Universidade Federal da Bahia. Programa de Pós Graduação em Ciência Animal nos Trópicos

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1 Universidade Federal da Bahia Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia Programa de Pós Graduação em Ciência Animal nos Trópicos VALIDAÇÃO DE UM PROGRAMA DE PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS COM TRANSPORTE DE OÓCITOS E DE EMBRIÕES POR LONGAS DISTÂNCIAS Marcus Vinícius Galvão Loiola Salvador-Bahia 2013

2 i Sistema de Bibliotecas - UFBA Loiola, Marcus Vinícius Galvão. Validação de um programa de produção in vitro de embriões bovinos com transporte de oócitos e de embriões por longas distâncias / Marcus Vinícius Galvão Loiola f. : il. Orientador: Prof. Dr. Antonio de Lisboa Ribeiro Filho. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal da Bahia, Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia, Salvador, Nelore (Zebu) - Reprodução. 2. Nelore (Zebu) - Transferência de embriões. 3. Ovulação - Indução. 4. Sêmen. 5. Inseminação artificial. I. Ribeiro Filho, Antonio de Lisboa. II. Universidade Federal da Bahia. Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia. III. Título. CDD CDU

3 ii MARCUS VINÍCIUS GALVÃO LOIOLA VALIDAÇÃO DE UM PROGRAMA DE PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS COM TRANSPORTE DE OÓCITOS E DE EMBRIÕES POR LONGAS DISTÂNCIAS Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos, da Universidade Federal da Bahia, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal nos Trópicos. Área de concentração: Reprodução Animal Orientador: Prof. Dr. Antonio de Lisboa Ribeiro Filho SALVADOR BA

4 iii FEVEREIRO 2013 BIBLIOGRAFIA DO AUTOR MARCUS VINÍCIUS GALVÃO LOIOLA - filho de Jaime Gonçalves Loiola Sobrinho e Anita Dourado Galvão Loiola, nasceu em 26 de julho de 1986, na cidade de Irecê, estado da Bahia. Iniciou o curso de graduação em Medicina Veterinária em fevereiro de 2005 na Universidade Federal da Bahia e em agosto de 2010 concluiu a graduação. Em 01 de março de 2011, ingressou no programa de Pós-graduação em Ciência Animal nos Trópicos, pela Universidade Federal da Bahia, sob orientação do professor Dr. Antonio de Lisboa Ribeiro Filho, defendendo a dissertação de mestrado em 25 de fevereiro de 2013.

5 iv Dedico este trabalho ao meu pai, Jaime Gonçalves Loiola Sobrinho, por ser o maior incentivador na construção de minha carreira profissional e pelo exemplo de seriedade e dignidade, pelo carinho e dedicação a sua família, por todos os ensinamentos, conselhos e pela contribuição na formação do meu caráter. Dedico-o também a meu filho Emerson, que apesar de sua pouca idade, é o responsável pelos melhores momentos da minha vida. Nenhum problema ou preocupação consegue persistir diante do seu sorriso ou abraço.

6 v AGRADECIMENTOS A Deus por todas as oportunidades concedidas, pela força e coragem para enfrentar todos os obstáculos nesta nova trajetória. Ao meu pai, Jaime Gonçalves Loiola Sobrinho, pelos ensinamentos, carinho e exemplo de ser humano e por contribuir de forma direta nos momentos mais difíceis desta caminhada e a minha mãe, Anita Dourado Galvão Loiola (in memorian) que acompanha todos os meus passos e neste momento se orgulha com esta realização. A minha esposa Tamira pelo apoio, palavras de incentivo diante das dificuldades da distância, pelos cuidados e ensinamentos ao nosso filho nos momentos em que tive de está ausente, pelo carinho e dedicação, por acreditar e ajudar a tornar este sonho em realidade. Você é muito especial para mim. A todos os meus familiares, em especial, Jardel, Denise, Ana, Fernando, Ricardo, Son (in memorian), Tia Dene, Tio Dadá e minhas queridas sobrinhas, que mesmo distantes, sempre me apoiaram e torceram pelo meu sucesso. Ao meu orientador, Dr. Antonio de Lisboa Ribeiro Filho, pela confiança depositada em todos esses anos, pelos ensinamentos, conselhos, amizade, brincadeiras e acima de tudo lealdade e respeito. Sou-lhe eternamente grato pelas oportunidades que tem me oferecido. Ao professor amigo, Marcos Chalhoub Coelho Lima, pela grande contribuição para minha carreira profissional, pelas orientações e ensinamentos, tanto acadêmico, como prático, pela acessibilidade sempre que necessário, pela oportunidade a me concedida de vivenciar a realidade do profissional de campo e por contribuir com sugestões relevantes para este trabalho. Aos grandes amigos de profissão, Sidnei, Endrigo, Alexandra, Priscila, Carlos Henrique, Bruno, Alana, Edivânia e Mariana, pela amizade, convivência e enorme participação neste trabalho, a ajuda de todos vocês foi crucial para execução deste trabalho e mostra o quanto somos fortes quando estamos unidos como uma verdadeira equipe. A todos os colegas, funcionários e professores do Laboratório de Fisiopatologia da Reprodução Animal e da Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia da UFBA pela ajuda no desenvolvimento desta pesquisa.

7 vi A Coordenação Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa de estudos de suma importância para desenvolvimento deste trabalho. Enfim, a todos que de forma direta ou indireta contribuíram para a realização deste trabalho. MUITO OBRIGADO!!!!

8 vii LISTA DE FIGURAS Validação de um programa de produção in vitro de embriões bovinos com transporte de oócitos e de embriões por longas distâncias Figura 1. Página Produção de embriões bovinos no Brasil de acordo com a técnica utilizada, durante o período de

9 viii LISTA DE TABELAS Validação de um programa de produção in vitro de embriões bovinos com transporte de oócitos e de embriões por longas distâncias Tabela 1. Tabela 2. Tabela 3. Tabela 4. Participação do Brasil no total de embriões bovinos produzidos in vivo e in vitro no mundo, durante o período Taxas de oócitos viáveis recuperados (OOVI), embriões produzidos (EMB) e de gestação (GES). Médias e desvio padrão de oócitos totais recuperados (OOTO), OOVI, EMB e número de prenhezes por sessão de OPU em um programa de PIVE na raça Nelore com transporte de oócitos e de embriões por longas distâncias Comparação da taxa de clivagem (TXCLIV), da taxa de embriões produzidos (TXEMB) e da taxa de gestação (TXGES) em um programa de PIVE utilizando sêmen convencional (CONV), ou sêmen sexado (SEX) com transporte de oócitos e de embriões por longas distâncias Comparação entre as taxas de gestação de receptoras que tiveram os embriões transportados por longas distâncias e inovulados no turno da manhã (TE-M), no turno da tarde (TE-T) e no turno da noite (TE-N) Página

10 ix LISTA DE SIGLAS %: Por cento χ 2 : Qui-quadrado µg: Microgramas µl: Microlitro BRL: Buffalo rat liver BSA: Albumina Sérica Bovina CIV: Cultivo in vitro CL: Corpo lúteo CO 2 : Dióxido de carbono CONV: Sêmen convencional CR1aa: Charles Rosenkrans 1 - aminoácidos CR2aa: Charles Rosenkrans 2 - aminoácidos D0: Dia 0 D10: Dia 10 D11: Dia 11 D17: Dia 17 D8: Dia 8 DNA: Ácido desoxirribonucleico ecg: Gonadotrofina coriônica equina EMB: Embriões produzidos Fert-talp: Tyrode albumina lactato piruvato FIV: Fertilização in vitro FSH: Hormônio folículo estimulante GDF9: Fator de crescimento e iniciação-9 GES: Gestações h: Horas IA: Inseminação artificial IATF: Inseminação artificial em tempo fixo IEC: Índice de escore corporal IGF: Fator de crescimento semelhante à insulina IGF-I: Fator de crescimento semelhante à insulina I im: Intramuscular KSOM: Namely potassium simplex optimization medium LH: Hormônio luteinizante mg: Miligramas Mhz: Megahertz MIV: Maturação in vitro ml: Mililitro mm: Milímetros mmhg: Milímetro de mercúrio MOET: Múltiplas ovulações e transferência de embriões N 2 : Gâs nitrogênio O 2 : Gâs oxigênio ºC: Graus Celsius OOTO: Oócitos totais recuperados

11 OOVI: Oócitos viáveis OPU: Aspiração folicular guiada por ultrassonografia (Ovum pick up) P4: Progesterona PGF2α: Prostaglandina F2α PHE: Epinefrina PIVE:Produção in vitro de embriões S: Desvio-padrão SBTE: Sociedade Brasileira de Tecnologias em embriões SEX: Sêmen sexado SFB: Soro fetal bovino SOF: Synthetic oviductal fluid SPSS: Statistical Package for Social Science SVE: Soro de vaca em estro TCM: Tissue Culture Medium TE-M: Transferência de embrião no turno da manhã TE-N: Transferência de embrião no turno da noite TE-T: Transferência de embrião no turno da tarde TETF: Transferência de embriões em tempo fixo TXCLI: Taxa de clivagem TXEMB: Taxa de embriões produzidos TXGES: Taxa de gestação U.I.: Unidades internacionais VERO: Linhagens de células estabelecidas para cultivo x

12 xi SUMÁRIO Validação de um programa de produção in vitro de embriões bovinos com transporte de oócitos e de embriões por longas Página distâncias Resumo 1 Abstract 3 Introdução 5 Objetivos 6 Hipóteses 7 Revisão de Literatura 7 Histórico da produção in vitro de embriões bovinos 7 Produção in vitro de embriões bovinos no Brasil e no mundo 9 Etapas da produção in vitro de embriões 11 Utilização de sêmen sexado na produção in vitro de embriões bovinos 19 Transporte de oócitos por longas distâncias 21 Transporte de embriões por longas distâncias 22 Sincronia receptora-embrião 24 Material e Métodos 25 Animais e local do experimento 25 Aspiração folicular 25 Transporte dos oócitos e dos embriões 26 Produção in vitro dos embriões 27 Transferência de embriões 28 Diagnóstico de gestação 29 Análise estatística 29 Resultados e Discussão 30 Conclusões 35 Referências 37

13 1 Validação de um programa de produção in vitro de embriões bovinos com transporte de oócitos e de embriões por longas distâncias RESUMO Objetivou-se avaliar a viabilidade de um programa de produção in vitro de embriões (PIVE) bovinos da raça Nelore cuja maturação oocitária e cultivo embrionário ocorreram parcialmente durante o transporte, determinar o efeito da fertilização com sêmen sexado sobre a taxa de clivagem, a produção de embriões e a taxa de gestação, assim como, a influência de diferentes sincronias receptora-embrião sobre a taxa de gestação em um programa de PIVE com transporte de oócitos e embriões por longas distâncias. Para tanto, 123 fêmeas Nelore foram submetidas a 274 procedimentos de aspiração folicular (OPU). Os oócitos foram aspirados em fazendas no estado da Bahia, classificados e apenas os considerados viáveis eram acondicionados em criotubos e transportados em incubadora portátil em condições de maturação in vitro para o laboratório no estado de São Paulo. No laboratório, prosseguiram-se as etapas de produção in vitro, sendo que a fertilização era realizada com espermatozoides oriundos de sêmen convencional (grupo CONV) ou sexado para fêmea (grupo SEX). No dia seis do cultivo embrionário, os embriões produzidos eram submetidos às mesmas condições de transporte que os oócitos, em meios de cultivo e remetidos para as fazendas no estado da Bahia onde eram transferidos às receptoras. O tempo gasto com o transporte variou de 18 a 24 horas, sendo que todos os embriões foram transferidos no dia sete, entretanto em diferentes turnos, perfazendo três grupos experimentais: TE-M, embriões inovulados durante a manhã (06:00 à 11:59), TE-T, inovulações à tarde (12:00 à 17:59) e TE-N, inovulações à noite (18:00 à 24:00). O diagnóstico de gestação foi realizado por ultrassonografia transretal. As fêmeas tiveram média de 46,18±32,7 oócitos recuperados e 30,74±24,3 oócitos viáveis por OPU. A taxa de embriões produzidos foi de 32,85% (10,09±6,2 embriões/opu) e a taxa de gestação foi de 33,12% (2,71±1,2 prenhez/opu). O tipo de sêmen não influenciou na taxa de clivagem dos oócitos (CONV=61,49% e SEX=63,43%, P=0,49), assim como, nas taxas de embriões produzidos (CONV=38,11% e SEX=47,76%, P=0,054) e nas taxas de gestação (CONV=33,37% e SEX=31,93%, P=0,586). Em relação ao turno da inovulação (sincronia receptora-

14 2 embrião): As taxas de gestação entre os embriões transferidos pela manhã e à tarde não diferiram (TE-M: 36,10% e TE-T: 40,99%, P=0,167), assim como, entre à tarde e à noite (TE-T: 40,99% e TE-N: 50,00%, P=0,095), no entanto, houve diferença entre as taxas de gestação no turno da manhã e da noite (TE-M: 36,10% e TE-N: 50,00%, P=0,006). Os resultados encontrados demonstram que o transporte de oócitos e de embriões foi eficiente em um programa de PIVE bovinos, mesmo quando utilizado o sêmen sexado, entretanto, uma atenção especial deve ser dada a sincronia receptoraembrião, visto que, esta pode interferir nas taxas de gestação. Palavras-chave: Bos indicus, Nelore, Sêmen sexado, Sincronia receptora-embrião, Transferência de embriões

15 3 Validation of a program of in vitro production of bovine embryos with transport of oocytes and embryos for long distances ABSTRACT This study aimed to assess the feasibility of a program of in vitro embryo production (PIVE) Nellore cattle whose oocyte maturation and embryo development occurred partly during transport, to determine the effect of fertilization with sexed semen on the cleavage rate, production embryos and pregnancy rates, as well as the influence of different synchronicities receptor-embryo on pregnancy rate in a program with PIVE transport of oocytes and embryos for long distances. Therefore, 123 Nellore underwent 274 procedures follicular aspiration (OPU). The oocytes were aspirated on farms in the state of Bahia, classified and only considered viable and were placed in vials and transported in portable incubator under conditions of in vitro maturation to the laboratory in the state of São Paulo. In the laboratory, they proceeded up the steps of production in vitro, fertilization was performed with sperm from semen conventional (group CONV) or to sexed female (group SEX). On day six of embryo development, the embryos produced were subjected to the same conditions of carriage that oocytes, in culture medium and sent to farms in the state of Bahia where they were transferred to recipients. The time spent on transport ranged from 18 to 24 hours, and all embryos were transferred on day seven, though in different shifts, totaling three experimental groups: TE-M embryos transferred during the morning (06:00 to 11: 59), TE-T, transfer afternoon (12:00 to 17:59) and TE-N, transfer evening (18:00 to 24:00). Pregnancy diagnosis was performed by transrectal ultrasonography. Females had a mean of ± 32.7 oocytes retrieved and ± 24.3 viable oocytes by OPU. The rate of embryos produced was 32.85% (10.09 ± 6.2 embryos / OPU) and the pregnancy rate was 33.12% (2.71 ± 1.2 pregnancy / OPU). The type of semen did not influence the cleavage rate of oocytes (CONV = 61.49% and 63.43% SEX =, P = 0.49), as well as the rates of embryos produced (CONV = 38.11% and SEX = 47.76%, P = 0.054) and in pregnancy rates (CONV = 33.37% and SEX = 31.93%, P = 0.586). Regarding the shift of embryo transfer (embryo-recipient synchrony): Pregnancy rates between embryos transferred in the morning and in the afternoon did not differ (TE-M: 36.10% and TE-T: 40.99%, P =

16 ) and between afternoon and evening (TE-T: 40.99% and TE-N: 50.00%, P = 0.095), however, there were differences in the pregnancy rates during the morning and night (TE-M: 36.10% and TE-N: 50.00%, P = 0.006). The results show that the transport of oocytes and embryos was efficient in a program PIVE cattle, even when used sexed semen, however, special attention should be given to embryo-recipient synchrony, since is can interfere in rates of gestation. Keywords: Bos indicus, Nelore, Sexed semen, embryo-recipient Synchrony, Transfer of embryos

17 5 INTRODUÇÃO Nos últimos anos, as fêmeas bovinas têm sido alvo de numerosas pesquisas visando um melhor aproveitamento de seus gametas, principalmente aquelas consideradas geneticamente superiores (SENEDA et al., 2002). Segundo Gordon (2003), bezerras ao nascimento possuem mais de 100 mil oócitos em seus ovários, que pelas vias naturais podem dar origem a 0,01% de produtos viáveis, algo próximo de dez descendentes em toda sua vida reprodutiva. Uma forma de melhorar a exploração desses gametas é através das biotecnologias da reprodução, como a indução de múltipla ovulação e transferência de embriões (MOET) e a produção in vitro de embriões (PIVE) (MERTON et al., 2003). O Brasil passou por um crescimento significativo no segmento das biotecnologias na última década. Após um amplo e consolidado conhecimento na obtenção de embriões in vivo, o país passou a dominar a aspiração folicular ou ovum pick up (OPU) e a PIVE, ocupando uma posição importante no mercado de embriões bovinos, sobretudo, por possuir o maior rebanho comercial do mundo e ser o principal exportador de carne bovina (IBGE, 2011; SENEDA et al., 2002). Atualmente, o método in vitro superou a MOET e tornou-se a técnica de escolha na produção de embriões (VIANA et al., 2012), especialmente, por ser mais utilizada em raças zebuínas, as quais fisiologicamente possuem uma maior população folicular, maior recuperação de oócitos por aspiração e consequentemente maior produção embrionária (PONTES et al., 2010). A PIVE é considerada uma ferramenta eficiente para a produção de animais de maior mérito genético, sendo um instrumento importante para exploração maximizada do potencial reprodutivo dos rebanhos, diminuindo o intervalo entre as gerações e acelerando o melhoramento genético animal (VARAGO et al., 2008). Vários fatores podem influenciar nos seus resultados: diferentes metodologias de maturação, cultivo, capacitação espermática, sêmen, individualidade da doadora e do touro, entre outros (CAMARGO et al., 2006). O crescimento desta biotecnologia no Brasil permitiu sua aplicação em larga escala e a exportação deste modelo para vários países latino-americanos e de outros continentes (BOLS et al., 2012; MEIRELLES et al., 2008). Entretanto, a grande

18 6 extensão territorial e a distância entre as propriedades onde ficam os animais e os laboratórios de PIVE, muitas vezes têm limitado a expansão da produção in vitro comercial, principalmente pelas condições e pelo tempo gasto com o transporte dos oócitos e dos embriões (ALVES et al., 2003; MARINHO et al., 2012; TESSMANN et al., 2004). Diversas alternativas de transporte têm sido relatadas, um exemplo é o uso de incubadoras portáteis capazes de simular o ambiente do laboratório, permitindo assim, tanto a maturação dos oócitos, quanto o cultivo dos embriões enquanto estes são transportados, o que possibilita a execução de todo o processo de produção in vitro sem nenhuma interrupção até o momento de transferência para as receptoras (MAX et al., 2012). Entretanto, são poucos os estudos envolvendo essas temáticas e os resultados apresentados na literatura ainda são controversos (ALVES et al., 2003; ARRUDA et al., 2012). Sendo assim, o estudo de estratégias de transporte de oócitos e de embriões por longas distâncias e o impacto que a utilização de doses de sêmen sexado, assim como, a inovulação do embrião transportado por longas distâncias em diferentes sincronias receptora-embrião sobre os resultados destes procedimentos, possibilitará um melhor entendimento e elementos auxiliares ao emprego desta tecnologia por técnicos e criadores. OBJETIVOS Considerando os questionamentos apresentados acima, os objetivos desta pesquisa foram: Avaliar a viabilidade de um programa de produção in vitro de embriões bovinos da raça Nelore cuja maturação oocitária e cultivo embrionário ocorreram parcialmente durante o transporte por longas distâncias. Determinar o efeito da fertilização com sêmen sexado para fêmea na taxa de clivagem, produção de embriões e taxa de gestação em um programa de produção in vitro de embriões com transporte de oócitos e embriões por longas distâncias.

19 7 Estudar a influência de diferentes sincronias receptora-embrião sobre a taxa de gestação em um programa de produção in vitro de embriões com transporte de oócitos e embriões por longas distâncias. HIPÓTESES Ao realizar este trabalho hipotetisou-se que: O transporte de oócitos e de embriões pode ser realizado por longas distâncias, desde que em um ambiente que simule as mesmas condições de atmosfera e de temperatura que são cultivados no laboratório. O sêmen sexado para fêmea pode ser utilizado na PIVE bovinos cujos oócitos foram transportados por longas distâncias, apresentando resultados similares ao sêmen convencional em relação a taxa de clivagem, produção de embriões e taxa de gestação. O momento da inovulação influencia nos resultados da taxa de gestação das receptoras devido à necessidade de uma sincronia entre a receptora e o embrião transportado por longas distâncias. REVISÃO DE LITERATURA Histórico da produção in vitro de embriões bovinos Os primeiros estudos sobre fertilização tiveram como referências trabalhos realizados com estrela do mar a partir de 1940, pelo fato que, nestes invertebrados a fertilização ocorre externamente ao sistema reprodutor da fêmea (GONÇALVES et al., 2002). Posteriormente surgiram as pesquisas relacionadas com a produção de embriões in vitro, que em mamíferos, tiveram como marco o nascimento do primeiro bebê de proveta, Louise Brown, na Inglaterra no ano de 1978 (STEPTOE e EDWARDS, 1978 apud GONÇALVES et al., 2002).

20 8 O primeiro bezerro produzido por fertilização in vitro (FIV) nasceu em 1981 nos Estados Unidos, provenientes de oócitos maturados in vivo (BRACKETT et al., 1982 apud SENEDA et al., 2002). No Brasil, vários laboratórios iniciaram suas pesquisas com FIV no final da década de 1980 (WATANABE et al., 2002). Em 1994, uma equipe de pesquisa obteve gestações de embriões zebuínos fertilizados in vitro (PEIXER et al., 1994) e em 1996 pesquisadores da Universidade de São Paulo conseguiram o nascimento de bezerros da raça Nelore mediante os processos de maturação, fecundação e cultivo embrionário in vitro (AZAMBUJA et al., 1996). Até o final da década de 90, a produção in vitro de embriões no Brasil foi realizada, quase que exclusivamente, para fins de pesquisas e consequentemente não teve impacto comercial (VIANA et al., 2012). Devido à sua complexidade e características de altos custos era esperado um crescimento lento, apenas para atender as demandas de mercados específicos (PONTES et al., 2010). Posteriormente, estudos realizados por universidades e centros de pesquisas contribuíram para a formação de uma base sólida de conhecimento na área, o desenvolvimento de protocolos de maturação, fertilização e cultivo in vitro, a melhor compreensão e controle da fisiologia reprodutiva em raças zebuínas e a otimização da aspiração folicular guiada por ultrassonografia (OPU) foram pontos cruciais para tornar esta biotecnologia pronta para o uso comercial (RUBIN, 2005). O período entre 1999 e 2003 marcou a saída da PIVE do laboratório para o campo (VIANA et al., 2012), entretanto, sendo utilizada em paralelo com a MOET e compreendida ainda como uma alternativa complementar em casos específicos, como doadoras inférteis ou de altíssimo valor financeiro (THIBIER, 2005). A partir de 2004 houve uma estabilização e posteriormente um declínio na utilização da MOET e a produção in vitro tornou-se a técnica de escolha para a produção de embriões no Brasil (VIANA et al., 2010). O principal motivo para a expansão da PIVE comercial foi a superação do maior limitador da superovulação: a inconsistente resposta ovariana a estímulos exógenos de FSH em doadoras bovinas (BARUSELLI et al., 2006). Entre outros fatores que contribuíram para a hegemonia desta biotécnica estão ainda: o maior número de folículos disponíveis para aspiração nos ovários de doadoras zebuínas e a qualidade e o potencial dos oócitos recuperados nestes animais, uma vez

21 9 que, 97,3% dos embriões bovinos produzidos no Brasil são de doadoras Bos taurus indicus (VIANA et al., 2012). O contínuo e expressivo aumento da PIVE, sustentado principalmente pelas raças zebuínas de corte, estabilizaram-se nos últimos anos, contudo, passou a ser observado um avanço significativo da utilização desta técnica no setor leiteiro a partir de 2005 até os dias atuais (VIANA et al., 2010). Do ponto de vista comercial, esta ferramenta, associada a OPU, vem sendo cada vez mais acessível e eficiente, podendo ser considerada uma técnica consolidada que provocou uma mudança significativa no cenário nacional da indústria de embriões (SENEDA et al., 2002; 2006). Produção in vitro de embriões bovinos no Brasil e no mundo De acordo com relatórios fornecidos pela Sociedade Brasileira de Tecnologia de Embriões (SBTE), a produção de embriões bovinos no Brasil aumentou significativamente na última década. Este aumento é diretamente relacionado com a expansão da PIVE, que se tornou a técnica de escolha para aumentar o número de descendentes de animais geneticamente superiores (VIANA et al., 2010). A figura 1 mostra o crescimento da indústria de produção de embriões no país, diferenciando o número de embriões produzidos pelas diferentes técnicas (MOET e PIVE) entre o período de Uma grande expansão no número total de embriões produzidos pode ser notada a partir de 2000, sendo que em 2004 a produção anual supera a marca de embriões. Durante a produção brasileira total tende a se estabilizar com números em torno dos embriões/ano (VIANA et al., 2012). Em relação à produção in vitro, o Brasil passa então a liderar o ranking mundial. Em 2003 já são mais de embriões gerados por este método (SENEDA et al., 2006; THIBIER, 2004) e em 2008 foi responsável por mais da metade da produção in vitro do mundo, ultrapassando a marca dos embriões (Tabela 1) (MEIRELLES et al., 2008). Figura 1. Produção de embriões bovinos no Brasil de acordo com a técnica utilizada durante o período de

22 10 Fonte: Adaptado de Viana et al. (2012) Tabela 1. Participação do Brasil no total de embriões bovinos produzidos in vivo e in vitro no mundo, durante o período In vivo In vitro Total Ano Brasil Mundo % Brasil Mundo % Brasil Mundo % ,53 746,25 9,3 220,43 330,95 66,6 289, ,20 26, ,37 763,47 7,5 212,44 434,58 48,9 269, ,05 22, ,74 777,75 10,8 204,40 441,36 46,3 288, ,11 23, ,21 789,97 15,5 137,04 330,65 41,4 259, ,62 23, ,82 691,55 17,0 83, ,1 201, ,63 19, ,83 693,79 17,0 63,16 330,85 19,1 180, ,64 17, ,86 629,69 13,8 48,67 160,70 30,3 135,53 790,38 17, ,30 580,08 8,0 10,20 109,21 9,3 56,50 689,28 8, ,45 664,32 8,9 12,53 139,37 9,0 71,98 803,69 9,0 Fonte: Adaptado de Viana et al. (2010)

23 11 O cenário nacional da indústria de embriões passa então a refletir nos números da produção mundial. A participação do país no panorama mundial aumenta até 2005, estabilizando nos próximos anos, sendo responsável por 26,9% da produção total de embriões em todo o mundo em 2008 (VIANA et al., 2010). Enquanto no restante do mundo, na maioria das vezes, a técnica in vitro é utilizada como última opção, em situações onde a recuperação de embriões pela lavagem uterina é inviável, no Brasil a PIVE bovinos tem se tornado a primeira opção na multiplicação de animais de interesse zootécnico (NONATO JR et al., 2003). Certamente este fato correlaciona-se com o plantel nacional, pelo predomínio da raça Nelore, tanto por produzir mais na PIVE, quanto pela valorização dos embriões devido aos altos preços muitas vezes alcançados nesta raça. Com o maior domínio da técnica e a grande quantidade de laboratórios também contribuiu para a sua popularização (PONTES et al., 2011). Etapas da produção in vitro de embriões O termo PIVE é geralmente utilizado para se referir a uma série de procedimentos realizados em laboratório, que incluem a maturação, a fertilização e o cultivo in vitro, necessários para produzir embriões a partir de oócitos imaturos. Além disso, a colheita dos oócitos realizada através da OPU também é considerada por alguns autores como uma etapa da PIVE (VAGARO et al., 2008). Colheita dos oócitos A colheita de oócitos é considerada a base do programa de produção de embriões in vitro (PIETERSE et al., 1988), podendo ser realizada tanto in vitro, por meio de ovários de abatedouros, quanto in vivo, através de diversos procedimentos que foram evoluindo ao longo das últimas décadas (GONÇALVES et al., 2008). Quando realizada in vitro, através de ovários de abatedouros, é efetuada a punção folicular com agulha acoplada a uma seringa ou bomba de vácuo

24 12 (GONÇALVES et al., 2002). Apesar de bastante utilizada com propósitos científicos e viabilizar o nascimento de um número expressivo de descendentes de doadoras que vieram a óbito, quando realizada de forma comercial, este procedimento apresenta algumas dificuldades, como: problemas no transporte do abatedouro ao laboratório, o desconhecimento acerca do estado de saúde e do padrão hormonal dos animais, assim como a impossibilidade de repetição da técnica para um mesmo animal (SENEDA et al., 2002). Com os entraves da colheita em ovários de abatedouros, foram propostas novas alternativas, buscando o aproveitamento de oócitos in vivo (BOLS et al., 1995; LEIVAS et al., 2004). Primeiramente foi realizada de forma cirúrgica, através de diferentes técnicas como a laparotomia, a laparoscopia transvaginal ou paralombar e a colpotomia, sendo possível a recuperação de oócitos com êxito em vacas, novilhas e até mesmo bezerras (HINRICHS et al., 1990; TESSMANN, 2004), entretanto, a dificuldade de realização destas técnicas, a ocorrência de fibroses, aderências ovarianas e os riscos de peritonites impediram sua expansão (LOONEY et al., 1994). O advento da ultrassonografia na reprodução animal marcou a evolução da obtenção de oócitos bovinos in vivo (BONI, 2012). Os primeiros relatos ocorreram em 1987, em que os ovários eram manipulados por via transretal e posicionados dorsolateralmente na cavidade abdominal e um transdutor linear com frequência de 3,5 MHz era posicionado externamente na pele, na região paralombar, de forma que fosse possível a visualização dos folículos e sua punção por meio de agulhas específicas (SENEDA et al., 2002). Posteriormente, Pieterse et al. (1988), a partir de modificações da técnica usada para humanos, descreveram a aspiração folicular via transvaginal por meio da ultrassonografia, tornando viável o aproveitamento de oócitos de forma simples e inócua, podendo ser repetida várias vezes em um mesmo animal, sem as limitações descritas nos procedimentos anteriores. Na OPU, um sistema de bomba a vácuo permite a recuperação de oócitos e líquido folicular para um tubo coletor. Em seguida, é feita a procura e seleção dos oócitos viáveis, em microscópio estereoscópico, de acordo com sua morfologia, aqueles selecionados são então, transportados até o laboratório onde se inicia as etapas de produção in vitro (GARCIA et al., 2004).

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