UNIVERSIDADE LUTERANA DO BRASIL

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1 UNIVERSIDADE LUTERANA DO BRASIL CURSO DE ODONTOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA NÍVEL: MESTRADO ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: ODONTOPEDIATRIA ESTUDO IN VITRO DA AÇÃO ANTIMICROBIANA DE MATERIAIS EMPREGADOS NA OBTURAÇÃO DOS CANAIS DE DENTES DECÍDUOS UTILIZANDO METODOLOGIAS DIFERENTES CANOAS - RS 2005

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3 ESTUDO IN VITRO DA AÇÃO ANTIMICROBIANA DE MATERIAIS EMPREGADOS NA OBTURAÇÃO DOS CANAIS DE DENTES DECÍDUOS UTILIZANDO METODOLOGIAS DIFERENTES Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Odontologia do Curso de Odontologia da Universidade Luterana do Brasil como requisito final para obtenção do título de mestre em Odontologia Área de Concentração: Odontopediatria Orientador: Prof. Dr. Italo Medeiros Faraco Junior CANOAS RS

4 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) P693e Piva, Fabiane. Estudo in vitro da ação antimicrobiana de materiais empregados na obturação dos canais de dentes decíduos utilizando metodologias diferentes / Fabiane Piva. Canoas, f. : il. Dissertação (Mestrado em Odondotologia - área de concentração : Odontopediatria) Universidade Luterana do Brasil, Orientação: Prof. Dr. Ítalo Medeiros Faraco Junior. 1. Odontologia. 2. Odontopediatria. 3. Dentes decíduos. 4. Restauração dentária. I. Faraco Junior, Ítalo Medeiros. II. Título. CDU (Bibliotecária responsável: Débora Jardim Jardim CRB 10/1598) 3

5 DADOS CURRICULARES NASCIMENTO 02/05/1977 Cachoeira do Sul/RS FILIAÇÃO Domingo Piva Isaura Franceschette Piva Graduação em odontologia pela Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Santa Maria UFSM Especialização em Odontopediatria na Faculdade de Odontologia da Pontifícia Universidade Católica PUC/RS Mestrado em Odontologia (Área de concentração em Odontopediatria) no Curso de Odontologia da Universidade Luterana do Brasil ULBRA/Canoas Professora das disciplinas de Odontopediatria I e II e Clínica de Bebês do Curso de Odontologia da Universidade Luterana do Brasil ULBRA/Cachoeira do Sul. 4

6 DEDICATÓRIA Dedico esta dissertação a meus pais, Domingo e Isaura, pelo amor, carinho e dedicação que sempre me deram em todos os momentos de minha vida, me incentivando na conquista dos meus ideais. 5

7 AGRADECIMENTO ESPECIAL Ao meu orientador, Prof. Dr. Italo Medeiros Faraco Junior, pelos ensinamentos transmitidos, pelo exemplo de sabedoria, de organização, pela dedicação na orientação deste trabalho e pela amizade desenvolvida. 6

8 AGRADECIMENTOS Ao Professor Paulo Foriani Kramer em nome do grupo da Odontopediatria da ULBRA Canoas/RS, pelo incentivo e confiança que em mim depositaram ao me proporcionarem a oportunidade de ingressar na docência. A todos, muito obrigada. À minha família pelo amor incondicional, carinho e constante estímulo. Vocês são especiais para mim e grandes responsáveis pelas minhas conquistas. À minha irmã Cristiane pela paciência e carinho e pelos seus ensinamentos que muito me ajudaram no aprendizado em microbiologia. E pela nossa grande e sincera amizade. Ao Rafael pelo carinho e compreensão. Aos Colegas Cristiano, Karini, Licéli e Simone pelo convívio, amizade e pelos momentos especiais que tivemos durante o curso. Aos Colegas Gilberto Sari e Raquel Meira pela convivência, apoio e amizade que muito me ajudaram no início da minha vida acadêmica. 7

9 Ao Coordenador da Odontologia da ULBRA - Campus Cachoeira do Sul, professor Francisco Avelar Bastos pela sua compreensão, constante incentivo e amizade. Às professoras Tânia Prochnow e Elsa Nhuch, responsáveis pelo laboratório de microbiologia da ULBRA - Canoas, pelo apoio e incentivo. À Ana Carolina Evangelista da Fonseca que demonstrou em todos momentos extremo interesse ao conhecimento e muito colaborou no início deste trabalho. Aos professores Carlos e Cyntia Estrela pela disponibilidade em me receber em Goiânia, pela maneira especial que me atenderam, pelos conhecimentos transmitidos e pela amizade. Ao Professor Carlos Alberto Feldens pelo seu conhecimento, dedicação e paciência em ensinar e pela enorme contribuição na interpretação dos resultados deste trabalho. A todos que de alguma maneira contribuíram para a realização deste trabalho, meus sinceros agradecimentos. 8

10 RESUMO Proposição - avaliar in vitro a capacidade antimicrobiana de seis materiais utilizados como obturadores de canais de dentes decíduos por meio de dois métodos. Metodologia - os materiais testados foram: pasta Guedes-Pinto, pasta CTZ, óxido de zinco e eugenol, Calen, L&C e MTA. Uma mistura microbiana foi preparada acrescentando-se 1 ml de cada uma das suspensões puras dos seguintes microrganismos: Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Candida albicans. No método de exposição direta 54 cones de papel absorvente esterilizados foram contaminados na mistura microbiana. Após, os cones de papel foram distribuídos em placas de Petri contendo as diferentes pastas, ficando cobertos completamente pelas mesmas. Nos intervalos de 24, 48 e 72 horas três cones foram removidos do contato com os respectivos materiais e imersos em 7 ml de Letheen Broth ficando incubado a 37ºC por 48 horas. Um inóculo de 100 µl obtido do Letheen Broth foi transferido para 7 ml de BHI e mantido sob as mesmas condições de incubação. O crescimento microbiano foi avaliado macroscopicamente pela turvação no caldo BHI. Para o método de difusão em ágar foram utilizadas 18 placas de Petri contendo 20 ml do meio BHI ágar que foram inoculadas com 100 µl da mistura microbiana usando swab esterilizado na superfície do meio. Foram utilizadas três placas para cada material, sendo que em duas foram confeccionadas três cavidades e em uma quatro (total=10 poços/material), sendo estas preenchidas completamente com os diferentes 9

11 materiais. As placas foram preencubadas à temperatura ambiente por 1 hora e depois incubadas a 37ºC por 48 horas. As zonas de inibição foram mensuradas em milímetros e submetidas aos testes Kruskal-Wallis e Mann-Whitney. Resultados somente a pasta CTZ e o MTA inibiram completamente a mistura com o método de exposição direta. No método de difusão as pastas CTZ e Guedes-Pinto apresentaram halos de inibição estatisticamente maiores que os demais materiais (p<0,001). A L&C e o MTA não apresentaram halos de inibição. Conclusão - a pasta CTZ e o MTA evidenciaram ação antimicrobiana pelo método de exposição direta e as pastas Guedes-Pinto, CTZ, Calen e o OZE apresentaram ação antimicrobiana por difusão em ágar. Palavras Chave - dente decíduo, tratamento do canal radicular, microbiologia 10

12 ABSTRACT Proposition: to evaluate in vitro the antimicrobial capacity of six materials used as root canal filling in deciduous tooth by two methods. Methodology- the tested materials were: the Guedes-Pinto paste, the CTZ paste, zinc oxide eugenol, Calen, L&C and MTA. One microbial mixture was prepared with 1 ml of each of these pure suspensions of the following microorganisms: Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Candida albicans. For the direct exposure test, 54 paper points sterilized were contaminated with the microbial mixture suspensions. After, the paper points were placed on Petri plates containing the different root canal filling remaining completely covered by themselves. At intervals of 24, 48 and 72 h, 3 paper points were removed from contact with the respective materials and immersed in 7 ml of Letheen Broth, followed by incubation at 37 C for 48 h. An inoculum of 100 µl obtained from Letheen Broth was transferred to 7 ml of BHI under identical incubation conditions. The microbial growth was macroscopally evaluated by the turbidity in the BHI broth. For the agar diffusion test, 18 Petri plates with 20 ml of BHI agar were inoculated with 100 µl of the microbial mixture suspensions, using sterile swabs on the surface of the medium. Three plates were used for each material, considering that in two of them, three cavities were made and one cavity out of four (total = ten per material), these were completely filled with the different materials. The plates were preincubated for 1h at room temperature, and then incubated at 37 C for 11

13 48 h. The inhibition zones were measured in millimeters and the Kruskal-Wallis and Mann-Whitney tests were performed. Results- only the CTZ paste and the MTA cement substances completely inhibitted the mixture with the direct exposure test. For the agar diffusion test the CTZ and Guedes-Pinto pastes presented inhibition halos statistically bigger than the other materials (p<0,001). The L&C paste and the MTA did not present inhibition halos. Conclusion- the CTZ and MTA presented antimicrobial action by direct exposure method and the Guedes-Pinto, CTZ, Calen pastes and the OZE presented antimicrobial action by agar diffusion test. Key words : deciduous tooth, root canal therapy, microbiology 12

14 SUMÁRIO DADOS CURRICULARES...iv DEDICATÓRIA...v AGRADECIMENTO ESPECIAL...vi AGRADECIMENTOS...vii RESUMO...iv ABSTRACT...xi LISTA DE ILUSTRAÇÕES ABREVIATURAS E SÍMBOLOS INTRODUÇÃO REVISÃO DA LITERATURA PROPOSIÇÃO METODOLOGIA Amostras microbianas e preparo das suspensões Componentes e preparo dos materiais obturadores Testes de atividade Determinação da Ação Antimicrobiana por Exposição Direta Determinação da Ação Antimicrobiana por Difusão em Ágar Análise dos dados RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS

15 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Quadro 1: Relação dos microrganismos constituintes da mistura Quadro 2: Medidas dos halos de inibição (mm) formados nas 10 cavidades realizadas no ágar com o método de difusão Fluxograma 1: Delineamento experimental do teste por exposição direta Fluxograma 2: Delineamento experimental do teste por difusão em ágar Tabela 1: Atividade antimicrobiana com o método de exposição direta Tabela 2: Tamanho dos halos (mm) de inibição microbianos com o método de difusão em ágar Tabela 3: Visualização da atividade antimicrobiana dos materiais nos dois diferentes métodos

16 ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ATCC - American Type Culture Collection ATM - atmosfera de ar BHI - Brain Heart Infusion caldo BHIA - Brain Heart Infusion ágar ICB/USP Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de São Paulo CBM - concentração bactericida mínima CIM - concentração inibitória mínima CTZ - cloranfenicol, tetraciclina e óxido de zinco DP desvio padrão KRI - pasta composta por iodofórmio, paramonoclorofenol, cânfora e mentol IRM - Intermediate restorative material L&C - Lopes & Costa pasta composta por hidróxido de cálcio, carbonato de bismuto, colofônia e azeite de oliva LB - Letheen Broth MTA - Mineral Trioxide Aggregate OZE - óxido de zinco e eugenol P.A. - pró-análise PMCC - paramonoclorofenol canforado SPSS Statistical Package for Social Sciences TSA - Triptona de soja - ágar TSB - Triptona de soja - caldo C - grau Celsius g - grama mm - milímetro ml mililitro µl - microlitro - marca registrada p - probabilidade ph - sigla para potencial hidrogeniônico % - sinal matemático que indica porcentagem 14

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18 1. INTRODUÇÃO Sabe-se que as medidas de promoção de saúde bucal e os procedimentos preventivos são essenciais para que o desenvolvimento bucomaxilofacial da criança seja garantido. Entretanto, existem situações em que o dente decíduo apresenta lesões cariosas extensas ou é acometido por traumatismo alveolodentário, tendo como conseqüência comprometimento pulpar, tornando-se assim necessária a realização do tratamento endodôntico para a sua preservação no arco dentário. O tratamento endodôntico de dentes decíduos, também chamado de pulpectomia, tem como passos principais a instrumentação, a irrigação e o preenchimento dos canais com um material obturador. Diferentes técnicas de tratamento e medicamentos são propostos na literatura para promover a limpeza e a sanificação dos canais radiculares de dentes decíduos (GUEDES- PINTO et al., 1981; DANDASHI et al.,1993; BENGTSON et al., 1995). No entanto, a peculiar conformação e a topografia dos canais radiculares dos dentes decíduos com curvaturas acentuadas e uma grande quantidade de canais acessórios dificultam o acesso e a instrumentação desses dentes (HIBBARD, IRELAND, 1957; TOLEDO, 1961; BENFATTI, TOLEDO, 1966). Scheffer et al. (1973) chegaram a contra-indicar a instrumentação dos canais radiculares de molares decíduos devido à dificuldade apresentada pela topografia radicular e também à possibilidade de lesão aos tecidos periapicais 16

19 e ao germe do dente permanente. Em vista disso, por muito tempo, o tratamento endodôntico de dentes decíduos ficou restrito à manipulação da câmara pulpar, na qual eram colocados medicamentos como formocresol, tricresol formalina e paramonoclorofenol canforado e posterior selamento do dente, dispensando assim a instrumentação dos canais radiculares (SWEET, 1935, VELLING, 1961). Além do aspecto anatômico, o processo de rizólise em dentes decíduos ocorre de maneira irregular e nem sempre é detectado radiograficamente. Esse fato faz com que haja dificuldade de se estabelecer um limite apical tanto para a instrumentação quanto para a obturação dos canais, havendo a possibilidade de lesar o periodonto e atingir o germe do dente permanente (BENFATTI et al., 1967; SHEFFER et al., 1973). O extravasamento de materiais com propriedades não biocompatíveis e não reabsorvíveis também pode afetar as estruturas periapicais e ocasionar a sua permanência no tecido ósseo ou gengival mesmo após a esfoliação do dente decíduo (RUSSO et al., 1976; RIFKIN, 1980; HENDRY, 1982). Frente a essas características peculiares dos dentes decíduos que dificultam a manipulação dos canais, o sucesso do tratamento endodôntico depende de meios que proporcionem a redução ou a eliminação das bactérias não só nos canais radiculares, mas também nos locais em que o preparo químico-mecânico não obteve acesso. Considerando-se as limitações da instrumentação dos canais de dentes decíduos, a utilização de pastas obturadoras com capacidade antimicrobiana representa um dos aspectos mais importantes para obtenção do sucesso da terapia endodôntica. Além disso, a manutenção das condições de limpeza e de sanificação obtidas durante a instrumentação dos canais são, no decorrer do tempo, mantidas graças não só aos medicamentos contidos no material obturador como também na ação terapêutica de seus componentes no interior do canal. Algumas características ideais das pastas obturadoras de dentes decíduos foram descritas por diferentes autores (RIFKIN, 1980; KUBOTA et al., 1992). O material deve ser de fácil inserção no canal radicular e também de 17

20 fácil remoção, deve ser inóculo aos tecidos periapicais e ao germe do dente sucessor permanente. Deve ainda apresentar boa radiopacidade para que possa ser realizado o acompanhamento radiográfico pós-operatório do tratamento, assim como não deve manchar a estrutura dentária e ser reabsorvível para acompanhar o processo de rizólise e possuir ação antimicrobiana. Em função de a ação antimicrobiana ser uma das mais importantes características das pastas obturadoras de canais de dentes decíduos, o presente estudo avaliará in vitro a capacidade antimicrobiana de seis materiais diante de uma mistura de microrganismos por meio de dois métodos diferentes, a difusão em ágar e a exposição direta. 18

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22 2. REVISÃO DA LITERATURA Dentre os materiais utilizados na obturação de canais radiculares em dentes decíduos, o óxido de zinco e eugenol é um dos mais amplamente empregados nos tratamentos endodônticos, especialmente nas escolas de Odontologia americanas e canadenses, nas quais 94% preconizam a utilização desse cimento (PRIMOSCH et al., 1997). No Brasil, estudos semelhantes ao de Primosch et al. (1997) observaram que o óxido de zinco e eugenol é o segundo material mais utilizado, representando 19% e 22,9% das Faculdades de Odontologia Brasileira pesquisadas (KRAMER et al., 2000; CORRÊA BRUSCO et al., 2002). Esse material apresenta boa radiopacidade, fácil manipulação e inserção nos canais; no entanto, apresenta certo potencial irritante e citotóxico aos tecidos periapicais e nem sempre reabsorve juntamente com o processo de rizólise, permanecendo, portanto, no interior do tecido gengival (COX JUNIOR et al., 1978; RUSSO et al., 1976; SPEDDING, 1985; SADRIAN, COLL, 1993; WRIGHT et al., 1994; COSTA et al., 1996; MANI et al., 2000). Devido ao fato de ser um dos materiais mais comumente utilizado na terapia pulpar em dentes decíduos, diversos estudos clínicos, radiográficos, histológicos e da atividade antimicrobiana compararam o emprego do óxido de zinco e eugenol com diferentes materiais obturadores. Hendry et al. (1982) e Woods et al. (1984) compararam o emprego do óxido de zinco e eugenol e materiais obturadores à base de hidróxido de cálcio utilizando-os como cimento obturador nos tratamentos endodônticos realizadas em dentes de cães e demonstraram que, quando foi utilizado o óxido de zinco 20

23 e eugenol, este provocou maior reação inflamatória crônica e reabsorção lenta do material e que nem sempre acompanhou o processo fisiológico de reabsorção das raízes dos dentes decíduos dos cães. A retenção prolongada do óxido de zinco e eugenol também foi relatada por Coll et al. (1988), que, apesar de encontrarem taxas de sucesso em 77,7% dos casos, observaram que 73,3% dos incisivos decíduos tratados endodonticamente apresentavam óxido de zinco e eugenol no tecido gengival após a esfoliação dos dentes. Sadrian, Coll (1993) observaram que a retenção do óxido de zinco e eugenol após a esfoliação de molares decíduos com tratamento endodôntico foi de 52,1% e de incisivos decíduos foi de 44,8%, totalizando uma taxa de 49,4% de retenção do material, após a perda do dente, em crianças. No entanto, o sucesso clínico e radiográfico (55%) assim como as falhas (29,4%) não tiveram relação com a taxa de retenção do material. Mani et al. (2000) também relataram que, em 60% dos casos, o óxido de zinco e eugenol reabsorveu mais lentamente que as raízes dos dentes decíduos tratados endodonticamente, enquanto 40% reabsorveram juntamente com as mesmas. Gould (1972) observou que 29 dos 35 molares decíduos obturados em uma única sessão com óxido de zinco e eugenol e acompanhados por um mesmo período de tempo apresentaram sucesso clínico e radiográfico (82,8%), entretanto nenhuma menção foi dada quanto à retenção do óxido de zinco e eugenol no tecido gengival. Holan, Fuks (1993) e Mani et al. (2000) avaliaram o sucesso do tratamento endodôntico em molares decíduos, utilizando como material obturador o óxido de zinco e eugenol. As taxas de sucesso clínico e radiográfico foram respectivamente de 65% e 83,3%. Os estudos que avaliaram a ação antimicrobiana do óxido de zinco e eugenol serão descritos de forma mais extensa abordando além dos resultados as diferentes metodologias empregadas (BENFATTI, ANDRIONI, 1969; COX JUNIOR et al., 1978; GROSSMAN, 1980; OGATA et al., 1984; WRIGHT et al., 1994; TCHAOU et al., 1995; TCHAOU et al., 1996). Em 1969, Benfatti, Andrioni avaliaram a ação antimicrobiana de alguns medicamentos empregados no tratamento endodôntico de dentes decíduos. Os materiais testados foram pastas contendo óxido de zinco associado ao 21

24 formocresol, PMCC (ox-para), antibiótico (frademicina) e com eugenol (OZE). Para a realização do experimento, foram utilizadas placas de Petri com ágar simples enriquecido com triptona, nas quais foram semeados microrganismos coletados de canais de dentes decíduos contaminados (Streptococcus e Staphylococcus). A metodologia utilizada foi a disco-difusão e a leitura dos halos foi realizada após o período de 48 horas de incubação da placas a 37ºC. Os resultados demonstraram que a pasta ox-para provocou maior halo de inibição diante das bactérias testadas, seguida pelas pastas contendo formocresol e antibiótico, que mostraram igualdade na inibição do crescimento bacteriano. Os menores halos de inibição foram evidenciados com o OZE. Os autores concluíram, ao final do estudo, que todas as pastas testadas foram eficientes na inibição do crescimento dos microrganismos testados e que podem ser empregadas no tratamento endodôntico de dentes decíduos infectados. Cox Junior et al. (1978) avaliaram o efeito antimicrobiano do óxido de zinco e eugenol, óxido de zinco e eugenol zinco acetato, formocresol e pasta N-2 nas suas formulações originais e em seus componentes separadamente. O método utilizado foi a disco-difusão em meio ágar, sendo que os discos foram impregnados com os respectivos materiais e dispostos sobre as placas previamente inoculadas com os microrganismos Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Streptococcus viridans, permanecendo em estufa a 37 C por 24 horas até que se procedeu às leituras dos halos de inibição. Os resultados puderam evidenciar que o óxido de zinco e eugenol foi capaz de inibir somente as bactérias Gram positivas (Staphylococcus aureus e Streptococcus viridans) não apresentado capacidade de inibição diante do microrganismo Gram negativo testado (Escherichia coli). Os autores concluíram, no final do estudo, que, diante dos microrganismos testados e mediante o método empregado o óxido de zinco e eugenol - zinco acetato acrescido de formocresol foi o que apresentou maior potencial inibitório seguido da pasta N-2. Grossman (1980) avaliou o efeito antimicrobiano de 11 cimentos obturadores e a duração desse efeito no período de 24 horas a 10 dias. Os 22

25 cimentos utilizados foram AH 26, Diaket, Kerr, Mynol, N2, ProcoSol, Roth 811, RC2B, Tubliseal, OZE (óxido de zinco e eugenol) e OZE acrescido de 6,5% de paraformaldeído, testados em condições de anaerobiose frente a cepas isoladas de Bacillus subtilis e bactérias removidas da cavidade bucal. O método utilizado foi a difusão orifícios no ágar, sendo que, após o período de 24 horas a 37ºC, foram realizadas as leituras dos diâmetros dos halos de inibição. O maior halo de inibição do crescimento microbiano foi observado para o OZE acrescido de paraformaldeído (30,9mm), enquanto somente o OZE apresentou halo de 12,6mm. No entanto, com o passar do tempo, todos os cimentos apresentaram decréscimo ou ausência de halo de inibição independentemente da presença ou não de paraformaldeído. Após cinco dias, o OZE não demonstrou nenhum efeito antimicrobiano aos microrganismos testados. Com a finalidade de avaliar in vitro as possíveis influências que a variação da proporção pó/líquido dos cimentos endodônticos pudessem exercer sobre a ação antimicrobiana, Ogata et al. (1984) realizaram um estudo com os cimentos Fillcanal, óxido de zinco e eugenol, Alphacanal, Vedacanal e N-Rickert diante de diferentes microrganismos (Streptococcus faecalis, Streptococcus liquefaciens, Staphylococcus aureus, Pseudomonas sp, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus sp, Candida sp, Streptococcus mitis, Neisseria sp). A metodologia empregada foi a difusão orifício no ágar, sendo que, em cada placa de Petri, foram realizados três orifícios eqüidistantes que continham os cimentos em três consistências diferentes: fluida, média e espessa. A leitura dos halos de inibição foi realizada após 24 horas de incubação das placas a 37ºC. Após a análise dos resultados, os autores concluíram que existe uma relação direta entre a fluidez dos materiais testados com sua maior capacidade antimicrobiana. Quanto ao óxido de zinco e eugenol, ficou evidente que a proporção pó/líquido mais fluida foi mais efetiva diante dos microrganismos testados, exceto para o microrganismo Bacillus sp em que as proporções fluida e média apresentaram resultados iguais. Wright et al. (1994) compararam in vitro os efeitos antimicrobianos e citotóxicos da pasta KRI e do óxido de zinco e eugenol (OZE). A ação 23

26 antimicrobiana foi avaliada diante da cultura isolada de Enterococcus faecalis, utilizando o método de difusão orifícios no ágar. Após 24 horas, os halos foram mensurados, e os resultados puderam demonstrar que a pasta OZE produziu zonas de inibição de crescimento microbiano maiores que a pasta KRI. Quanto à citotoxicidade, a pasta KRI manteve-se bastante citotóxica durante o período de quatro horas em contato com as culturas de células (fibroblastos de ratos), enquanto a do OZE reduziu com o passar do tempo. Os autores concluíram que a pasta KRI tem menor capacidade antimicrobiana que o OZE diante do microrganismo testado e que se mostrou mais citotóxica quando em contato direto com a cultura de fibroblastos. Tchaou et al. (1995) observaram o potencial antimicrobiano in vitro de materiais utilizados na prática endodôntica de dentes decíduos, diante de culturas bacterianas originárias de 13 dentes com canais radiculares infectados. Com auxílio de limas endodônticas, a amostra bacteriológica foi coletada imediatamente após a exodontia do dente e transferida para o meio de cultura. As diferentes pastas foram testadas pelo método de difusão - orifício no ágar. Os materiais foram agrupados de acordo com o poder antimicrobiano: Categoria I, com maior poder antimicrobiano, incluiu os materiais: hidróxido de cálcio e paramonoclorofenol canforado (PMCC); óxido de zinco e PMCC; OZE e formocresol. Categoria II, com poder antimicrobiano médio: OZE e clorexidina; KRI; OZE; óxido de zinco e água. Categoria III, com o menor poder antimicrobiano: Vitapex; hidróxido de cálcio e água; vaselina. Não houve diferença significativa numa mesma categoria, porém houve diferença entre as categorias. A exceção foi o efeito antimicrobiano do OZE e formocresol que não teve diferença significativa quando comparado com o OZE e clorexidina, KRI ou OZE. Nessa mesma linha de pesquisa, Tchaou et al. (1996) compararam o efeito antimicrobiano de nove materiais obturadores diante de 21 culturas isoladas de microrganismos. Os materiais utilizados foram paramonoclorofenol canforado e hidróxido de cálcio, paramonoclorofenol canforado e óxido de zinco, formocresol e óxido de zinco e eugenol, clorexidine e óxido de zinco e eugenol, pasta KRI, óxido de zinco e eugenol (OZE), óxido de zinco e água, 24

27 hidróxido de cálcio e água, Vitapex e vaselina que foi utilizada como controle. O método utilizado foi a difusão - orifício no ágar, sendo que foram testados dois materiais por placa, mantidos em estufa a 37 C até que se procedesse à leitura das zonas de inibição. Após a mensuração dos halos de inibição bacteriana, os autores dividiram os materiais em cinco grupos, sendo que o óxido de zinco e eugenol foi classificado no grupo dos materiais que possuem pequeno poder de inibição. No entanto, o óxido de zinco e eugenol inibiu quase todas as espécies microbianas testadas, exceto Peptostreptococcus micros, Peptostreptococcus magnus, ambos microrganismos anaeróbios Gram positivos e o Streptococcus mutans aeróbio facultativo Gram positivo. A utilização de pastas contendo iodofórmio é descrita na literatura desde quando foi denominada de KRI a pasta composta por iodofórmio, paramonoclorofenol, cânfora e mentol. Desde então, diversos estudos clínicos, radiográficos e histológicos em dentes permanentes e decíduos de animais e humanos têm demonstrado sucesso com materiais iodoformados derivados desta primeira composição (CASTAGNOLA, ORLAY, 1952; MAISTO, ERAUSQUIN, 1965; RIFKIN, 1980; MASS, ZILBERMAN, 1989). Relatos também demonstraram nenhum efeito desfavorável ao germe do dente permanente quando a pasta contendo iodofórmio foi utilizada (GARCIA- GODOY, 1987; FUKS, 1996). As pastas que contêm iodofórmio são prontamente reabsorvíveis, quando extravasadas na região periapical e, devido à liberação de iodo em estado nascente, estimulam a reparação óssea na região, bem como a neoformação óssea, favorecendo o reparo de lesões periapicais. O iodofórmio também apresenta um potencial antibacteriano residual que previne a reinfecção dos canais radiculares (TAGGER, SARNAT, 1984; DANIEL et al., 1999). Em 1981, Guedes-Pinto et al. apresentaram no Brasil uma nova técnica para tratamento de dentes decíduos com polpa necrosada. Nessa técnica, um dos aspectos mais relevantes foi o desenvolvimento de uma pasta para obturação de canais de dentes decíduos composta de partes iguais de iodofórmio, paramonoclorofenol canforado e Rifocort. A manipulação da pasta era realizada previamente a sua inserção nos canais, após a completa 25

28 homogeinização de seus componentes. Nesse trabalho clínico e radiográfico, foram selecionados 45 dentes decíduos com indicação para terapia pulpar, não sendo excluídos dentes com fístula ou mobilidade patológica. A técnica utilizada para o tratamento endodôntico foi realizada em uma única sessão, sob anestesia local e isolamento absoluto e irrigação com líquido de Dakin e Endo- PTC com auxílio de limas endodônticas. Após secagem dos canais, a pasta foi colocada com auxílio da broca lentulo, e o dente foi selado. O controle radiográfico foi realizado a cada dois meses, sendo que, no primeiro ano, foi observado apenas um caso de insucesso. Os autores relataram a regressão espontânea de fístulas após uma semana do tratamento e a completa reabsorção da pasta quando esta foi extravasada do canal, assim não interferindo no processo de rizólise do dente decíduo e na erupção do dente sucessor permanente. A partir dessa publicação, vários estudos têm avaliado diferentes características dessa pasta que levou o nome de seu idealizador, Guedes- Pinto. Em estudos recentes, ela foi classificada como a mais utilizada pelas Faculdades de Odontologia do Brasil em obturação de canais de dentes decíduos (KRAMER et al., 2000; CORRÊA BRUSCO et al., 2002). A biocompatibilidade da pasta Guedes-Pinto foi avaliada no tecido conjuntivo subcutâneo de camundongos por Michel et al. (1985). Os autores relataram que a referida pasta mostrou-se bem tolerada pelo tecido conjuntivo provocando discreta reação inflamatória que foi decrescendo com o passar do tempo estudado, até que o tecido retornou à completa normalidade ao término do experimento em 90 dias. Lujan (1990) e Chedid et al. (1992) estudaram as reações da pasta Guedes-Pinto em contato com o tecido pulpar de ratos. Concluíram que a pasta Guedes-Pinto apresentou reação inflamatória nos períodos iniciais do estudo que decresceu com o passar do tempo. Houve também a formação de ponte de dentina e regressão completa da inflamação passados 28 dias do procedimento clínico nos animais. A citotoxicidade da pasta Guedes-Pinto foi testada in vitro, assim como seus componentes separadamente por Santos (1998). Os resultados puderam evidenciar que a pasta Guedes-Pinto foi a menos citotóxica entre as substâncias testadas (pasta 26

29 Guedes-Pinto, ácido fosfórico a 37%, formocresol de Buckley e glutaraldeído a 2%) e que, dentre os componentes (Rifocort, PMCC, iodofórmio, formaldeído, cresol, glicerina, água destilada), o paramonoclorofenol canforado apresentou a maior citotoxicidade do estudo. A análise histológica do tecido periapical de dentes decíduos de cães, comparando a técnica preconizada por Guedes-Pinto et al. (1981) e a técnica empregada na Faculdade de Odontologia de Araçatuba, foi estudada por Faraco Junior, Percinoto (1998). Os autores concluíram que as duas técnicas foram bem toleradas pelos tecidos periapicais quanto à intensidade de inflamação e o grau de reabsorção. Estudos clínicos e radiográficos em dentes decíduos humanos têm demonstrado excelentes resultados com o emprego da pasta Guedes-Pinto tanto em pulpotomia (BENGTSON et al., 1992) quanto no tratamento endodôntico (GUEDES-PINTO et al., 1981; PUPPIN-RONTANI et al., 1994). A boa radiopacidade, a biocompatibilidade com os tecidos periapicais (SOUZA et al., 2000) e a capacidade de reabsorção são algumas das características favoráveis dessa pasta. No entanto, a presença do iodofórmio faz com que a forte coloração da pasta promova possível manchamento da estrutura dentária remanescente. Quanto à capacidade antimicrobiana, Guedes-Pinto et al. (1981) consideraram que a presença do paramonoclorofenol canforado, do iodofórmio e do antibiótico de superfície (Rifamicina contido no Rifocort ) confere ótima propriedade antisséptica à pasta. Tentando demonstrar essa ação antimicrobiana, alguns estudos têm sido realizados utilizando diferentes metodologias. Bonow, em 1993, avaliou a atividade antimicrobiana imediata e residual de quatro pastas e três líquidos utilizados na terapia endodôntica de dentes decíduos. As pastas utilizadas foram pasta Guedes-Pinto original (GUEDES- PINTO et al., 1981); pasta Guedes-Pinto modificada 1: com menos iodofórmio acrescida de óxido de zinco; pasta Guedes-Pinto modificada 2: com menos iodofórmio acrescida de hidróxido de cálcio; pasta Guedes-Pinto modificada 3: com menos iodofórmio acrescida de óxido de zinco e hidróxido de cálcio. Os líquidos testados foram o formocresol, formocresol diluído a 1/5 e glutaraldeído a 2%. A metodologia utilizada foi a disco-difusão em meio ágar. Os discos foram impregnados com cada pasta e líquido, colocados sobre placas de Petri 27

30 semeadas com os seguintes microrganismos Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Enterococcus faecalis e Bacillus subtilis. As pastas e os líquidos foram testados nos intervalos experimentais imediato, 7, 14, 28, 60 e 90 dias, nos quais foi verificada a ausência ou a presença de halo de inibição e a mensuração do diâmetro desse halo. Os resultados demonstraram que a pasta Guedes-Pinto acrescida de óxido de zinco seguida da pasta Guedes- Pinto original foram as que apresentaram atividade antimicrobiana mais acentuada, enquanto o formocresol diluído a 1/5 obteve a mais fraca atividade antimicrobiana. Gomes et al. (1997) verificaram, por meio de cultura microbiológica, a eficiência do preparo biomecânico e da pasta Guedes-Pinto, utilizada na obturação dos canais de dentes decíduos necrosados. No estudo, foram realizadas três coletas de material biológico em diferentes fases do tratamento endodôntico. A primeira amostra foi realizada logo após a remoção do teto da câmara pulpar, a segunda coleta foi após o preparo químico mecânico dos canais, e a terceira coleta foi realizada decorridos sete dias da obturação dos canais com a referida pasta obturadora. Todas as coletas microbiológicas seguiram o mesmo protocolo, sendo realizadas com auxílio de cones de papel absorvente estéreis introduzidos no canal e transferidos imediatamente para tubos de ensaio contendo caldo para cultivo de microrganismos. Os tubos que apresentaram turvação, ou seja, com culturas positivas, foram desprezados e os que não apresentaram turvação até um período de 20 dias foram considerados culturas negativas. Os resultados encontrados na primeira e na segunda amostra, ou seja, antes e após o preparo químico-mecânico foram de culturas positivas em 100% dos casos. Já na terceira amostra, após sete dias da pasta no interior dos canais, foram encontradas 52% de culturas positivas. Perante esses resultados, os autores recomendam que outras técnicas laboratoriais sejam utilizadas para a verificação do potencial antimicrobiano da pasta Guedes-Pinto. Silva et al. (2002) avaliaram a ação antimicrobiana de cinco pastas obturadoras utilizadas em canais radiculares de dentes decíduos. Pasta 28

31 contendo iodofórmio, PMCC, hidróxido de cálcio e propilenoglicol; pasta com iodofórmio, PMCC, Rifocort ; pasta de hidróxido de cálcio e propilenoglicol; pasta composta de PMCC, hidróxido de cálcio e propilenoglicol; pasta contendo iodofórmio, hidróxido de cálcio e propilenoglicol. Além das pastas, seus componentes também foram avaliados separadamente pelo método de difusão - orifício no ágar frente aos seguintes microrganismos: Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus, Candida albicans e Enterococcus faecalis. A leitura dos halos foi realizada após 24 horas de incubação das placas a 37ºC. Os resultados demonstraram a maior efetividade antimicrobiana da pasta composta por iodofórmio, PMCC e rifocort contra todos os microrganismos testados. Quanto aos componentes, o PMCC e o rifocort foram os que apresentaram efetividade antimicrobiana contra os quatro microrganismos testados. Praetzel (2003) avaliou o efeito antimicrobiano bactericida e bacteriostático da pasta Guedes-Pinto (Guedes-Pinto et al., 1981) armazenada sob refrigeração e à temperatura ambiente em diversos períodos de tempo, do imediato a 90 dias. A atividade antimicrobiana da pasta foi testada frente aos seguintes microrganismos: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Enterococcus faecalis, Escherichia coli e Bacillus subtilis por meio do método de difusão - orifício no ágar. O estudo concluiu que a pasta Guedes-Pinto, nas diferentes formas de armazenamento, apresentou um poder bacteriostático diante de todos os microrganismos testados em todos os períodos de tempo. O potencial bactericida também foi evidenciado para quase todos os microrganismos, exceto para o Enterococcus faecalis e para o Bacillus subtilis. As excelentes propriedades do hidróxido de cálcio quanto à preservação e ao reparo dos tecidos periapicais comprovam o seu histórico uso na endodontia. Na dentição decídua, o uso de pastas associando o iodofórmio e o hidróxido de cálcio demonstrou resultados clínicos e histopatológicos favoráveis nas terapias pulpares de dentes decíduos (MAISTO, EURASQUIM, 1965; KUBOTA et al., 1992). A adição do hidróxido de cálcio às pastas iodoformadas aumenta o ph conferindo o efeito antimicrobiano à pasta, além 29

32 de difundir na região do assoalho da câmara pulpar e túbulos dentinários, assim ativando a fosfatase alcalina e promovendo a reparação óssea (REYES, REINA, 1989). A atividade antimicrobiana é resultante do seu ph alcalino alcançado pela dissociação iônica do hidróxido de cálcio em íons cálcio e íons hidroxila que inibem as enzimas da membrana citoplasmática das bactérias, alterando a disponibilidade de nutrientes, provocando efeitos tóxicos à célula bacteriana. Também promovem a ativação da fosfatase alcalina no tecido, conferindo a este a mineralização e o reparo ósseo (ESTRELA et al., 1994). Alguns estudos verificaram o potencial antimicrobiano do hidróxido de cálcio P.A. (pró-análise) acrescido de água destilada, solução salina e também associado a diferentes veículos (DIFIORI et al., 1983; LAGE MARQUES et al., 1992; SIQUEIRA JUNIOR, UZEDA, 1997; BARBOSA et al., 1997; ESTRELA et al., 1998; ESTRELA et al., 2001c; LIN et al., 2003). DiFiore et al. (1983) testaram o potencial antibacteriano de pastas de hidróxido de cálcio acrescidas de diferentes veículos, sendo eles o PMCC, acetato de metacresila, metil celulose e água destilada. Culturas de Streptococcus sanguis foram semeadas em placas contendo meio semi-sólido. Cinco cilindros com 10mm de comprimento por 8mm de diâmetro foram colocados nas placas e receberam as pastas com os diferentes veículos, e selados com Cavit, sendo que o cilindro controle recebeu apenas o último material. As placas foram incubadas anaerobicamente, e os halos de inibição mensurados nos intervalos de 2, 4, 6 e 8 dias. Os resultados demonstraram que as pastas de hidróxido de cálcio com água destilada e metil celulose não evidenciaram halos de inibição. As pastas de hidróxido de cálcio contendo PMCC e acetato de metacresila apresentaram halos de inibição microbiana que foram diminuindo com o tempo do estudo. Os resultados são discutidos pelos autores ao esclarecerem que o tamanho do halo de inibição formado não reflete, necessariamente, o poder antimicrobiano de um material, uma vez que esse tamanho pode sofrer influência do tamanho molecular da substância testada e da sua constante de difusão. 30

33 Lage Marques et al. (1992) analisaram a capacidade antimicrobiana do hidróxido de cálcio P.A. perante as cepas microbianas Bacillus subtilis, Candida albicans, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis e Pseudomonas aeruginosa. As metodologias utilizadas no estudo foram a difusão orifícios em ágar e a diluição. Na difusão em ágar, foram utilizadas placas de Petri, contendo o meio semi-sólido Ágar Triptona de Soja (TSA), contaminadas na superfície com os respectivos microrganismos, nas quais foram realizados orifícios de 8mm de diâmetro que foram completamente preenchidos com uma pasta de hidróxido de cálcio. As placas foram incubadas a 37 C por 24 horas até a leitura dos halos de inibição. No experimento em meio líquido, o caldo Triptona de soja (TSB) foi inoculado com 0,5 ml de cada suspensão microbiana acrescida de 1 ml de solução de hidróxido de cálcio (Ca(OH) 2 P.A. com solução salina estéril) nas diluições de ½, 1/10, 1/50 e 1/100. Os tubos foram incubados em estufa à 37 C por 24 horas. No último método, para verificar a viabilidade das células microbianas, foram coletadas alíquotas de 0,1 ml de cada um dos tubos e transferidas para 5 ml de caldo TSB e novamente incubadas por 24 horas a 37 C para após realizar a leitura da turvação do meio. Os resultados no meio semi-sólido demonstraram somente uma área de difusão do hidróxido de cálcio em torno dos poços. Já em meio líquido, os resultados evidenciaram que o efeito antimicrobiano aumentou quanto mais concentrado o hidróxido de cálcio. Assim, os autores concluíram, que, diante dos microrganismos testados e com os métodos utilizados in vitro, o hidróxido de cálcio em altas concentrações apresentou poder bactericida, enquanto, já em baixas concentrações, não demonstrou ação antimicrobiana. Siqueira Junior, Uzeda (1997) compararam a atividade antimicrobiana da clorexidine, metronodazol e hidróxido de cálcio associado a diferentes veículos in vitro perante os seguintes microrganismos (Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas gingivalis, Actinomyces israelli, Fusobacterium nucleatum, Propionibacterium acnes, Campylobacter rectus, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguis, Actinomyces viscosus, Streptococcus mutans e Streptococcus salivarius). Os materiais utilizados no estudo foram o hidróxido de cálcio associado à água destilada, hidróxido de 31

34 cálcio e paramonoclorofenol canforado (PMCC), hidróxido de cálcio e glicerina, digluconato de clorexidine a 0,12% e metronidazol gel a 10%. O método empregado foi a difusão orifícios em meio ágar, no qual, após a contaminação da superfície do ágar com os respectivos microrganismos, as pastas foram imediatamente preparadas e colocadas no interior dos poços realizados nas placas de ágar, permanecendo a 37 C até o período da leitura dos halos de inibição. Os resultados demonstraram que o hidróxido de cálcio acrescido do PMCC apresentou zonas de inibição diante de todos os microrganismos testados, entretanto o hidróxido de cálcio adicionado à água destilada e à glicerina não foi efetivo sobre nenhuma bactéria testada, não apresentando qualquer halo de inibição, fato que foi discutido pelos autores como sendo decorrente das limitações do teste de difusão para testar essas substâncias e da incapacidade de difusibilidade do hidróxido de cálcio no meio semi-sólido. A clorexidine a 0,12% e o metronidazol gel a 10% inibiram todos os microrganismos testados, porém não foram mais efetivos que o hidróxido de cálcio adicionado ao PMCC. Em 1997, Barbosa et al. compararam o efeito antimicrobiano do hidróxido de cálcio, gluconato de clorexidine e paramonoclorofenol canforado (PMCC) clinicamente e in vitro. No experimento clínico, foram selecionados 311 unirradiculares com necrose pulpar e lesão periapical. Foi realizado o preparo químico-mecânico dos canais e colocado sobre a câmara pulpar uma bolinha de algodão contendo PMCC e o dente foi selado até a próxima consulta. Na segunda consulta, foi coletada a primeira amostra microbiológica do canal e transferida imediatamente para tubos que continham meio trioglicolato e incubados por 7 dias a 37 C. Após essa coleta, os canais foram divididos em três grupos: Grupo 1: novamente bolinha de algodão com PMCC sobre a câmara pulpar; Grupo 2: canais preenchidos com pasta composta de hidróxido de cálcio e solução salina; Grupo 3: canais preenchido com clorexidine a 0,12%. Decorridos sete dias foram realizadas as obturações dos canais das amostras que não apresentaram crescimento no caldo da primeira coleta; em caso contrário, o experimento prosseguiu com uma nova coleta. Todos os medicamentos foram efetivos na redução da microbiota endodôntica, não havendo diferença estatisticamente significativa entre eles. Quando a pasta de 32

35 hidróxido de cálcio e solução salina foi empregada, 73,3% dos casos foram negativos ao crescimento bacteriano. No estudo in vitro, os microrganismos testados foram Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas gingivalis, Actinomyces israelli, Fusobacterium nucleatum, Propionibacterium acnes, Actinomyces naeslundii, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Pseudomonas aeruginosa, e os materiais foram o hidróxido de cálcio adicionado à solução salina, PMCC, clorexidine a 0,12% e 0,2%. Os métodos utilizados foram a difusão orifícios no meio ágar e discodifusão. Os resultados do estudo in vitro demonstraram que o PMCC apresentou maior zona de inibição diante de todos os microrganismos testados. A pasta de hidróxido de cálcio e solução salina apresentou efeito inibitório somente sobre duas espécies microbianas (Actinomyces israelli e Actinomyces naeslundii), sendo relacionado esse baixo desempenho do hidróxido de cálcio in vitro com a metodologia utilizada e a pouca difusibilidade do material no ágar. Estrela et al. (1998) determinaram in vitro o tempo requerido pelo hidróxido de cálcio associado à solução salina estéril para expressar seu efeito antimicrobiano em contato direto com os microrganismos. Os microrganismos testados foram Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Streptococcus sp e quatro diferentes misturas (Mistura I: M. luteus + E. coli + P. aeruginosa; Mistura II: M. luteus + Streptococcus sp + S. aureus; Mistura III: E. coli + P. aeruginosa; Mistura IV: S. aureus + P. aeruginosa). O método utilizado foi a exposição direta, no qual cones de papel absorvente imersos nas suspensões microbianas foram dispostos em placas de Petri e imediatamente cobertos pela substância testada, no caso o hidróxido de cálcio e solução salina estéril. As placas foram incubadas a 37 C e nos intervalos de 0, 1, 2, 6, 12, 24, 48, 72 horas e 7 dias, cones foram retirados do contato direto com a pasta e individualmente imersos em tubos de ensaio contendo 10 ml de caldo Brain Heart Infusion (BHI) e novamente incubados por 48 horas. Os tubos que apresentaram crescimento microbiano foram selecionados para um novo teste, no qual um inóculo de 0,1 ml foi transferido para placas contendo BHI ágar para confirmar o crescimento microbiano. Os resultados evidenciaram o efeito 33

36 antimicrobiano do hidróxido de cálcio somente após 12 horas de contato com o Micrococcus luteus e Fusobacterium nucleatum, 24 horas para Streptococcus sp, 48 horas para Escherichia coli e 72 horas para Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa. A mistura II foi sensível ao hidróxido de cálcio após 48 horas enquanto as misturas I, III e IV foram inativadas após 72 horas de exposição. Diante dos resultados obtidos no estudo, os autores concluíram que a pasta composta por hidróxido de cálcio e solução salina estéril possui ação antimicrobiana sobre todos os microrganismos testados após 72 horas de contato. Estrela et al. (2001c) também avaliaram a influência dos veículos na ação antimicrobiana do hidróxido de cálcio. Para tanto, utilizaram os seguintes veículos: solução salina estéril, PMCC, solução de clorexidine a 1%, lauril sulfato de sódio a 3% e Otosporin. Os microrganismos testados foram cepas isoladas de Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Streptococcus mutans e Candida albicans e uma mistura composta por todos esses microrganismos. O método empregado foi a exposição direta, no qual cones de papel absorvente foram imersos nas diferentes suspensões microbianas, e logo após, colocados sobre placas de Petri e cobertos completamente com as respectivas pastas que foram imediatamente preparadas. As placas foram mantidas a 37 C até completar os períodos experimentais de 1 minuto, 48 e 72 horas e 7 dias. A cada intervalo de tempo, cones foram removidos do contato de cada pasta e imediatamente transferidos para tubos contendo o caldo Letheen Broth (LB) e mantidos ali por 48 horas a 37 C. Após esse período, alíquotas de 0,1 ml obtidas do LB foram transferidas para tubos contendo caldo BHI seguindo as mesmas condições de incubação até que foram realizadas as leituras dos resultados por meio da turvação do caldo. Os resultados demonstraram que o efeito antimicrobiano diante de todos os microrganismos testados somente ocorreu após 48 horas de contato com as diferentes pastas. Entretanto, os veículos associados ao hidróxido de cálcio não exerceram influência no tempo de inativação microbiana. 34

37 Lin et al. (2003) compararam a atividade antimicrobiana do hidróxido de cálcio, clorexidine e a combinação destes materiais perante o Enterococcus faecalis. As combinações de materiais foram as seguintes: hidróxido de cálcio e água estéril, Pulpdent, clorexidine (Peridex 0,12%), hidróxido de cálcio e Peridex 0,12% e Pulpdent e Peridex 0,12%. O método utilizado foi a discodifusão. Após a saturação dos discos com os materiais experimentais, esses foram colocados sobre placas de Petri contendo meio semi-sólido Mueller- Hinton, previamente inoculadas na superfície com o Enterococcus faecalis. O período de incubação foi de 24 em estufa a 37 C, procedendo-se assim à leitura dos halos de inibição. Os resultados evidenciaram que o Peridex apresentou zonas de inibição maiores, quando comparadas com as formadas pelo hidróxido de cálcio. O hidróxido de cálcio e água destilada e o Pulpdent apresentaram resultados semelhantes, porém inferiores aos obtidos pelo Peridex. A clorexidine sozinha e a combinação desta com o hidróxido de cálcio mostraram efeitos antimicrobianos significantemente maiores que o hidróxido de cálcio sozinho, porém a combinação não mostrou aumento significantemente maior da ação antimicrobiana da clorexidine sozinha. Tendo em vista os resultados obtidos no estudo, os autores concluíram que a combinação da clorexidine e hidróxido de cálcio não aumentou a atividade antimicrobiana do hidróxido de cálcio diante do Enterococcus faecalis. Na década de 70, foi preconizado o uso de uma pasta composta por hidróxido de cálcio, sulfato de bário, colofônia e polietilenoglicol 400 para ser utilizada como curativo de demora, que nos dias de hoje continua sendo comercializada com o nome de Calen (SS White), que sofreu apenas uma pequena modificação na sua formulação original substituindo-se o sulfato de bário por óxido de zinco (FAVA, 1991). Esta pasta é recomendada por Silva, Leonardo (1995) para obturação dos canais de dentes decíduos. A capacidade antimicrobiana da pasta Calen e da associação do hidróxido de cálcio com o polietilenoglicol foi estudada por alguns autores (ESTRELA et al., 2001b; GOMES et al., 2002a; GOMES et al., 2002b). 35