ESTACIONÁRIAS FASE ESTACIONÁRIA NORMAL Grupos Funcionais Polares são ligados à matriz de sílica. A técnica, em geral, substitui com vantagens a Cromatografia por Adsorção. GRUPOS FUNCIONAIS MAIS COMUNS: DIOL CIANO AMINO

92 FASE ESTACIONÁRIA REVERSA Em Cromatografia de Fase Reversa, os grupos funcionais ligados à base de sílica são apolares. Os analitos são atraidos para a superficie pelos seus grupos funcionais não polares. O analito mais polar elui primeiro, seguidos pelos outros em ordem decrescente de polaridade. Os grupos butil, octil, octadecil e fenila são os mais utilizados. O grupo octadecil é responsável pela maioria das separações em fase reversa. OCTADECIL OCTIL FENIL Si- O - Si - C 18 O O Si- O - Si - C 18 O O Si- O - Si - C 18 O O Si- O - Si - C 18 Si- O - Si - C 8 O O Si- O - Si - C 8 O O Si- O - Si - C 8 O O Si- O - Si - C 8 Si- O - Si - O O Si- O - Si - O O Si- O - Si - O O Si- O - Si - CH 2 - CH 2 - CH 2 - CH 2 -

93 ESCOLHA DO SOLVENTE EM HPLC Minicursos CRQ-IV FASE MÓVEL O sucesso da separação cromatográfica só é possível se for aplicada uma FM correta a uma FE conveniente. A escolha da composição da FM leva em conta vários fatores, tais como: Propriedades físico-químicas que afetam a solubilidade, partição e adsorção e, portanto, a separação Propriedades físicas que afetam a possibilidade de detecção dos componentes Propriedades físicas que dificultam o manuseio das bombas, detectores ecoluna Propriedades que afetam a segurança (toxidez e inflamabilidade) Custo

94 FASE MÓVEL SELEÇÃO DA FASE MÓVEL EM FUNÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICAS Os seguintes parâmetros devem ser considerados para uma escolha adequada da FM: Viscosidade Compressibilidade Pressão de vapor Toxidez Índice de Refração Corte de UV (cut off) espectro de absorção UV-VIS Miscibilidade de solventes e outras características importantes Força dos Solventes

95 FASE MÓVEL SELEÇÃO DA FASE MÓVEL EM FUNÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICAS VISCOSIDADE A viscosidade do solvente ou misturas de solventes tem importância fundamental durante o bombeamento isocrático ou por gradiente. A figura abaixo apresenta a viscosidade de alguns solventes. 94

96 FASE MÓVEL SELEÇÃO DA FASE MÓVEL EM FUNÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICAS VISCOSIDADE P da coluna depende da vazão, temperatura, viscosidade da FM e empacotamento da coluna. Viscosidade elevada acarreta em dificuldades no bombeamento e elevam o P. Exemplo da influência da viscosidade em coluna fase reversa C 8-5 m 25cm 4.6mm: Solvente Viscosidade (cp) Vazão (ml/min) P (atm) Metanol Isopropanol

97 FASE MÓVEL SELEÇÃO DA FASE MÓVEL EM FUNÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICAS VISCOSIDADE Água, metanol, hidrocarbonetos e outros compostos com viscosidade menor que 1cP são ótimos solventes no parâmetro viscosidade. A viscosidade influência na eficiência pois afeta o coeficiente de difusão acarretando em perda de número de pratos teóricos da coluna. A viscosidade de misturas de solventes não varia linearmente com a composição.

98 FASE MÓVEL SELEÇÃO DA FASE MÓVEL EM FUNÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICAS CORTE UV (CUT OFF) O UV cut off é o comprimento de onda abaixo do qual o solvente absorve mais que uma unidade de absorbância em uma cela de 1cm de caminho óptico. É uma referência para a seleção do solvente da FM quando se usa detector UV. É importante determinar o espectro de absorção do solvente antes de usá-lo como FM, pois eventuais impurezas podem alterar muito o valor do cut off.

99 SELEÇÃO DA FASE MÓVEL EM FUNÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICAS MISCIBILIDADE DE SOLVENTES E OUTRAS CARACTERÍSTICAS Além das propriedades discutidas, outros cuidados especiais devem ser tomados na escolha dos solventes: Os componentes devem se dissolver na FM para que sejam transportados através da coluna Imiscibilidade com a FE Inércia química com a FE e os componentes da amostra Pureza condizente com o detector utilizado. Mistura de solventes devem produzir soluções homogêneas fator importante nas análises por gradiente (o mesmo cuidado deve ser tomado na troca de solventes; em caso de troca de dois solventes imiscíveis, deve-se usar um solvente intermediário solúvel em ambos). Sistemas não miscíveis prejudicam o desempenho da bomba, da coluna e induzem ruídos no detector além de alterar os tempos de retenção e prejudicar análises quantitativas.

100 SELEÇÃO DA FASE MÓVEL EM FUNÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICAS FORÇA DOS SOLVENTES A interação das moléculas dos compostos analisados (analitos) com o solvente (FM) e consequentemente suas solubilidades depende basicamente das seguintes forças de interação: Dispersão Interação dielétrica Dipolos Pontes de hidrogênio

101 SELEÇÃO DA FASE MÓVEL EM FUNÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICAS Miscibilidade em água UV cut off IR 20 C Força do Solvente Viscosidade a 20 C, cp Hexano não Isooctano não Tetracloreto de carbono não Clorofórmio não Cloreto de metileno não Tetrahidrofurano sim Éter dietílico não Acetona sim Acetato de etila pobre Dioxano sim Acetonitrila sim Propanol sim Metanol sim Água sim >

102 FASE MÓVEL RELAÇÃO ENTRE SELETIVIDADE COM POLARIDADE DA FM Ao variar a polaridade da fase móvel, varia o fator capacidade(k=t r/to) e consequentemente a seletividade na separação. Variação de tr e resolução com a composição do solvente em análise de metil, etil, propil e butil parabenos. coluna ODS (10cm x 0.6 cm), UV 254nm, 40 C, água/metanol

103 SELEÇÃO DA FASE MÓVEL EM FUNÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICAS RELAÇÃO ENTRE SELETIVIDADE COM POLARIDADE DA FM Variação do fator capacidade com a composição da fase móvel

104 FASE MÓVEL SELEÇÃO DA FM NO DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO ANALÍTICO Abaixo descreve-se um procedimento típico para seleção de FM em separações isocráticas com fase reversa: Escolher a coluna conveniente (C 8 C 18 ) Fixar a temperatura da coluna (40 C) Para compostos ácidos ou básicos ajustar a FM água com ácido fosfórico 0.05M ajustando o ph a 3.5 com hidróxido de sódio Equilibrar a coluna com solvente orgânico puro (acetonitrila ou metanol, vazão = 1.5ml/min) Injetar l da amostra Se os componentes eluírem perto de to, repetir as análises alterando a concentração de água crescentemente até o obter separação satisfatória. A figura abaixo ilustra esse teste utilizando acetonitrila:

105 SELEÇÃO DA FM NO DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO ANALÍTICO Constata-se a força do solvente na separação.

106 FASE ESTACIONÁRIA REVERSA ORIENTAÇÃO PARA OTIMIZAÇÃO DA SEPARAÇÃO Minicursos CRQ-IV picos muito rápidos Fase móvel 100% Orgânica picos muito lentos Adicione água (incrementos de 20%) até k = 5 injete amostra Ajuste a > 1.2 picos muito próximos Diminua vazão Aumente a coluna Diminua as partículas ainda não separa Tente outra Fase estacionária Utilizar Fase Normal Adicione pequenas quantidades de modificadores orgânicos fortes Ajuste ph para os compostos parcialmente iônicos; força iônica Ajuste Temperatura Altere o modificador fator retenção : k = t R / tm fator separação: = k2 / k1 = t R2 / t R1

107 REAÇÕES PÓS-COLUNAS Minicursos CRQ-IV Para a detecção de alguns componentes, principalmente a baixas concentrações, é preciso transformá-los em derivados que apresentem maior sensibilidade para um determinado detector. Isso é necessário quando o componente: Não é bom cromóforo Não é bom fluoróforo Não é eletroquimicamente ativo Nestes casos efetua-se reações específicas, formando derivados que possam apresentar algumas das seguintes propriedades: Alta constante de equilíbrio de formação Rápida velocidade de formação Espectro UV-VIS de alta sensibilidade Fluorescência Eletroquimicamente ativos

108 REAÇÕES PÓS-COLUNAS EXEMPLO: HERBICIDA GLIFOSATO Minicursos CRQ-IV Característica original: É um mau cromóforo e um mau fluoróforo Reação pós coluna: reação com hipoclorito e o-ftalaldeído (OPA) e mercaptoetanol (MERC) OCl - OCl - Glifosato Glicina Isoindol MERC Detecção: fluorimetricamente do isoindol (excitação a nm, emissão a nm) injetor 50 C reactor reactor bomba coluna fluorímetro bomba bomba registrador OCl - OPA / MERC

109 REAÇÕES PÓS-COLUNAS EXEMPLO: BARBITÚRICOS característica original: baixa absorbância no UV reação pós coluna: elevação de ph a um sistema alcalino (em sistemas alcalinos, a absorbância máxima de barbitúricos se desloca para comprimentos de onda mais altos, porém, nessa condição, a FM dissolve a sílica da FE, assim, o problema é resolvido elevando-se ph somente após a coluna.) detecção: UV a 240 nm 108

110 PICOS COM CAUDA EM HPLC COM FASE REVERSA Picos com cauda em fase reversa continua sendo um problema em cromatografia. Particularmente na separação de compostos básicos e portanto um problema constante na análise de produtos farmacêuticos. Picos com cauda causam inúmeros problemas, incluindo baixa resolução, sensibilidade reduzida, precisão e quantificação inadequada. A figura 1 ilustra como a resolução e sensibilidade da amostra é afetada por picos com cauda. A figura 2 ilustra como a exatidão e precisão de uma análise pode sofrer devido a inabilidade dos sistemas de dados identificar exatamente onde uma cauda do pico inicia e termina.

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112 CAUSAS DE CAUDA NO PICO AÇÃO CORRETIVA SOLVENTE DA AMOSTRA MAIS FORTE QUE A FASE MÓVEL EXCESSO DE MASSA DE AMOSTRA INTERAÇÃO DE SILANOL COM AMINAS DISSOLVA A AMOSTRA NA FASE MÓVEL OU REDUZA A FORÇA DO SOLVENTE REDUZA A MASSA DE AMOSTRA INJETADA TABELA 2 INDICA A QUANTIDADE RECOMENDADA DE AMOSTRA A SER INJETADA PARA DIFERENTES COLUNAS. REDUZA O ph da FASE MÓVEL PARA <3 AUMENTE A FORÇA IÔNICA DA FASE MÓVEL, 25mM A 50mM É RECOMENDADO ADICIONE UMA AMINA COMPETITIVA NA FASE MÓVEL 10mM DE TEA É SUFICIENTE. SELECIONE FASE ESTACIONÁRIA COM MENOR ATIVIDADE DE SILANOL.- FIG.6 ADSORÇÃO DE ÁCIDOS NA sílica VAZIOS NA COLUNA AUMENTE A CONC. DE SAL NA FASE MÓVEL. 25mM A 50mM E USUALMENTE SUFICIENTE. REDUZA O ph da FASE MÓVEL PARA <3. ADICIONE UM ÁCIDO ORGÂNICO COMPETITIVO. 1% DE ACIDO ACÉTICO OU 0.1% DE TFA É USUALMENTE SUFICIENTE. SUBSTITUA A COLUNA. TENTATIVA DE PREENCHER OS VAZIOS RARAMENTE VALE A PENA.

113 ANÁLISE DE COMPOSTOS BÁSICOS Problemas com a forma do pico de compostos básicos são normalmente comuns. Mas há vários passos simples que podem melhorar significativamente a forma do pico de bases: 1- Selecione uma coluna base-sílica desativada. 2- Usar fase móvel com baixo ph. 3 Aumento da concentração de sais na fase móvel. 4 Selecione uma coluna heavily endcapped. 5 Adicione uma base competitiva.

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120 ANÁLISE DE COMPOSTOS ÁCIDOS 1 Adicione um ácido orgânico competitivo. Adicionou-se 1% de ácido acético à fase móvel para minimizar as interações soluto-silanol, pela ação de um ácido competidor. Os resultados foram notáveis, com o pico de ibuprofen eluindo perfeitamente gaussiano fator cauda Substituindo o ácido acético por 0.1% de ácido trifluoracético tfa. A concentração relativamente alta de ácido acético resulta em ruído da linha de base. Usando tfa 0.1% como modificador aquoso resulta numa fase móvel mais transparente, menos ruído, e o pico de ibuprofen ainda elui com uma banda simétrica, fator cauda Em ph 3, a fase móvel está tamponada, porém a capacidade tamponante é baixa. aumento da concentração para 10 20mm melhorará a reprodutibilidade cromatográfica por mais tempo, além de melhorar ainda mais a forma do pico.

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122 HPLC FASE REVERSA COM FASE MÓVEL AQUOSA Tempo de retenção não reprodutível é um problema comum quando se usa fase móvel altamente aquosa. Na separação de compostos muito polares, solúveis em água não é incomum usar fm com menos de 10% de modificador orgânico(metanol, acetonitrila, etc.) Para conseguir retenção suficiente. Entretanto, nestas condições a reprodutibilidade é ruim. Com o tempo, os picos eluirão com tempo de retenção cada vez menores e a resolução piora. A figura mostra cromatogramas de análise de vitaminas em coluna ymc odsfm:5meoh 95% 0.1M KH2PO4 f:1ml/min Vitamina C vitamina B1 vitamina B6 - nicotinamida

123 HPLC FASE REVERSA COM FASE MÓVEL AQUOSA COLAPSO DE FASE ESTACIONÁRIA A mudança do tempo de retenção é causada pelo fenômeno denominado colapso de fase de fases alquílicas hidrofóbicas c18 ou c8 em condições de fase móvel altamente aquosas. A medida que o colapso de fase progride, a viabilidade da fase alquilica interagir com solutos diminui e o tempo de retenção decresce. Há também evidência que este colapso de fase pode deslocar a FM aquosa dos poros da FE, reduzindo a área superficial acessível para os solutos e portanto reduzindo os tempos de retenção. Em condições normais a fase alquílica está extendida na FM e solvente e moléculas da amostra tem total acesso a fe. Quando se usa Fm altamente aquosa a FE tende a colapsar e o tempo de retenção é afetado.

124 HPLC FASE REVERSA COM FASE MÓVEL AQUOSA COLAPSO DE FASE ESTACIONÁRIA A figura mostra cromatogramas em coluna c8 base desativada; Após deixar por 10 min. em FM 100% aquosa o tempo de retenção de amoxicilina diminuiu de 5 min. Indicando colapso da fase; Purgando a coluna com solvente orgânico a fase alquilica é novamente extendida e o tempo de retenção é restaurado.

125 HPLC REVERSA COM FASE MÓVEL AQUOSA COLUNAS QUE NÃO EXIBEM PROBLEMAS COM COLAPSO DE FASE Alguns fabricantes resolveram o problema usando silanos polares com fase ligada ou usando endcapping hidrofilico. Ambos tem o mesmo efeito de manter a fase alquilica(c18 ou C8) extendida, mesmo MBOS quando se usa fase móvel 100% aquosa. Colunas: AquaSep, HydroBond AQ, HydroBond PS, ProntoSIl AQ, Zorbax SB AQ

126 CROMATOGRAFIA POR INTERAÇÃO IÔNICA ION PAIR CHROMATOGRAPHY A análise de compostos com carga tem sido obtida por supressão de ion (ajuste cuidadoso do ph da fase móvel para resultar em analito não ionizável. Determinação do ph ótimo da fase móvel em supressão de ion frequentemente requer trabalho extensivo no desenvolvimento do método. Para amostras contendo mais de um componente ionizável, o método frequentemente nao é adequado. As limitações da supressão de ion, conduziu ao desenvolvimento de uma metodologia mais adequada para a separação de componentes ionizados: cromatografia por interação iônica ion pair chromatography. A técnica envolve a adição de composto iônico na fase móvel para promover a formação de pares de ions (ion pairs) com analitos carregados. Estes reagentes são constituidos de uma cadeia alquílica com terminal ionizável. Quando usado com colunas hidrofóbicas Fase Reversa, os reagentes ion par podem ser usados para aumentar seletivamente a retenção de analitos carregados.

127 FASES MÓVEIS TAMPONADAS PARA HPLC COM FASE REVERSA QUANDO UMA FASE MÓVEL DEVE SER TAMPONADA? Em HPLC com fase reversa, a retenção dos analitos está relacionada com sua hidrofobicidade. Quanto mais hidrofóbico o analito, mais ele será retido. Quando um analito é ionizado, ele torna -se menos hidrofóbico e portanto sua retenção diminui. Ácidos perdem um proton e tornam-se ionizados quando o ph aumenta. Bases ganham um proton e tornam-se ionizados quando o ph decresce. Portanto, nas separações contendo ácidos e/ou bases utilizando fase reversa, é necessário controlar o ph da faxe móvel, usando um tampão apropriado para se obter resultados reprodutíveis. 126

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129 A figura 2 mostra que metilamfetamina é totalmente protonada em ph menor que 3 e sua retenção não é afetada por pequena mudança no ph da fase móvel. Já a ph 7, próximo de seu pka, uma mudança de apenas 0.2 unidades de ph desloca a retenção de quase 9%. 128

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131 ANÁLISE QUALITATIVA Minicursos CRQ-IV A análise qualitativa em HPLC tem por objetivo a identificação dos analitos de interesse. Existem dois casos a serem considerados para análise qualitativa com HPLC: Análise Qualitativa em Controle de qualidade Análise Qualitativa em identificações não rotineiras

132 ANÁLISE QUALITATIVA Análise Qualitativa em Controle de qualidade Minicursos CRQ-IV É normalmente efetuada através da comparação do tempo de retenção ou retenção relativa dos analitos de interesse com esses parâmetros de padrões. Tais análises são realizadas com metodologias já estabelecidas. É fundamental o controle e monitoramento das condições analíticas para evitar conclusões errôneas. Análise qualitativa em identificações não rotineiras Neste caso é importante conhecer o máximo da história da amostra e utilizar detectores que auxiliam a identificação da estrutura do composto, como detector de espectrometria de massa.

133 ANÁLISE QUANTITATIVA Minicursos CRQ-IV MÉTODOS POR NORMALIZAÇÃO Assume-se que todos os componentes da amostra eluem da coluna e são detectáveis Existem dois procedimentos: Normalização de área (% em área) Normalização utilizando-se a área corrigida

134 ANÁLISE QUANTITATIVA Minicursos CRQ-IV MÉTODOS POR NORMALIZAÇÃO Normalização de área (% em área) Ai % i x100 A i A i = área do composto i Ai = somatória das áreas de todos componentes Considera-se que todos os componente apresentam resposta proporcional a sua concentração e que mesma concentração de diferentes compostos resulte em áreas iguais (o que dificilmente ocorre).

135 ANÁLISE QUANTITATIVA Minicursos CRQ-IV MÉTODOS POR NORMALIZAÇÃO Normalização com área corrigida AxF i i % i x100 AxF i i Ai = área do composto i F i = fator de resposta do componente i A i F i = somatória das áreas de todos componentes multiplicadas pelos respectivos fatores de resposta É necessário conhecer todos os componentes da amostra para determinação dos fatores de resposta de cada componente

136 ANÁLISE QUANTITATIVA MÉTODOS ABSOLUTOS Utiliza-se métodos absolutos quando: O objetivo da análise é quantificar um ou alguns dos componentes da amostra. Ao utilizar detectores específicos ou seletivos que detectam somente os componentes de interesse Existência de compostos na amostra que não são eluídos nas condições de análise ou não são detectados e que não haja interesse de quantificá-los. Quantificação de componentes em baixa concentração. Existem dois procedimentos: Padronização externa Padronização interna

137 ANÁLISE QUANTITATIVA MÉTODOS ABSOLUTOS - Padronização externa 1. Determina-se a curva de calibração de cada componente através da análise de misturas padrões injetando-se um determinado volume. 2. Posteriormente, injeta-se o mesmo volume da amostra e obtem-se a concentração do analito através da urva dec calibração. A i Nesta técnica, se o volume injetado não for exatamente o mesmo ou se houver alteração de algum parâmetro que afete a resposta do componente no detector, como por exemplo, variação da intensidade de luz do UV-VIS ou alteração na FM, as áreas dos picos poderão ser maiores ou menores daquelas obtidas na calibração e consequentemente os resultados serão incorretos. C i

138 ANÁLISE QUANTITATIVA Minicursos CRQ-IV MÉTODOS ABSOLUTOS - Padronização interna Para minimizar os problemas da padronização externa, a amostra e a mistura padrão são modificadas pela adição de um composto considerado como padrão interno. O padrão interno deve ter as seguintes características: 1. Não estar presente na amostra original, ser estável e não reativa. 2. Pico separado dos componentes da amostra 3. Eluir próximo dos componentes de interesse 4. Detecção semelhante dos picos de interesse 5. Concentração que produza área similar aos picos analisados 6. Pureza elevada ou conhecida (possíveis impurezas não devem eluir com os picos de interesse).

139 ANÁLISE QUANTITATIVA MÉTODOS ABSOLUTOS - Padronização interna 1. Determina-se a curva de calibração de cada componente através da análise de misturas padrões contendo o padrão interno. Nessa curva de calibração utiliza-se a relação entre área do componente i e área do padrão interno em função das relações de suas concentrações. 2. Posteriormente, injeta-se a amostra contendo padrão interno (preferencialmente na mesma concentração utilizada na calibração) e obtem-se a concentração do analito através da curva de calibração. Se o volume de amostra injetado for diferente do utilizado na calibração, ou se algum parâmetro analítico for alterado resultando em áreas diferentes daquelas esperadas nas condições de calibração, a relação de área entre analito e padrão interno não será afetada. A i / Ap i C i / Cp i

140 UHPLC ULTRA HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPY A tecnica utiliza particulas menores que 2µm o que fornece colunas com maior eficiência( maior número de pratos) e consequentemente melhor separação, desde que os analitos tenham coeficiente de partição diferentes. Normalmente utiliza-se colunas com 1.7µm o que acarreta maior pressão no sistema, sendo necessário utilizar equipamento configurado para isso. O sistema necessita de baixo volume morto, bomba para trabalhar com pressões maiores que HPLC convencional, detectores de baixo volume da cela. Em analises rápidas, o detector precisa permitir velocidade de amostragem na faixa de 50milisegundos ou invez de 400 na HPLC convencional e constante de tempo de 0.05 seg. SISTEMAS UHPLC E FASES ESTACIONARIAS Waters Corporation Acquity UPLC System 6 FE BEH/sílica Thermo Scientific Accela High Speed LC 3 FE Hypersil Gold Agilent 1200 Series 8 FE Eclipse, Extend e Stablebond Restek(colunas) Pinnacle DB 1.9µm Grace/ Alltech - colunas

141 V ERIFICAÇÃO DE EQUIVALÊNCIA DE COLUNAS HPLC Dois grupos projeto USP e projeto Snyder/Dolan, utilizando parâmetros para caracterizar colunas HPLC, com a finalidade de avaliar a equivalencia entre elas. PROJETO USP Grupo de trabalho: Agilent, NIST,Phenomenex, Supelco,ThermoHypersil- Keystone, Waters Parâmetros avaliados: Hidrofobicidade Quelação de metais Atividade do grupo silanol Seletividade Densidade de ligações Projeto Snyder/Dolan Grupo de trabalho Impurezas PQRI informação obtida em Wyeth, Eli Lilly, FDA-laboratorio de Rockville, 3M, Laboratorio de Snyder/Dolan - 8 compostos/ 2 amostras Parâmetros avaliados: Hidrofobicidade Seletividade Acidez pontes de H Basicidade pontes de H Capacidade de troca iônica Site:

142 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO HPLC COM AUXILIO DE COMPUTADOR Varios softwares foram desenvolvidos com o objetivo de auxiliar no desenvolvimento de método de análise por HPLC. São softwares caros, mas o investimento permite uma economia para as Empresas, pois cada método é desenvolvido em pouco tempo. Dependendo da experiência em cromatografia e da complexidade da amostra, um método desenvolvido manualmente(método convencional), pode levar um mês ou mais. Com um desses programas eletronicos, o método pode ser desenvolvido em algumas horas ou poucos dias. ALGUNS PROGRAMAS BEM CONHECIDOS E DOCUMENTADOS: DRY-LAB 2000 PLUS(Rheodyne) CHROMSWORD AUTO - (Hitachi Agilent Iris) ACD LABS METHOD DEVELOPMENT SOFTWARE POPLC- Phase Optimized Liquid Chromatography BISCHOFF CHROMATOGRAPHY

143 REFERÊNCIAS PARA CONSULTA HPLC Methods for Pharmaceutical Analysis George Lunn Norman Schmulf Wiley Interscience 1997 (1632 pag.) ISBN HPLC Methods for Recently Approved Pharmaceuticals George Lunn Wiley 2005 (717 pag.) ISBN HPLC for Pharmaceutical Scientists Yuri Kazakevich Rosario Lobrutto Wiley Jan 2007(1104 pag.) ISBN HPLC Made to Measure Stravos Kromidas Wiley 2006 ISBN X Validation Chromatographic Methods A Practical Guide David M. Bliesner Wiley 2006 (304 pag.) ISBN HPLC Practical and Industrial Applications Joel Swadesh Modern HPLC for practicing scientists Michael W.Dong Wiley Interscience 2006 HPLC A practical user s guide Marvin C. McMaster John Wiley & Sons

144 REFERÊNCIAS PARA CONSULTA Fundamentos da Cromatografia a líquido de alto desempenho REMOLO CIOLA-, ed. Edgard Blucher, 1998, 1a Ed. Bulletin 781, How to protect your HPLC Column and prolong its life, Bulletin 826, HPLC Troubleshouting guide, Bulletin 788, Guidelines for formulating mobile phases for various reversed phase HPLC Columns, Bulletin 844, Post Columns reactions enhance detections sensitivity and selectivity in HPLC analysis, Bulletin 879, CG and HPLC Phases and packings for US Pharmacopoeia methods, The Reporter, Optimizing HPLC Separations, Pharmaceutical Technology, ed. Brasileira, vol. 2, número 3, junho 1998, Validação de métodos cromatográficos, pág. 12

145 FONTES DE INTERNET Minicursos CRQ-IV

146 Agradecimentos CEP CURSOS - Centro de Educação Profissional Cursos a O Centro de Educação Profissional (CEP) é uma Empresa voltada para a Educação Continuada e Profissionalizante através de: Cursos de Extensão Presenciais; Distância (EAD); Cursos In-Company;Programas Especiais e Especializações; Assessoria e Consultoria Customizada; Dentro das diversas áreas que o CEP atua, destacam-se: Instrumentação e Desenvolvimento Analítico, Controle de Qualidade, Garantia da Qualidade, Assuntos Regulatórios, Pesquisa e Desenvolvimento, Microbiologia e Habilidades Gerenciais. Informações: / info@cepcursos.com Professor Ayrton: ayrtonargenton@hotmail.com Av. Ibirapuera 2907, Ed. Comercial State, Conj. 1709, Moema - SP - SP - TEL/ FAX: