Papel das Proteínas da Coagulação Sanguínea na Agressividade dos Gliomas. Mayara Regina Arruda de Souza

Transcrição

1 Papel das Proteínas da Coagulação Sanguínea na Agressividade dos Gliomas Mayara Regina Arruda de Souza Rio de Janeiro Junho de 2012

2 MAYARA REGINA ARRUDA DE SOUZA Aluna do curso de Farmácia Matrícula Papel das Proteínas da Coagulação Sanguínea na Agressividade dos Gliomas Trabalho de Conclusão de Curso, TCC, apresentado ao curso de graduação plena em Farmácia, da UEZO como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Farmacêutica, sob a orientação do Prof. Robson de Queiroz Monteiro e co-orientação da Drª Tatiana Correa Carneiro Lobo. Rio de Janeiro Junho de 2012

3 S729 Souza, Mayara Regina Arruda de. Papel das Proteínas da Coagulação Sanguínea na Agressividade dos Gliomas f. ; 30 cm. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Farmácia) Centro Universitário Estadual da Zona oeste, Rio de Janeiro, 2012 Bibliografia: f Coagulação sanguínea. 2. Fator tecidual. 3. Glioblastoma. 4. Microvesículas. I. Título. CDD 615.1

4 Papel das Proteínas da Coagulação Sanguínea na Agressividade dos Gliomas Elaborado por Mayara Regina Arruda de Souza Aluna da Faculdade de Farmácia da Universidade Estadual da Zona Oeste Este trabalho de Graduação foi analisado e aprovado com Grau: Rio de Janeiro, de de 2012 Jamila Alessandra Perini, Doutora em Química Biológica Daniel Escorsim Machado, Doutor em Ciências Morfológicas Robson de Queiroz Monteiro, PhD Presidente RIO DE JANEIRO, RJ BRASIL JUNHO DE 2012 ii

5 A Tati, Por toda a ajuda que me deu desde o início, me ensinando com muita paciência e carinho. Por todo o apoio nos momentos mais difíceis e pela orientação espetacular. iii

6 Agradecimentos Antes de tudo, agradeço a Deus por todas as obras realizadas em mim, por toda graça concedida e por toda força que tem me dado para continuar essa árdua caminhada. Aos meus pais que, sem sombra de dúvidas, são os melhores pais do mundo. Obrigada por todo o amor, apoio, compreensão, orgulho, amizade, torcida e confiança na minha vitória. Se não fosse por vocês, nada disso estaria acontecendo. Ao meu irmão, que mesmo com todas as brincadeiras, está sempre ao meu lado para o que eu precisar. A minha cunhada, pelas palavras de apoio nos momentos difíceis. À minha querida avó, Rosa, por toda alegria demonstrada a cada passo dado, com comemorações calorosas e muito animadas. À Toinha pelos puxões de orelha e ombro amigo quando necessário e à tia Lizi por me apresentar às análises clínicas, as quais me levaram ao mundo da Farmácia. A todos os meus amigos, os quais não citarei para não deixar ninguém de fora, por fazerem parte da minha vida e estarem ao meu lado quando preciso. Ao meu querido amor, Philippe. Obrigada pelo companheirismo, dedicação, amizade, por ouvir minhas lamúrias e me dizer palavras confortantes, por comemorar minhas conquistas como se fossem suas, por aturar meu estresse diário sem reclamar (muito). Seu apoio é o que me leva a continuar tentando alcançar meus objetivos sempre. Às minhas amigas de laboratório e fora dele, Juliana e Nathy, obrigada por dividir comigo todos os momentos bons e ruins do lab, pelos passeios no Nova América às sextas-feiras, pelas risadas incontroláveis e tantas alegrias proporcionadas ao longo de tantos anos de amizade. Nathy, obrigada por me ajudar a concretizar esse trabalho (que também é seu!), pelos experimentos feitos iv

7 comigo e sem mim, sem sua ajuda este trabalho ainda estaria pela metade com toda certeza. Ao Robson, agradeço por me acolher em seu grupo e por toda orientação, principalmente nos momentos em que mais precisei. Os anos em que trabalhei em seu laboratório foram alguns dos melhores da minha vida. Obrigada a todas as meninas do lab, por sempre me ajudarem no que precisei, em especial a Luize, Luciana e Flávia, vocês são demais! E, é claro, um abraço à PRIMEIRA TURMA DE FARMÁCIA da UEZO, minha turma nem sempre querida, mas sempre lembrada. Um obrigada especial para meus amigos da turma Juliana, Bárbara, Tarcila, Bruno, Débora, Samira, Rosilaine e, um beijo mais do que especial para Aline e Roberta, meninas obrigada por tornarem esses quatro anos bem mais agradáveis e divertidos, por estarem ao meu lado quando sorri, quando chorei, quando me estressei (às vezes com vocês mesmas), por me ajudarem nos trabalhos acadêmicos e na vida, por comemorarem junto comigo as minhas vitórias. Eu adoro vocês demais e espero que nossa amizade vá além da universidade. Ao projeto do Prof. Leopoldo de Meis, Jovens Talentosos, o qual me inseriu na carreira científica e me apoiou financeiramente para eu chegar onde estou. Finalmente, gostaria de agradecer à CNPq pelo importante suporte financeiro. v

8 O sucesso é ir de fracasso em fracasso sem perder entusiasmo. Winston Churchill ( ) vi

9 Resumo Os níveis de expressão de Fator Tecidual (TF), proteína que inicia a coagulação sanguínea, estão fortemente correlacionados com o grau histológico de malignidade dos gliomas. De fato, a presença de trombos vaso-oclusivos é maior em tumores de grau IV (glioblastoma), sugerindo que as propriedades prócoagulantes do tumor contribuem para o seu comportamento agressivo e para o estabelecimento de hipóxia e necrose tumorais. Nesse trabalho, as linhagens P7 e ST1 de glioma de rato, com diferentes níveis de agressividade, foram analisadas comparativamente, com o objetivo de identificar diferenças nos mecanismos pró-coagulantes das mesmas. Um ensaio enzimático específico (ativação do Fator X na presença de Fator VIIa e de células P7 ou ST1) e PCR em tempo real demonstraram a expressão constitutiva de TF pelas células P7, de maior agressividade, em contraste com a ausência desta proteína na linhagem ST1. Análises por citometria de fluxo, utilizando marcação com anexina V, demonstraram que as células P7 e ST1 expõem de forma similar o lipídeo prócoagulante fosfatidilserina em sua membrana externa. Desta forma as duas linhagens permitiram a montagem do complexo protrombinase (Fator Xa/Fator Va), possibilitando a ativação de protrombina em trombina. No entanto, ensaios de coagulação do plasma demonstraram que a somente a linhagem celular P7 foi capaz de acelerar o tempo de coagulação. Nossos dados sugerem que o TF produz uma significativa diferença nas propriedades pró-coagulantes destas linhagens, sendo uma proteína possivelmente envolvida na agressividade dos gliomas. Foram analisadas também, as microvesículas liberadas por estas células e suas semelhanças com as mesmas. Palavras-chave: Coagulação sanguínea, Fator tecidual, Glioblastoma, Microvesículas. vii

10 Abstract The expression levels of tissue factor (TF), a protein that initiates blood clotting, are strongly correlated with the histological grade of malignancy of gliomas. In fact, the presence of vaso-occlusive thrombi is higher in grade IV tumors (glioblastoma), suggesting that the procoagulant properties contribute to the tumor s aggressive behavior and for the establishment of tumor s hypoxia and necrosis. In that study, P7 and ST1 rat glioma cell lines with different levels of aggression, were comparatively analyzed with the objective identifying differences in the mechanisms of these procoagulant. A specific enzyme assay (activation of Factor X in the presence of Factor VIIa and P7 or ST1 cells) and real-time PCR showed the constitutive expression of TF by P7 cells, most aggressive, in contrast to the absence of this protein in ST1 cell line. Analysis by flow cytometry, using labeling with annexin V, showed that STI and P7 cells similarly exposed the lipid procoagulant phosphatidylserine on its outer membrane. Thus, both cell lines allowed the assembly of the prothrombinase complex (factor Xa / factor Va), enabling the activation of prothrombin to thrombin. However, plasma coagulation assays demonstrated that only P7 cell line was able to accelerate the clotting time. Our data suggest that TF produces a significant difference in the procoagulant properties of these cell lines, and a protein possibly involved in the aggressiveness of gliomas. We also evaluate microvesicles released by these cell lines and their similarities with them. Keywords: Blood coagulation, Tissue factor, Glioblastoma, Microvesicles. viii

11 Lista de Figuras Figura 1 Esquema representando os complexos procoagulantes... 3 Figura 2 Cascata da coagulação sanguínea... 4 Figura 3 Sobrevida de pacientes com câncer apresentando ou não VTE... 5 Figura 4 Evolução dos graus dos gliomas... 7 Figura 5 Invasão do glioblastoma pelo cérebro... 8 Figura 6 Fator tecidual contribui para o crescimento tumoral, angiogênese, metástase e trombose em pacientes com câncer Figura 7 Papéis do complexo binário fator tecidual/fator VIIa (TF/VIIa) no organismo Figura 8 Proteases da coagulação sanguínea, incluindo fator VIIa (FVIIa), fator Xa (FXa) e trombina, podem ativar os receptores do tipo PAR presentes na superfécie das células tumorais Figura 9 Contribuição do fator tecidual (TF), proteases da coagulação e receptores ativados por proteases (PARs) para a angiogênese tumoral Figura 10 Liberação de uma microvesícula Figura 11 - Análise da expressão de TF na membrana de células das linhagens P7 e ST Figura 12 - Expressão de RNAm do TF nas linhagens celulares de glioblastoma P7 e ST Figura 13 - As células de glioblastoma P7 promovem a ativação do FXa através do complexo tenase extrínseco...31 Figura 14 - MVs derivadas de glioblastoma P7 promovem a ativação do FXa através do complexo tenase extrínseco...31 Figura 15 - Ativação da coagulação sanguínea in vitro...32 Figura 16 - Ativação da coagulação sanguínea in vitro com as MVs...33 Figura 17 - As células de glioblastoma P7 e ST1 promovem a formação de trombina através do complexo protrombinase...34 Figura 18 - Análise da exposição de fosfatidilserina na membrana de células das linhagens P7 e ST ix

12 Lista de Tabelas Tabela 1 Anticoagulantes endógenos (TFPI) e exógenos (NAPc2 e Ixolaris) que bloqueiam o complexo TF/FVIIa...13 x

13 Sumário Resumo...vii Abstract...viii Lista de Figuras...ix Lista de Tabelas...x 1. INTRODUÇÃO REVISÃO BIBLIOGRÁFICA COAGULAÇÃO E CÂNCER Coagulação Sanguínea Distúrbios da Coagulação Sanguínea no Câncer Biologia da Coagulação na Patogênese do Glioma FATOR TECIDUAL Importância do fator tecidual para o tumor O papel do Fator Tecidual no crescimento do tumor Papel do Fator Tecidual na Progressão Tumoral Papel do Fator Tecidual na angiogênese MICROVESÍCULAS Microvesículas são diferentes de exossomos Efeitos Gerais de Microvesículas Microvesículas e Câncer O MODELO CELULAR C6/ST1/P7 DE REVERSÃO FENOTÍPICA TUMORAL/NORMAL OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS MATERIAIS E MÉTODOS xi

14 4.1. CULTURA DE CÉLULAS PURIFICAÇÃO DE MVS SECRETADAS EM SOBRENADANTES DE CULTURA DE CÉLULAS ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE TF NA MEMBRANA DE CÉLULAS DAS LINHAGENS P7 E ST Citometria de fluxo Reações de PCR quantitativo em tempo real Síntese de cdna Desenho dos Óligo-iniciadores Reação de Q-PCR ATIVAÇÃO DA COAGULAÇÃO SANGUÍNEA IN VITRO ENSAIO DE FORMAÇÃO DE FXA ENSAIO DE ATIVAÇÃO DA PROTROMBINA AVALIAÇÃO DA EXPOSIÇÃO DE FOSFATIDILSERINA RESULTADOS ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE TF NA MEMBRANA DE CÉLULAS DAS LINHAGENS P7 E ST ENSAIOS DE FORMAÇÃO DO FXA ATIVAÇÃO DA COAGULAÇÃO SANGUÍNEA IN VITRO AVALIAÇÃO DA ATIVAÇÃO DA PROTROMBINA AVALIAÇÃO DA EXPOSIÇÃO DE FOSFATIDILSERINA DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS xii

15 1. INTRODUÇÃO A elevada ocorrência de trombose em pacientes com câncer vem chamando a atenção de pesquisadores de várias partes do mundo. A relação entre a ativação da cascata de coagulação e a progressão tumoral tem sido muito estudada, mas muitos pontos ainda não estão totalmente esclarecidos. Desta forma é necessário novas pesquisas nessa área, a fim de que se conheça e que se entenda todos os mecanismos utilizados pelas células tumorais para seu crescimento e desenvolvimento, visto que a trombose é a segunda causa de morte comum em pacientes com câncer. Neste contexto, a pesquisa em questão trata da incidência de tromboembolismo venoso em pacientes com glioblastoma multiforme e busca entender essa estreita relação entre as proteínas da coagulação sanguínea e a biologia tumoral, destacando o papel da sinalização celular mediada pelo fator tecidual (TF) iniciador da cascata de coagulação juntamente com o fator VIIa (FVIIa) e o fator Xa (FXa), formando o complexo ternário TF/FVIIa/FXa. Esse complexo age diretamente em receptores de membrana acoplados a proteína G, os receptores PAR (do inglês, protease activated receptor), ativando-os. Essa ativação desencadeia uma série de sinalizações intracelulares que podem favorecer a progressão, migração e metástase tumoral. Para estudar essa ligação foram utilizadas duas linhagens de glioblastoma de rato com características opostas, a P7, que é uma linhagem mais agressiva, e a ST1, que é uma linhagem menos agressiva. Além disso, as células de diferentes tipos tumorais liberam fragmentos de membrana chamados de microvesículas (MVs) ou micropartículas, que carreiam consigo características similares às das células de origem, inclusive a presença de TF na membrana. Então, em etapa posterior, estudou-se as MVs liberadas pelas linhagens celulares de glioblastoma, P7 e ST1 com o objetivo de descobrir se, de fato, esses fragmentos possuem as mesmas características das linhagens que a originaram. Para alcançar esses resultados, além da cultura de células, foram feitos experimentos que mimetizam as etapas da cascata de coagulação in vitro com as células e com as microvesículas.

16 2 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1. COAGULAÇÃO E CÂNCER Coagulação Sanguínea O processo de coagulação sanguínea é parte integrante de um complexo mecanismo denominado sistema hemostático, cuja função primordial consiste em reconhecer danos vasculares e recrutar uma apropriada combinação de células e enzimas, que levam ao tamponamento do vaso, interrompendo assim a perda de sangue (LIMA, 2008). A formação do coágulo de fibrina envolve complexas interações entre proteases plasmáticas e seus cofatores, que culminam na gênese da enzima trombina, que, por proteólise, converte o fibrinogênio solúvel em fibrina insolúvel. Em 1964, Macfarlane e Davie & Ratnoff propuseram a hipótese da cascata para explicar a fisiologia da coagulação do sangue. Nesse modelo, a coagulação ocorre por meio de ativação proteolítica, seqüencial de zimogênios, por proteases do plasma, resultando na formação de trombina que, então, converte a molécula de fibrinogênio em fibrina. Esse modelo de cascata divide a coagulação em três vias: a via extrínseca, que envolve componentes sanguíneos, mas também, elementos que usualmente não estão presentes no espaço intravascular; a via intrínseca, iniciada por componentes presentes no meio intravascular; e a via comum, onde as duas outras vias convergem no ponto de ativação do fator X (FX) (FRANCO, 2001). E esse modelo é, hoje, entendido como inadequado do ponto de vista da fisiologia da coagulação já que essa divisão não ocorre in vivo. Atualmente, aceita-se que mecanismos hemostáticos, fisiologicamente relevantes estejam associados com três complexos enzimáticos pró-coagulantes, os quais envolvem serinoproteases dependentes de vitamina K (fatores II, VII, IX e X) associadas a cofatores (V e VIII), todos localizados em uma superfície de membrana contendo fosfolipídeos (COLMAN et al., 2001) principalmente fosfatodilserina (que fornece uma superfície negativa para suportar a formação dos complexos) (Figura 1).

17 3 As diversas enzimas da coagulação convertem seus substratos procofatores em cofatores, os quais localizam as proteases sobre as superfícies celulares, contendo fosfatidilserina (em especial das plaquetas), em que essas reações acontecem. Os elementos biológicos que contribuem para o componente de fosfolipídeos da coagulação incluem tecidos vasculares lesados, células inflamatórias e plaquetas. O principal contribuinte, em termos de números de sítios, são as membranas de plaquetas, que, quando ativadas, expressam sítios de ligação para os complexos FIXa/FVIIIa (complexo tenase ) e FXa/FVa (complexo protrombinase ). Adicionalmente, íons Ca 2+ são necessários em diversos passos das reações da coagulação. (FRANCO, 2001). Figura 1 Esquema representando os complexos pró-coagulantes. O início da coagulação se faz mediante ligação do fator tecidual (FT), com subseqüente ativação dos fatores IX e X. O complexo fator IXa/fator VIIIa ativa o fator X com eficiência ainda maior, e o fator Xa forma complexo com o fator Va, convertendo o fator II (protrombina) em fator IIa (trombina). A superfície de membrana celular em que as reações ocorrem também encontra-se representada. Adaptado de Jenny et al., O início da coagulação dá-se quando ocorre uma exposição do sangue a componentes que, normalmente, não estão presentes no interior dos vasos, em decorrências de lesões estruturais (injúria vascular) ou alterações bioquímicas (por exemplo, liberação de citocinas). Qualquer que seja o evento desencadeante, a iniciação da coagulação do sangue se faz mediante expressão do seu componente crítico, o fator tecidual (TF), e sua exposição ao espaço intravascular.

18 4 Quando há uma exacerbação do processo de coagulação sanguínea, o organismo entra em um estado hipercoagulante, favorecendo a formação de trombos nos vasos sanguíneos, obstruindo-os. Esse estado é chamado de trombose (Figura 2). A Injúria Vascular B Figura 2 Cascata de coagulação sanguínea. (A) Esquema simplificado do processo de coagulação in vivo, destacando os principais zimogênios (FIX, FX, protrombina), enzimas ativas (FVIIa, FIXa, FXa, trombina) e os co-fatores (Fator tecidual, FVIIIa, FVa). As siglas FVIIa, FIX, FIXa, FX, FXa, FVIIIa e FVa representam, respectivamente, os fatores VIIa, IX, IXa, X, Xa, VIIIa e Va. (B) Formação de trombos dentro de um vaso sanguíneo. Adaptado de Lima, Distúrbios da Coagulação Sanguínea no Câncer A correlação entre trombose e câncer foi descrita pela primeira vez em 1865 pelo clínico francês Armand Trousseau ( ). Desde então, a associação entre trombose e câncer foi ampliada e estabelecida e tem sido chamada de Síndrome de Trousseau, a qual abrange casos em que os eventos trombóticos inexplicados precedem o diagnóstico de uma neoplasia maligna oculta ou aparecem concomitantemente com o tumor (MEIS et al., 2010). É estimado que quase 15% de todos os pacientes com câncer sofrerão complicações tromboembólicas no curso de sua doença. Além disso, a taxa de recorrência após o primeiro episódio de tromboembolismo venoso (VTE) em pacientes com câncer é significantemente mais alta, comparada àquela vista em pacientes sem câncer. Já foi descrito que o VTE é a segunda causa mais comum

19 5 de morte em pacientes com câncer (HOFFMAN, HAIM, BRENNER, 2001) e estudos epidemiológicos têm demonstrado que há uma significativa correlação entre a ocorrência de trombose e um pior prognóstico da doença (Figura 3), o que pode estar associado ao fato de pacientes com eventos tromboembólicos apresentarem tumores de comportamento mais agressivo do que daqueles sem trombose (SORENSEN et al., 2000). Figura 3 Sobrevida de pacientes com câncer apresentando ou não VTE. Curvas de sobrevida de pacientes com diagnóstico de câncer e tromboembolismo venoso ao mesmo tempo ( ) e pacientes com câncer sem tromboembolismo venoso ( ). Adaptado de Sorensen et al., O VTE é mais comum em pacientes com carcinomas primários de pâncreas, estômago, cólon, pulmão e doença metastática. Além de mecanismos patogênicos relacionados ao tumor, fatores predisponentes para hipercoagulabilidade em pacientes com câncer incluem: cirurgia, infecção, imobilização, quimioterapia e agentes hormonais (HOFFMAN, HAIM, BRENNER, 2001). Uma série de fatores tem sido proposta para explicar o estado trombofílico do paciente com câncer, dentre os quais podemos citar como os mais importantes: (i) A síntese de moléculas pró-coagulantes, especialmente TF, pelas células tumorais; (ii) A síntese de citocinas pró-inflamatórias, por células de algumas neoplasias, ou devido à resposta imunológica antitumoral. Estas

20 6 citocinas podem, por exemplo, ativar células endoteliais e monócitos a expressarem moléculas pró-coagulantes em sua membrana externa; (iii) A interação direta entre as células tumorais e as células vasculares, resultando na ativação destas últimas e na consequente modulação do sistema hemostático; (iv) A exposição do fosfolipídeo fosfatidilserina (PS) na membrana externa das células tumorais, permitindo a geração de superfícies lipídicas que suportam a formação dos complexos da coagulação sanguínea; e (v) O aumento dos níveis plasmáticos de fragmentos celulares, denominados microvesículas ou micropartículas, com atividade pró-coagulante (MEIS et al., 2010). Neste contexto, tem-se enfatizado cada vez mais a importância do sistema de coagulação sanguínea em diferentes processos do desenvolvimento neoplásico, principalmente no que diz respeito à angiogênese e metástase tumorais. Então, o estudo dos mecanismos pró-coagulantes associados ao desenvolvimento neoplásico, responsáveis pelos estados pró-trombóticos observados, poderia revelar não apenas possíveis alvos terapêuticos contra tal efeito colateral (os eventos tromboembólicos), mas também contra a doença primária, o câncer (LIMA, 2008) Biologia da Coagulação na Patogênese do Glioma Gliomas de alto-grau representam os tumores primários mais comuns do Sistema Nervoso Central (SNC). Esses tumores extremamente letais causam um comprometimento significativo do sistema neurológico (FADUL, ZACHARSKI, 2005) (Figura 4). Eles podem ser classificados em diferentes graus (grau I-IV) e subgrupos histopatológicos (GESSLER et al., 2010).

21 7 Figura 4 Evolução dos Graus dos Gliomas. Esquema mostrando a progressão do astrocitoma infiltrante de acordo com a Organização Mundial de Saúde (WHO), do grau II à esquerda ao grau IV à direita. Setas indicam as células em pseudo-paliçada e a parte mais clara entre essas células indica a parte necrosada. Adaptado de Brat et al., 2003 Uma complexa cascata de eventos genéticos e celulares leva ao desenvolvimento do glioma grau IV, também denominado glioblastoma multiforme (GBM). Eventos genéticos que caracterizam a transição do glioma de mais baixo grau ao glioblastoma incluem a perda de PTEN (do inglês, phosphatase and tensin homolog) e superexpressão de VEGF, dois eventos moleculares que estão correlacionados com o aumento da expressão de TF. A diminuição do gene supressor de tumor PTEN, regulador chave da via PI3-K, medeia a ativação da AKT em glioblastoma com coincidente aumento na expressão de TF (RONG et al., 2005). O GBM, o tumor primário mais comum do sistema nervoso central em adultos, resulta em uma sobrevida média de menos de um ano (FADUL, ZACHARSKI, 2005) e apresenta como principais características histológicas, as atipias nucleares, hiperplasia microvascular, altas taxas de mitoses, de proliferação vascular por aumentar a quantidade do Receptor do Fator de Crescimento Epidermal (EGFR) e fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) e de necrose, em conseqüência da hipóxia (LOUIS et al., 2007). Células vizinhas às áreas de necrose formadas são conhecidas como pseudo-paliçadas, e elas representam uma onda de células tumorais migrando para longe da zona hipóxica central criada após a trombose intravascular. Estas células secretam

22 8 fatores pró-angiogênicos que promovem hiperplasia microvascular e expansão do tumor (JENKINS et. al., 2010). Além disso, o glioma de grau IV é altamente invasivo, mas não apresenta ocorrência de metástase para outros órgãos e é um tumor resistente a terapias multimodais (Figura 5). A B Figura 5 Invasão do Glioblastoma pelo cérebro. (A) Fotografia mostrando o glioblastoma invadindo áreas do cérebro diferentes da área de origem. (B) Recorrência local do glioblastoma. A massa tumoral reaparece dezessete meses após a cirurgia de retirada. Adaptado de Nakada et al., 2007 As células de glioblastoma migram e se infiltram no parênquima normal do cérebro seguindo os tratos de substância branca, o que torna a ressecção cirúrgica completa quase impossível. Seu rápido crescimento requer a formação de novos vasos que são susceptíveis a hemorragias, porém essa neovascularização não acompanha o rápido crescimento da massa tumoral. A hipóxia e a necrose acontecem em conseqüência desse crescimento e promovem a produção de VEGF. Isso torna os tumores menos sensíveis à radiação e à quimioterapia. Estas características biológicas são mediadas pela secreção de fatores solúveis, incluindo proteases, e a expressão de receptores que permitem a interação de células tumorais com outras células e a matriz extracelular no microambiente tumoral, enquanto regulam suas próprias vias de sinalização intracelular de um modo autócrino (JENKINS et. al., 2010).

23 9 Gliomas malignos estão associados a um risco muito alto de VTE (JENKINS et al., 2010). Alguns autores postularam que há uma potencial relação entre a geração de trombina e a patogênese do glioma. Através de experimentos de imunohistoquímica, observou-se a presença de trombina em amostras de glioblastoma humano e no tumor obtido de um modelo de glioma de ratos, a linhagem celular C6. A detecção de mrna de protrombina nessas células sugere que, pelo menos uma parte da trombina é derivada do tumor e outra parte é derivada do plasma. A presença de trombina não só promoveu a proliferação das células C6 em cultura, um efeito que foi bloqueado por um inibidor de trombina, como também estimulou a produção de VEGF medido no sobrenadante. Em um modelo de rato, os autores demonstraram que a administração sistêmica de um inibidor de trombina resultou na redução da massa tumoral e aumento da sobrevida quando comparado com o controle (FADUL, ZACHARSKI, 2005). A ocorrência de vaso-oclusão após uma trombose intravascular poderia levar diretamente ao desenvolvimento de hipóxia; a necrose resultante poderia ser responsável pela indução de hiperplasia microvascular que define a histologia do GBM (JENKINS et al., 2010). A superexpressão de EGFR em células de glioma humano causa uma expressão aumentada de TF, e a estimulação de EGFR leva a um aumento da regulação de TF de maneira dose-dependente, independentemente de hipóxia (RONG et al., 2009). As células de glioma muitas vezes expressam uma forma oncogênica truncada de EGFR conhecido como EGFRvIII; a expressão desta forma estimula a formação de MVs contendo EGFRvIII, levando a expressão aumentada de TF, a produção aumentada de VEGF e angiogênese (MILSOM et al., 2008). Mecanismos oncogênicos são responsáveis por uma maior regulação da expressão de TF pelas células de GBM; este ambiente pró-trombótico rico em TF poderia levar a uma trombose local, necrose induzida pela hipóxia, angiogênese e ao crescimento do tumor periférico em gliomas (RONG et al., 2009).

24 FATOR TECIDUAL O fator tecidual (TF) é uma proteína transmembrana de 47 kda pertencente a superfamília de receptores de citocinas (GESSLER et al., 2010). TF é o receptor da enzima FVIIa, e esta propriedade o define como o principal regulador da cascata de coagulação sanguínea. A formação do complexo TF/FVIIa na superfície da célula leva a conversão proteolítica do FX circulante para sua forma ativa (FXa) (juntamente com a ativação de FIX), o qual converte pequenas amostras de protrombina para trombina. A geração de trombina é amplificada pela contribuição das plaquetas, FVa, FVIIIa e FIXa, resultando em uma quantidade ainda maior de atividade da trombina e uma rápida geração de coágulos contendo fibrina insolúvel e plaquetas. Uma vez gerado, o complexo TF/FVIIa é capaz de interagir com as células por meio de receptores ativados por proteases (PAR do inglês protease activated receptor) acoplados a proteína G, quer diretamente (PAR-2) quer via FXa (PAR-1 ou PAR-2) ou trombina (PAR-1) (MAGNUS, GARNIER e RAK, 2010). Em tecidos saudáveis, o escopo desta atividade é restrito pela expressão normalmente extravascular de TF. Por isso, a formação do complexo TF/FVIIa pode ocorrer somente sob circunstâncias muito especiais, incluindo: injúria vascular penetrante, extravasamento de sangue, ruptura ou descontinuidade do revestimento endotelial, indução da expressão de TF nas células endoteliais (durante a angiogênese, por exemplo), entrada de um grande número de células expressando TF (leucócitos inflamatórios, células cancerosas metastáticas ou blastos leucêmicos, por exemplo) na corrente sanguínea ou MVs contendo TF na membrana (RAK et al., 2009). O TF, ao iniciar a coagulação sanguínea, desempenha um importante papel na hemostasia normal, doenças cardiovasculares e trombose. A ativação da coagulação nas proximidades de células tumorais expressando TF e a liberação de fragmentos com atividade pró-coagulante na circulação contribui significantemente para a trombose associada ao câncer, tromboembolismo e síndrome de Trousseau no câncer avançado (VERSTEEG et al., 2008; SCHAFFNER e RUF, 2008).

25 Importância do fator tecidual para o tumor A transcrição de TF é induzida pela ativação de EGFR, pela perda de PTEN e hipóxia e sua expressão está positivamente correlacionada com o grau histológico dos gliomas e com a extensão da necrose. A expressão aumentada de TF está ligada ao estado hipercoagulativo dos tumores, incluindo gliomas malignos (GESSLER et al., 2010) e com progressão tumoral em vários cânceres (SCHAFFNER e RUF, 2008). Além de seu papel pró-trombótico, TF pode atuar como um receptor transmembranar, como explicado anteriormente, e seu domínio intracelular está envolvido na modulação de várias vias de sinalização intracelulares relevantes para o crescimento do tumor, angiogênese e metástase, tais como a via de MAP cinase p44/p42 (MAPK), via da MAPK p38 e via da PI3/Akt (GESSLER et al., 2010; DUTRA-OLIVEIRA A. et al, 2012). O TF é expresso por todos os tipos de cânceres. A formação do complexo TF/FVIIa na superfície das células tumorais leva à clivagem e ativação de PAR-2. A via de sinalização TF/FVIIa/PAR-2 parece promover trombose, crescimento, angiogênese e metástase tumoral (Figura 6) (KASTHURI et al., 2009).

26 12 Figura 6 Fator tecidual contribui para o crescimento tumoral, angiogênese, metástase e trombose em pacientes com câncer. A expressão de TF pelas células tumorais pode aumentar o crescimento do tumor por aumentar a sobrevida celular e/ou a angiogênese. A expressão de TF pelas células tumorais no sangue aumenta a metástase pela ativação da coagulação e plaquetas. A liberação de micropartículas TF-positivas pelas células tumorais e células hospedeiras no sangue pode levar ao tromboembolismo venoso. KASTHURI et al., O papel do Fator Tecidual no crescimento do tumor Recentemente, um estudo mostrou um papel direto do TF sobre o crescimento do tumor. Notavelmente, a redução seletiva na expressão de TF em células de câncer de coloretal usando um RNA de interferência reduziu dramaticamente o crescimento do tumor em ratos (KASTHURI et al., 2009). Interessante foi que a redução da expressão do TF não afetou o crescimento das células in vitro, sugerindo que o crescimento do tumor mediado por TF requer um fator presente in vivo que não está presente quando as células são crescidas in vitro. Um provável candidato é o FVIIa, o qual poderia formar o complexo TF/FVIIa na superfície das células tumorais in vivo levando a ativação da sinalização dependente de PAR-2. A geração de trombina e ativação de PAR-1 nas células tumorais também pode aumentar o crescimento tumoral. A inibição do complexo TF/FVIIa ou com um inibidor do fator tecidual ou com uma proteína anticoagulante de nematódeo chamada NAPc2 ou com outros

27 13 inibidores do TF (Tabela 1) reduziu o crescimento da linhagem celular de melanoma B16 em ratos (KASTHURI et al., 2009). Em outro estudo, ratos sem PAR-2, mas não PAR-1, exibiram um crescimento tumoral reduzido em um modelo de tumor mamário espontâneo (VERSTEEG et al., 2008). A ativação da via de sinalização TF/FVIIa/PAR-2 pode aumentar o crescimento tumoral por aumentar diretamente a sobrevida celular e/ou pelo aumento na expressão de proteínas pró-angiogênicas, tais como VEGF e interleucina-8 (IL-8) (HJORTOE et al., 2004). Tabela 1 Anticoagulantes endógenos (TFPI) e exógenos (NAPc2 e Ixolaris) que bloqueiam o complexo TF/FVIIa. Adaptado de Meis, Papel do Fator Tecidual na Progressão Tumoral Alguns autores sugerem que o TF contribui para a progressão tumoral através de mecanismos pró-coagulantes e de sinalização celular (RAK et al., 2009). Ele mantem contato direto com a célula por uma via de sinalização independente da ativação da coagulação. A expressão de TF influencia a função de integrinas. TF regula a migração de células epiteliais não-cancerosas especificamente na laminina 5, uma matriz para integrinas α3β1 e α6β1. Esta via é dependente da sinalização do domínio citoplasmático de TF e da interação extracelular com o ligante fisiológico VIIa, o qual induz a fosforilação do domínio citoplasmático de TF de uma maneira dependente de PAR-2 (SCHAFFNER e RUF, 2008). O domínio citoplasmático de TF também interage com as MAPK p38,

28 14 p44/42 (ERK1/2), vias de Rac e estabelece sinergia com fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) induzido por quimiotaxia, enfatizando a relevância do domínio citoplásmico para sinalização celular, levando a motilidade e migração celular. Recentes estudos tem mostrado que a interação de TF com integrinas é regulada pela ligação com VIIa em células epiteliais normais, mas é constitutiva em células de câncer de mama agressivo (SCHAFFNER e RUF, 2008). Interessantemente, a associação induzida de TF/FVIIa com integrinas envolve uma porção não-coagulante de TF (Figura 7), a qual é dependente da sinalização através de PAR-2. Utilizando um anticorpo monoclonal específico para TF (10H10), foi possível bloquear a regulação, bem como, a associação constitutiva de TF com integrinas β1 nas células tumorais (SCHAFFNER e RUF, 2008). Este anticorpo também potencializou o bloqueio sinalização de PAR-2 mediada pelo complexo TF/FVIIa sem inibir a atividade coagulante de TF. Sabe-se que o fator tecidual é expresso nas células tumorais na conformação de sinalização (SCHAFFNER e RUF, 2008). Sinalização Angiogênese CXCL1, VEGF, IL8 Integrina/migração Trombina Coagulação Fibrina Plaqueta Figura 7 Papéis do complexo binário Fator Tecidual/Fator VIIa (TF-VIIa) no organismo. Além de ser o iniciador da cascata de coagulação sanguínea, TF pode desencadear uma sinalização intracelular ao ligar-se a um receptor PAR acoplado à proteína G de células tumorais, a resposta celular pode levar a progressão, migração, angiogênese e metástase (em alguns tipos de câncer) tumoral. Adaptado de Schaffner e Ruf, 2008.

29 15 Já foi demonstrado que o FVIIa em concentrações nanomolares (ηm) pode ativar PAR-2 quando TF e FX estão presentes. Esses resultados induzem uma cascata de eventos na superfície da célula tumoral. FVIIa se liga ao TF, o complexo binário TF/FVIIa converte o zimogênio inativo FX em FXa, então o FXa cliva e ativa PAR-2 para promover a migração celular (Figura 8). TF/FVIIa também pode ativar PAR-2 diretamente, especialmente quando TF está expresso em altas concentrações (CAMERER et al., 2000). Vários tumores expressam FVIIa ectopicamente in vivo e in vitro e a síntese ectópica de VIIa é suficiente para induzir a migração da célula tumoral quando exposto a gradientes do substrato FX (KOIZUME et al., 2006). Figura 8 Proteases da coagulação sanguínea, incluindo Fator VIIa (FVIIa), Fator Xa (FXa) e trombina, podem ativar os receptores do tipo PAR presentes na superfície das células tumorais. Os receptores do tipo PAR, que são acoplados à proteína G (Ptn G), medeiam aumento na atividade da Proteína cinase C (PKC) ou reduzem a atividade da Adenilato Ciclase (AC). Estes fenômenos levam à ativação da via de MAPK e, consequentemente, desencadeiam fenômenos pró-tumorais. MEIS et al., 2010

30 Papel do Fator Tecidual na angiogênese A expressão de TF pelas células tumorais tem sido apontada como responsável pelo crescimento e angiogênese aumentados. Alguns autores apontam que o TF é expresso nas células endoteliais na vasculatura tumoral, embora essa observação não seja universal. Poder-se-ia imaginar que a expressão aumentada de TF nas células endoteliais poderia induzir a trombose e a morte das células tumorais, ao invés de promover o crescimento. Contudo, tem sido proposto que a expressão de TF nessas células promove um aumento da formação de novos vasos. Um estudo mostrou que a expressão aumentada de fator tecidual nas células tumorais está associada com a expressão aumentada de VEGF e a um aumento no tamanho do tumor em ratos. Em tumores humanos, níveis elevados de TF estão associados com o aumento do VEGF e da vascularização. Estudos mostraram que, em alguns tipos de células, a neovascularização requer a geração de trombina dependente de TF e a ativação de PAR-1 nas células endoteliais (Figura 9) (KASTHURI et al., 2009).

31 17 Trombina Fibrina Célula Tumoral Angiogênese Figura 9 Contribuição do fator tecidual (TF), proteases da coagulação e receptores ativados por proteases (PARs) para a angiogênese tumoral. Formação do complexo TF/FVIIa na superfície das células tumorais ativa o sistema de coagulação. A clivagem de PAR-2 por FVIIa ou FXa induz a expressão de várias proteínas pró-angiogênicas, incluindo fator de crescimento vascular endotelia (VEGF), interleucina-8 (IL-8) e metaloproteinases de matriz (MMPs). A ativação de PAR-1 pela trombina ou FXa induz um conjunto semelhante de genes. Adaptado de Mceachron e Mackman, 2009 Como dito anteriormente, um dos mecanismos utilizados pelas células tumorais é a liberação de partículas com atividade pró-coagulante, as microvesículas ou micropartículas MICROVESÍCULAS Durante a ativação, células eucarióticas liberam componentes de sua membrana plasmática no espaço extracelular. Esses fragmentos circulantes, conhecidos como microvesículas (MVs) ou micropartículas (MPs), tem sido detectados em diversos fluidos incluindo sangue periférico (Janowska-Wieczorek et al., 2004). Este processo, que permite uma liberação seletiva do conteúdo celular para o entorno foi notado pela primeira vez por Wolf em 1967, como a formação de um material particulado pró-coagulante ("poeira") em torno de

32 18 plaquetas ativadas (AL-NEDAWI et al., 2009). Essas estruturas vesiculares intactas são bastante heterogêneas em tamanho (seu diâmetro pode variar de 0,1-1 µm) e composição, sendo constituídas principalmente de diferentes lipídeos e proteínas de membrana similares àqueles presentes na célula da qual se originam (LIMA, 2008). As microvesículas tem sido apontadas como importantes vias de sinalização na comunicação intercelular (JANOWSKA-WIECZOREK et al., 2005) Microvesículas são diferentes de exossomos Fluidos corpóreos humanos contem dois tipos diferentes de fragmentos derivados das células: microvesículas e exossomos. Células eucarióticas, incluindo células sanguíneas, endoteliais e tumorais, liberam microvesículas pelo brotamento de partes de sua membrana externa. Exossomos surgem de endossomos, os quais são inicialmente formados pela invaginação da membrana plasmática. Endossomos liberam vesículas dentro de seu lúmen, vesículas intraluminais. Endossomos contendo vesículas intraluminais são chamados corpos multivesiculares (MVBs). Finalmente, quando membranas dos MVBs se fundem com a membrana plasmática, essas vesículas intraluminais são secretadas e são chamadas exossomos. Exossomos atingem um tamanho de 30 a 100 nm e se pode esperar que todos os tipos de células contendo MVBs secretem exossomos, esses tipos de células incluem células hematopoiéticas, células tumorais e células epiteliais (DOORMAAL et al., 2009). A composição das microvesículas depende muito do tipo de célula que lhe deu origem, embora a composição da membrana da microvesícula permaneça distinta daquela da célula parental muitas vezes com remodelação significativa, permitindo funções especializadas. A este respeito, nem todas as proteínas da membrana plasmática são incorporadas nas vesículas liberadas (MURALIDHARAN-CHARI et al., 2010). A fosfatidilserina (PS) é transferida para a face externa da membrana, especificamente em sítios onde ocorre a liberação das microvesículas, enquanto a topologia das proteínas de membrana permanece intacta (LIMA et al., 2009) (Figura 10). A externalização de PS em células tumorais ocorre, presumivelmente, em um esforço para reprimir uma resposta

33 imunológica e promover a sobrevivência das células tumorais (MURALIDHARAN- CHARI et al., 2010). 19 Figura 10 Liberação de uma microvesícula. Microvesículas são formadas pelo brotamento da membrana plasmática, como mostrado. Nem todas as proteínas da membrana plasmática são incorporadas nas vesículas liberadas, embora a topologia de proteínas de membrana permanece intacta. Proteínas da membrana, como oncogenes e outros receptores do fator de crescimento, receptores de integrinas e moléculas MHC de classe I, proteínas solúveis, como proteases e citocinas, bem como ácidos nucléicos, tem sido encontrados em microvesículas. Microvesículas parecem ser enriquecidas em alguns lipídios, como colesterol, enquanto a fosfatidilserina é transferida para a face externa da membrana, especificamente em locais de liberação de microvesículas. Adaptado de Muralidharan-Chari et al., Efeitos Gerais de Microvesículas As microvesículas (MVs) estão associadas a muitos processos patológicos e fisiológicos no corpo humano. Membranas de MVs contem fosfolipídeos e proteínas que, com frequência, são originadas de lipid rafts da célula parental, incluindo receptores transmembranares, tais como fator tecidual (TF). Além disso, proteínas intracelulares, segundos mensageiros e material genético podem ser inclusos e especificamente incorporados nas MVs. Como consequência desta incorporação, as propriedades funcionais e o papel biológico das MVs podem diferir de sua célula de origem (DEL CONDE et al., 2005).

34 20 As MVs interagem com as células pela ligação com receptores de adesão específicos do tipo celular. Após esta interação inicial, as membranas de MVs podem fundir com a membrana plasmática da célula-alvo, transferindo receptores que podem induzir a sinalização celular ou mesmo a transformação, a informação genética e segundos mensageiros (HUNTER et al., 2008). MVs não estão apenas envolvidas na comunicação intercelular, mas também em outros processos incluindo regulação da apoptose, modulação da resposta imune, inflamação, angiogênese e coagulação. A liberação de microvesículas é um fenômeno fisiológico. Todos os tipos de disparos bioquímicos induzem a liberação de MVs, tais como citocinas e quimioterápicos, bem como disparos físicos, tais como hipóxia e estresse. Em doenças, níveis anormais de MVs são observados, e seus números, origem celular e composição são dependentes da (estado) doença (DOORMAAL et al., 2009) Microvesículas e Câncer Embora a liberação de microvesículas ocorra sob condições fisiológicas, a liberação aberrante de MVs pode surgir em algumas doenças, como o câncer. De fato, comparado com controles saudáveis, o sangue de pacientes com câncer contem níveis elevados de microvesículas derivadas de células (DOORMAL et al., 2009). Amostras de MVs liberadas por células tumorais mostraram uma correlação com sua invasividade tanto in vitro como in vivo. MVs em pacientes com câncer foi documentada pela primeira vez em 1978, quando elas foram identificadas em culturas de nódulos do baço e linfonodos de um paciente do sexo masculino com doença de Hodgkin. Cerca de uma década mais tarde, foi demonstrado que vesículas derivadas de membrana plasmática de células de melanoma de camundongo altamente metastático B16 (F10) eram liberadas espontaneamente e, quando fundidas com células de melanoma murino fracamente metastático B16 (F1), tornou-as capazes de fazer metástase para o pulmão (MURALIDHARAN-CHARI et al., 2010). Esses dois estudos incentivam a novas investigações sobre o papel da liberação de microvesículas na progressão do câncer. Desde então, a

35 21 transferência de materiais celulares mediada por microvesículas para as células de adjacentes ou células remotas tem sido mostradas para afetar muitas etapas da progressão do tumor (DOORMAL et al., 2009), incluindo angiogênese, escape do sistema imunológico, degradação da matriz extracelular e metástase. A liberação de microvesículas pelas células tumorais facilita a transferência de proteínas solúveis, ácidos nucleicos, proteínas transmembranares funcionais, receptores de quimiocina, fator tecidual e receptores tirosina quinase, tais como EGFR e receptor do fator de crescimento epidermal humano 2 (HER2) (MURALIDHARAN-CHARI et al., 2010) O MODELO CELULAR C6/ST1/P7 DE REVERSÃO FENOTÍPICA TUMORAL/NORMAL A linhagem C6 de glioma de rato foi estabelecida a partir de um tumor cerebral induzido quimicamente por etilnitrosouréia (Benda et al., 1968). Após passagens alternadas in vitro e in vivo da cultura primária derivada do tumor primário, várias linhagens clonais foram selecionadas, e o clone C6, de onde se originou a linhagem, era o que expressava maiores quantidades de proteína S100 que, na época, foi utilizada como um marcador de células gliais (Benda et al., 1968). Por alguns anos, esta linhagem de rato foi uma das poucas opções disponíveis de células gliais em cultura, tendo sido intensamente utilizada como modelo experimental para neurociências, proliferação celular e tumorigênese (Cretu et al., 2005; Garberg et al., 2005; Goncharov et al., 2005). Enquanto modelo de diferenciação e proliferação celular, a linhagem C6 apresenta inibição de crescimento em resposta ao tratamento com uma variedade de agentes diferenciadores, tais como glicocorticóides (Armelin & Armelin, 1983), ácido retinóico, 1,25-dihidroxivitamina D3 e dibutiril-amp cíclico (Fischer et al., 1987), dentre outros. Além disso, a linhagem C6 leva à formação de tumores similares aos glioblastomas humanos quando injetada no cérebro de ratos neonatos, e tem sido utilizada extensivamente como um modelo experimental de glioblastoma in vivo (Grobben et al., 2002). Apesar desta linhagem ser de origem clonal, já é conhecido que as sucessivas passagens em cultura leva a uma mudança progressiva de fenótipo e

36 22 a uma heterogeneidade crescente (Goya et al., 1996). Com o objetivo de estudar a parada de crescimento induzida por glicocorticóides nesta linhagem, foram isoladas, pelo grupo da Dra. Mari Sogayar, linhagens clonais variantes a partir da linhagem C6 (COLIN, 2006). Deste isolamento, originaram-se as linhagens tumorais ST1 e P7 (Armelin & Armelin, 1983). A linhagem ST1 é hipersensível ao tratamento com glicocorticóides, apresentando uma dramática reversão do fenótipo transformado e tumorigênico, a julgar pela aquisição de morfologia achatada e fusiforme e aumento da aderência, forte inibição do crescimento em substratos sólido e semi-sólido in vitro assim como inibição do caráter tumorigênico in vivo, quando injetada de forma subcutânea em camundongos imunossuprimidos do tipo nude. A linhagem P7 é completamente refratária a este tratamento, mantendo suas características de transformação e caráter tumorigênico inalteradas pelo tratamento com glicocorticóides (GC). Sabendo da relação de oposição existente entre estas linhagens, foi desenvolvido este estudo, com o interesse de aprofundar este conhecimento.

37 23 3. OBJETIVOS 3.1. OBJETIVO GERAL Avaliar se níveis de TF nas linhagens celulares de glioma ST1 e P7, e em microvesículas derivadas das mesmas, estão correlacionados com a agressividade tumoral OBJETIVOS ESPECÍFICOS a) Analisar quantitativamente a expressão de TF nas linhagens de glioma ST1 e P7; b) Identificar as microvesículas liberadas pelas linhagens de glioma ST1 e P7; c) Determinar a diferença nos níveis de expressão do TF nas micropartículas liberadas pelas linhagens celulares de glioma ST1 e P7; d) Analisar se estas micropartículas apresentam características similares às suas células de origem, com relação ao efeito na coagulação sanguínea.

38 24 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1. CULTURA DE CÉLULAS As linhagens celulares ST1 e P7 de Glioma foram gentilmente cedidas pela Profª Mari Sogayar do Instituto de Química da USP mantidas a 37ºC, em estufa com 5% de CO 2, através de duas passagens semanais em garrafas de cultura contendo meio de cultura DMEM-F12 (Dulbecco s Modified Eagle Medium), acrescido de 10% (v/v) de soro fetal bovino (SFB), e suplementado com glicose 30%, 100mg/L de estreptomicina, 250mg/L de fungisona, 3,7 g/l de bicarbonato de sódio e 2mM de L-glutamina. Após separação do sobrenadante de cultura para posterior purificação de microvesículas, as células eram soltas com tampão Hank's contendo 10mM de HEPES e 0,2mM de EDTA, centrifugadas a 1100 rpm por 7 min, ressuspendidas em meio DMEM-F12 contendo 10% (v/v) de SFB e transferidas para outra garrafa de cultura, ou ainda, mantidas a 4ºC até sua utilização PURIFICAÇÃO DE MVS SECRETADAS EM SOBRENADANTES DE CULTURA DE CÉLULAS Sobrenadantes de cultura de células eram centrifugados primeiramente a 2000 x g por 15 min (para a eliminação de possíveis células mortas) e em seguida mais duas vezes a x g por 1h cada, sempre a 4ºC. O precipitado obtido era então ressuspendido em salina tamponada por fosfato (PBS), quantificado por contagem em um citômetro de fluxo BD FACScalibur TM (Becton, Dickinson and Company), e conservado a -80ºC até sua utilização.

39 4.3. ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE TF NA MEMBRANA DE CÉLULAS DAS LINHAGENS P7 E ST Citometria de fluxo As análises feitas no citômetro de fluxo facscalibur (Becton-Dickinson, EUA), foram analisadas com os seguintes parâmetros: desvio frontal (ou forward scatter), desvio lateral (ou side scatter) e sinais de fluorescência na cor verde (fl1), cujo comprimento de onda é de 525 nm ou, na cor laranja (fl2), cujo comprimento de onda é de 575 nm. A excitação das amostras foi realizada por laser de argônio, ajustado para emitir 15 mw a 488 nm. Um total de eventos foi adquirido e os dados obtidos foram analisados utilizando o programa winmdi Reações de PCR quantitativo em tempo real Síntese de cdna Amostras do RNA total das células foram utilizadas como template para síntese de cdna em uma reação de transcrição reversa. Alíquotas de 1µg de RNA total foram submetidas a tratamento prévio com 2µl de DNase I (1U/µl fermentas) em solução contendo tampão 5X de síntese de primeira fita Super Scrip III (Invtrogen) e 0,5 µl de RNase OUT (40U/µl, invitrogen) em volume final de 10 µl. O tratamento ocorreu através de incubação de 10 minutos a 37 C. Em seguida, para inativação da enzima, a amostra foi incubada a 75 C por 10 minutos. Para cada amostra de RNA previamente tratada, foi preparado reações contendo 0,5 µl de Oligo dt (0,5g/µl, Invitrogen), 0,5 µl de Random Primer (100ng/ul, Invitrogem) e 1 µl de dntp (100mM, Invitrogen) para um volume final de 12 µl. As amostras foram incubadas a 75 C por 10 minutos para desnaturação das moléculas e, em seguida, foi adicionado 7 µl de uma solução contendo 2 µl de tampão de 5x de síntese de primeira fita para a enzima Super Scrip III (Invitrogen), 2 µl de DTT (0,1M, Invitrogen), 0,5 µl de RNase OUT (40U/ul, invitrogen) e 2,5 µl de água Milli-Q para um volume final de 19 µl. Houve uma nova incubação de 25 C por 10 minutos, para anelamento dos iniciadores, 42 C

40 26 por 2 minutos e, então, foi adicionado 2 µl da enzima Super Scrip III (200U/µl, Invitrogen). A reação de transcrição reversa ocorreu a 42 C por 2 horas e, em seguida, foi inativada a 72 C por 10 minutos. Com o objetivo de degradar o RNA excedente, foi adicionado 1 µl de RNase H (5U/µl, Fermentas) em cada tubo e posteriormente incubados a 37 C por 30 minutos, seguidos por uma incubação a 72 C por 10 minutos para inativação da enzima Desenho dos Óligo-iniciadores Os iniciadores utilizados para a amplificação dos genes nos experimentos de Q-PCR foram desenhados com o auxílio do programa computacional Primer Express versão 2.0 (Applied Biosystems) Reação de Q-PCR As reações de PCR em tempo real foram realizadas utilizando o sistema TaqMan. Foram feitas duplicatas de cada amostra utilizando o Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) em um volume final de 15 µl, contendo os primers forward/reverse (400 nm) probe (200 nm) e cdna (0,250 µg). Todas as amplificações foram realizadas no aparelho ABI Prism 7500 Sequence detection System (PE Applied Bisystems), com a seguinte ciclagem: desnaturação à 95 C por 10 minutos, 40 ciclos de 15 segundos à 95 C (desnaturação) e 60 segundos à 60 C (anelamento dos primers e elongação). Foi definido um threshold (0.03) na fase exponencial de amplificação do gene no programa GeneAmp Assim que foi estabelecido o threshold, a partir da intersecção deste com a curva de amplificação, obteve-se o Ct da amostra (Threshold cycle, ciclo onde a fluorescência se encontra estatisticamente acima do background). Em experimentos de Real-Time PCR, como em todas as técnicas de expressão, deve-se considerar a possibilidade da variação da concentração inicial de cdna na análise dos dados provenientes de duas ou mais amostras. Desta forma, para que os dados possam ser comparados, é necessário que estes sejam previamente normalizados, ou seja, a expressão do gene alvo foi determinada em

41 função da expressão do gene controle. A quantificação das amostras foi realizada usando GAPDH como controle ATIVAÇÃO DA COAGULAÇÃO SANGUÍNEA IN VITRO A habilidade das linhagens celulares e das MVs estudadas em potencializar a coagulação sanguínea in vitro foi avaliada através de ensaio de recalcificação do plasma, de acordo com o seguinte protocolo: 50 µl de plasma humano pobre em plaquetas contendo citrato de sódio (citrato de sódio 3,8%, 1:9, v/v) foi incubado com 50 µl de células ou MVs ressuspendidas em PBS, em diferentes concentrações ou ainda, com 50 µl apenas de PBS (controle) -, por 1 min. a 37ºC. Adicionou-se então 100 µl de CaCl 2 6,25 mm, e o tempo necessário para ocorrência de coagulação foi monitorado em um Coagulômetro KC-4 micro Amelung (Amelung Ltd, Diagnostic Grifols) ENSAIO DE FORMAÇÃO DE FXa A ativação de FX para FXa pelo FVIIa foi realizada em 50 mm HEPES, 100 mm NaCl, 5 mm CaCl 2, 1 mg ml -1 BSA, ph 7,5 (tampão HEPES- BSA). FVIIa (1 nm) foi incubado com as células (5 x 10 5 ml -1 ) ou com as MVs na presença de 100 nm FX. Após a incubação, a reação foi interrompida a cada 5 min. (células) e a cada 10 min. (MVs) (5-20 min.) com 50 mm de Tris HCl, 150 mm NaCl, 10 mm de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 1 mg ml -1 de polietilenoglicol (PEG) 6000, ph 7,5 (tampão Tris-EDTA ou tampão de parada) e acrescida de 50 µl do peptídeo sintético S µM (substrato cromogênico para FXa) preparado em tampão Tris-EDTA. A absorbância a 405 nm foi lida a 37ºC, por 10 min., a intervalos de 6 s, através de um leitor de microplacas Thermomax Microplate Reader (Molecular Devices). Velocidades (mod /min) obtidas nos primeiros minutos de reação foram utilizadas para calcular a concentração de Fxa formado.

42 ENSAIO DE ATIVAÇÃO DA PROTROMBINA A ativação da protrombina pelo complexo protrombinase (fator Xa/fator Va) foi realizada em tampão HEPES-BSA. Fator Xa (10pM, concentração final) foi incubado com Fva (1 nm, concentração final), na presença das células (5 x 10 5 ml -1 ) ou das MVs, por 2 min. a 37ºC. A reação foi então iniciada pela adição de protrombina (500 nm, concentração final), e alíquotas de 10 µl foram removidas a cada 1 min. e adicionadas a poços de microplaca contendo 40 µl de tampão Tris- EDTA. Após a adição de 50 µl do peptídeo sintético S µm (substrato cromogênico para trombina preparado em tampão Tris-EDTA Chromogenix), a absorbância a 405 nm foi lida a 37ºC, por 20 min., a intervalos de 6 s, através de um leitor de microplacas Thermomax Microplate Reader (Molecular Devices). Velocidades (mod /min) obtidas nos primeiros minutos de reação foram utilizadas para o cálculo da concentração de trombina formada AVALIAÇÃO DA EXPOSIÇÃO DE FOSFATIDILSERINA Para detecção da exposição de PS, células e MVs foram ressuspendidas em 150 mm de NaCl, 5 mm de KCl, 2,5 mm de CaCl 2, 1 mm de MgCl 2 e 10 mm de HEPES, ph 7,3 (tampão de ligação de anexina) e incubadas com 25 µg/ml de anexina V conjugada a fluoresceína (FITC) (Molecular Probes) por 15 min à temperatura ambiente. As amostras foram, então, levadas ao citômetro de fluxo BD FACScalibur (Becton, Dickinson and Company) (total de eventos por amostra), e os dados coletados analisados pelo programa BD CellQuest Pro (Becton, Dickinson and Company).

43 29 5. RESULTADOS 5.1. ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE TF NA MEMBRANA DE CÉLULAS DAS LINHAGENS P7 E ST1 Em primeiro lugar, foi analisada a expressão de RNAm para TF nas linhagens P7 e ST1. Para isso, nós realizamos um PCR quantitativo em tempo real com o objetivo de quantificar essa exposição de fator teciadual pelas duas linhagens analisadas. O resultado mostra uma presença maior de TF na linhagem P7 do que na linhagem ST1 (figura 11). Figura 11 Expressão de RNAm do TF nas linhagens celulares de glioblastoma P7 e ST1. Os níveis de expressão nas células P7 e ST1 foram determinados pelo RT-PCR quantitativo, usando primers específicos para TF. Por meio da análise de Citometria de Fluxo, utilizando um anticorpo monoclonal, demonstramos marcação positiva para o TF na membrana das células P7 e ST1. Como esperado, a quantidade de TF encontrada na linhagem P7 foi 3 vezes maior do que a encontrada na linhagem ST1, como mostrado na figura 12.

44 30 Figura 12 Análise da expressão de TF na membrana de células das linhagens P7 e ST1. Realizada através de ensaios de citometria de fluxo. A linha em verde representa a marcação do TF para linhagem P7 (dmf 148.9), linha azul representa marcação para linhagem ST1 (dmf 39.69), linha rosa e roxa presentam os controles para P7 e ST1 respectivamente ENSAIOS DE FORMAÇÃO DO FXa Para sabermos se o TF presente nas linhagens estudadas é funcional, foi realizado um ensaio enzimático de formação do fator Xa. Como representado pela figura 13, observou-se que, na presença das células P7, houve a ativação do complexo tenase extrínseco e a consequente formação de FXa. Já na presença da linhagem ST1, não foi observada a ativação do zimogênio. Sugerindo, então, que o TF presente nas células ST1 não é funcional. Esse mesmo experimento foi realizado também com as micropartículas e, mais uma vez, obtivemos resultados similares aos encontrados com suas células de origem (figura 14).

45 31 Figura 13 As células de glioblastoma P7 promovem a ativação do FXa através do complexo tenase extrínseco. A ativação de FX (100nM) por FVIIa (1nM) na presença ( ) das células P7 e na presença das células ST1 ( )(concentração de células de céls/ml). Os dados são médias ± EP de três experimentos independentes. Figura 14 MVs derivadas de glioblastoma P7 promovem a ativação do FXa através do complexo tenase extrínseco. A ativação de FX (100nM) por FVIIa (1nM) na presença ( ) das MVs originadas pelas células P7 e na presença das MVs originadas pelas células ST1 ( )(concentração de MVs de MVs/ml). Os dados são médias ± EP de três experimentos independentes.

46 ATIVAÇÃO DA COAGULAÇÃO SANGUÍNEA IN VITRO A fim de determinar se as linhagens celulares P7 e ST1 exibem propriedades pró-coagulantes, foi testado primeiro o efeito destas linhagens no tempo de recalcificação do plasma humano. Como representado na figura 15, aumentando a concentração da linhagem celular P7, o tempo de recalcificação é fortemente diminuído. Já quando observamos o gráfico correspondente a linhagem celular ST1, não há uma mudança significativa. O mesmo foi feito com as microvesículas liberadas por estas linhagens (figura 16) e o resultado foi similar aos de suas células de origem. Figura 15 Ativação da coagulação sanguínea in vitro. Redução do tempo de recalcificação do plasma humano depende da concentração de células quando comparadas ao controle somente com PBS. Foi observada a redução do tempo de coagulação apenas na presença das células P7. As células ST1 não apresentaram a capacidade de reduzir o tempo de recalcificação. Os dados representam a média ± EP de três experimentos independentes.

47 33 Figura 16 Ativação da coagulação sanguínea in vitro com as MVs. Redução do tempo de recalcificação do plasma humano depende da concentração de microvesículas quando comparadas ao controle somente com PBS. Foi observada a redução do tempo de coagulação apenas na presença das MVs liberadas pelas células P7. As microvesículas liberadas pelas células ST1 não apresentaram a capacidade de reduzir o tempo de recalcificação significativamente. Os dados representam a média ± EP de três experimentos independentes AVALIAÇÃO DA EXPOSIÇÃO DE FOSFATIDILSERINA A montagem tanto dos complexos tenase intrínseco e protrombinase é suportado pela presença de fosfatidilserina (PS) na membrana externa das células tais como nas plaquetas ativadas. Portanto, a presença de PS nas linhagens celulares P7 e ST1 foi demonstrado por ensaios de citometria de fluxo usando anticorpos anti-ps específicos (figura 17). Isto indica que as células P7 normalmente expõem PS na sua superfície, o que contribui para sua atividade pró-coagulante.

48 34 Figura 17 Análise da exposição de fosfatidilserina na membrana de células das linhagens P7 e ST1. A linha azul (P7) e linha verde (ST1) representa a fluorescência na presença de anexina V-FITC e negativo para iodeto de propídio. A linha preta e rosa representa o controle na ausência de anexina V-FITC para as respectivas linhagens analisadas AVALIAÇÃO DA ATIVAÇÃO DA PROTROMBINA A capacidade das células P7 e ST1 para ativar protrombina na presença de FXa e seu cofator, FVa, é avaliada na figura 18, a qual mostra que sob estas condições uma formação extremamente rápida de trombina foi observada com as células P7, mas não foi observada com as células ST1. A ativação do zimogênio foi diretamente correlacionada com a concentração do cofator.

49 Figura 18 As células de glioblastoma P7 e ST1 promovem a formação de trombina através do complexo protrombinase. A ativação de protrombina humana (0,5 nm) por Fator Xa (10 pm) e Fator Va (1nM) foi realizada na presença das células P7 ( ) ou na presença das células ST1( ). A formação de trombina foi determinada adicionando-se o substrato cromogênico S-2238 (2mM) (Chromogenix, Mölndal, Suécia), e a densidade ótica medida a 405nm em um leitor de Elisa. As velocidades (mod/min) obtidas nos primeiros minutos da reação foram usadas para calcular a quantidade de trombina formada. Os dados são médias ± DP de quatro experimentos independentes. 35