Ligia Ma r i a Piassi, 1 Ca r i n e Da h l Co r c i n i, 2 An d r e a Pa n z a r d i, 3 RESUMO

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1 Efeito de crioprotetores impermeáveis sore viilidde in vitro de espermtozoides EFEITO DE CRIOPROTETORES IMPERMEÁVEIS SOBRE A VIABILIDADE IN VITRO DE ESPERMATOZOIDES CONGELADOS DE CAMUNDONGOS (Mus musculus) Ds Linhgens SWISS-ALBINA e BALB/c Ligi M r i Pissi, 1 C r i n e D h l Co r c i n i, 2 An d r e P n z r d i, 3 An t o n i o Se r g i o V r e l Ju n i o r, 4 Th o m z Lu c i Jr. 5 e Jo ã o C r l o s De s c h m p s 5 1. Universidde Federl de Pelots 2. Doutornd pel Universidde Federl de Pelots, Fculdde de Veterinári, Deprtmento de Biotecnologi 3. Universidde Federl do Rio Grnde do Sul, Fculdde de Veterinári 4. Universidde Federl do Rio Grnde 5. Universidde Federl de Pelots, Fculdde de Veterinári. RESUMO O trlho ojetivou vlir os efeitos dos disscrídeos scrose, trelose e lctose, como crioprotetores impermeáveis à memrn plsmátic em diluentes pr criopreservção de sêmen de cmundongos. Pr vlição do sêmen utilizrm-se os seguintes prâmetros: motilidde progressiv (MOT) ds céluls espermátics, e tx de clivgem emrionári (TXCL) otid por meio de fertilizção in vitro, ns linhgens SWISS-ALBINA e BALB/c. Os trtmentos vlidos form: S1=scrose; S2=trelose; S3=lctose, pr SWISS-ALBINA e B1=lctose; B2=trelose pr BALB/c. Avliou-se MOT durnte s seguintes etps: descongelção (DES), centrifugção e ressuspensão no meio P-1 (CEN) e pós dez minutos de incução (10M). A MOT no S2 pr linhgem SWISS-ALBINA ns três etps (47% no DES; 66,5% n CEN e 67,2% no 10M) foi superior (P<0,001) S1 (32,5% no DES; 51,5% no CEN e 47,7% n 10M) e S3 (30% no DES, 46,5% n CEN e 32,7% no 10M). N linhgem BALB/c, MOT no B2 foi superior o B1 (P<0,001). Em conclusão, pode-se recomendr utilizção dos disscrídeos testdos, com destque pr trelose, n congelção rápid de sêmen de cmundongos. PALAVRAS-CHAVES: Cmundongo, criopreservção, disscrídeos, sêmen. ABSTRACT EFFECT OF IMPERMEANT CRYOPROTECTANTS ON THE IN VITRO VIABILITY OF FROZEN SPERMATOZOA OF SWISS-ALBINA AND BALB/C MICE (Mus musculus) The ojective of this study ws to evlute the effect of three discchrides (sucrose, threlose nd lctose) used s nonpenetrting cryoprotectnts in extender for mice semen. The prmeters evluted were sperm motility (MOT) nd clevge rte (CLV) fter in vitro fertiliztion in the SWISS-ALBINA nd BALB/c lines. The tretments were S1=sucrose; S2=threlose; S3=lctose, for SWISS- ALBINA; nd B1=lctose; B2=threlose for BALB/c. MOT ws evluted fter: thwing (THA), centrifugtion nd resuspension in P-1 medium (CEN) nd fter 10 minutes of incution (10M). The MOT for the SWISS-ALBINA line ws higher for S2 (P<0.001) in the 3 evluted steps (47% t DES; 66.5% t CEN nd 67.2% t 10M) thn for S1 (32.5% t DES; 51.5% t CEN nd 47.7% t 10M) nd S3 (30% t DES, 46.5% t CEN nd 32.7% t 10M). For the BALB/c line, MOT ws superior for B2 thn for B1 (P<0.001). Thus, the tested discchrides, especilly threlose, cn e recommended for freezing of mice sperm. KEY WORDS: Cryopreservtion, discchrides, mice, semen.

2 1162 PIASSI, L. M. et l. Introdução A criopreservção de sêmen é um iotécnic estelecid e difundid em todo o mundo, em diferentes espécies de mmíferos. Esse fto deve-se em grnde prte à descoert, por POLGE et l. (1949), d função crioprotetor do glicerol. Porém, técnic só foi empregd com sucesso em cmundongos recentemente. Inúmeros trlhos form presentdos n décd de 1990, inicilmente utilizndo 10% de rfinose e 5% de glicerol como gentes crioprotetores d célul espermátic de cmundongos (YOKOYAMA et l., 1990). Depois esteleceuse técnic descrit como método NAKAGATA (1995), o qul utiliz 18% de rfinose e 3% de leite em pó desntdo como crioprotetores pr congelção de sêmen ness espécie (OKUYAMA et l., 1990; TADA et l., 1990). O sucesso desse método se deu pel fcilidde de execução d técnic de congelção, ssim como pelo fto de não necessitr de prelhgem específic pr técnic, o que diminuiu o custo do processo (NAKAGATA, 1995; GLENISTER & THORNTON, 2000). O protocolo Nkgt de congelção de sêmen, utilizdo no mundo inteiro, inclusive pr linhgens trnsgênics, present muit vrição nos resultdos ds txs de congelção e descongelção, em virtude de spectos ind pouco explordos do protocolo, relciondos à viilidde d célul pós-descongelção (ARAV et l., 2002; STACY et l., 2005). Por isso, outros métodos de congelção rápid form estuddos, sedos em modificções no protocolo Nkgt, os quis tmém presentrm resultdos em vriáveis n técnic de criopreservção de sêmen (SZTEIN et l., 1997; AN et l., 2000; WARD et l., 2003). Possivelmente, esss vrições sejm decorrentes d lt sensiilidde triuíd os espermtozoides de cmundongo diferentes mecnismos de estresse, como s mudnçs osmótics, ph e vrições ns txs de congelção (WARD et l., 2003). Segundo KUSAKABE et l. (2001), ficou evidencido que célul espermátic do cmundongo não necessit de crioprotetores permeáveis à memrn plsmátic como o glicerol, pr congelção, mntendo su viilidde pósdescongelção pens com o uso de crioprotetores impermeáveis. SZTEIN et l. (2000) consttrm ind que os gentes crioprotetores impermeáveis (trelose, rfinose e scrose) são superiores em relção os gentes crioprotetores permeáveis (DMSO, propnediol, formmid e glicerol), nos prâmetros de motilidde, viilidde e fertilidde pós-descongelção. O mecnismo de ção dos çúcres n proteção do espermtozoide durnte congelção ind não está totlmente esclrecido. Especul-se que disscrídeos como trelose e scrose intergem com os grupos polres d memrn, promovendo estilizção d memrn espermátic (DALIMATA & GRAHAM, 1997). Atulmente, modelos trnsgênicos de cmundongo vêm sendo desenvolvidos e comercilizdos, o que justific o umento de interesse pel preservção de mteril genético (SONGSASEN & LEIBO, 1997; AN et l., 2000). As numeross linhgens mutntes, pr serem mntids como exemplres vivos nos iotérios, necessitm de miores recursos finnceiros e espço físico pr mnutenção (WARD et l., 2003). Com formção dos ncos de germoplsm, é possível rmzenr diversos genoms n form hploide e, posteriormente, difundi-lo prtir d técnic de fertilizção in vitro, por um custo em inferior (AN et l., 2000). Trlhos visndo vlir viilidde d congelção de sêmen em linhgens isogenétics, heterogenétics e trnsgênics têm demonstrdo que cd linhgem responde diferentemente o processo de congelção e descongelção, com resultdos stnte vridos, em relção à motilidde espermátic e fertilidde (NAKAGATA, 1996; SONGSASEN & LEIBO, 1997; NAKA- GATA, 2000; SZTEIN et l., 2000; NISHIZONO et l., 2004). O ojetivo deste trlho foi testr o efeito crioprotetor dos disscrídios trelose, lctose e scrose n congelção rápid de sêmen de cmundongos SWISS-ALBINA (heterogenétic) e BALB/c (isogenétic), utilizndo como vriáveis pr ess vlição motilidde progressiv e cpcidde fecundnte in vitro do sêmen.

3 Efeito de crioprotetores impermeáveis sore viilidde in vitro de espermtozoides Animis MteriL e Métodos Nos qutro experimentos relizdos, form utilizds dus linhgens de cmundongos, SWISS-ALBINA/UFPel e BALB/c-UNICAMP, fornecidos pelo Biotério Centrl d Universidde Federl de Pelots. Os mchos presentvm idde entre oito e vinte semns e s fêmes, entre cinco sete semns. Os nimis form mntidos no iotério em condições controlds, com tempertur proximd de 20 C, com fotoperíodo de 14 h luz/ di e dministrção de rção lnced e águ d liitum. As fêmes erm mntids em giols coletivs, num concentrção de vinte nimis por giol e os mchos, em giols individuis. Meios de cultivo Pr os procedimentos de recuperção dos oócitos, foi utilizdo o fluido tuárico humno modificdo (m-htf, Irvine Scientific ), e pr fertilizção in vitro (FIV) e o cultivo in vitro (CIV) dos zigotos, o meio preimplnttion stge one (P-1, Irvine Scientific). Amos form suplementdos com lumin séric ovin (BSA Frção V, Sigm-Aldrich), ns concentrções de 5 mg/ml pr s colets e 10 mg/ml pr FIV e CIV. Preprção ds soluções de congelção Form vlidos três disscrídeos como crioprotetores impermeáveis à memrn: trelose, lctose e scrose (Sigm-Aldrich ), tendo como se um solução-tmpão de 3% de leite em pó desntdo em águ ultrpur (SZTEIN et l., 2000; SZTEIN et l., 2001). Centrifugou-se solução tmpão g por trint minutos e, posteriormente, filtrou-se o sorendnte otido em memrn com 0,22 µm de poro (Millipore ). Os çúcres form crescentdos seprdmente à solução filtrd, num concentrção finl de 0,3M cd. Pr dissolução complet dos solutos, gitrm-se s três soluções de leite e çúcr 60 C, em gitdor eletromgnético quecido. Após dição dos çúcres, s soluções form centrifugds g por dez minutos e filtrds em filtros com 0,22 µm de poro. Avlirmse tods s soluções crioprotetors qunto à osmolridde, devendo estr entre 380 e 450 mosm. Após, form liquotds e rmzends em freezer, té serem utilizds. Esse rmzenmento não poderi ser mior que trint dis sem lterr os resultdos (SZTEIN et l., 2000; SZTEIN et l., 2001). Congelção e rmzenmento do sêmen Scrificrm-se os mchos dodores por deslocmento cervicl (HOGAN et l., 1986). A ordgem dos testículos foi feit por lprotomi, sendo removids cud do epidídimo e prte do ducto deferente, pr um plc de petri de 35 mm de diâmetro (Corning ), contendo 500 µl de solução de congelção ser testd. Pr colet do sêmen, relizou-se o rompimento ds estruturs ntômics, com uxílio de gulhs hipodérmics (30 G), pr otenção d suspensão de espermtozoides (SZTEIN et l., 1997; SZTEIN et l., 2000; REVEL et l., 2004). As plcs, contendo solução de congelção e os espermtozoides, form mntids por dez mininutos em estuf de CO2 (37 C, 5% de CO2), com intuito de possiilitr síd dos espermtozoides de dentro ds estruturs ntômics. Após esse período vliou-se, qulittivmente, suspensão de sêmen prtir dos prâmetros motilidde progressiv (MOT). Estndo o sêmen viável, com motilidde superior 80 % e vigor 4, efetuou-se o preenchimento ds plhets de congelmento de 0,25 ml (IMV ), com 100 µl de sêmen cd. Ests form mntids por dez minutos em vpor de N2, um ltur de 5 cm, e depois form mergulhds no N2L e trnsferids pr os otijões de rmzenmento, onde permnecerm té serem utilizds, num período entre três sete dis (SZTEIN et l., 1997; SZTEIN et l., 2000). Descongelção e cpcitção Pr descongelção, s plhets, pós serem retirds do N 2 L, form mntids por cinco

4 1164 PIASSI, L. M. et l. segundos em tempertur miente de 20 C e, depois, mergulhds em nho-mri 37 C, por dois minutos. Trnsferirm-se s doses de sêmen de cd plhet, individulmente, pr tuos cônicos de 1,5 ml (Eppendorff ), sendo vlids nesse momento qunto à motilidde espermátic. Logo em seguid, centrifugrm-se os tuos contendo s doses de sêmen por qutro minutos 735 g. O sorendnte foi retirdo e o pellet ressuspendido em 50 µl de meio P-1, suplementdo com BSA e nteriormente equilirdo. Após outr vlição, trnsferirm-se s doses pr estuf de CO 2, onde permnecerm por dez minutos, fim de serem novmente vlids qunto à motilidde e o vigor espermáticos (SZTEIN et l., 1997). Pr o cálculo d dose inseminnte, houve diluição de 1:100 de um líquot de 2 µl de cd mostr, ojetivndo-se relizr contgem de céluls n Câmr de Neuuer. Utilizrm-se doses inseminntes que resultssem em um concentrção de 2 x 10 6 espermtozoides/ml no meio de fecundção, justd prtir do vlor d MOT. Os espermtozoides form trnsferidos pr gots de 200 µl do mesmo meio, recoerts com óleo minerl, permnecendo em estuf por um hor e trint minutos pr cpcitção do sêmen. Recuperção e vlição dos oócitos As fêmes dodors form sumetids à superovulção, com plicção intrperitonil (i.p.) de 10 UI de gondotrofin coriônic equin (ecg) (Novormon ; Sintex S.A.; Argentin). Após hors, receim plicção i.p. de 10 UI de gondotrofin coriônic humn (hcg) (Choriomon ; Meizler; Suiç). Scrificrm-se s fêmes por deslocmento cervicl, de qutorze quinze hors pós plicção do hcg. Os ovidutos form retirdos e mntidos em gots de 500µl de m-htf em plc de petri de 35mm de diâmetro (Corning ). Posteriormente, relizou-se ruptur d mpol do oviduto, com gulh hipodérmic 30 G e pinç, so lup estereomicroscópic. Logo seguir, os oócitos form recuperdos e seprdos em outr plc com o mesmo meio pr serem vlidos qunto su integridde morfológic, como o preconizdo pel Sociedde Interncionl de Trnsferênci de Emriões (IETS). Fertilizção in vitro Após o período de cpcitção dos espermtozoides, os oócitos form trnsferidos pr s plcs de fecundção. Utilizrm-se vinte oócitos por got de 200 μl. Os gmets coincudos permnecerm em estuf por um período entre seis e sete hors (REVEL et l., 2004). Após, os prováveis zigotos form lvdos, pssndo por um sequênci de três gots de meio m-htf, pr retird do mior número de espermtozoides possível e, depois, trnsferidos pr um got de meio P-1. Finlmente, form trnsferidos pr plcs contendo gots de 60µl de meio P-1 suplementdo com BSA (HOGAN et l., 1986) e recoerts com óleo de silicone, num concentrção de dez zigotos por got de cultivo, permnecendo em estuf (37 C, 5% de CO 2 ), pr completr seu desenvolvimento. Cultivo in vitro Após 24 e 36 hors do finl d FIV, com uxílio de lup estereomicroscópic, foi relizd vlição d cpcidde fecundnte do sêmen. Com esse ojetivo, verificou-se o número de emriões com dus céluls formdos, clculndo, ssim, tx de clivgem emrionári por trtmento. Desenho experimentl Experimento 1 A prtir do protocolo de congelção rápid de sêmen descrito por SZTEIN et l. (1997) e SZTEIN et l. (2000), foi relizd vlição do efeito dos três disscrídeos (scrose, trelose e lctose) n congelção rápid de sêmen de cmundongos, utilizndo o todo trint mchos d linhgem heterogenétic SWISS-ALBINA, distriuídos entre os três trtmentos (S1: scrose, S2: trelose e S3: lctose), relizndo-se dez repetições por trtmento. Form rmzends, de cd

5 Efeito de crioprotetores impermeáveis sore viilidde in vitro de espermtozoides trtmento, qutro mostrs (plhets de 0,25 ml contendo 100µl de sêmen cd) por mcho. Pr vlição pós-descongelção, descongelrm-se dez plhets de cd trtmento, sendo cd plhet proveniente de um mcho, pr vlição d viilidde espermátic, prtir dos prâmetros de motilidde progressiv espermátic no descongelmento, pós centrifugção e dez minutos pós incudos n estuf de CO 2. Experimento 2 Utilizrm-se o todo vinte fêmes d linhgem SWISS-ALBINA superovulds e com ovulção induzid, pr vlição ds mostrs de sêmen criopreservds no experimento 1, sendo sudividids por mcho e por trtmento, resultndo em oito fecundções por trtmento. Os oócitos recuperdos form vlidos e então crescentdos às gots de fecundção, permnecendo de seis sete hors em cocultivo com o sêmen descongeldo previmente vlido. Oservrm-se s txs de clivgem (TXCL) nos três trtmentos (scrose, trelose e lctose), pr determinção d cpcidde fecundnte do sêmen criopreservdo d linhgem SWISS-ALBINA. Experimento 3 Utilizrm-se quinze mchos d linhgem isogenétic BALB/c, retirndo-se cd epidídimo pr vlição em um trtmento (B1: lctose e B2: trelose, os quis presentrm o pior e o melhor resultdo no experimento1), respectivmente. Form congelds qutro mostrs de sêmen por trtmento, por niml (plhets de 0,25 ml com 100µl de suspensão de sêmen e solução de congelmento), resultndo em 60 mostrs/ trtmento. Posteriormente, sete plhets de cd trtmento form descongelds, sendo vlids qunto à viilidde ds doses espermátics, prtir dos prâmetros de MOT. Experimento 4 Utilizrm-se dez fêmes d linhgem SWISS-ALBINA e quinze fêmes d linhgem BALB/c, superovulds e induzids à ovulção, como no experimento 2. Pr vlição do efeito dos crioprotetores lctose e trelose ns dus linhgens, três plhets de cd mcho, por trtmento, form descongelds e vlids qunto à motilidde (MOT), pr, utilizndo técnic de FIV, determinr tx de clivgem emrionári (TXCL). Relizrm-se cruzmentos entre s dus linhgens, medinte utilizção do sêmen de mchos SWISS-ALBINA congeldo no experimento 1. Ds plhets congelds, utilizrm-se doze plhets, de cd trtmento, pr fecundr oócitos de BALB/C (heterocruzmento) e oito plhets de cd trtmento pr fecundr oócitos de fême SWISS-ALBINA (endocruzmento), ssim como o sêmen de mchos BALB/c congeldo no experimento 3. Ds plhets congelds neste experimento form utilizds sete plhets de cd trtmento, pr fecundr oócitos de fêmes d linhgem SWISS-ALBINA, e qutorze plhets de cd trtmento, pr fecundr os oócitos d linhgem BALB). Desenvolveu-se este experimento com finlidde de serem vlids, lém d cpcidde fertiliznte do sêmen de BALB/c, interção entre os trtmentos e s linhgens utilizds. Análise esttístic Procedeu-se à nálise dos ddos medinte utilizção do progrm Sttistix. Como vriáveis dependentes form considerds: MOT e TXCL. Os efeitos dos trtmentos e ds linhgens nos experimentos 1 e 3, referentes à congelção de sêmen ds linhgens SWISS-ALBINA e BALB/c, respectivmente, form comprdos por meio do teste não prmétrico de Kruskl-Wllis. Comprrm-se s vriáveis TXCL, nos experimentos 2 e 4, medinte teste não prmétrico, qui-qudrdo (x 2 ), e vliou-se interção entre s TXCL nos cruzmentos do experimento 4 empregndo o teste prmétrico LSD. experimento 1 RESULTADOS Em relção à vriável motilidde progressiv (MOT), não se oservou diferenç esttístic (P>0,05) entre os trtmentos 1 e 3, nos momentos

6 1166 PIASSI, L. M. et l. DES e CEN, ms mos presentrm-se diferentes (P<0,01) do trtmento 2 nesses momentos (DES, CEN). No momento (10M), houve diferenç significtiv (P<0,01) entre os três trtmentos (Figur 1). Motilidde Progressiv (%) DES CEN 10M Momentos d vlição c Scrose Trelose Lctose FIGURA 1. Motilidde progressiv (MOT) médi (%) dos espermtozoides de cmundongo d linhgem SWISS-ALBI- NA, em função dos trtmentos e dos momentos de vlição (DES = pós-descongelção; CEN = pós-centrifugção; 10M = pós dez minutos de incução). Letrs diverss ns rrs de cor igul significm diferenç esttístic (P<0,01). Portnto, pode-se oservr que, neste experimento, o trtmento 2 mnteve-se superior, em relção à MOT, qundo comprdo os trtmentos 1 e 3, em todos os momentos do processo de vlição. Experimento 2 Em relção à fertilidde in vitro do sêmen criopreservdo de cmundongos d linhgem SWISS-ALBINA, vlid por meio ds txs de clivgem in vitro (TXCL) otids pós FIV, não foi oservd diferenç (P>0,05) entre os três trtmentos. O S1 (scrose) resultou num TXCL de 38,2% (39/102); o S2 (trelose) resultou num TXCL de 45,9% (51/111) e o S3 (scrose), num TXCL de 43,4% (33/76). De um totl de 289 oócitos insemindos neste experimento, 123 (42,6%) form fertilizdos. Experimento 3 Em relção o congelmento do sêmen de cmundongos d linhgem isogenétic, BALB/c, pode-se oservr que houve diferenç (P<0,001) entre os trtmentos utilizdos. Os resultdos de MOT com o diluente preprdo com o crioprotetor trelose form iguis 48%, 65,3% e 56%, nos momentos DES, CEN e 10M, respectivmente, e os resultdos otidos com lctose iguis 44,6%; 50,6% e 42% (Figur 2). Motilidde Progressiv (%) DES CEN 10M Momentos de Avlições Lctose Trelose FIGURA 2. Motilidde progressiv (MOT) médi (%) dos espermtozoides de cmundongo d linhgem BALB/c, em função dos trtmentos e dos momentos de vlição (DES = pós-descongelmento; CEN = pós-centrifugção; 10M = pós dez minutos de incução). Letrs distints ns rrs representm diferenç esttístic (P<0,001) nos trtmentos. Experimento 4 Mchos BALB/c versus fêmes BALB/c: no cruzmento isogenético d linhgem BALB/c, não se oservou diferenç significtiv entre os dois trtmentos, sendo otids txs de clivgem de 46,4% (52/112) no B 1 (lctose) e de 35,7% (40/112) no B 2 (trelose). De um totl de 224 oócitos, 92 (41,1%) form fertilizdos. Mchos BALB/c versus fêmes SWISS- ALBINA: no cruzmento hírido em que os espermtozoides erm origindos de mchos BALB/c, tmém não se oservou diferenç (P>0,05) entre os trtmentos. Form otids txs de clivgem (TXCL) de 37,7% (26/69) no B 1 (lctose) e de 40,2% (35/87) no B 2 (trelose). De um totl de 156 oócitos, 61 (39,1%) form clivdos. Mchos SWISS-ALBINA versus fêmes BALB/c: no cruzmento hírido em que os esper-

7 Efeito de crioprotetores impermeáveis sore viilidde in vitro de espermtozoides mtozoides erm provenientes de mchos SWISS- ALBINA, não se oservou diferenç (P>0,05) entre os trtmentos. Form otids TXCL de 39,5% (15/38) no B 1 (lctose) e de 40,6% (28/69) no B 2 (trelose). De um totl de 107 oócitos, 43 (40,2%) form clivdos. Entre os cruzmentos vlidos, tmém não se verificou diferenç (P>0,05) ns TXCL. No endocruzmento d linhgem BALB/c tx de clivgem foi de 41,1%. Nos heterocruzmentos, form iguis 39,1% e 40,2% pr o cruzmento de sêmen de BALB/c com oócitos de SWISS-ALBINA e pr o cruzmento de sêmen de SWISS-ALBINA com oócitos de BALB/c, respectivmente (Tel 1). TABELA 1. Número de oócitos e tx de clivgem emrionári otid nos diferentes cruzmentos Cruzmentos Oócitos Clivdos (%) Bl/c X Bl/c (41,1) Bl/c X Swiss (39,1) Swiss X Bl/c (40,2) Totl (40,2) Não houve diferenç (P>0,05). Em relção à interção entre s TXCL e os trtmentos, oservou-se que no trtmento 1 (B1) médi de clivgem foi igul 42,5% e no trtmento 2 (B2), médi foi igul 38,4%, não hvendo, portnto, diferenç P>0,05) entre os trtmentos (Tel 2). TABELA 2. Número de oócitos e tx de clivgem emrionári otid nos diferentes trtmentos Trtmentos Oócitos Clivdos (%) B1 - lctose (42,5) B2 - trelose (38,4) Totl (40,2) Não houve diferenç (P>0,05). Discussão No presente trlho ficou evidente superioridde do disscrídeo trelose como crioprotetor externo ds céluls espermátics de cmundongos ds linhgens SWISS-ALBINA e BALB/c, pr vriável MOT, o ser comprdo os disscrídeos scrose e lctose, utilizndo o protocolo de congelmento rápido descrito por SZTEIN et l. (1997), SZTEIN et l. (2000), SZTEIN et l. (2001). Os protocolos mis utilizdos pr criopreservção de sêmen de cmundongos utilizm o trisscrídeo rfinose como crioprotetor externo no diluente descongelmento (YOKOYAMA et l., 1990; SONGSASEN & LEIBO, 1997). Entretnto, outrs opções de crioprotetores, como os disscrídeos, trelose e scrose, são efetivos pr criopreservção, pois qundo form comprdos o efeito crioprotetor d rfinose, no congelmento de sêmen de cmundongos, não se consttrm diferençs ns txs de sorevivênci dos espermtozoides (AN et l., 2000). Como ns demis espécies, tmém com os cmundongos deste experimento ocorreu um qued de viilidde espermátic, evidencid pel vriável MOT, pós-descongelmento, como reltdo por MOCHIDA et l. (2004). Verificouse que s porcentgens de céluls com motilidde progressiv vrirm entre 30% e 67%, de cordo com o trtmento e o momento de vlição n linhgem SWISS-ALBINA, e entre 42% e 65% n linhgem BALB/c, confirmndo um qued de viilidde pós-descongelmento e um interção entre viilidde pós-descongelmento e linhgem utilizd. Os resultdos otidos neste trlho form semelhntes às txs de motilidde pós-descongelmento otids em trlhos de criopreservção, utilizndo deferentes linhgens de cmundongos (SONGSASEN & LEIBO, 1997; NISHIZONO et l., 2004). A prtir do indicdor de qulidde espermátic trvés d MOT, é possível determinr viilidde espermátic pel porcentgem de espermtozoides vivos com movimento progressivo no cmpo de oservção. Est vlição é norml-

8 1168 PIASSI, L. M. et l. mente relizd por microscopi óptic e, por ser sujetiv, pode sofrer vrições, dependendo do exmindor. Concord-se portnto que, sendo-se pens nos resultdos otidos prtir ds vlições de MOT, não se pode crcterizr viilidde do sêmen pós o processo de criopreservção, nem determinr se um crioprotetor é melhor ou pior pr formção de ncos de emriões. Pr isso, devem ser utilizdos outros métodos de vlições in vitro, como vlição d integridde d memrn e do crossom, e cpcidde de fertilizção por meio do teste de penetrção ou d FIV (SONGSASEN & LEIBO, 1997; NISHIZONO et l., 2004). Como função do sêmen criopreservdo é ser utilizdo num progrm de fertilizção, sej medinte inseminção rtificil ou FIV, o melhor indicdor de viilidde espermátic é cpcidde fertiliznte do sêmen (SONGSASEN & LEIBO, 1997; NISHIZONO et l., 2004). Pôde-se consttr que, emor trelose tenh presentdo superioridde em relção à MOT, ns dus linhgens vlids, esses resultdos não estão diretmente relciondos à superioridde n cpcidde fertiliznte do sêmen in vitro. As txs de clivgem, oservds pós s fertilizções in vitro, não presentrm diferençs esttístics entre os trtmentos e os cruzmentos vlidos. Resultdo semelhnte foi verificdo por NISHIZONO et l. (2004), em vlição ds vriáveis MOT e d cpcidde fertiliznte, prtir d FIV, comprndo-se o crioprotetor permeável DMSO e ssocição de crioprotetores impermeáveis, trelose e leite em pó. Durnte o experimento, pôde-se verificr que um mostr de sêmen vlid pós o descongelmento, com MOT 30%, mntém cpcidde de fertilizção, não diferindo de um mostr com MOT 60%. Isso ocorre possivelmente porque, pr técnic de FIV, o se clculr concentrção espermátic mínim por got de fertilizção (1 2 x 10 6 espermtozoides/ ml), est é justd prtir do número de céluls vivs e móveis. Ess prátic fz com que hj um equlizção ds mostrs de sêmen, pois mntém um número de céluls mínims viáveis pr fertilizção (SZTEIN et l., 2000). Outro fto ser oservdo é pequen distânci que o espermtozoide tem de percorrer pr encontrr o oócito in vitro. Tlvez in vivo, tnto motilidde qunto vigor sejm mis relevntes, e miores vlores de mos possm influencir positivmente ns txs de fertilizção. No experimento 4 relizdo neste trlho, não foi consttdo o efeito d interção entre os trtmentos utilizdos n criopreservção do sêmen e o cruzmento entre s linhgens, vlid prtir do endocruzmento d linhgem isogênic BALB/c e dos heterocruzmentos, entre s dus linhgens, SWISS-ALBINA versus BALB/c. Resultdos próximos os verificdos no presente trlho form reportdos por GLENISTER & THORNTON (2000), otendo txs de clivgem emrionári vrindo de 37% 57% em linhgens hírids. Entretnto, porcentgens de clivgem vriáveis entre 0% e 40% form oservds medinte o uso de oócitos híridos (SZTEIN et l., 2000) e 80% em linhgens como CB6F1 (SZTEIN et l., 2001). Bixs txs de fertilizção in vitro com sêmen congeldo, oservds em lgums linhgens de cmundongos, estão ssocids dnos cusdos pelo processo de congelmento os espermtozoides, loclizdos principlmente no crossom e mitocôndri, e não os efeitos do processo sore motilidde (NISHIZONO et l., 2004). Porém, deve-se ressltr que no presente trlho não form vlids s crcterístics morfológics e estruturis ds céluls espermátics, pré-congelmento e pós-descongelmento, ftores que pode influencir ns txs de fertilizção. CONCLUSÃO Os disscrídeos trelose, scrose e lctose se mostrrm eficzes como crioprotetores d célul espermátic de cmundongos ds linhgens SWISS-ALBINA, e os disscrídeos trelose e lctose são eficzes como crioprotetores d célul espermátic de cmundongos ds linhgens BALB/c. Os resultdos otidos demonstrm viilidde espermátic pós-

9 Efeito de crioprotetores impermeáveis sore viilidde in vitro de espermtozoides congelmento, o que possiilit utilizção do sêmen congeldo à técnic de FIV, viilizndo formção de nco de gmets msculinos de ms s linhgens. Referêncis AN, T. Z.; IWAKIRI, M.; EDASHIGE, K.; SAKURAI, T.; KASAI, M.; Fctors ffecting the survivl of frozenthwed mouse spermtozo. Cryoiology, v. 40, p , ARAV, A; YAVIN, S.; ZERON, Y.; NATAN, D.; DEKEL, I.; GACITUA, H. New trends in gmete s cryopreservtion. Moleculr nd Cellulr Endocrinology, v. 187, p , DALIMATA, A. M.; GRAHAM, J. K.; Cryopreservtion of rit spermtozo using cetmid in comintion with trehlose nd methyl cellulose. Theriogenology, v. 49, p , GLENISTER, P. H.; THORNTON, C. E. Cryoconservtion: rchiving for the future. Mmmlin Genome, v. 11 p , HOGAN, B.; CONSTANTINI, F.; LACY, E. Mnipulting the mouse emryo: lortory mnul. Cold Spring Hror Lortory, p KUSAKABE, H.; SZCZYGIEL, M. A.; WHITTINGHAM, D. G.; YANAGIMACHI, Y. Mintennce of genetics integrity in frozen nd freeze-dried mouse spermtozo. Proceedings of the Ntionl Acdemy of Sciences of the United Sttes of Americ, v. 24, p , MOCHIDA, K.; OHKAWA, M.; INOUE, K.; VALDEZ JR, D. M.; KASAI, M.; OGURA, A. Birth of mice fter in vitro fertiliztion using C57BL/6 sperm trnsported within epididymides t refrigerted tempertures. Theriogenology, v. 64. p , NAKAGATA, N. Studies on cryopreservtion of emryos nd gmetes in mice. Experimentl Animls, v. 44, p. 1-8, NAKAGATA, N. Use of cryopreservtion techniques of emryos nd spermtozo for production of trnsgenic (Tg) mice nd for mintennce of Tg mouse lines. Lortory Animl Science, v. 46, p , NAKAGATA, N. Cryopreservtion of mouse spermtozo. Mmmlin Genome, v. 11 p , NISHIZONO, H.; SHIODA, M.; TAKEO, T.; TETSUMI, I.; NAKAGATA, N. Decrese of fertilizing ility of mouse spermtozo fter freezing nd thwing is relted to cellulr injury. Biology of Reproduction, v. 71, p , OKUYAMA, M.; ISOGAI, S.; SAGA, S.; HAMADA, H.; OGAWA, S. In vitro fertiliztion (IVF) nd rtificil insemintion (AI) y cryopreserved spermtozo in mouse. Journl of Fertility nd Implnt, v. 7, p , POLGE, C.; SMITH, A.U.; PARKES, A.S. Revivl of spermtozo fter vitrifiction nd dehydrtion t low tempertures. Nture, n. 164, p. 166, REVEL, A.; MOSHE, N.; HELMAN, A.; SAFRAN, A.; SIMON, A.; KOLER, M.; Mouse emryos generted from frozen-thwed oocytes cn successfully survive second cryopreservtion. Humn Reproduction, v. 19, p , SONGSASEN, N.; LEIBO, S. P. Cryopreservtion of mouse spermtozo: I. Effect of seeding on fertilizing ility of cryopreserved spermtozo. Cryoiology, v. 35, p , SONGSASEN, N.; LEIBO, S. P. Cryopreservtion of mouse spermtozo: II. Reltionship etween survivl fter cryopreservtion nd osmotic tolernce of spermtozo from three strins of mice. Cryoiology, v. 35, p , STACY, R.; EROGLU, A.; FOWLER, A.; BIGGERS, J.; TONER, M.; Therml chrcteriztion of Nkgt`s mouse sperm freezing protocol. Cryoiology, v. 52, p , SZTEIN, J. M.; FARLEY, J. S.; YOUNG, A. F.; MOBRA- ATEN, L. E. Motility of cryopreserved mouse spermtozo ffected y temperture of collection nd rte of thwing. Cryoiology, v. 35, p , SZTEIN, J. M.; FARLEY, J. S.; MOBRAATEN, L. E. In vitro fertiliztion with cryopreserved inred mouse sperm. Biology of Reproduction, v. 63, p , SZTEIN, J. M.; NOBLE, J. S.; FARLEY, J. S.; MOBRAA- TEN, L. E. Comprison of permeting nd nonpermeting cryoprotectnts for mouse sperm cryopreservtion. Cryoiology, v. 41, p. 8-39, TADA, N.; SATO, M.; YAMANOI, J.; MIZOROGI, T.; KASAI, K.; OGAWA, S. Cryopreservtion of mouse spermtozo in the presence of rffinose nd glycerol. Journl Reproduction nd Fertility, v. 89, p , 1990.

10 1170 PIASSI, L. M. et l. WARD, M. A.; KANEKO, T.; KUSAKABE, H.; BIGGERS, J. D.; WHITTINGHAM, D. G.; YANAGIMACHI, R.; Longterm preservtion of mouse spermtozo fter freeze-drying nd freezing without cryoprotection. Biology of Reproduction, v. 69, p , YOKOYAMA, M.; AKIBA, H.; KATSUKI, M.; NOMU- RA, T. Production of norml young following trnsfer of mouse emryos otined y in vitro fertiliztion using cryopreserved spermtozo. Experimentl Animls, v. 39, p , Protocoldo em: 14 mio Aceito em: 8 out

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