Maturação in vitro de oócitos de cadelas domésticas: efeitos na qualidade oocitária e presença espermática na maturação in vitro

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1 RPCV (2007) 102 ( ) R E V I S T A P O R T U G U E S A DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Maturação in vitro de oócitos de cadelas domésticas: efeitos na qualidade oocitária e presença espermática na maturação in vitro Bitch oocytes in vitro maturation: effects of oocyte quality and spermatozoa in in vitro maturation A. A. Rocha*, R. Bastos, I. C. N. Cunha, C. R. Quirino Universidade estadual do Norte Fluminense, Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias, Laboratório de Reprodução e Melhoramento Genético Animal Av. Alberto Lamego, 2000 Horto, Campos dos Goytacazes, Brasil CEP.: Resumo: Na aplicação das biotecnologias reprodutivas em canídeos, os oócitos recuperados de folículos ováricos das fêmeas representam uma fonte importante de estudos que envolvem o desenvolvimento dos gametas femininos in vitro. Porém os resultados obtidos nas técnicas de maturação in vitro (MIV) para espécie canina, por exemplo, são muito inferiores se comparados com os de outros mamíferos domésticos. Nesta espécie o mecanismo de maturação pré-ovulatória ocorre de forma diferente exigindo que após a ovulação os oócitos permaneçam ainda de 2 a 5 dias completando a maturação nos oviductos. De acordo com a fisiologia reprodutiva da fêmea durante este período já se observa a aceitação da cópula com o macho, o que permite o contacto dos oócitos já ovulados com os espermatozóides. O objetivo deste estudo foi verificar a influência da fase do ciclo éstrico, da idade e do índice de condição corporal de cadelas domésticas na qualidade oocitária, e avaliar a influência da presença de espermatozóides caninos durante o processo de MIV. Os resultados obtidos neste estudo demonstram a existência de uma influência significava da idade da fêmea, tendo-se verificado que quanto mais velha for a cadela, menor é o número de oócitos de melhor qualidade obtidos. Dados semelhantes foram verificados com cadelas com baixo índice de condição corporal em que se observaram taxas de oócitos degenerados também elevadas. Em relação à presença de espermatozóides caninos no processo de MIV, verificou-se que o contato espermatozóide-oócito eleva significantemente o índice de MIV. Palavras-chave: oócito, cadela maturação in vitro, espermatozóide Summary: Oocytes recovered from ovarian folicules represent important studies for in vitro gametes development. In canids, studies with reproductive biotechnologies are increasing, however studies from in vitro maturation (IVM) of canine oocytes are poor if compared with other domestic mammals. The mechanisms for canine oocyte maturation are different. After ovulation oocytes still remain 2-5 days completing the *Correspondência: amanda@uenf.br/rocha_aa@yahoo.com.br Tel: ; maturation. In this period the female reproductive physiology allows acceptance of males and matting occurs, and the occytes stay in contact whit spermatozoa in the uterine tube. The aim of this study was to investigate the effect of female age, estrous cycle and body codition on quantity and quality of oocyte; and the influence of interactions between canine spermatozoa and oocyte during the IVM process. Results showed significant influence of age with older bitches obtaining lower number of oocytes with good quality. Similar results were obtained in relation the females with low body condition, whith higher rates of degenerate oocytes. In relation the presence of canine spermatozoa in the IVM, it was verified that the contact spermatozoa-oocyte raises the IVM significantly. Keywords: Oocyte, bitch, in vitro maturation, spermatozoa Introdução Na aplicação das biotecnologias reprodutivas em canídeos, os oócitos recuperados de folículos ováricos das fêmeas representam fonte importante de estudos que envolvem o desenvolvimento dos gametas femininos in vitro. Porém os resultados verificados nas técnicas de maturação in vitro (MIV) para espécie canina, por exemplo, são muito inferiores se comparados com outros mamíferos domésticos. Em cadelas e raposas, o mecanismo de maturação pré-ovulatória acontece de forma diferente se comparados com outras espécies de mamíferos. Nestas fêmeas a ovulação ocorre de 1 a 2 dias após o pico pré-ovulatório de LH, ainda no início da fase de estro, e os folículos ováricos iniciam sua luteinização antes mesmo da ovulação, além disso, estes oócitos são ovulados ainda imaturos, no início da primeira divisão meiótica (MI) e logo após a ovulação ocorre a quebra da vesícula germinativa. Desta forma após a ovulação os oócitos requerem ainda de 2 a 5 dias para completar a maturação (Otoi et al., 2000). Fisiologicamente, no momento da ovulação, a fêmea destas espécies já se encontra aceitando a monta do 267

2 Rocha AA et al. RPCV (2007) 102 ( ) macho, fazendo com que seus oócitos imaturos permaneçam em contato com espermatozóides por longos períodos no trato genital (Yamada et al., 1992). A maturação in vitro (MIV) de oócitos retoma a esperança de preservação de espécies em extinção, porém resultados satisfatórios nem sempre são verificados quando trata-se de MIV em oócitos de cadelas. Vários motivos podem influenciar em bons índices de MIV, entre eles a qualidade oocitária parece possuir grande impacto (Hewitt e England, 1997b). Para a espécie canina não se sabe ainda ao certo, quais os motivos que podem levar a dadora, a apresentar quantidade maior ou menor de oócitos e índices diferentes de qualidade oocitária. Os aspectos mais discutidos até o momento referem a idade da cadela dadora e da fase do ciclo éstrico em que esta se encontra (Nickson et al., 1993; Yamada et al., 1993; Hay et al., 1997; Rodrigues et al., 2003). Estudos em cães podem servir como modelo experimental próximo ao ideal para o desenvolvimento da reprodução assistida em canídeos, contribuindo para preservação de espécies em extinção (Bolamba et al., 1998). Porém a baixa competência meiótica de oócitos cultivados in vitro ainda é um obstáculo para a fertilização in vitro e consequentemente desenvolvimento embrionário nos programas de recuperação genética. Por este motivo, este estudo buscou verificar se a idade, a fase do ciclo éstrico e estado nutricional da fêmea dadora de ovários possui efeito na quantidade e qualidade oocitária, bem como determinar se existe influencia da presença de espermatozóides em diferentes etapas do processo de MIV de oócitos. Material e métodos Avaliação das cadelas Foram utilizadas 107 cadelas dadoras de ovários, com idades variando de 6 meses a 16 anos, provenientes da rotina de ovariohisterectomia (OSH) do Centro de Controle de Zoonoses (CCZ) do município de Campos dos Goytacazes RJ, Brasil e do Hospital Veterinário da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF RJ, Brasil). A avaliação de todas as cadelas utilizadas foi feita antes do procedimento de OSH, através de exame clínico e anamnese com o proprietário do animal. Avaliação da fase do ciclo éstrico das fêmeas As cadelas passaram por exame clínico com inspeção da região vulvar e perineal, seguido de recolha de material para realização de citologias vaginais para estadiamento do ciclo (Johnston et al., 2001). Após a cirurgia, a avaliação da superfície ovariana permitiu a confirmação da determinação da fase do ciclo. Neste estudo, os animais foram divididos em dois grupos: animais em atividade reprodutiva (pro-estro, estro e diestro) e animais em repouso reprodutivo (anestro). Avaliação da idade dos animais Todas as cadelas foram avaliadas quanto à idade, tendo sido feita pela inspeção da dentição formada no momento da recolha (erupção, desgaste e perda dentária). Neste estudo utilizou-se os padrões descritos por Román (1999). As fêmeas avaliadas foram divididas em 3 grupos: cadelas pré-púberes (entre 6 meses e 1,5 anos), cadelas maturas (entre 1,5 e 8 anos), cadelas com mais de 8 anos. Avaliação do estado nutricional (índice corporal) A análise do índice corporal foi baseado no sistema de avaliação da condição corporal da Nestlé PURINA (Laflamme, 1997; Mawby et al., 2001; Kealy, 2002). Por este sistema os animais foram subdivididos em três grupos: cadelas magras, regulares e obesas. Preparação dos meios de cultura e procedimento de maturação A preparação dos meios de lavagem dos oócitos, bem como os meios de maturação foram preparados diariamente em material estéreis e em capela de fluxo laminar. O fluido foi mantido em tubos cônicos, em estufa a 38,5 ºC em atmosfera de 5% CO 2 em ar, para equilíbrio até o momento de utilização. Os meios de manipulação dos oócitos foram preparados com TCM-199 (sem heppes) acrescido de 10% de soro fetal bovino (SFB), e equilibrados em ph 7,5. Os meios de maturação seguiaram protocolo de TCM 199, acrescido de 10% de soro de cadela em estro, e penicilina e estreptomicina, equilibrados em ph 7,6. O soro de cadela em estro foi previamente coletado e armazenado em microtubos para congelação. Todo o material foi previamente equilibrado em estufa a 38,5 ºC em atmosfera de 5% CO 2 em ar, pelo menos por 2 horas antes da utilização. As culturas foram realizadas em placas plásticas de cultura celular, com 4 gotas de 100 µl do meio de maturação cobertas por óleo mineral Sigma, em cada gota eram tratados de 15 a 20 oócitos. Obtenção e classificação dos oócitos Os ovários recolhidos das cadelas foram levados ao Laboratório de Reprodução e Melhoramento Genético Animal (LRMGA/UENF) e o início do processamento do material ocorreu em no máximo 3 horas do término da cirurgia. O par de ovários de cada fêmea separadamente foi fatiado e escarificado com lâminas de bisturi, o fluido obtido foi avaliado em estéreo-microscópico em aumento de 20 a 40X, dentro de fluxo laminar. Os oócitos foram classificados em grau I, grau II e degenerados conforme descrição de Hewitt e England 268

3 Rocha AA et al. RPCV (2007) 102 ( ) (1997a). Para cada cadela, todos os oócitos obtidos foram contados e classificados em cada um dos grupos. Maturação in vitro dos oócitos Os oócitos classificados em grau I foram selecionados para o processo de MIV por 72 horas e/ou co-incubação com espermatozóides, de acordo com o grupo de tratamento. Durante este período, os oócitos foram mantidos em gotas de meio de maturação suplementados com hormonas (TCM + FSH + LH + antibióticos), em estufa a 38,5 ºC em atmosfera de 5% CO 2 em ar. Os oócitos de grupos tratados foram submetidos a meio de fecundação (Talp Fec) durante a co-incubação com espermatozóides. Seleção do doador e preparação do sêmen Foi utilizado um único doador de sêmen, um cão da raça Bull Terrier de 2 anos, em boas condições de saúde. O sêmen foi recolhido por massagem peniana e mostrou-se dentro de excelentes padrões quanto a motilidade, vigor, concentração e patologias espermáticas, segundo o Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (1996). Os espermatozóides viáveis foram selecionados pela técnica de gradiente de centrifugação com Percoll, ajustando a concentração espermática a 10 6 espermatozóides/ml. Determinação da MIV (avaliação da configuração nuclear) Durante a avaliação foram considerados maturados todos os oócitos que se apresentaram em metáfase II (MII) com cromossomos visivelmente condensados. Os oócitos em fases anteriores a MII ou sem identificação de material nuclear foram considerados imaturos e degenerados respectivamente (Hewitt e England, 1997a). Para determinar se houve maturação, os oócitos tratados foram corado por iodeto de propídeo e verificados em microscópio de fluorescência (aumento de 40X, filtro excitador 510, posição G 247). Delineamento experimental Experiência I Influência da idade, da fase do ciclo éstrico e do estado nutricional das fêmeas dadoras de ovários, na quantidade e qualidade dos oócitos obtidos. Nesta etapa, cada par de ovários proveniente de dadoras, foi processado separadamente para que os oócitos pudessem ser contados e avaliados. Os oócitos foram separados em três grupos (GI, GII e degenerados). Experiência II Influência de diferentes tempos de co-incubação entre o espermatozóide e oócito, na indução da maturação in vitro de oócitos de cadelas. Esta etapa propôs verificar a influência da presença de espermatozóides caninos durante o período de maturação in vitro de oócitos de cadelas. Para isto, quatro tratamentos foram propostos: Grupo controle - oócitos cultivados em meios de MIV, por 72 horas. Grupo spz 48h oócitos maturados por 48 horas, e incubados por 24 horas com espermatozóides caninos. Grupo spz 24h oócitos maturados por 24 horas e incubados por mais 24 horas com espermatozóides caninos e retornaram o cultivo por mais 24 horas em meio de MIV. Grupo spz 0h oócitos imaturos foram incubados por 24 horas com espermatozóides caninos em meio de FIV, e após este período passaram por 48 horas de MIV. Todos os tratamentos completaram 72 horas de MIV. O esquema a seguir demonstra o delineamento proposto (Figura 1). Analise estatística Após a análise preliminar, onde foi realizada a análise descritiva, os dados foram submetidos a análise de variância (ANOVA) e as médias foram comparadas pelo teste T com 5% de significância. Resultados e discussão Experiência I Idade das cadelas dadoras de ovários. A ANOVA mostrou que não houve diferença estatística entre os efeitos analisados (P>0,05). As cadelas pré-púberes, maduras e com mais de 8 anos obtiveram em média a mesma quantidade de oócitos. Porém em relação a qualidade oocitária verificou-se diferença estatística entre os grupos (P<0,05). A Tabela 1 apresenta as médias e desvios-padrão para o número total de oócitos. Grupos 0 h 24 h 48 h 72 h Controle MIV MIV MIV avaliação Sptz 48 MIV MIV sptz-oócito avaliação Sptz 24 MIV sptz-oócito MIV avaliação Sptz 0 sptz-oócito MIV MIV avaliação Figura 1 - Delineamento experimental da Experiência II 269

4 Rocha AA et al. RPCV (2007) 102 ( ) Os dados descritos na tabela mostram que com o aumento da faixa etária ocorre diminuição na qualidade das estruturas analisadas. Estes estudos concordam com os apresentados por Rocha et al. (2004) que relatou que a média de oócitos de melhor qualidade foi significantemente menor em cadelas idosas. Estes dados sugerem que deficiências na regulação dos eixos de estímulo hormonal, bem como a capacidade de fertilização oocitária in vivo estariam relacionadas com a idade avançada das fêmeas. Fase do ciclo éstrico das cadelas dadoras de ovários. A ANOVA não mostrou diferença significativa em nenhum dos grupos (P>0,05). O número total de oócitos apresentou médias semelhantes tanto para cadelas em e atividade reprodutiva, como para as que estavam em repouso reprodutivo. O mesmo resultado foi verificado em relação a qualidade oocitária nos dois estados reprodutivos. A Tabela 2 mostra os resultados visualizados para a característica efeito do ciclo éstrico na quantidade e qualidade oocitária. Índice corporal das cadelas dadoras de ovários. Foi possível observar influência significativa entre a condição corporal as cadelas ováriohisterectomizadas na qualidade dos oócitos obtidos dos folículos ováricos (P<0,05). Para as quatro avaliações realizadas (número total de oócitos, número de oócitos GI, GII e degenerados) o resultado estatístico foi semelhante. Observou-se que os animais que estavam magros apresentaram redução no número total de oócitos. Em relação à qualidade destes oócitos, em todas as classes analisadas, as fêmeas magras apresentaram diminuição da qualidade das estruturas, com redução no número de oócitos GI e GII (P<0,05), ao comparar com cadelas de índice corporal regular ou obesas (Tabela 3). Pelo fato de poucas hipóteses terem sido avaliadas sobre este aspecto, sugere-se que os diferentes estados nutricionais das fêmeas acarretam grande variação na concentração plasmática de leptina. A leptina é um hormônio secretado pelo tecido adiposo sendo crucial em diversos processos fisiológicos, principalmente o Tabela 1 - Médias e desvios-padrão para número total de oócitos, oócitos de grau I, grau II e degenerados obtidos de ovários de cadelas em diferentes faixas etárias Médias e desvio-padrão das diferentes classes de oócitos Faixa Etária Total de oócitos Oócitos de Grau I Oócitos de Grau II Oócitos degenerados Pré-púberes 59,1 + 16,0 a 16,2 + 7,6 a 17,5 + 4,2 a 25,4 + 9,0 a (n=11) Maturas 57,3 + 22,8 a 15,5+10,1 ab 18,6 + 9,6 ab 22,9 + 8,0 ab (n=38) Com mais de 8 anos 54,6 + 15,6 a 11,5 + 5,7 b 16,1 + 6,6 a 27,1 + 7,4 a (n=58) A avaliação deve ser seguida em colunas, onde letras diferentes determinam que houve variação estatística entre os dados analisados (P<0,05). Tabela 2 - Médias e desvios-padrão para número total de oócitos, oócitos GI, GII e degenerados obtidos de ovários de cadelas em estação reprodutivo e repouso reprodutivo Médias e desvio-padrão das diferentes classes de oócitos Fase do ciclo éstrico Total de oócitos Oócitos de Grau I Oócitos de Grau II Oócitos degenerado Repouso reprodutivo 55,0 +18,1 a 13,4 + 8,0 a 17,0 + 7,6 a 24,8 + 7,9 a (n=69) Atividade reprodutiva 57,7 + 9,0 a 13,5 + 8,7 a 17,4 + 7,7 a 26,5 + 8,0 a (n=38) A avaliação deve ser seguida em colunas, onde letras diferentes determinam que houve variação estatística entre os dados analisados (P<0,05). Tabela 3 - Médias e desvios-padrão para número total de oócitos, oócitos de grau I, grau II e degenerados obtidos de ovários de cadelas em diferentes estados nutricionais Médias e desvio-padrão das diferentes classes de oócitos Score corporal Total de oócitos Oócitos de Grau I Oócitos de Grau II Oócitos degenerado Magras 40,5 + 2,8 a 7,7 + 3,8 a 11,1 + 4,7 a 21,7 + 7,9 a (n=39) Regular 65,8+16,6 b 17,8 + 9,1 b 21,2 + 7,5 b 26,7 + 7,5 b (n=51) Obesas 62,1 + 7,9 b 13,4 + 3,7 b 18,6 + 3,6 b 30,1 + 5,7 b (n=17) A avaliação deve ser seguida em colunas, onde letras diferentes determinam que houve variação estatística entre os dados analisados (P<0,05). 270

5 Rocha AA et al. RPCV (2007) 102 ( ) reprodutivo (Zhang et al., 1994; Mantzoros, 2000). Desta forma os animais em estado de sub-alimentação, bem como em sobre-alimentação (obesas) apresentam respectivamente deficiência e abundância deste hormônio (Stergios Moschos et al., 2002). Lebrethon et al. (2000) determinaram que a elevação na concentração plasmática de leptina acelera a freqüência dos pulsos do GnRH. Sendo que diretamente este fato irá estimular a secreção do FSH e LH. Estes dois últimos hormônios, por sua vez, possuem grande importância no desenvolvimento oocitário intra-folicular, atuando diretamente na qualidade da célula oocitária (Hafez, 1995; Figueiredo et al., 2002). Em tal estudo não foram avaliadas as concentrações plasmáticas da hormona leptina, porém os dados observados podem sugerir o fato de cadelas em condição corporal ideal ou sobre-alimentadas, logo, com maior quantidade de tecido adiposo e possivelmente maior concentração plasmática de leptina, apresentarem maior número de oócitos, associado a elevação direta da qualidade destas estruturas. Experiência II A ANOVA realizada neste trabalho determinou que os grupos tratados, consequentemente que sofreram influência da presença de espermatozóides durante algum momento do processo de maturação, atingiram taxas maiores de MIV, se comparados com o grupo controle, o qual não passou por co-incubação espermática (P<0,05). Neste experiência foram utilizados 748 oócitos, provenientes de 82 cadelas em idade matura, condição corporal regular e em anestro, divididos nos seguintes grupos: 178 (grupo controle), 196 (grupo SPZ 48), 203 (grupo SPZ 24) e 171 (grupo SPZ 0) de forma aleatória a 38,5 ºC em atmosfera de 5% CO 2 em ar. Sendo que apenas os oócitos que atingiram MII foram considerados maturados. A Tabela 4 mostra as médias e desvios encontrados em cada grupo de tratamento e cada situação de divisão meiótica (oócitos maturos e imaturos). O desenvolvimento oocitário canino, in vivo e in vitro, ainda não foi totalmente estudado, muito pouco se sabe sobre a fisiologia deste processo. Porém, os resultados deste estudo comprovam a possibilidade da presença de espermatozóides caninos induzir a retomada da meiose, atingindo assim a maturação oocitária in vitro. Saint-Dizier et al. (2001), mostraram que a penetração espermática in vitro induz o término da maturação oocitária atingindo consequentemente fase de metáfase II, sendo que 10% de MII já foi verificada versus 2,1% em oócitos controle sem presença de espermatozóides. Algumas espécies de mamíferos já estudados apresentam duas hipóteses que podem auxiliar na discussão destes resultados. Eppig (2001) verificou que em oócitos de murganhos a forte união das células do cumulus realiza efeito inibitório no processo de maturação, sendo este efeito revertido no momento em que se inicia a expansão da camada de células do cumulus. Por outro lado, Hay (1996) cita que vários autores descreveram o fato da interação entre espermatozóides e a zona pelúcida dos oócitos estimular a síntese do fator promotor da maturação (MPF) no citoplasma oocitário. Estes estudos foram realizados em bovinos (Hay, 1996). Desta forma, o resultado deste estudo leva a crer que o contato do espermatozóide canino estimule a retomada da meiose, induzindo a separação das células do cumulus e consequentemente a maturação in vitro. Durante o processo de fertilização oocitária, em situação in vivo ou in vitro, como verificada neste estudo, o espermatozóide canino necessita ultrapassar a barreira fisiológica formada pela compactação das células do cumullus ao redor do oócito. A expansão desta camada induzida pela passagem do espermatozóide, seja por ação enzimática das reações acrossomais ou mecânicas, concorda com estudos já citados de Eppig (2001), que verificou esta ação em murganhos. Este fato sugere que a ativação do processo de maturação possivelmente seja influenciada pela presença espermática em oócitos caninos, devido a ação de expansão das células do cumulus. Tabela 4 - Médias reais e desvios-padrão para número de oócitos degenerados ou não identificados, imaturos e maturos (MII) nos grupos controle e tratados com espermatozóides Médias e desvio-padrão das diferentes classes de oócitos Tratamento % degenerados % oócitos em diferentes estádios de MIV Não identificados Imaturos Maturos (MII) Controle 30, ,02 a 64, ,91 a 4,91 + 4,76 a (n=178) SPZ 48 18, ,97 b 55, ,71 a 26, ,57 b (n=196) SPZ 24 15,51 + 6,70 b 60, ,87 a 24, ,27 b (n=203) SPZ 0 20,58 + 8,77 b 59, ,06 a 19, ,89 b (n=171) A avaliação deve ser seguida em colunas, onde letras diferentes determinam que houve variação estatística entre os dados analisados (P<0,05). 271

6 Rocha AA et al. RPCV (2007) 102 ( ) Além disso, a idéia de que o amadurecimento do núcleo da célula espermática esteja relacionado com a elevação da concentração de MPF dentro do ooplasma, também concorda com os resultados obtidos, indicando que a interação estimulada pelo espermatozóide de cão pode controlar fatores citoplasmáticos dos gametas femininos. Mesmo sem as mensurações das concentrações de MPF intra-oocitária, a concordância dos fatos sugere que como verificado na espécie bovina (Hay, 1996), em cães o contato entre células do cumulus e espermatozóide também possa elevar as taxas de maturação na espécie. Para confirmação de tal fato porém, são necessários maiores estudos que determinem as concentrações dos fatores que promovem a maturação e sua ocorrência e aumento em células imaturas que permanecem na presença de espermatozóides. Os valores médios obtidos para a MIV dos oócitos na forma convencional (apenas em meios de cultivo suplementados) foram de 4,9% em média. Esta taxa é bastante semelhante com o que boa parte da literatura descreve (Hay, 1996; Hewitt e England, 1998a; Hewitt e England, 1998b; Vannucchi, 2003). Sabe-se também que mesmo com os resultados obtidos nos grupos tratados (em média 23,5% de MIV), este estudo encontra-se bastante distantes do sucesso que a técnica apresenta em outras espécies. Porém, para espécie canina este resultado pode ser considerado como um grande avanço na biotecnologia aplicada a reprodução de carnívoros. Conclusão Os resultados obtidos neste estudo permite concluir que a elevação das taxas de MIV de oócitos de cadelas domésticas, é possível com adequação da técnica, onde oócitos ainda imaturos podem ser incubados com espermatozóides caninos, sendo que, este fato eleva significantemente as taxas de maturação in vitro. Além disso, a idade das cadelas dadoras de ovários, bem como a condição corporal em que esta fêmea se encontra, influencia na quantidade de oócitos de melhor qualidade, conferindo maior índice de oócitos viáveis para técnica de MIV. Bibliografia Bolamba D, Borden-Russ KD, Durrant BS (1998). In vitro maturation of domestic dogs oocytes culture in advanced preantral and early antral follicles. Theriogenology, 49: Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (1996). Manual para exame andrológico e avaliação de sêmen animal. 2ª edição Belo Horizonte, 49. Eppig JJ (2001). Oocyte control of ovarian follicular development and function in mammals. Reproduction, 122: Figueiredo JR, Rodrigues APR, Amorim CA (2002). Manipulação de oócitos inclusos em folículos ováricos pré-antrais - Moifopa. In: Gonçalves PBD, Figueiredo JR, Freitas VJF Biotécnicas aplicadas à reprodução animal. São Paulo, Varela: Hafez ESE (1995). Hormônios, fatores de crescimento e reprodução. In: Hafez, E.S.E. Reprodução animal. 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9 RPCV (2007) 102 ( ) R E V I S T A P O R T U G U E S A DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Perfil de susceptibilidade a antibióticos de agentes etiológicos de mastite subclínica bovina em Portugal Antimicrobial susceptibility traits of subclinical bovine mastitis pathogens in Portugal Sandro F. Nunes*, Lina M. Cavaco, Cristina L. Vilela e Ricardo Bexiga Centro Interdisciplinar de Investigação em Sanidade Animal (CIISA), Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa (TULisbon). Avenida da Universidade Técnica, Lisboa Resumo: A mastite bovina permanece a razão mais frequente para a utilização de antibióticos nas explorações leiteiras. A escolha do fármaco a administrar é geralmente empírica, baseada na sua disponibilidade para administração intramamária e reflete a experiência adquirida do Médico Veterinário. Informação relativa às susceptibilidades dos microrganismos isolados em diferentes regiões geográficas assume uma crescente importância. Este trabalho visou a avaliação da susceptibilidade a 12 fármacos, por difusão em disco, de 234 isolados contagiosos e ambientais de mastite subclínica, obtidos em explorações da zona centro de Portugal, no período compreendido entre 2000 e Os fármacos testados foram: penicilina, ampicilina, amoxicilina/ácido clavulânico, cefazolina, cefoperazona, cefquinoma, aminosidina, estreptomicina, gentamicina, sulfametoxazole/trimetoprima, rifaximina e colistina. No total dos isolados testados, cefazolina (91,0%) e a associação amoxicilina/ácido clavulânico (90,2%) revelaram a maior eficácia in vitro. As cefalosporinas constituíram o grupo de fármacos com os melhores resultados, inclusivamente contra microrganismos Gram negativos. Níveis elevados de resistência in vitro a penicilina e ampicilina foram observados para microrganismos Gram positivos, particularmente face a Staphilococcus aureus e Streptococcus agalactiae. De uma forma global, o maior número resistências encontrado neste estudo, em comparação com outros países, poderá ser reflexo da pressão selectiva sobre estirpes resistentes devidas a antibioterapias mal direccionadas. Summary: Bovine mastitis remains the main reason for antibiotic use in dairy farms. Antimicrobial drug selection is usually empirical, based on the drug availability for intramammary administration and reflects the previous experience of the Veterinarian. Information regarding susceptibility of the microrganisms isolated in different geographic regions has become of major importance. The present work aimed at assessing the susceptibility to 12, through disc diffusion, drugs of 234 contagious and environmental mastitis pathogens from subclinical mastitis cases, isolated in dairy farms from the central region of Portugal, from 2000 to The drugs tested were: penicillin, ampicillin, amoxicillin/clavulanic acid, *Correspondência: amsandronunes@fmv.utl.pt Tel: , ext. 1263; Fax: cefazolin, cefoperazone, cefquinome, aminosidine, streptomycin, gentamycin, sulfamethoxazole/trimethoprim, rifaximin and colistin. Overall, cefazolin (91.0%) and the association amoxicillin/clavulanate (90.2%) revealed higher in vitro efficacy. Cephalosporins were the antimicrobial group showing better results, including Gram negative microrganisms. High levels of in vitro resistance to penicillin and ampicillin were found for Gram positive pathogens, especially against Staphilococcus aureus and Streptococcus agalactiae. Globally, the high number of resistances found in this study, when compared to other countries, may reflect the selective pressure on resistant strains due to misguided antibiotherapies. Introdução A mastite permanece como a patologia de maior impacto económico nas explorações de bovinos leiteiros. A forma subclínica de infecção, apesar de menos evidente para o produtor do que a clínica, é a que mais afecta o rendimento económico da produção de leite. O impacto das mastites subclínicas deriva da diminuição do nível de produção e qualidade do leite, particularmente por aumento do número de células somáticas, constituindo igualmente a razão mais frequente para a administração de antibióticos em bovinos leiteiros (Hillerton e Berry, 2005). Questões de saúde pública, principalmente as relacionadas com a presença de resíduos e a disseminação de resistências bacterianas aos antibióticos, determinaram recomendações para uma redução gradual da utilização de antibióticos em medicina veterinária (WHO, 2001). A identificação dos agentes etiológicos de qualquer infecção e a avaliação do seu perfil de sensibilidade a fármacos antimicrobianos torna-se assim essencial para a adequada selecção da antibioterapia a instituir (Gentilini et al., 2002). No entanto, e no caso específico de mastite, este procedimento nem sempre é passível de ser adoptado pelo clínico assistente da exploração, sobretudo pela 275

10 Nunes SF et al. RPCV (2007) 102 ( ) morosidade associada ao processo. É frequente a decisão de antibioterapia imediatamente após a detecção de infecção clínica, bem como a administração de antibióticos de forma preventiva, aquando do período de secagem dos animais. A escolha sobre o fármaco a utilizar é geralmente tomada de forma empírica, com base na experiência prévia adquirida do clínico e nos resultados de estudos realizados em outros países. A disponibilidade dos fármacos de novas gerações, com um maior amplo espectro de acção, surge como uma alternativa fácil, associada a uma maior probabilidade de sucesso terapêutico. No entanto, a selecção de estirpes com resistências a antibióticos é um processo rápido, pelo que a utilização deste tipo de fármacos não deverá ser considerado para uma primeira escolha terapêutica. Existem, em vários países Europeus, recomendações fundamentadas para a primeira e segunda escolhas do princípio activo a utilizar em terapêutica de mastites (Vaarst et al., 2002). No entanto, a extrapolação de informação obtida em outros países, com práticas clínicas e de maneio diferentes, deverá ser cautelosamente considerada. É assim essencial o conhecimento de quais os principais agentes etiológicos de mastite em Portugal e do seu perfil de susceptibilidade aos fármacos antimastíticos. O presente trabalho visou avaliar o perfil de susceptibilidade de isolados de mastites subclínicas, obtidos em 12 explorações do centro de Portugal entre 2000 e 2003, face aos fármacos disponíveis no mercado nacional para terapêutica de mastites. Material e métodos Isolados bacterianos Um total de 234 isolados de mastite subclínica bovina foi incluído neste estudo, agrupado de acordo com a epidemiologia da infecção: microrganismos de natureza contagiosa (35 Staphylococcus aureus, 61 Streptococcus agalactiae, 9 Streptococcus dysgalactiae) e ambiental (68 Staphylococcus coagulase-negativos SCN, 51 Streptococcus spp. e 10 bacilos Gram negativos). Os isolados estudados, obtidos de amostras de leite de quartos com mastite subclínica detectada através do Teste Californiano de Mastites ( +++ ), foram recolhidos em 12 explorações comerciais leiteiras do Ribatejo-Oeste durante o período de 2000 a 2003 (Bexiga et al., 2005). Após isolamento e identificação bioquímica (API System, BioMérieux), procedeu-se à sua preservação a -70 ºC. Fármacos Os fármacos testados foram: amoxicilina/ácido clavulânico 30 µg (AMC), ampicilina 10 µg (AMP) cefazolina 30 µg (KZ), cefoperazona 75 µg (CFP), cefquinoma 10 µg (CEQ), estreptomicina 10 µg (S), gentamicina 10 µg (CN), penicilina 10 U (P) e sulfametoxazole/trimetoprima 25 µg (SXT) produzidos pela Oxoid e cedidos pela Intervet/Schering-Plough; colistina 10 µg (CL), fornecidos pela BBL ; rifaximina 40 µg (RAX), produzidos pela Mast Diagnostics e cedidos pela Univete; e aminosidina 60 µg (AN), cedidos pela Ceva Saúde Animal. A escolha dos fármacos teve por base a sua disponibilidade no mercado português, para administração intramamária em bovinos leiteiros. Teste de sensibilidade a antibióticos A susceptibilidade aos diferentes antibióticos foi avaliada pelo método de difusão em disco, de acordo com as normas instituídas pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2002) para testes de susceptibilidade a antibióticos de bactérias de origem veterinária. Cada isolado foi propagado em placas de agar Mueller-Hinton (Oxoid ) ou Mueller- Hinton suplementado com 5% de sangue desfibrinado de carneiro (Biomérieux ) dependendo do seu género. Após aposição dos discos impregnados com os fármacos sobre as placas, estas foram incubadas a 37 ºC durante 24 horas em aerobiose. Os diâmetros dos halos de inibição de crescimento obtidos foram registados e comparados com os limites de sensibilidade definidos para isolados de origem veterinária (CLSI, 2002). Nos casos omissos, foram adoptados os limites de sensibilidade recomendados pelos fabricantes dos discos. Análise estatística Para efeitos de análise estatística os isolados testados que apresentaram um perfil de sensibilidade intermédia foram considerados como resistentes. Diferenças observadas entre perfis de sensibilidade foram avaliadas por Teste de Friedman e Qui-quadrado (α 0,05). A análise dos dados foi elaborada recorrendo ao programa SPSS versão Resultados Os padrões de sensibilidade in vitro dos 234 isolados de natureza contagiosa e ambiental, estabelecidos com base na avaliação dos halos de inibição de crescimento dos 12 princípios activos testados, são apresentados nas tabelas 1 e 2, respectivamente. No total dos isolados testados, cefazolina (91,0%) e a associação amoxicilina/ácido clavulânico (90,2%) apresentam a maior eficácia in vitro, seguidas de cefquinoma (78,3%), cefoperazona (76,5%) e rifaximina (72,2%). Nenhum dos grupos de isolados testados apresentou susceptibilidades significativamente diferentes entre si face a P e AMP. Ambos os princípios activos exibem reduzida eficácia contra Staph. aureus, Strep. agalactiae e SCN (< 40% de isolados sensíveis) e apenas 276

11 Nunes SF et al. RPCV (2007) 102 ( ) isolados de Strep. dysgalatiae e Streptococcus spp. apresentam níveis superiores de sensibilidade. Em oposição, os restantes antibióticos beta-lactâmicos apresentam a maior eficácia, especialmente face a isolados ambientais. A associação AMC apresenta boa eficácia relativamente a todos os isolados particularmente contra bactérias do género Streptococcus. As cefalosporinas constituem o grupo de fármacos com maior eficácia contra os isolados testados, inclusivamente contra Gram negativos. Os aminoglicosídeos AN e CN revelam bons níveis de inibição do crescimento dos isolados testados, com a excepção de Streptococcus spp. Apresentam ainda os melhores resultados relativamente a Gram negativos. Pelo contrário, S apresenta um dos maiores níveis de resistências. A maior eficácia é obtida contra SCN, apenas com 30,9% de isolados sensíveis. SXT e RAX apresentam níveis médios de sensibilidade. SXT apresenta o segundo melhor valor contra Staph. aureus e uma boa eficácia contra microrganismos Gram negativos. RAX apresenta melhores resultados que SXT, face a bactérias Gram positivas, com excepção de Staph. aureus. Cl apresenta, quando considerado o total dos isolados, os níveis mais baixos de sensibilidade, com apenas 9,4% de isolados sensíveis. Considerando apenas os microrganismos Gram negativos, apenas 50% destes é sensível a CL. Discussão A utilização de antibióticos no tratamento de mastite tem-se tornado uma importante fonte de discussão, e por vezes mesmo discórdia, como consequência da crescente preocupação com o uso prudente destes fármacos em animais. Devido à diversidade de agentes etiológicos de mastite, foram desenvolvidas estratégias de controlo baseadas na minimização da exposição do úbere a agentes patogénicos, dos quais se salienta o plano de controlo dos 5 pontos (Neave et al., 1966). Deste plano, fazem parte a utilização e manutenção adequadas das salas de ordenha, a desinfecção dos tetos após a ordenha (post-dip), o tratamento das mastites clínicas durante a lactação, o refugo de animais afectados por mastites crónicas e a antibioterapia de secagem. Contudo, ocorrem invariavelmente novos casos de mastite e o uso de fármacos antimicrobianos assume um papel importante no seu controlo. Em Portugal, Reino Unido e na maioria dos países Europeus, o tratamento da mastite é feito por administração intramamária de fórmulas farmacêuticas contendo um ou mais antibióticos, por vezes associados a corticosteróides. Outras vias de administração são reservadas apenas para o tratamento de mastite clínica severa ou infecções crónicas de Staph. aureus (Serieys et al., 2005). Os países nórdicos possuem recomendações nacionais para um uso controlado destes fármacos, particularmente em casos de mastite bovina. Estas preconizam a administração parenteral de um número muito reduzido de fármacos, preferencialmente penicilina G (Hillerton e Berry, 2005). A vantagem da administração sistémica face à terapêutica local pode ser explicada, em parte, pelo seu efeito colateral em infecções subclínicas eventualmente presentes em outros quartos e pela melhor difusão do fármaco na presença de coágulos ou micro-abcesso que impedem a sua progressão pela via intramamária, diminuindo assim a incidência de novos casos. As decisões terapêuticas são geralmente empíricas e baseiam-se nas experiências anteriores de sucesso no tratamento para a exploração em questão. Raramente o veterinário tem informação sobre a identificação do agente patogénico e respectivo padrão de sensibilidade para o guiar na decisão terapêutica (Owens et al., 1997). Discrepâncias expressivas na prevalência, incidência e antibioresistências dos agentes patogénicos da mastite têm sido identificadas e descritas, limitando uma possível extrapolação dos perfis de susceptibilidade dos agentes contagiosos e ambientais entre os vários países. A prevalência de mastites de origem contagiosa, causadas por Staph. aureus, Strep. agalactiae e Strep. dysgalactiae, permanece elevada em Portugal em comparação com outros países (Myllys et al., 1998; Bradley, 2002; Schlegelova et al., 2002; Bexiga et al., 2005). Mais preocupante ainda é o facto de não se terem verificado alterações expressivas nas espécies e frequência de isolados, em relação aos referidos há mais de 20 anos na mesma área geográfica (Atalaia, 1983; Bexiga et al., 2005). No Reino Unido, verifica-se que as infecções por Strep. agalactiae se encontram controladas e que as causadas por Staph. aureus se encontram em declínio. Pelo contrário, observa-se um aumento de infecções causadas por agentes ambientais, especialmente Gram negativos e Strep. uberis (Bradley, 2002; Hillerton e Berry, 2005). Cenário semelhante verifica-se na Finlândia e França, com tendência para a diminuição de mastites devidas a agentes contagiosos em oposição às causadas por agentes ambientais (Myllys et al., 1998; Guerin- Faublee et al., 2003; Pitkala et al., 2004). De acordo com a maioria dos dados referidos na literatura disponível, não têm ocorrido alterações significativas das susceptibilidades a antibióticos dos agentes patogénicos de mastite. No entanto, são frequentemente referidas diferenças entre os perfis de resistência dos microrganismos, em função da localização geográfica das explorações a partir das quais foram isolados (Owens et al., 1990; Owens et al., 1997; Watts and Salmon, 1997; Myllys et al., 1998; Salmon et al., 1998; De Oliveira et al., 2000; Erskine et al., 2002; Pitkala et al., 2004). Informação sobre 277

12 Nunes SF et al. RPCV (2007) 102 ( ) incidência e prevalência dos agentes patogénicos envolvidos localmente, respectivos perfis de sensibilidade a fármacos antimicrobianos tem-se tornado decisiva na escolha do fármaco a administrar no tratamento e controlo de mastite bovina. Os resultados obtidos neste estudo permitem estabelecer um perfil generalizado das sensibilidades a antibióticos dos isolados obtidos de mastite subclínica bovina da região Ribatejo-Oeste. Entre os fármacos mais utilizados para o controlo de infecções intramamárias bovinas, encontram-se os antibióticos beta-lactâmicos, que se podem considerar divididos em dois grandes sub-grupos: penicilinas e cefalosporinas. Analisando os resultados obtidos face a estes fármacos, verificaram-se diferenças significativas entre a susceptibilidade a penicilinas, P e AMP, e aos restantes fármacos: AMC e cefalosporinas. Estas diferenças poderão ser devidas à produção de beta-lactamases pelos isolados, especialmente do género Staphylococcus, frequente em isolados de mastite (Watts e Salmon, 1997; De Oliveira et al., 2000). A elevada eficácia verificada para a associação amoxicilina e ácido clavulânico, um inibidor de beta-lactamases, contra Staph. aureus e restantes SCN, suporta esta hipótese. Os resultados obtidos no presente estudo diferem da maioria dos dados publicados, que referem para staphylococci isolados de mastite uma baixa resistência a P e AMP (Watts et al., 1995; Owens et al., 1997; Costa et al., 2000; De Oliveira et al., 2000; Gentilini et al., 2000; Erskine et al., 2002). O espectro de acção destes fármacos, dirigido a microrganismos Gram positivos, justifica a sua ineficácia face a isolados Gram negativos. As cefalosporinas são categorizadas em gerações, de acordo com o seu espectro de acção. Neste estudo, foram testados representantes de 3 gerações distintas: KZ representante da 1ª, CFP da 3ª e CEQ da 4ª. Os resultados obtidos mostram uma elevada eficácia de todas elas contra microrganismos Gram positivos e Gram negativos. De realçar que KZ, uma cefalosporina de 1ª geração cujo espectro de acção é direccionado predominantemente para as bactérias Gram positivas, mostrou-se eficaz face a 40% dos isolados Gram negativos. A elevada sensibilidade de Strep. dysgalactiae às cefalosporinas, assim como à maioria dos antibióticos testados com acção para microrganismos Gram positivos, está de acordo com o descrito na literatura (Owens et al., 1990; Owens et al., 1997; Erskine et al., 2002; Rossitto et al., 2002). Os aminoglicosídeos têm como espectro de acção bactérias Gram negativas. Entre os três fármacos testados, o maior número de resistências verificou-se em relação a S, com apenas 10 isolados Gram negativos susceptíveis. Apesar do seu espectro de acção, S revelou-se menos eficaz face a bactérias Gram-negativas do que face a SCN. No entanto, o reduzido número de isolados Gram negativos testados poderá ter originado uma distorção dos resultados, pelo que deverão ser realizados estudos com base numa maior amostragem de microrganismos Gram negativos. AN e CN apresentam eficácia elevada relativamente aos isolados Gram negativos (80%) mas também contra Staph. aureus e SCN, com taxas de sensibilidade próximo ou acima de 70%. Este valor é ligeiramente inferior ao verificado em outros países (Costa et al., 2000; Gentilini et al., 2000; Erskine et al., 2002). Apesar destes bons resultados, AN não está correntemente disponível como preparação intramamária no Tabela 1 - Percentagens de susceptibilidade de agentes contagiosos a ampicilina (AMP), amoxicilina/ácido clavulânico (AMC), penicilina (P), cefazolina (KZ), cefoperazona (CFP), cefquinoma (CEQ), aminosidina (AN), estreptomicina (S), gentamicina (CN), sulfametoxazole/trimetoprima (SXT), rifaximina (RAX) e colistina (CL). % Susceptibilidade Agentes contagiosos Staph. Strep. Strep. Total aureus agalactiae dysgalactiae (n=35) (n=61) (n=9) (n=105) AMP 28,6 34,4 88,9 37,2 P 28,6 21,3 77,8 28,6 AMC 82,9 98, ,4 KZ 94,3 96, ,2 CFP 37,1 88, ,5 CEQ 80,0 74, ,3 AN 71,4 8,2 44,5 32,4 S 5,7 1,6 0 2,8 CN 71,4 6,6 33,4 30,5 SXT 91,4 35,5 66,7 56,8 RAX 77,1 54,1 77,8 63,8 CL 0 3,2 11,1 2,8 Tabela 2 - Percentagens de susceptibilidade de agentes ambientais a ampicilina (AMP), amoxicilina/ácido clavulânico (AMC), penicilina (P), cefazolina (KZ), cefoperazona (CFP), cefquinoma (CEQ), aminosidina (AN), estreptomicina (S), gentamicina (CN), sulfametoxazole/trimetoprima (SXT), rifaximina (RAX) e colistina (CL). % Susceptibilidade Agentes contagiosos SCN Streptococcus Gram Total spp. negativos (n=68) (n=51) (n=10) (n=129) AMP 36,8 60,8 0 43,4 P 39,7 54,9 0 42,6 AMC 85,3 100, ,6 KZ 86,8 98, ,8 CFP 79,4 86, ,8 CEQ 76,5 88, ,3 AN 85,3 31, ,6 S 30,9 2, ,8 CN 69,1 37, ,4 SXT 64,7 56, ,8 RAX 89,7 76, ,1 CL 19,1 2, ,7 278

13 Nunes SF et al. RPCV (2007) 102 ( ) mercado europeu, inviabilizando a sua utilização. A susceptibilidade dos isolados face a SXT contrasta com o descrito na literatura. Embora a elevada eficácia contra Staph. aureus esteja de acordo com o descrito na bibliografia, a susceptibilidade de Strep. dysgalactiae (66,7%) e bactérias Gram negativas (80%) encontram-se abaixo do descrito com uma susceptibilidade de aproximadamente 96% (Erskine et al., 2002). A ansamicina RAX é um antibiótico semi-sintético de largo espectro, indicado para administração intramamária e intra-uterina em bovinos de leite. Os estudos de susceptibilidade para isolados de origem veterinária são ainda raros, sendo mesmo inexistentes relativamente a isolados de mastite bovina. A susceptibilidades elevadas observadas confirmam a abrangência do espectro de acção deste fármaco, com maior eficácia em relação aos Gram positivos do que aos Gram negativos. O elevado número de resistências a CL, deve-se em grande medida ao seu espectro de acção restrito a bacilos Gram negativos (Guerin-Faublee et al., 2003). No entanto, contrariamente ao observado anteriormente em isolados de mastite (Guerin-Faublee et al., 2003) apenas 50% dos bacilos Gram negativos se mostraram susceptíveis a este fármaco, valor inferior ao verificado relativamente a AN, CN e SXT. De um modo geral, os isolados mais prevalentes na região do Ribatejo-Oeste, testados neste estudo, apresentam valores de susceptibilidade inferiores aos verificados noutros países (Owens et al., 1990; Watts et al., 1995; Myllys et al., 1998; De Oliveira et al., 2000; Gentilini et al., 2002; Guerin-Faublee et al., 2002; Rossitto et al., 2002; Yoshimura et al., 2002; Guerin-Faublee et al., 2003; Rajala-Schultz et al., 2004; Luthje and Schwarz, 2006). Considerando o grupo de isolados responsáveis por mastites de natureza contagiosa, verifica-se uma baixa percentagem de agentes sensíveis a P e AMP, o que inviabiliza a adopção das recomendações dos países nórdicos. Inclusivamente em relação a Strep. agalactiae, que é referido com sendo sempre sensível a P, foram encontradas resistências in vitro em 78,7% dos isolados. Também em Staph. aureus foram encontrados elevadas percentagens de resistências o que, aliado ao facto de este microrganismo poder assumir uma localização intracelular e assim evadir-se às defesas do animal e resistir à antibioterapia, corrobora a necessidade de considerar o refugo de animais com mastites crónicas, de acordo com o plano de controlo dos 5 pontos. Em relação aos microrganismos ambientais, verifica-se uma diferença entre o perfil de bactérias Gram positivas e Gram negativas. Estas provocam infecções geralmente clínicas, agudas, com uma expressiva componente inflamatória, e poderá ser considerada a não utilização de antibióticos no seu controlo. Considerando então apenas os microrganismos Gram positivos de origem ambiental, verificamos que a maioria dos fármacos com um espectro de acção adequado se revelou eficaz, à excepção de P e AMP. Uma vez mais, estes resultados reforçam a necessidade do conhecimento dos perfis de sensibilidade dos isolados nacionais, a fim de evitar a extrapolação de dados referentes a outros países que podem sugerir terapêuticas menos adequadas. De uma forma global, o maior número de isolados resistentes encontrados neste estudo poderá reflectir a existência de práticas de antibioterapia incorrectamente dirigidas, que acarretam uma pressão de selecção sobre estirpes resistentes. Este facto tem sérias implicações em saúde animal, considerando a possibilidade de dispersão horizontal de genes de resistência. A proximidade entre o Homem e os animais ou seus produtos tornam esta preocupação extensiva à saúde pública. Também a facilidade de acesso a antibióticos por pessoas não credenciadas, acentua os riscos de uma terapêutica não dirigida. Este aspecto apenas recentemente foi objecto de legislação, com a criação da Receita Veterinária que visa o controlo na prescrição de antibióticos a animais de produção. No entanto, pensamos que um dos principais factores que contribuirá para o estabelecimento de medidas adequadas de controlo de mastites é o conhecimento dos perfis de susceptibilidade dos agentes etiológicos locais, sendo necessária a realização e publicação de estudos realizados noutras regiões de Portugal. Uma vez conhecido o panorama nacional, será possível aos clínicos responsáveis pelas explorações uma escolha fundamentada do fármaco a utilizar, reduzindo o insucesso terapêutico e, simultaneamente, a utilização de antibióticos. Agradecimentos O presente estudo foi financiado pelo Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal (CIISA) da Faculdade de Medicina Veterinária, e pela Fundação de Ciência e Tecnologia Projecto POCTI/CA/1995/95/2003. Os autores agradecem à Ceva Saúde Animal, Intervet/Schering-Plough e Univete a cedência de discos com antibióticos. Os autores agradecem ainda aos produtores envolvidos no estudo. Bibliografia Atalaia V (1983). Contribuição para o estudo das mamites bovinas da região do Ribatejo-Oeste. Repositório de Trabalhos do Laboratório Nacional de Investigação Veterinária, 15: Bexiga R, Cavaco LM, Vilela CL (2005). Mastites subclínicas bovinas na zona do Ribatejo-Oeste. Revista da Sociedade Portuguesa de Ciências Veterinárias, 100, ( ):

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15 RPCV (2007) 102 ( ) R E V I S T A P O R T U G U E S A DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Comparing the effect of three different disbudding methods on behaviour and plasma cortisol of calves Comparação do efeito de três métodos de descorna sobre o comportamento e o cortisol plasmatico de vitelas George Stilwell G 1 *, Miguel S. Lima 1, Donald M. Broom 2 1 CIISA, Departamento de Clínica, Faculdade de Medicina Veterinária, UTL (TULisbon) 2 Centre for Animal Welfare and Anthrozoology, Department of Veterinary Medicine, University of Cambridge, Madingley Road, Cambridge, CB3 0ES, Reino Unido Summary: This paper compares the effects of three disbudding methods on cortisol and behaviour of calves. We compared the results of several studies in which thirty six calves were disbudded in the following way: five scoop disbudded (S); seven hot-iron disbudded (HI), eight caustic paste disbudded (CP); eight sham-disbudded with iron (ND-HI); and eight sham-disbudded with paste (ND-CP). Cortisol was measured 15 minutes before the procedures and 1, 3, 6 and 24 hours after dehorning. Behaviour was assessed during the procedure, 15 minutes after dehorning and before each blood sampling. During the procedure HI showed more struggling behaviours than all other groups. Group S struggled more than CP, ND-HI and ND-CP. There was no difference in cortisol base-line and 24 hours values between any of the groups. Compared with all other groups, S had higher cortisol at 1, 3 and 6 hours. At 1 hour cortisol was higher in CP and HI compared with sham-disbudded and in CP compared with HI. Compared with sham-disbudded groups, S showed more pain-related behaviours at all times except 24 hours and more pain behaviours at 6 hours compared with the other methods; CP and HI showed more signs than sham-disbudded until 3 hours. Although there were differences in age between groups, these results suggest that: scoop-disbudding causes more pain than any other method until 6 hours; dehorning with hot-iron elicits more struggling during the procedure; hot-iron and caustic paste disbudding causes pain until 3 hours but there are no significant differences between them. Keywords: pain, scoop, hot-iron, caustic paste, dehorning, behaviour, cortisol Resumo: Este artigo compara o efeito de três métodos de descorna sobre o cortisol e comportamento de vitelas. Comparámos os resultados de diversos ensaios em que 36 vitelas foram descornadas da seguinte forma: guilhotina (S, n=5); ferro quente (HI, n=7); pasta caustica (CP, n=8); descorna simulada com ferro (ND-HI, n=8); descorna simulada com pasta (ND-CP, n=8). O cortisol foi medido 15 minutos antes da descorna e à 1, 3, 6 e 24 horas pós-descorna. O comportamento * Correspondência: stilwell@fmv.utl.pt; Tel: ; Fax: Departamento de Clínica, Faculdade de Medicina Veterinária Avenida da Universidade Técnica, Lisboa foi avaliado durante a descorna, aos 15 minutos pós-descorna e antes de cada colheita de sangue. Durante o procedimento HI debateu-se mais do que qualquer outro grupo e S debateu-se mais do que CP, ND-CP, ND-HI. Não houve diferença no cortisol entre grupos antes da descorna e às 24 horas. À 1, 3 e 6 horas S apresentou mais cortisol do que qualquer outro grupo. Uma hora após descorna CP e HI mostraram cortisol mais elevado do que os grupos simulados e CP tinha níveis mais elevados do HI. Comparando com os grupos simulados, S apresentou sempre mais sinais de dor excepto às 24 horas e mais às 6 horas quando comparado com os outros métodos. À 1 e 3 horas CP e HI apresentaram mais comportamentos de dor do que ND-CP e ND-HI. Apesar de existir diferenças de idade entre grupos estes resultados sugerem que a guilhotina causa dor intensa até 6 horas; o ferro quente provoca dor mais intensa durante o procedimento; a descorna por ferro quente ou pasta causa dor até 3 horas, não existindo diferenças comportamentais entre estes métodos. Palavras-chave: descorna, guilhotina, ferro-quente, pasta cáustica, dor, comportamento, cortisol Introduction Cattle disbudding is a routine procedure that is considered necessary and acceptable in modern dairy farms (Stafford e Mellor, 2005; EFSA, 2006). Keeping adult horned cows in free stall dairy farms threatens animal and human safety and welfare because these animals have more potential to cause injury. This is evident by the wounds and various injuries, especially problematic when the udder is affected, that are seen in dairy farms where horned animals are kept. The International Association for the Study of Pain (IASP) definition for pain is that it is "an unpleasant sensory and emotional experience associated with actual or potential tissue damage, or described in terms of such damage" (Merskey, 1979), modified 281

16 Stilwell GG et al. RPCV (2007) 102 ( ) slightly by Broom and Fraser (2007) to "an aversive sensation and feeling associated with actual or potential tissue damage". It is also useful to follow the rule by which "animals should be given the benefit of any doubt so that, where there is a choice, judgments should overestimate the intensity of pain to avoid missing animals in pain" (Molony and Kent, 1997). According to these statements, we should consider horn bud amputation or burning, by caustics or heat, as a potentially painful procedure. Pain management is sometimes ignored or forgotten in farm animals, as it is evident in several surveys in which practitioners report their efforts to control pain after painful procedures (Whay and Huxley, 2005; Huxley and Whay, 2006; Stilwell, unpublished). Although common sense and legislation (Decreto- Lei nº48/2001) require cornual nerve blocking before disbudding and it is well established that this simple intervention is known to reduce struggling, procedure length and appetite reduction, it is rarely performed in dairy farms. A recent survey with practitioners at the 2007 Congress of the Portuguese Buiatric Association, showed that anaesthesia and analgesia are seldom performed for calf disbudding (Stilwell, unpublished). The main reason for this is the idea that the procedure is not painful, or is only temporarily painful. Other reasons may result from the belief that cattle are very resistant to pain, perhaps a consequence of difficulty in detecting pain-related behaviours in these animals, or that the alleviation of pain is too expensive, or that currently available drugs are not efficient (Whay and Huxley, 2005; Huxley and Whay, 2006). Although some studies (Petrie et al., 1995; Morisse et al., 1995; McMeekan et al., 1998; Graf and Senn, 1999; Vickers et al., 2005) have looked at the welfare of calves, following the different disbudding methods, only two tried to compare the effects of hot-iron and caustic paste disbudding (Morisse et al., 1995; Vickers et al., 2005). Cortisol is a physiological variable frequently used in the assessment of pain because it is well established that stress activates the Hypothalamus-Pituitary- Adrenal (HPA) axis (Stott, 1981; Broom and Johnson, 2000; Matteri et al., 2000; Moberg, 2005). A few minutes after a painful experience cortisol is released and is usually kept above baseline while acute pain is felt. Stimuli other than pain (fear, handling, hunger, anxiety, tissue damage and many other environmental effects) can cause an increase in plasma cortisol, so it is important to control these factors and to understand the circadian cycle that is shared by all individuals (Broom, 1988; Harbuz and Lightman, 1992; Mellor et al., 2005; Lane, 2006; Stilwell et al., 2008a). Another way to evaluate pain is to assess behaviour modification. This can be done by objectively measuring the incidence of pain-related behaviours that are usually related to the effort of the animal to get rid of the pain source, to speed recovery or to avoid further injury (Broom e Johnson, 2000; Rushen, 2000; Mellor et al., 2005). Head shaking, ear flicking, head rubbing and quick transitions from standing to lying have been used to assess pain following disbudding (Morisse et al., 1995; Graf and Senn, 1999; Vickers et al., 2005; Stilwell, 2008; Stilwell et al., 2008b). These measures also have to be dealt with caution because cattle is a species in which concealment of vulnerability and weakness seems to be adaptive (Broom, 2001; Dobromylskyj et al., 2005) and because different animals give different responses to pain as a result of diverse and complex factors such as age, breed, previous experiences, temperament etc. With cattle, very subtle signs (e.g. inert lying) may be of crucial importance while others, very important in other species, might be seldom exhibited. Although the extrapolation "if it hurts humans it must hurt animals" is advisable, the same may not be true for the assessment of pain as it may lead to the exclusion of very specific or subtle changes in behaviours that are important for pain evaluation (Stilwell, 2005). The 2007 practitioners survey (Stilwell, data not published) showed that the disbudding methods used in Portugal are: chemical disbudding with a caustic paste (80 % of farms), thermo-cautery with a hot-iron (60% of farms) and guillotine disbudding, also known as scoop (12% of farms). Some farms use more than one method. Caustic paste disbudding is done by applying a thin layer of sodium or calcium hydroxide (ph 14) over the horn bud of calves under the age of 6 weeks. The hot-iron disbudding is done by applying for 30 to 60 seconds a specific device, heated to over 600 ºC, over the horn bud of 6 to 8 weeks old calves, burning the growing tissue at its base. The scoop-disbudding is done by closing the sharp jaws of the tool, amputating the horn and tissue at its base, sometimes including the surrounding skin and bone. This method is usually used in older animals, above the age of 10 weeks. The handling and restraining of the animals also differ according to the method used. Because calves to be paste-disbudded are small, they are easily subdued and forced to lie down. Animals for hot-iron or scoop disbudding have to be firmly restrained because of need to remain still for longer periods. The objective of this study was to compare cortisol and behaviour of calves disbudded with the three methods used in Portugal (scoop, hot-iron or caustic paste), so as to try and grade them according to their effects on welfare. Material and methods Experiment design Three dairy farms were selected according to the dehorning method used. We tried to replicate the field conditions in a way to conveniently assess the pain and 282

17 Stilwell GG et al. RPCV (2007) 102 ( ) distress experienced by the calves. Handling technique, operator and calf age were the ones routinely used in each farm. All animals were used to human handling and regular presence in the paddocks. The different studies were done for several days but all disbudding, blood sampling and behaviour recording started at 10 a.m. in similar weather conditions clear sky and mild temperatures. In each farm, animals to be disbudded or sham-disbudded were randomly selected and an individual number was sprayed on both flanks. Blood sampling into a heparinised Starsted tube (7 ml) took place approximately 15 minutes before the disbudding and then at 1, 3, 6 and 24 hours after the disbudding. Blood was immediately centrifuged. Plasma was then frozen at minus 20 ºC. Cortisol was assayed in duplicate and measured by a validated solid radioimmunoassay, without extraction, using a commercial kit (Coat-A-Count; Diagnostic Product Corporation, Los Angeles, CA, USA) at the Faculdade de Medicina Veterinaria in Lisbon. Behavioural assessment was done during the procedure in which the degree of struggling was graded from 0 = no struggling behaviour recorded, to 5 = all struggling behaviours were recorded. At 15 minutes, 1, 3, 6 and 24 hours after the disbudding the incidence of five different pain-related behaviours were recorded for a period of 15 minutes. The behaviours assessed are described in Table 1. Handling and blood collection was as quick and peaceful as possible so as to reduce stress and was done by an experienced veterinarian inside the first 30 seconds after restrain The number of animals in each group and mean age are presented in Table 2. Each farm s husbandry conditions and disbudding method used were as follows: Scoop disbudding: this study was done in a single day. Five Holstein-Frisian female calves with mean age 117±32 days were kept in concrete floored paddocks. Concentrate, grass hay and water were permanently available. For disbudding the calves were put into a crunch and the head was restrained with a rope. The scoop-dehorner was pushed against the head and rapidly closed to cut off the horn base. The procedure was repeated for the other bud and took no more than 45 seconds in total. Due to farm constraints, there was no sham scoop-disbudded group but two other groups were formed to test regional anaesthesia and analgesia efficacy (Stilwell, 2008). Hot-iron disbudding: this study was repeated with different animals along several days. Fifteen female calves with mean age 98±15 days were kept in concrete floored paddocks. They were already weaned and were eating concentrate and alfalfa/grass hay. The disbudding procedure was done with the calves standing and the head restrained by a head-halter. While one person gently pressed the calves against a wall another operator applied the hot-iron to the base of each horn bud for the duration of 30 to 45 seconds. The sham-iron-disbudding was done in the same way but a cold device was applied to the head. The total procedure took from 90 to 120 seconds and was always done by the same stockman. Caustic-paste disbudding: this study was repeated with different animals along several days. Sixteen Holstein-Friesian female calves with mean age 25±10 days, kept in a large straw-bedded paddock with access to a computer-controlled milk distributor and ad libitum concentrate and grass hay. These animals were randomly allocated to treatment groups with no age differences: CP - caustic paste disbudded with no treatment (n=8) and ND-CP - sham-disbudded (n=8). Table 1 Description of the behaviours recorded at disbudding and for 24 hours after the procedure Struggling at dehorning Hot-iron and Scoop (occurrence of any of the five behaviours were added) Caustic paste (occurrence of any of the five behaviours were added). Behaviours after dehorning Ear flick Head shake Head rub Transitions (lying/raising) Inert lying Description Lifting front limbs; falling on back limbs; backing; vocalization; open mouth. Trying to rise; shaking head; stretching back limbs; vocalization; open mouth. Description Flicking ears with no apparent reason (e.g. presence of flies). Shaking head. Scratch head against objects or using back leg. Lying and raising hastily with no resting objective. Sternal lying with head on flank and ignoring external stimulus. Table 2 Number and age (mean ±SD) of calves in each group accordingly to the disbudding method used Disbudding method Scoop Hot-iron Caustic Paste Sham-dehorned Sham-dehorned (S) (HI) (CP) (ND-HI) (ND-CP) Animals (n) Age in days 117 ±33 a 98 ±15 b 25 ±10 c 76 ±11 b 31 ±5 c Different superscript letters indicate difference in age between groups for which p <

18 Stilwell GG et al. RPCV (2007) 102 ( ) For the disbudding, animals were forced to lie down, the hair around the horn bud was clipped and the paste was applied to each horn. Sham-paste-disbudded animals were handled in the same way but an inert gel was applied instead of the paste. The total procedure took no more than 60 seconds. Two calves were removed from the study (one from group ND-CP and one from group HI) due to respiratory disease and the need for treatment. Statistical analysis Distributions of these variables were shown by Levene and Shapiro Wilks tests to be non-normal, so non-parametric analyses were used. Differences between the five groups at each time were determined by the Mann Whitney U-test following a Kruskal Wallis one-way analysis of variance. P-values less than 0.05 were considered significant. SPSS for Windows (version 14) was used for the analysis. Results There was a difference in ages between the disbudded groups (Table 2) but not between the two hot-iron groups (HI and ND-HI) and the two caustic paste groups (CP and ND-CP). Comparing cortisol values at each moment (Figure 1) we found that there were no differences between groups at 15 minutes (baseline) or at 24 hours (p=0.669 and 0.126, respectively). Additionally, there were no differences in cortisol between the two sham-disbudded groups at any time (always p 0.05). In contrast, at 1 hour, both sham-disbudded groups showed lower cortisol than S (p<0.004) and CP calves (p<0.001) and group HI had higher cortisol than ND-HI (p=0.002) but only showed a trend towards difference (p=0.051) when compared with group ND-CP. When comparing the different disbudding methods at 1 hour the S group showed higher cortisol levels compared to CP and HI groups (p=0.019 and p=0.003, respectively), and CP had higher cortisol than HI (p=0.001). At 3 and 6 hours there was still a difference between S and the other disbudded groups: for CP p=0.002 and p=0.019, respectively; and for HI p=0.03 and p=0.01, respectively. The different pain-related behaviour s incidence for the various groups is shown in Table 3. Struggling was significantly higher in the HI group than in any of the other groups (p<0.01) and group S struggled more than both sham-disbudded and the CP animals (p<0.05). In contrast there were no differences in struggling between sham-disbudded groups and caustic paste disbudded animals (p>0.491). The S group showed more pain behaviours than sham-disbudded at all times (p<0.001) except at 24 hours but only at 6 hours when compared with the two other disbudded groups (CP p=0.03 and HI p=0.048). The HI group showed more behaviours than the ND- HI at 15 minutes, 1 hour and 3 hours (at 6 hours there was a trend with p=0.054) and more behaviours than ND-CP at all times except at 24 hours. The group CP showed higher incidence of pain-related behaviours when compared to both sham-disbudded groups at 15 minutes and 1 hour and at 3 hours when compared with ND-HI. Figure 1 Mean ±SD plasma cortisol of calves disbudded by different methods S - Scoop; HI - hot-iron; CP - caustic paste; ND-HI sham-disbudded with iron; ND-CP sham-disbudded with paste. Different superscript letters in each period of time indicate difference between groups for which p <