Sistema Reprodutor e Tecnologia da Reprodução Medicamente Assistida
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- Marcela Bergmann Chagas
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1 FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA MESTRADO INTEGRADO EM ENGENHARIA BIOMÉDICA DISCIPLINA DE ANATOMIA E HISTOLOGIA Sistema Reprodutor e Tecnologia da Reprodução Medicamente Assistida Carlos Plancha Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento Sistema Reprodutor Masculino Estrutura do testículo Organização histológica testicular Kierszenbaum, Histology and Cell Biology Jeffrey B. Kerr, Atlas of Functional Histology Espermatogénese Produção de Androgénios Correlação Funcional Compartimento tubular: Células da linhagem germinal Células de Sertoli Compartimento inter-tubular: Células de Leydig Céls. mióides, fibroblastos, vasos
2 Controlo gonadotrófico sobre compartimentos testiculares e função testicular Células de Leydig Células de Sertoli A espermatogénese processa-se na parede dos tubos seminíparos, da região basal para a região luminal Junqueira and Carneiro, Basic Histology, 11 th ed. SPERMATOGENESIS IS ALSO A COMPARTMENTALIZED PROCESS Occluding junctions between Sertoli cells form 2 compartments that stage different phases of spermatogenesis Barreira hemato-testicular Comp. ad-luminal: espermiogénese meiose Comp. Basal: espermatocitogénese espermatogénese
3 SPERMATOCYTOGENESIS IS A LINEAGE EXPANSION EVENT Self renewal of stem cell pool Commitment to differentiation SPERMATOCYTOGENESIS IS A LINEAGE EXPANSION EVENT Pool renewal or Adark spermatogonia Apale spermatogonia Pool renewal B spermatogonia Ehmcke and Schlatt; Reproduction, 2006 Mitotic expansion & differentiation into spermatocytes SPERMATOCYTOGENESIS IS A LINEAGE EXPANSION EVENT From lineage commitment until spermiation, developing germcells share the same cytoplasm Don W. Fawcett
4 SPERMATOCYTOGENESIS IS A LINEAGE EXPANSION EVENT From lineage commitment until spermiation, developing germcells share the same cytoplasm Don W. Fawcett TRANSITION TO MEIOSIS REQUIRES CELLULAR TRANSLOCATION After synthesizing the DNA complement required for meiosis, spermatocytes are translocated from the basal to the adluminal compartment Kierszenbaum, Histology and Cell Biology TRANSITION TO MEIOSIS REQUIRES CELLULAR TRANSLOCATION This cellular translocation is a complex event and requires active participation of Sertoli cells CQF Wang and CY Cheng (2007) A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis. J Cell Biol 178(4):
5 Meiose MEIOSE MITOSE Emparelhamento dos cromossomas homólogos Recombinação genética Distribuição independente dos homólogos na meiose I SPERMIOGENESIS IS A CYTODIFFERENTIATION EVENT spermiation Main events: - Dramatic morphological modifications (loss of cytoplasm and development of tail) - Development of large lysosomal structure (the acrosome) - Nuclear remodelling and condensation Junqueira and Carneiro, Basic Histology, 11 th ed. Junqueira and Carneiro, Basic Histology, 11 th ed. Espermatogénese
6 Gâmeta masculino Sistema Reprodutor Feminino
7 O Aparelho Reprodutor Feminino exibe alterações cíclicas - secreção hipotálamo-hipofisária (RHs, FSH, LH) - ovário: hormonas sexuais e ciclo ovárico (fases folicular e luteínica) - mucosa uterina: ciclo menstrual (fases proliferativa e secretora) - colo do útero: modific. da secreção - epitélio vaginal: modific. epiteliais O Aparelho Reprodutor Feminino exibe alterações cíclicas - O desenvolvimento folicular ovárico permite explicar a produção cíclica de hormonas sexuais e a libertação cíclica do gâmeta feminino Fol ículo Folí primordial Fol ículo Folí primá prim á rio Estrutura do ovário Presença de folículos ováricos, ou estruturas deles derivadas, em vários estadios de desenvolvimento
8 Oogenesis involves growth and maturation phases and takes place inside the Ovarian Follicle Growth Maturation Prophase I Metaphase II GDF - 9 Igf - 1, 2 FSH,LH Cellular interactions Perifollicular Matrix Laminin Factors involved in oogenesis and folliculogenesis The Oocyte secretes dominant paracrine effectors (GDF-9, BMP-15) and Dong et al. (1996) Nature 383: 531. Galloway et al. (2000) Nature Genetics 25: 279. Juengel et al. (2002) Biol Reprod 67: dictates the rate of follicle development JJ Eppig (2001) Reproduction 122: 829. JJ Eppig, K Wigglesworth, FL Pendola (2002) The mammalian oocyte orchestrates the rate of ovarian follicular development. PNAS 99: Ovarian follicle development in humans Long Poorly understood (except Gonadotropin-dependent last stages) Primordial ~ days Preantral ~90 days ovulation Period of current ART intervention MA Edson et al.. (2009) The Mammalian Ovary from Genesis to Revelation. Endocrine Reviews, 30:
9 Desenvolvimento folicular ovárico em humanos CRESCIMENTO FOLICULAR BASAL JANELA DE SELECÇÃO 1º ciclo 2º ciclo 3º ciclo 4º ciclo Adaptado de Gougeon & Lefèvre Estrutura do ovário Presença de folículos ováricos, ou estruturas deles derivadas, em vários estadios de desenvolvimento Ovulação do complexo oocito-cumulus Gâmeta feminino Complexos oocito-cumulus
10 Gametogénese - ovulação - um gâmeta por mês - ejaculação - milhões de gâmetas Gâmeta feminino Ovocito secundário Oogénese Gâmeta masculino Espermatozóide Espermatogénese Fertilização em mamíferos - Visão geral - Incorporação do spz no ovócito Formação 2 pronc. haplóides Início da clivagem Desenvolvimento embrionário pré-implantatório Em suspensão humano ratinho
11 Ultraestrutura da célula muscular lisa Alterações cíclicas - ap. repr. feminino - ovário: fases folicular e luteínica. Morfologia diferencial de: - células glandulares - glândulas uterinas em diferentes fases do ciclo menstrual - mucosa uterina: ciclo menstrual (fases proliferativa e secretora).
12 Alterações cíclicas - ap. repr. feminino - secreção hipotálamo-hipofisária (RHs, FSH, LH) - ovário: fases folicular e luteínica - mucosa uterina: ciclo menstrual - epitélio vaginal O processo da fertilização e o desenvolvimento pré-implantação ocorrem em suspensão no interior do aparelho reprodutor feminino Trompa de Falópio humano Acessibilidade à manipulação ratinho Fertilização e desenvolvimento pré-implantação em cultura Estratégias da Reprodução Medicamente Assistida
13 Infertilidade - Ausência de gravidez após um ano de relações sexuais regulares sem contracepção. - Actualmente, afecta % dos casais em idade fértil. Causas de Infertilidade A vida ocidental (sbt urbana) actual veio adicionar factores de infertilidade: a idade da gestação é adiada Tratamento da infertilidade Equipa multidisciplinar Equipa clínica Equipa laboratorial (Andrologia, Embriologia, Criopreservação) Avaliação diagnóstica e terapêutica da infertilidade Avaliação e manipulação de gâmetas e embriões
14 Técnicas de Reprodução Medicamente Assistida Estimulação controlada da ovulação Inseminação intra-uterina Fertilização in vitro (FIV) Injecção intra-citoplasmática de espermatozóide (ICSI) Congelamento de gâmetas e embriões Transferência de embriões congelados (TEC) Biópsia testicular para extracção de espermatozóides (TESE) Maturação Oocitária in vitro (IVM) Inseminação intra-uterina com esperma de dador Doação de oocitos Doação de embriões Biópsia embrionária e diagnóstico genético pré-implantação (DGPI) Técnicas de Reprodução Medicamente Assistida Estimulação controlada da ovulação Inseminação intra-uterina Introdução de espermatozoides no interior do útero ( 2 milhões formas progressivas no sémen preparado) Colheita e preparação laboratorial do sémen Aumentam a possibilidade de ocorrência de Fertilização in vivo Técnicas de Reprodução Medicamente Assistida Estimulação controlada da ovulação Inseminação intra-uterina Fertilização in vitro (FIV) Injecção intra-citoplasmática de espermatozóide (ICSI) Congelamento de gâmetas e embriões Transferência de embriões congelados (TEC) Biópsia testicular para extracção de espermatozóides (TESE) Maturação Oocitária in vitro (IVM) Inseminação intra-uterina com esperma de dador Doação de oocitos Doação de embriões Biópsia embrionária e diagnóstico genético pré-implantação (DGPI)
15 Técnicas de Reprodução Medicamente Assistida Fertilização in vitro (FIV) Para ocorrer implantação: 1. Os gâmetas têm de viajar no ap. reprodutor feminino 2. Têm de interagir no processo da fertilização X 3. O desenvolvimento embrionário préimplantatório ocorre em suspensão ao longo do ap. reprodutor feminino A FIV surgiu originalmente para fazer face a situações de infertilidade de causa feminina por oclusão tubária A colheita de gâmetas masculinos faz-se por masturbação e recuperação do ejaculado para um recipiente esterilizado Fertilização in vitro (FIV) lavagem Fertilização in vitro (FIV) A colheita de gâmetas femininos realiza-se por punção e aspiração folicular, com acesso transvaginal, sob controlo ecográfico
16 Fertilização in vitro (FIV) + ovócito espermatozóides A fertilização extra-corporal implica: -Estimulação controlada da ovulação e punção ovárica -Colheita e preparação laboratorial do sémen -Contacto entre ovócitos e espermatozóides -Cultura embrionária e transferência de embriões para o útero fertilização Fertilização in vitro (FIV) + ovócito espermatozóides 70-80% fertilização Fertilização in vitro (FIV) + ovócito espermatozóides 35-40% Resolução de algumas situações de infertilidade
17 Técnicas de Reprodução Medicamente Assistida Fertilização in vitro (FIV) Injecção intra-citoplasmática de espermatozóide (ICSI) Para fertilizarem o ovócito, os espermatozóides: 1. Concentração total 2. Motilidade. (fracção de formas progressivas) 3. Morfologia. (fracção de formas normais) A ICSI (Intra-Cytoplasmic Sperm Injection) surgiu para fazer face a alguns tipos de infertilidade de causa masculina ICSI Micro-injecção de um espermatozóide no ovócito É uma especialização da FIV em que o espermatozóide é introduzido por micromanipulação no interior do ovócito ICSI Micro-injecção de um espermatozóide no ovócito
18 Técnicas de Reprodução Medicamente Assistida FIV ou ICSI 1-célula Desenvolvimento pré-implantatório humano 2-células 4-células 8-células Blastocisto In vivo em suspensão... In vitro em cultura... Estratégias da Reprodução Medicamente Assistida Resolução de situações de Infertilidade Técnicas de Reprodução Medicamente Assistida Criopreservação Gónadas: tecido ovárico e testicular Gâmetas: espermatozóides e oocitos Embriões: estadios pré-implantatórios Técnicas de Reprodução Medicamente Assistida Criopreservação Embriões: estadios pré-implantatórios Caso existam embriões excedentários, estes poderão ser conservados até nova transferência embrionária - Desidratação dos embriões - Arrefecimento lento e controlado - Armazenamento em Azoto líquido (-196ºC) TEC Transferência de Embriões Criopreservados A lise de alguns blastómeros não inviabiliza a viabilidade embrionária Aumenta a probabilidade de gravidez por punção
19 TESE - Casos especiais: TEsticular Sperm Extraction p.e. azoospermia Maturação oocitária in vitro (IVM) Cellular and nuclear morphology of COCs and oocyte maturation Compact COC Expanded COC GV (immature) MI (immature) MII (mature) Técnicas de Reprodução Medicamente Assistida Estimulação controlada da ovulação Inseminação intra-uterina Fertilização in vitro (FIV) Injecção intra-citoplasmática de espermatozóide (ICSI) Congelamento de gâmetas e embriões Transferência de embriões congelados (TEC) Biópsia testicular para extracção de espermatozóides (TESE) Maturação Oocitária in vitro (IVM) Inseminação intra-uterina com esperma de dador Doação de oocitos Doação de embriões Biópsia embrionária e diagnóstico genético pré-implantação (DGPI)
20 p.e. Azoospermia Portador/Doença genética Técnicas de Reprodução Medicamente Assistida Estimulação controlada da ovulação Inseminação intra-uterina Fertilização in vitro (FIV) Injecção intra-citoplasmática de espermatozóide (ICSI) Congelamento de gâmetas e embriões Transferência de embriões congelados (TEC) Biópsia testicular para extracção de espermatozóides (TESE) Maturação Oocitária in vitro (IVM) Inseminação intra-uterina com esperma de dador Doação de oocitos Doação de embriões As técnicas hoje disponíveis em Medicina da Reprodução permitem ultrapassar com sucesso a maioria das situações de Infertilidade Conjugal. Técnicas de Reprodução Medicamente Assistida Estimulação controlada da ovulação Inseminação intra-uterina Fertilização in vitro (FIV) Injecção intra-citoplasmática de espermatozóide (ICSI) Congelamento de gâmetas e embriões Transferência de embriões congelados (TEC) Biópsia testicular para extracção de espermatozóides (TESE) Maturação Oocitária in vitro (IVM) Inseminação intra-uterina com esperma de dador Doação de oocitos Doação de embriões Biópsia embrionária e diagn. genético pré-implantação (DGPI)
21 Técnicas de Reprodução Medicamente Assistida Biópsia embrionária e diagnóstico genético pré-implantação (DGPI) - Estudos de Biologia fundamental - 1. A eliminação de alguns blastómeros em estadios pré-implantação não tem consequências para o desenvolvimento em mamíferos 2. Podem ser produzidos gémeos idênticos a partir da separação de blastómeros em fases iniciais do desenvolvimento DGPI Biópsia embrionária e Diagnóstico genético pré-implantação biópsia embrionária A Biópsia embrionária e o diagnóstico genético pré-implantação (DGPI) aproveitam estes conhecimentos da Biologia Fundamental e de técnicas de análise molecular em célula única para estender as indicações para Reprodução Medicamente Assistida a casais férteis DGPI Biópsia embrionária e Diagnóstico genético pré-implantação biópsia embrionária Definição de Diagnóstico Genético Pré-Implantação (DGPI) Trata-se de um diagnóstico pré-natal muito precoce em que embriões pré-implantação (ou ovócitos) são biopsados durante a cultura, sendo depois transferidos para a cavidade uterina os embriões livres da doença genética em causa
22 DGPI Biópsia embrionária e Diagnóstico genético pré-implantação ICSI biópsia embrionária blastómeros diagnóstico (PCR / FISH) não afectados afectados não transferidos Embrião biopsado transferidos congelados biópsia embrionária Existem hoje técnicas de Medicina da Reprodução indicadas também para situações de Fertilidade Questões em estudo e interrogações em Biologia e Medicina da Reprodução: A intervenção da Medicina da Reprodução ocorre numa fase minoritária ria do desenvolvimento folicular Primordial ~ dias Preantral ~90 dias ovulação Pouco compreendido (excepto últimos estadios do desenvolvimento folicular) Período de intervenção em PMA MA Edson et al.. (2009) The Mammalian Ovary from Genesis to Revelation. Endocrine Reviews, 30: Questões em estudo e interrogações em Biologia e Medicina da Reprodução: Células estaminais germinais podem ser isoladas de ovários adultos e originam estruturas semelhantes a folículos contendo células semelhantes a oócitos E Telfer, DF Albertini (2012) The quest for human ovarian stem cells. Nature Medicine 18(3):pp. YAR White et al. (2012) Oocyte formation by mitotically active germ cells purified from ovaries of reproductive-age women. Nature Medicine 18(3):pp.
23 Questões em estudo e interrogações em Biologia e Medicina da Reprodução: Os pronúcleos masculino e feminino não são equivalentes Micromanipulação e transferência nuclear em zigotos Genomic imprinting Os cromossomas maternos regulam mais o desenvolvimento do embrião. Os cromossomas paternos regulam mais o desenvolvimento dos anexos embrionários. Questões em estudo e interrogações em Biologia e Medicina da Reprodução: Células estaminais embrionárias rias (células ES) e clonagem O botão embrionário de blastocistos isolado e colocado em cultura origina células ES Para manterem a pluripotencialidade as células ES devem ser cultivadas em condições particulares FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA MESTRADO INTEGRADO EM ENGENHARIA BIOMÉDICA DISCIPLINA DE ANATOMIA E HISTOLOGIA Sistema Reprodutor e Tecnologia da Reprodução Medicamente Assistida Carlos Plancha Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento
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