INSTRUCOES DE USO SORO CONTROLE LIOFILIZADO
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- Valentina Fidalgo Azenha
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1 INSTRUCOES DE USO SORO CONTROLE LIOFILIZADO UTILIZACAO: CONTROLE INTERNO DA QUALIDADE EM SOROLOGIA- CIQ INTRODUCAO Os soros para Controle Interno da Qualidade, denominados PAINEL MASTER, foram desenvolvidos procurando atender às necessidades dos laboratórios de sorologia para a manutenção dos padrões de qualidade interna. É importante que os laboratórios de sorologia utilizem soros controles internos, em cada procedimento, além daqueles fornecidos habitualmente pelos produtores de kits. Os PAINEIS MASTER REAGENTES e NAO REAGENTE auxiliam os laboratórios a monitorar a qualidade dos resultados obtidos pelas diversas técnicas utilizadas, tanto no dia a dia, quanto nas mudanças dos lotes de kits e reagentes. São diferentes dos controles dos kits e devem ser utilizados, diariamente, na rotina para validar as reações. Este lote de soro controle será distribuído durante cerca de um ano para os laboratórios participantes, com determina a norma internacional para funcionamento do controle interno da qualidade. FUNDAMENTO O PAINEL MASTER corresponde a um pool de soros Reagentes e Não Reagentes para os parâmetros de uso obrigatório na triagem sorológica, em serviços de hemoterapia conforme RDC ANVISA nº 57 de 16 de dezembro de Devido ao grande número de reagentes(kits de diagnósticos) existente no mercado nacional e levando em consideração que nem sempre esses kits apresentam a mesma reatividade, passamos a produzir três modalidades de MASTER Reagente MR01=HIV, HTLV, HCV, anti-hbc e AgHBs, MR02=Chagas e MR03=Sífilis, cada um deles com composição diferente. APRESENTACAO PAINEL MASTER REAGENTE 01 - MR01 9 frascos contendo soro liofilizado com 5mL cada. PAINEL MASTER REAGENTE 02 - MR02 2 frascos contendo soro liofilizado com 5mL cada. PAINEL MASTER REAGENTE 03 - MR03 4 frascos contendo soro liofilizado com 2mL cada. PAINEL MASTER NAO REAGENTE - MNR 9 frascos contendo soro liofilizado com 5mL cada Tanto os PAINEIS MASTER REAGENTES quanto o PAINEL MASTER NAO REAGENTE estão liofilizados e após reconstituição estão prontos para uso e deverão ser processados da mesma forma que as amostras da rotina de seu laboratório. VALIDAÇÃO Na preparação e validação dos Painéis Máster, o PNCQ testou os reagentes relacionados, com o soro puro e com duas diluições (1/4 e 1/10) para servir de referência para os participantes selecionar qual o material apresenta a melhor reatividade para o reagente utilizado. CONSERVACAO E ESTABILIDADE As datas de fabricação e validade aparecem no rótulo do frasco. Não utilizar componentes cuja data de validade tenha expirado. Os soros controles depois de reconstituídos com água reagente são estáveis quando armazenados entre +2 e +8ºC durante 21 dias ou durante 6 meses entre -18ºC e -22ºC, ou menos. Antes de serem abertos, os soros podem ser transportados em temperatura ambiente por até 10 dias, sem perda de suas características iniciais.
2 RECONSTITUICAO DO SORO LIOFILIZADO 1. Reconstituir o material com o volume de água reagente indicado no rótulo. 2. Rasgar o lacre de alumínio e destampar a rolha de borracha, evitando a perda de algum material que tenha fixado na mesma; 3. Com o auxilio de uma pipeta volumétrica adicionar água reagente, no volume indicado no rótulo; 4. Tampar o frasco com a tampa de borracha, agitar por inversão, lentamente, sem provocar espuma e deixar descansar em temperatura ambiente por 30 minutos; 5. A cada 10 minutos inverter o frasco e agitar delicadamente para que haja completa dissolução; 6. Homogeneizar o material antes de sua utilização evitando a formação de espuma. PRECAUCOES DE BIOSSEGURANCA 1. Material utilizado somente para uso diagnóstico in vitro; 2. Evitar contaminação microbiana dos soros e não utilizá-los se houver sinais de contaminação; 3. Por ser um material potencialmente infectante devem ser seguidas as normas de biossegurança. 4. Para o descarte seguro dos soros, atender as recomendações normativas locais, estaduais ou federais; 5. As amostras-controle devem ser processadas da mesma forma que as amostras da rotina do laboratório; 6. Usar equipamentos de proteção individual (luvas, avental, máscara ou visor); 7. Não pipetar com a boca; 8. Em caso de acidente com derramamento, limpar o local com detergente e hipoclorito de sódio a 5%; 9. Autoclavar todos os materiais contaminados a 121ºC por 30 minutos, antes de descartá-los; 10. Evitar congelar e descongelar os soros muitas vezes; 11. Não comer, beber ou fumar no laboratório; 12. Não utilizar os soros após a data de vencimento. RECOMENDACOES SOBRE O USO DO SORO CONTROLE LIQUIDO 1. Retirar da geladeira ou congelar e deixar em repouso no meio ambiente até estabilizar a temperatura; 2. Homogeneizar o conteúdo dos frascos invertendo-os, várias vezes, antes do uso. Caso seja necessário, centrifugá-los; 3. Após a padronização distribuir em alíquotas com volume suficiente para utilização na rotina diária e conservá-las em freezer (entre -18ºC e 22ªC); 4. O soro controle deve ser processado da mesma forma que as amostras a serem analisadas. PAINEL MASTER REAGENTE PURO- MR (01-03) 1. Para métodos sandwich apresenta leituras que correspondem a uma relação DO/CO > 1,0 (faixa recomendada: 2,0 a 4,5). 2. Para métodos competitivos apresenta leituras que correspondem a uma relação DO/CO < 1.0 (faixa recomendada 0,3 0,7) 3. Para métodos de Floculação (VDRL e RPR) o título encontrado deve ser igual ou maior que 1/4 e igual ou maior que 1/40 para métodos de Hemoaglutinação. Padronização 1a ETAPA: Verificação Inicial 1. Antes de iniciar o Controle Interno da Qualidade com o uso dos Painéis MASTER, recomendamos que fosse feita uma avaliação inicial da reatividade dos mesmos, frente às metodologias e reagentes utilizados em seu laboratório. Para isso sugerimos os itens a seguir;
3 2. Realizar um ensaio do PAINEL MASTER NAO REAGENTE e dos PAINEIS MASTER REAGENTES PURO (MR01 a MR03), em cada um dos testes utilizados no laboratório; 3. Colocar os resultados obtidos na tabela em anexo; 4. Avaliar os resultados de acordo com a faixa de reatividade estipulada pelo laboratório; 5. Caso algum dos PAINEIS MASTER não apresente relação DO/CO adequada (dentro da faixa estabelecida), o laboratório poderá realizar a diluição do material fornecido a fim de se alcançar o valor desejado; 6. A diluição poderá ser feita com solução salina ou algum soro não reagente para o parâmetro que se deseja ajustar; 7. A tabela com os resultados encontrados pelo PNCQ com os diversos reagentes utilizados e respectivas diluições se encontra no Anexo I. 2a ETAPA: Padronização e elaboração do gráfico de Levey-Jennings 1. Após a escolha do PAINEL MASTER REAGENTE PURO ou ter realizado uma das diluições a serem utilizadas em cada teste, acessar no site do PNCQ o link PRO-IN EM TEMPO REAL, selecione o seu método/reagente; 2. Se o seu método reagente já tiver sido usado na caracterização, a relação DO/CO encontrados já está inserida e existe um gráfico de Levey Jennings com estes dados; 3. Insira a relação DP/CO do seu teste, de cada analito; 4. Imediatamente o programa realiza os cálculos e sua média, desvio padrão(dp) e coeficiente de variação(cv%) estarão visíveis, assim como os dos outros serviços que utilizam o mesmo método/reagente; 5. No caso de você estiver utilizando um método/reagente que não exista outro participante, aparecerá somente o seu resultado no Gráfico de Levey Jennings. Observação: No caso de não querer utilizar o Gráfico de Levey Jennings disponível no PRO-IN EM TEMPO REAL, deverão ser realizados os cálculos de 20 determinações em dias diferentes( 4 a 5 por dia) elaborado os gráficos em papel ou eletronicamente, para que possa ficar registrada a realização do Controle Interno da Qualidade. Nestes cálculos das 20 replicatas devem ser excluídos quaisquer valores discrepantes (Outlier). Sugerimos utilizar o teste de Grubbs. Os valores obtidos da média e DP serão utilizados para construir o Gráfico de Levey Jennings. É importante lembrar que para cada metodologia devem ser construídos dois gráficos de Levey- Jennings: um para o MNR e outro para o MR. Observação: Para métodos de floculação (VDRL e RPR) e hemoaglutinação, o valor de referência, para o Gráfico de Levey Jennings deve ser o título médio encontrado na padronização ± um título. 3a ETAPA: Utilização dos PAINEIS MASTER na rotina diária 1. Em cada série de ensaios realizada em seu laboratório, para cada parâmetro, deverá ser incluída uma amostra do MNR e do MR escolhido. 2. Os resultados obtidos com MNR e com o MR, para cada metodologia, deverão ser inseridos nos gráficos de Levey-Jennings construídos para essa metodologia, como especificado acima. 3. Em condições normais os valores encontrados com os MASTER, no dia a dia, estarão dentro da faixa de 3 DP (média ± 3 DP). 4. As analises e interpretações dos resultados obtidos para os soros controle reagentes deverão ser feitas seguindo as Regras de Westgard.
4 PAINEL MASTER NAO REAGENTE MNR 1. Para métodos sandwich deverá apresentar leituras que correspondam a uma relação DO/CO < 1.0 (faixa recomendada 0,7); 2. Para métodos competitivos, frente a kits que detectam anti-hiv, anti-htlv, anti-hcv, anti- HBc, AgHBs, anti - T. pallidum (negativo para testes treponêmicos e cardiolipínicos) e anti-t. cruzi (negativo para testes ELISA, hemoaglutinação e IFI). e relação DO/CO > 1.0 (faixa recomendada 1,3); 3. A análise dos resultados obtidos dos MNR devem servir para acompanhamento das reações diárias mas não se aplicam as Regras de Westgard para a interpretação desses resultados. Interpretação dos resultados obtidos nos gráficos de Shewart ou Levey-Jennings Regras de Westgard 1. A formulação das regras de Westgard está baseada em métodos estatísticos. Essas regras são comumente usadas para analisar os dados dentro de um gráfico de Levey-Jennings. 2. São usadas para definir os limites do desempenho específico de um ensaio em particular e podem ser usadas para detectar erros randômicos e sistemáticos. 3. São 6 as regras de Westgard comumente utilizadas, das quais 3, são Regras de Alerta e as outras 3, Regras Mandatórias. 4. A violação das Regras de Alerta devem ativar uma revisão dos procedimentos do teste, desempenho dos reagentes e calibração dos equipamentos. 5. A violação das Regras Mandatórias deve resultar na rejeição dos resultados obtidos com amostras de soro de pacientes no teste realizado. Deverão ser investigadas as causas que levaram ao aparecimento desse resultado. Regras de Alerta: 1. Alerta 1 2dp : É violada se o CQI excede a Média + 2dp. 2. Alerta 2 2dp : (*) Detecta erros sistemáticos e ocorre violação quando 2 valores consecutivos do CQI excedem, do mesmo lado a Média + 2dp. 3. Alerta 4 1dp : É violada se 4 valores consecutivos do CQI excedem o mesmo limite (Média + 1dp), do mesmo lado da média. 4. Isso pode indicar a necessidade de melhorar a manutenção dos instrumentos ou a calibração dos reagentes. (*) A regra 2 2dp em bioquímica clínica é considerada Regra Mandatória. Em nossa experiência, trabalhando com testes imuno-enzimáticos qualitativos é preferível considerá-la apenas como Regra de Alerta. Regras Mandatórias: 1. Mandatória 1 3dp : É violada quando o valor do CQI excede a Média + 3dp. 2. Mandatória R 4dp : É aplicada apenas quando o CQI é testado em duplicata. A regra é violada quando a diferença entre as duplicatas excede 4dp. 3. Mandatória 10x: É violada quando pelo menos 10 valores consecutivos do CQI estão do mesmo lado da Média. Ações decorrentes da violação Opções: 1ª - Aceitar a corrida por completo Somente uma Regra de Alerta é violada. 2ª - Rejeitar a corrida inteira Quando uma Regra Mandatória é violada.
5 Analise de Resultados Recomendamos antes de validar as reações analisar os resultados dos controles internos. Em algumas ocasiões poderão ser identificadas algumas das seguintes situações: Tendências: 4 1dp ou 10x Dispersão: Perda de precisão (12dp, 13dp e R4dp) Mudanças: Mudanças repentinas de distribuição. Mudança ou substituição de algum componente do lote. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS Levey, S. and Jennings, E. R. The use of control charts in clinical laboratories. Am. J. Clin. Pathol. 20: , Guidelines for Organizing National External Quality Assessment Schemes for HIV Serological testing. Global Programme on AIDS, WHO. GPA/RES/DIA/ Cura, E. y Wendel, S. Manual de Procedimientos de Control de Calidad para los laboratórios de Serología y de los Bancos de Sangre. PAHO/HPC/HCT/ Westgard, J. O.; Groth, T.; Aronsson, T. et al. Performance characteristics of rules for internal quality control: Probabilities for false rejection and error detection. Clin. Chem. 23: , Westgard, J. O.; Barry, P. L.; Hunt, M. R. et al. A multi rule Shewart chart for Quality Control in Clinical Chemistry. Clin Chem. 27(3(: , Organização Pan Americana de Saúde Simpósio Internacional sobre Controle de Qualidade em Bancos de Sangue do Cone Sul e Brasil. Outubro Versão: Fevereiro/10
6 Valores encontrados na amostra-controle pura (sem diluição) MNR - BSNR KITS MR01 - BS DO CO DO/CO a - HBc Bio-Rad 3,029 0,394 7,7 a-hbc Wiener a-hbc Murex 0,075 0,798 0,1 a-hbc Architect HIV - Wiener 1,291 0,151 8,5 HIV Ag-Ab Wiener V.4.0 3,192 0,209 15,3 HIV Bio-Rad AgAb 3,336 0,274 12,2 HIV Bio-Rd 1+2 3,228 0,144 22,4 HIV - Murex 1.2.O HIV - Murex AgAb HIV Bioeasy ,351 0,334 7,0 HIV Ag-Ab Architect AgHBs - Bio-Rad Ultra 0,812 0,071 11,4 AgHBs - Bioeasy AgHBs - Murex 3,376 0,143 23,6 AgHBs - Wiener 3,363 0,083 40,5 AgHBs - Architect HCV - Murex HCV - Murex AgAc 3,322 0,395 8,4 HCV - Wiener 3 Geração 2,513 0,201 12,5 HCV - Bioeasy HCV - BIO-RAD V.2 2,155 0,404 5,3 HCV - Combo Bio-Rad 2,207 0,415 5,3 HCV - Architect HTLV - ORTHO 3,868 0,386 10,0 HTLV - Murex 3,432 0,344 10,0 HTLV GOLD - REM 3,279 0,294 11,2 HTLV - Architect
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