INSTITUTO OSWALDO CRUZ LETÍCIA DE PAULA SCALIONI AVALIAÇÃO DE TESTES RÁPIDOS PARA O DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE C

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1 INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Medicina Tropical LETÍCIA DE PAULA SCALIONI AVALIAÇÃO DE TESTES RÁPIDOS PARA O DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE C Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências em Medicina Tropical. Orientadora: Dra. Livia Melo Villar RIO DE JANEIRO 2013 i

2 Ministério da Saúde Fundação Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo cruz Curso de Pós-Graduação em Medicina Tropical Esta dissertação intitulada: AVALIAÇÃO DE TESTES RÁPIDOS PARA O DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE C por Letícia de Paula Scalioni Banca examinadora composta pelos seguintes membros: Titulares Dra. Flávia Barreto dos Santos Dra. Vanessa Salete de Paula Dra. Cristiane Alves Villela Nogueira Suplentes: Dr. Thiago Moreno Lopes e Souza Dra. Alexsandra Rodrigues de Mendonça Favacho ii

3 Este trabalho foi realizado no Laboratório de Hepatites Virais do Instituto Oswaldo Cruz/FIOCRUZ, Rio de Janeiro,RJ. iii

4 AGRADECIMENTO Agradeço primeiramente a Deus por ser minha fonte de inspiração e determinação na busca constante da sabedoria, por sempre nos momentos difíceis torna-me forte para transpor as barreiras impostas. À minha mãe e irmã por todo o amor incondicional e apoio prestado em tudo o que faço, por acreditarem em mim muito mais que eu mesma e fazerem seus, os meus sonhos. Às amigas Natasha Rocha e Moyra Portilho, por me ouvirem incansáveis vezes, pelo apoio, amizade e cumplicidade. À minha orientadora Dra Livia Melo Villar agradeço por compartilhar seu conhecimento comigo, por me ensinar não apenas valores científicos, mas também pessoais. Tenho imenso orgulho em ser sua aluna. Do fundo do meu coração o meu muito obrigado. Você é uma referência para mim! À Vanessa Marques, Livia Villar e Márcia Paschoal agradeço a amizade dedicada durante esses anos, à paciência infinita e todo carinho que me deram. Aos amigos que conquistei e que me conquistaram Nathália Motta, Helena Medina, Maristella Costa, Allan Peres, Adilson José de Almeida, Lucy Dalva, agradeço pelo companheirismo, momentos de descontração e auxílio nos momentos difíceis. Agradeço a todos do Laboratório de Hepatites Virais em especial a Dra Elisabeth Lampe pelo apoio e acolhimento em seu laboratório. À Dra Vanessa Salete de Paula por seus conselhos, carinho e amizade. iv

5 A toda equipe do Programa de Diagnóstico Sorológico do LHV, em especial a Juliana Miguel, Elisângela Ferreira e Helena Medina. A ajuda de vocês foi fundamental para que este projeto fosse finalizado. Aos médicos do Grupo de atendimento às Hepatites Virais (IOC/Fiocruz) e do Hospital Clementino Fraga Filho em especial a Dra. Lia Lewis e Dra. Cristiane Alves Villela-Nogueira, ao Dr Flávio Flores, a Secretaria Municipal de Saúde de Tocantinópolis, a Fundação de Medicina Tropical/TO, a Universidade Federal de Tocantins, a Secretaria de Estado e Saúde de Tocantins e aos integrantes da Base de Estudo da UFMS no Pantanal, agradeço o auxílio para obtenção do material de estudo. À Fiocruz, a Pós-Graduação em Medicina Tropical e a CAPES por financiarem nossos trabalhos e a minha bolsa de estudo. Agradeço a todos os voluntários que cederam seu material biológico sem o qual este trabalho não seria realizado. Por fim agradeço aos membros da banca Dra. Flávia Barreto dos Santos, Dra. Vanessa Salete de Paula, Dra. Cristiane Alves Villela Nogueira, Dr. Thiago Moreno Lopes e Souza e Dra. Alexsandra Rodrigues de Mendonça Favacho que gentilmente aceitaram nosso convite. v

6 RESUMO Os testes rápidos de detecção de anticorpos anti-hcv podem facilitar o acesso ao diagnóstico em cenários de recursos limitados, logo, o objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho de testes rápidos para o diagnóstico de anti-hcv em amostras de soro, sangue total e fluido oral em populações com diferentes perfis de endemicidade e comportamento de risco para o HCV. Foram obtidas amostras biológicas de 3 grupos entre fevereiro de 2010 a setembro de 2011: (I) 194 indivíduos atendidos em centros de referência para o diagnóstico das hepatites virais no Rio de Janeiro (IOC/Fiocruz e UFRJ) que forneceram amostras pareadas de soro, sangue total e fluido oral avaliadas pelos testes rápidos WAMA Imuno-Rápido HCV (WAMA Diagnóstica) e Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy Diagnóstica Ltda) e, 174 amostras de fluido oral avaliadas pelo teste rápido Oraquick HCV (Orasure); (II) indivíduos residentes em áreas remotas (Tocantinópolis, Tocantis e Pantanal do Moto Grosso do Sul), onde 430 amostras pareadas de soro, sangue total e fluido oral foram avaliadas pelos testes Wama e Bioeasy e 459 amostras foram avaliadas pelo teste rápido Orasure; (III) indivíduos usuários de crack residentes em duas regiões geográficas do Brasil (Sudeste e Nordeste) e profissionais de beleza residentes na cidade do Rio de Janeiro que forneceram 200 amostras pareadas de soro, sangue total e fluido oral para avaliação nos testes Wama e Bioeasy e 43 amostras de fluido oral para uso no teste rápido Orasure. O anti-hcv foi avaliado em amostras de soro por dois testes imunoenzimáticos (ELISA) (Radim e Diasorin) e aquelas amostras reagentes foram submetidas ao PCR para detecção do HCV RNA. A reprodutibilidade, repetitividade e reação cruzada para outras infecções (dengue, HIV, malária e sífilis) também foram avaliadas. A sensibilidade e especificidade dos testes rápidos variaram respectivamente de 76,03% a 93,84% e 93,75% a 100% quando todos os indivíduos anti-hcv reagentes pelo ELISA foram incluidos. Ao incluirmos somente as amostras anti-hcv/hcv RNA detectado, a sensibilidade e especificidade dos testes avaliados no grupo I foram respectivamente: 99,09% e 100% no teste Bioeasy utilizando soro ou sangue total; 98,18% e 93,75% no teste Wama em soro; 95,35% e 100% no teste Orasure em fluido oral; 90,91% e 93,75% no teste Wama em fluido oral; e 86,36% e 100% no teste Bioeasy em fluido oral. No grupo II, o teste rápido Orasure em fluido oral apresentou o melhor desempenho com somente 4 resultados anti-hcv falso negativos em relação ao ELISA, porém todas estas amostras não tinham HCV RNA no soro. No grupo III, o teste rápido Bioeasy em sangue total e no soro apresentou o melhor desempenho sem nenhum resultado falso positivo ou negativo. Os ensaios de reprodutibilidade e repetitividade apresentaram concordância de 100%. Na avaliação da reação cruzada, foram encontrados 5 resultados falso negativo, sendo no teste Wama: 1 amostra reagente para Dengue e outra reagente para HIV, e no teste Bioeasy: 1 amostra reagente para Dengue, 1 reagente para HIV e 1 reagente para Plasmodium vivax. Também observamos 3 resultados falso positivo no teste Wama entre aquelas amostras reagentes para P.vivax. Concluímos que os testes rápidos para detecção de anti- HCV possuem sensibilidade apropriada para detecção de infecção ativa em populações com diferentes perfis de endemicidade, porém o desempenho dos mesmos varia de acordo com o fabricante do teste e a amostra biológica empregada. Palavras chave: teste rápido, anti-hcv, diagnóstico, soro, sangue total, fluido oral. vi

7 ABSTRACT Rapid tests for detection of anti-hcv antibodies can facilitate the access of diagnosis in limited resource scenarios, thus, the objective of this study is to evaluate the performance of rapid tests for the diagnosis of anti-hcv in sera, whole blood and oral fluid samples from populations with different endemicity profiles and risk behavior for HCV. Biological samples were obtained from 3 groups from February 2010 to September 2011: (I) 194 individuals referred to Reference Centers for Viral Hepatitis Diagnosis at Rio de Janeiro (IOC/Fiocruz e UFRJ) who donate paired sera, whole blood and oral fluid samples evaluated by rapid tests WAMA Imuno-Rápido HCV (WAMA Diagnóstica) and Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy Diagnóstica Ltda) and, 174 oral fluid samples evaluated by rapid test Oraquick HCV (Orasure); (II) individuals residing in remote areas (Tocantinópolis, Tocantis and Pantanal of Mato Grosso do Sul), where 430 paired sera, whole blood and oral fluid samples were evaluated by Wama and Bioeasy and 459 samples evaluated by Orasure rapid test; (III) crack users residing in two geographical areas of Brazil (Southeast and Northeast) and beauty professionals residing at Rio de Janeiro city who donated 200 paired sera, whole blood and oral fluid samples for evaluation at Wama and Bioeasy tests and 43 oral fluid samples to use in Orasure rapid test. Anti-HCV was evaluated in sera samples by two enzyme immunoassays (ELISA) (Radim and Diasorin) and those reactive samples were submitted to PCR for HCV RNA detection. The reprodutibility, repetitivity and cross reactivity for other infections (dengue, HIV, malaria and siphilis) were also evaluated. Sensitivity and specificity of rapid tests varied respectively from 76.03% to 93.84% and 93.75% to 100% when all anti-hcv reactive individuals by ELISA were included. When only anti-hcv/hcv RNA detected were included, the sensitivity and specificity of evaluated tests in group I were respectively: 99.09% and 100% at Bioeasy test using será or whole blood; 98.18% and 93.75% at Wama test in sera; 95.35% and 100% in Orasure test in oral fluid; 90.91% and 93.75% at Wama test in oral fluid and 86.36% and 100% at Bioeasy test in oral fluid. At group II, Orasure rapid test in oral fluid presented the best performance with only 4 anti-hcv false negative results compared to ELISA, however all of these samples did not have HCV RNA at serum. At group III, Bioeasy rapid test in whole blood and sera presented the Best performance without no false positive and negative results. Reprodutibility and repetitivity assays presented 100% of concordance. At cross reactivity evaluation, 5 false negative results were found, being at Wama assay: 1 reactive sample for dengue and another reactive sample for HIV, and at Bioeasy assay: 1 reactive samples to dengue, 1 reactive for HIV and 1 reactive for Plasmodium vivax. We also observed 3 false positive results at Wama assay among reactive samples for P.vivax. We concluded that rapid tests for anti- HCV detection present appropriate sensitivity for detection of active infection in populations with different profiles of endemicity, however the performance of those tests vary according the manufacturer of the assay and the type of biological samples employed. Keywords: rapid test, anti-hcv, diagnosis, serum, whole blood, oral fluid. vii

8 LISTA DE FIGURAS Figura 1.1. Morfologia do Vírus da Hepatite C... 3 Figura 1.2. Estrutura do genoma viral... 4 Figura 1.3. Genótipos do HCV... 8 Figura 1.4. Ciclo de replicação do HCV Figura 1.5. Prevalência global da infecção pelo vírus da Hepatite C Figura 1.6. Distribuição geográfica da prevalência de anti-hcv segundo os Estados brasileiros Figura 1.7. Representação esquemática da infecção pelo HCV Figura 4.1. Fluxograma do estudo realizado com as amostras presentes no painel de referência e estudo de campo Figura 4.2. Localização geográfica do Rio de Janeiro Figura 4.3. Localização da cidade de Tocantinópolis no estado do Tocantins, Brasil Figura 4.4. Cidade de Tocantinópolis Figura 4.5. Localização geográfica das comunidades pantaneiras, Mato Grosso do Sul, MS, Brasil Figura 4.6. Comunidade Serra do Amolar/São Lourenço, Pantanal, MS, Brasil Figura 4.7. Instruções para coleta de fluido oral com Salivette Figura 4.8. Extremidade coletora do teste rápido Oraquick Figura 4.9. Representação esquemática do princípio do teste imunoenzimático para detecção de anti-hcv Figura Disposição dos controles e amostras na microplaca do teste ETI-AB-HCVK-4 de acordo com o protocolo do fabricante Figura Representação esquemática da disposição dos controles e amostras na microplaca do teste HCV Ab, Radim de acordo com o protocolo do fabricante Figura Representação esquemática dos testes rápidos para detecção de anticorpos anti-hcv Figura Representação esquemática da estrutura de um dispositivo de teste rápido.. 41 Figura Representação das etapas para realização dos testes rápidos WAMA Imuno- Rápido HCV (WAMA Diagnóstica) e Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy Diagnóstica Ltda). 43 Figura Etapas de coleta e realização do teste do teste rápido Oraquick viii

9 Figura Modelo de quadro utilizado para a avaliação do desempenho dos testes rápidos em relação a um ensaio de referência (ELISA) LISTA DE TABELAS Tabela 4.1. Relação do n de amostras, testes rápidos e espécime biológico coletado Tabela 4.2. Grau de concordância, segundo o valor do índice Kappa (κ) para avaliação dos testes rápidos para detecção dos anticorpos anti-hcv Tabela 4.3. Parâmetros utilizados para a avaliação do desempenho dos testes rápidos Tabela 5.1. Desempenho dos testes rápidos Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy Diagnóstica Ltda) e WAMA Imuno-Rápido HCV (WAMA Diagnóstica) para detecção de anti-hcv em amostras de soro avaliadas por dois ensaios imunoenzimáticos comerciais (ETI-AB-HCVK- 4, Diasorin e HCV Ab, Radim) Tabela 5.2. Valores de DO e DO/CO das amostras falso negativas no teste rápido Bioeasy HCV Rapid Test avaliadas quanto à detecção do HCV RNA Tabela 5.3. Valores de DO e DO/CO das amostras falso negativas no teste rápido WAMA Imuno-Rápido HCV avaliadas quanto à detecção do HCV RNA Tabela 5.4. Desempenho dos testes rápidos em população de alta prevalência de anti- HCV Tabela 5.5. Desempenho dos testes rápidos em população com comportamento de risco de de baixa prevalência para anti-hcv Tabela 5.6. Desempenho do teste rápido Oraquick HCV Rapid Antibody Test (Orasure) em amostras de soro, sangue total e fluido oral. (n=120) Tabela 5.7. Avaliação da resposta cruzada em amostras reagentes para Dengue, HIV, P.vivax, T.pallidum testadas nos testes rápidos WAMA Imuno-Rápido HCV e Bioeasy HCV Rapid Test ix

10 LISTA DE SIGLAS E ABREVIAÇÕES HAV HBV HCV CMV EBV HIV HBsAg Anti-HCV HPT HNANB ORF 3 NC 5 NC UTR RNA DNA UDIs CG RE RNAm PCR DIV UFRJ DO/CO TO MS IOC Vírus da Hepatite A Vírus da Hepatite B Vírus da Hepatite C Citomegalovírus Epstein-Barr Vírus Vírus da Imunodeficiência Humana Antígeno de Superfície do HBV Anticorpo anti-hcv Hepatite pós-transfusional Hepatite Não-A Não-B do inglês Open Reading Frame fase de leitura aberta Região 3 Não Codificante Região 5 Não Codificante Untranslated region Ácido ribonucleico Ácido desoxirribonucleico Usuários de drogas intravenosa Complexo de Golgi Retículo Endoplasmático RNA mensageiro Reação em cadeia da polimerase Droga Intravenosa Universidade Federal do Rio de Janeiro Densidade óptica dividido pelo cut off Tocantins Mato Grosso do Sul Instituto Oswaldo Cruz x

11 FIOCRUZ LRNHV EUA SINAN IBGE UFMS DO VPP VPN FP FN HCC RSV IRES aa RIBA ELISA LDL LDL-R NC RER Linha T Linha C Fundação Oswaldo Cruz Laboratório de Referência Nacional para Hepatites Virais Estados Unidos da América Sistema de Informação de Agravos de Notificação Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística Universidade Federal de Mato Gross do Sul Densidade óptica Valor Preditivo Positivo Valor Preditivo Negativo Falso Positivo Falso Negativo Hepatocarcinoma Resposta Viral Sustentada Do inglês internal ribosome entry site Aminoácido Do inglês recombinant immunoblot assay Do inglês enzyme linked immunosorbent assay Lipoproteína de baixa densidade Receptor para LDL Não codificante Retículo endoplasmático rugoso Linha Teste Linha Controle xi

12 LISTA DE SINAIS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDA % Percentual I Um (algarismo romano) II Dois (algarismo romano) III Três (algarismo romano) KDa Kilo Dáltons ºC Graus Celcius no Número = Igual > Maior < Menor X Multiplicação UI/mL Unidades Internacionais por mililitro nm Nanômetro ng Nanograma µm Micrômetro µl Microlitro xii

13 SUMÁRIO 1.INTRODUÇÃO Histórico Estrutura e Organização Genômica do HCV Proteínas estruturais Proteínas não estruturais Genótipos Replicação do HCV Epidemiologia Aspectos Clínicos Transmissão e Prevenção Diagnóstico Diagnóstico Sorológico Diagnóstico Molecular Tratamento RACIONAL E JUSTIFICATIVA OBJETIVO GERAL Objetivos Específicos MATERIAIS E MÉTODOS Aspectos Éticos População de Estudo Painel de Referência Estudo de Campo População de alta prevalência para anti-hcv População de baixa prevalência para anti-hcv População com comportamento de risco Coleta das amostras biológicas de sangue e fluido Testes de diagnóstico do HCV Ensaio Imunoenzimático Princípio dos Testes xiii

14 Procedimento do Teste ETI-AB-HCVK-4 (Diasorin) Procedimento do Teste HCV Ab (Radim) Testes Rápidos para detecção de anticorpos anti-hcv Testes Rápidos utilizados no estudo Wama Imuno-Rápido HCV (WAMA Diagnóstica) Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy Diagnóstica Ltda) Oraquick HCV Antibody Rapid Test (OraSure Technologies, Inc. Bethlehem Pensilvânia) Detecção do RNA do HCV Genotipagem Avaliação do desempenho dos testes rápidos para detecção dos anticorpos anti-hcv Testes de Concordância Sensibilidade, especificidade e valores preditivos Avaliação da reprodutibilidade e repetitividade dos testes rápidos para diagnóstico da hepatite C Avaliação do desempenho do teste rápido Oraquick em amostras de soro, sangue total e fluido oral Avaliação da reação cruzada em testes rápidos para diagnóstico de anticorpos anti- HCV Análise Estatística RESULTADOS População de Estudo Painel de Referência Avaliação de testes rápidos para detecção de anticorpos anti-hcv em estudo de campo Avaliação do teste rápido Oraquick HCV (Orasure) em amostras de soro, sangue total e fluido oral Avaliação da reprodutibilidade e repetitividade dos testes para detecção do anti-hcv Avaliação da reação cruzada dos testes rápidos para detecção de anti-hcv DISCUSSÃO CONCLUSÕES PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS xiv

15 ANEXO I ANEXO II xv

16 1. INTRODUÇÃO 1.1 Histórico Até o final da Segunda Guerra Mundial apenas dois tipos de hepatites virais, com diferentes meios de transmissão (parenteral e entérico), haviam sido descobertos. Os agentes etiológicos das hepatites A e B foram identificados no início da década de 70 e com o desenvolvimento de testes sorológicos sensíveis a esses agentes, foi possível observar que muitos casos de hepatite pós-transfusional não eram atribuíveis à infecção pelo vírus da hepatite A (HAV) ou pelo vírus da hepatite B (HBV). Dessa forma, foi descrito pela primeira vez uma nova hepatite póstransfusional (HPT), chamada de hepatite não-a não-b (HNANB) (Feinstone et al. 1975). Após a implementação de medidas preventivas, na década de 70, como a exclusão de doação de sangue remunerada e/ou de portadores de HBsAg reagentes, foi possível observar uma redução de aproximadamente 85% do número de casos de hepatite pós-transfusional (HPT) (Alter et al. 1972). Mesmo com a adoção destes critérios, o número de casos de HPT continuou a ser notificado e sabidamente não estavam relacionados ao vírus HAV e HBV, bem como a outros agentes hepatotrópicos como o Citomegalovírus (CMV) e vírus Epstein-Barr (EBV) (Alter et al. 1975). A ausência de marcador sorológico associado à infecção pelo(s) agente(s) da HNANB dificultou a investigação etiológica da HNANB. No final dos anos 70, diferentes grupos de pesquisadores demonstraram ser possível a transmissão experimental dos agentes da HNANB aos chimpanzés através da administração parenteral de material infeccioso humano (soro, plasma, hemoconcentrado) (Hollinger et al. 1978; Alter et al. 1978; Tabor et al. 1978; Bradley et al. 1979; Bradley et al. 1981; Hollinger et al. 1984; Bradley et al, 1985). Em estudo realizado por Alter et al. (1978) onde amostras de plasma ou soro de pacientes com infecção aguda ou crônica NANB foram inoculadas em 5 chimpanzés, foi possível observar evidências bioquímicas e histológicas de hepatite, porém não houve evidência sorológica de hepatite tipo A ou tipo B. A hepatite havia sido transmitida pelo soro derivado de pacientes com hepatite crônica, bem como aguda, sugerindo fortemente um estado de portador crônico para o agente responsável pela hepatite não-a não-b. Portanto, era sabido que o agente transmissível poderia persistir e permanecer infeccioso por longos períodos. 1

17 Estudos posteriores tornaram evidente a natureza viral do agente etiológico da HNANB (Bradley et al. 1979; Bradley et al. 1980; Bradley et al. 1981; Feinstone et al. 1983; Hollinger et al. 1984; Bradley et al. 1985). Em 1989, o vírus da hepatite C (HCV) foi descrito por Choo et al. (1989) como o principal agente etiológico das hepatites conhecidas como NANB utilizando estudos de clonagem e sequenciamento genético de uma cepa isolada do plasma de um chimpanzé cronicamente infectado com o vírus da HPT não-a não B (Choo et al. 1989). A partir da identificação do agente etiológico da hepatite NANB e utilização de testes de detecção de anticorpos anti-hcv (utilizando peptídeos recombinantes) (Kuo et al. 1989), foi possível esclarecer que os casos clínicos de hepatite pós-transfusional NANB (Alter et al. 1989) tinham como responsável o HCV. 1.2 Estrutura e organização genômica do HCV O HCV é um vírus envelopado que possui estrutura genômica composta por uma fita simples de RNA de polaridade positiva e com aproximadamente nucleotídeos (Figura 1.1) (Choo et al. 1991; Li et al. 1995; Hoffmann et al. 2012). Através de comparações filogenéticas das seqüências virais, o HCV foi classificado como pertencente ao gênero Hepacivirus, na família Flaviviridae (Choo et al. 1991; Simmonds 2004). 2

18 E2 E1 RNA Fita Simples Nucleocapsídeo Glicoproteínas do Envelope Envelope Figura 1.1. Morfologia do Vírus da Hepatite C. As particulas de virus da hepatite C tem diâmentro estimado de 70 nm. Estruturalmente, apresentam moléculas de proteína C formando o nucleocapsídeo. Cobrindo o nucleocapsídeo, encontra-se o envelope de composição lipoglicoprotéica, contendo dois tipos de glicoproteínas denominadas E1 e E2. Disponível em: [Acesso em: 28 mar. 2012]. A partícula do HCV tem 70nm de diâmetro aproximadamente (He et al.1987; Simmonds 2004), estrutura tridimensional análoga à dos Flavivírus e simetria icosaédrica, com espículas de 6-8 nm em sua superfície (Prince et al. 1996) (Figura 1.1). As partículas virais apresentam elevada heterogeneidade bioquímica pela sua associação com anticorpos ou lipoproteínas (Roingeard et al. 2004). Os vírions podem circular na corrente sanguínea complexados às lipoproteínas de baixa densidade ou às imunoglobulinas, ou como partículas livres. O HCV possui uma relação restrita de hospedeiros, sendo apenas o homem e o chimpanzé susceptíveis à infecção natural (Brass et al. 2007). O HCV possui duas regiões não codificantes nas extremidades 5 e 3 (5 NC e 3 NC) e uma única região aberta de leitura (ORF) ao longo de seu genoma, que codifica uma poliproteína de cerca de 3000 aminoácidos ( aa) que durante e após a tradução, sofre uma série de clivagens por proteases virais e do hospedeiro que geram proteínas estruturais e não estruturais (Choo et al.1991; 3

19 Valoup-Fellous et al. 2006) (Figura 1.2). Dessa forma, tem-se uma divisão funcional em três regiões: região amino terminal que compreende as proteínas estruturais [core (C), glicoproteínas do envelope 1 (E1) e envelope 2 (E2)]; uma região central que inclui duas proteínas (p7 e NS2) que podem ter papel essencial na morfogênese viral visto que a expressão excessiva de proteínas p7 induz a apoptose em culturas de célula Huh 7 (Aweya et al. 2012); e região carboxi terminal que compreende as proteínas não estruturais necessárias para a replicação do RNA (NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B) (Figura 2.1) (Tellinghusein et al. 2007). Figura 1.2. Estrutura do genoma viral. Representação da fase de leitura aberta (ORF open reading frame) codificando genes estruturais e não-estruturais com as regiões 5 e 3 NC. O círculo claro refere-se ao sítio de atuação da peptidase celular; círculos escuros são sítios de atuação das peptidases virais; seta clara indica atuação da autoprotease NS2-NS3; setas escuras são referentes aos locais de atuação da protease NS3-NS4A (Adaptado de Lindenbach & Rice, 2005) Proteínas Estruturais O segmento amino terminal da poliproteína é processado pela peptidase sinal do hospedeiro para então produzir a proteína do nucleocapsídeo (core), duas glicoproteínas do envelope (E1 e E2) e a proteína p7 que é uma pequena proteína transmembrana composta por 63 aa pertencente à família das viroporinas, que são famílias de proteínas virais capazes de formar poros nas membranas das células infectadas (Reed et al. 2000). As proteínas do core (C) são compostas por 191 aa constituintes do capsídeo viral e associam-se, provavelmente, pela porção N-terminal, ao RNA genômico para formar o nucleocapsídeo (Drazan 2000). Apresenta peso molecular de aproximadamente 21 kda e é a proteína mais conservada do HCV. Acredita-se que a proteína do core madura é capaz de se agrupar espontaneamente para formar o capsídeo viral e interagir com as glicoproteínas do envelope E1 e E2 (Forns et al. 4

20 1999). Em sua região carboxi terminal há uma sequencia de 20 aa com função de sinalização que direciona a glicoproteína E1 ao retículo endoplasmático granular (Forns et al. 1999). As glicoproteínas do envelope viral E1 (35 kda) e E2 (70 kda) são produzidas a partir de clivagem enzimática e estão envolvidas nos processos de interação com o receptor e fusão celular (Grakoui et al. 1993; Takikawa et al. 2000). A proteína E1 é utilizada para propósitos clínicos de diagnóstico em testes de genotipagem enquanto a proteína E2 apresenta uma região hipervariável (HVR1) que pode induzir a produção de anticorpos neutralizantes, funcionando como um mecanismo de escape, evadindo desta forma da resposta imune do hospedeiro (Bukh et al. 1995; Penin et al. 2004; Lyra et al. 2004). A HVR1 desempenha papel importante na evolução da infecção pelo HCV. Os casos de resolução na fase aguda apresentam menor variabilidade (nas sequências de E2) dentro de um mesmo paciente em relação àqueles casos que evoluem para hepatite crônica (Chen & Wang 2007). Quanto a proteína E2, esta apresenta um sítio de ligação para CD81, que é uma proteína de membrana (26 kda), encontrada em diversas células, incluindo hepatócitos, células do sistema imune, fibroblastos e células endoteliais e, além disso, podem participar do processo de penetração do HCV nessas células. Além da interação das proteínas E2 com CD81 para penetração nos hepatócitos, o HCV ainda utiliza o receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDL-R) (Chen & Wang, 2007). A ligação com LDL-R e SR-B1 leva a mudanças conformacionais na partícula viral permitindo o envolvimento de outros co-receptores de membrana do hepatócito (CD 81, claudina-1 e ocludina) (Jahan et al. 2011). As proteínas E1 e E2 ainda são os principais alvos para produção de vacinas e têm sido bastante estudadas quanto à sua variabilidade (Chen & Wang 2007). A proteína p7 é um polipeptídeo de 63 aa que é parcialmente clivado a partir de E2. É composto por um pequeno fragmento hidrofóbico (hexâmeros) que tem atividade de canal iônico e pode ter um importante papel na maturação e liberação da partícula viral e, sua necessidade para a replicação do HCV em chimpanzés, confirma a proteína como possível alvo para a quimioterapia antiviral, já que está relacionado a apoptose celular, maturação e liberação da partícula viral (Sakai et al. 2003; Roingeard et al. 2004; Aweya et al. 2012). 5

21 1.2.2 Proteínas não estruturais A proteína NS2 é uma proteína não-estrutural de 23 kda e, é a primeira protease viral ativada pelo polipeptídeo. É responsável pela clivagem da junção NS2/NS3 (NS2/NS3 protease) e pela maturação das proteínas NS restantes (Dumoulin et al. 2003). Até hoje, poucas propriedades foram atribuídas a NS2 clivada madura, visto que ela parece agir inibindo a apoptose, modulando a expressão gênica e também, na fosforilação de NS5A (Franck et al. 2005). Sabe-se também, que a atividade de protease da NS2 é fundamental para que ocorra a replicação completa do HCV in vivo, entretanto a mesma é dispensável para replicação do vírus in vitro (Roingeard et al. 2004). A proteína NS3 (serina protease específica) é uma proteína não-estrutural hidrofílica de aproximadamente 70 kda. É uma proteína multifuncional e contém um domínio serino-protease na porção amino terminal e um domínio RNAhelicase/NTPase na porção carboxi terminal (Lindenbach & Rice 2005). O papel da helicase do HCV ainda não foi bem descrito, mas acredita-se que esteja envolvida na iniciação da síntese de RNA, sendo responsável pela dissociação das fitas de RNA de seus moldes (Pang et al. 2002). Além disso, estudos mostraram que a NS3 pode interferir nas funções da célula hospedeira, influenciando desta forma a resposta imune inata e celular (Gale et al.1998; Borowski et al.1999; Gale & Foy 2005; Meylan et al. 2005). Atualmente o alvo mais utilizado para o estudo de novas drogas antivirais para o HCV tem sido a serina protease NS3/4A (Vermehren & Sarrazin et al. 2011). A região genômica de NS4 codifica duas proteínas: NS4A (8 kda) e NS4B (23 kda). A proteína NS4A é composta por aproximadamente 54 aa e funciona como cofator para serina protease NS3 e é também incorporada como componente integral do core (Roingeard et al. 2004; Dubuisson et al. 2002). A proteína NS4B (p27), por sua vez, é a proteína viral do HCV menos caracterizada, porém, alguns estudos sugeriram que ela seja responsável por induzir a alterações nas membranas celulares denominada teia membranosa (Roingeard et al. 2004; Dubuisson et al. 2002; Moradpour & Blum 2004). Duas proteínas diferentes são codificadas pela região genômica NS5: NS5A ou p56 na forma hiperfosforilada (58 kda) e NS5B ou p65 (68 kda). Ambas proteínas são liberadas pela ação conjunta de NS3/NS4A. Embora já tenha sido demonstrado que as proteínas NS4B e NS5A são 6

22 proteínas associadas à membrana e a outras proteínas não estruturais do HCV, suas funções bioquímicas ainda são pouco conhecidas (Lin et al. 1997; Hugle et al. 2001). Alguns estudos mostram que proteína NS5A apresenta um domínio de zinco o qual é essencial para a replicação do HCV, além disso, funciona como co-receptor para outras proteínas (Verdegem et al. 2011; Yamasaki et al. 2012). Alguns estudos sugerem que a proteína NS5A esteja relacionada a resposta ao interferon, especulando que seja responsável pela manutenção da replicação viral mesmo na presença da droga (Gale et al. 1998; Tan & Katze 2001). A proteína NS5B é uma RNA-polimerase dependente do RNA viral, responsável por toda a replicação do material genético viral, sendo este empacotado para dar origem a novos vírions. 1.4 Genótipos A replicação do HCV é muito propensa a erros e gera mutações em uma taxa de aproximadamente 10-5 por nucleotídeo por replicação, gerando uma elevada diversidade viral (Stumpf & Pybus 2002). Desta forma, foi proposta uma classificação do HCV em genótipos (homologia de 65,7% a 68,9%) e subtipos (homologia de 76,9% a 80,1%) baseados em análises filogenéticas e sequenciamento. Os genótipos propostos são seis (1, 2, 3, 4, 5 e 6), sendo cada um subdividido em subtipos nomeados alfabeticamente, de acordo com a sua ordem de descoberta (Stumpf & Pybus 2002; Simmonds et al. 1993). O estabelecimento de um genótipo 7 está sendo proposto pela análise de um novo isolado (Murphy et al. 2007). A heterogeneidade genética do HCV faz com que este apresente quasispécies, que são vírus com genomas muito semelhantes, porém com homologia entre 90,8% a 99% nas sequências de nucleotídeos (Ueda et al. 2004). Quanto às regiões utilizadas para genotipagem, as mais utilizadas são: região 5 NC (RFLP e Lipa) e NS5B (sequenciamento). Algumas regiões são potencialmente endêmicas para determinados genótipos tais como (Figura 1.3): Costa da Guiné na África Ocidental para o genótipo 1, a África Central para o genótipo 2, o Norte do subcontinente indiano para o genótipo 3, a África Central para o genótipo 4 e o Sudeste Asiático para o genótipo 6 (Smith et al 1997). Esses genótipos disseminaram-se por todo o mundo principalmente no século XX como resultado da introdução de determinados fatores de risco, como as transfusões sanguíneas e a partilha de agulhas entre UDIs (Pybus et al. 2001; 7

23 Simmonds 2004). Dessa forma, os principais subtipos encontrados nos países industrializados incluem: o subtipo 1a distribuído globalmente no Norte da Europa e EUA e fortemente associado a UDIs; o subtipo 1b associado a indivíduos de idade mais avançada e a transfusões sanguíneas no passado; o subtipo 3a distribuído amplamente nos UDIs, particularmente da Europa. Os subtipos 2a, 2b e 2c, são encontrados nos países mediterrânicos e Extremo Oriente; o subtipo 4a, altamente distribuído na África e no Oriente Médio, onde no Egito é associado ao tratamento massivo da Esquistossomose; o subtipo 5a prevalente na África do Sul; e o genótipo 6 encontrado nos UDIs de Hong Kong, Vietnam e também na Austrália (Simmonds 2004). No entanto, tem sido verificada uma crescente disseminação do genótipo 4 (subtipos 4a e 4d) em alguns países do Sul da Europa, associado a infecção entre UDIs, co-infecção HCV-HIV e imigração proveniente do Norte de África (Franco et al. 2007; Sereno et al. 2009). Figura 1.3. Genótipos do HCV. Árvore filogenética dos genótipos do HCV e suas principais associações epidemiológicas com grupos de risco. (Adaptado de Simmonds, 2004) 1.5 Replicação do HCV 8

24 1.5 Replicação do HCV A replicação do HCV, mesmo com os avanços no desenvolvimento de cultivos celulares, ainda está pouco esclarecida e o modelo aceito mais utilizado para estudo é aquele baseado na similaridade do ciclo dos vírus pertencentes à família Flaviviridae. O início da replicação ocorre na membrana do hepatócito com a adsorção da partícula viral. Após adsorção o vírus se internaliza a célula por fusão de membrana ou endocitose mediada por receptor (Cabot et al. 2000; Szabó et al. 2003; Pawlotsky 2004; Penin et al. 2004). Algumas moléculas de superfície celular foram identificadas como possíveis receptores para o HCV nos processos de adsorção e internalização do HCV na célula hospedeira. Dentre os candidatos a receptores do HCV, receberam maior destaque as moléculas CD81 (forte interação com E2), encontradas na superfície de muitos tipos celulares, incluindo hepatócitos (Pileri et al. 1998), receptores LDL (LDLR) (Agnello et al. 1999) e SR-BI (scavenger receptor class B type I) (Scarselli et al. 2002). A claudina-1 foi descrita como molécula coreceptora necessária à internalização do HCV na célula (Evans et al. 2007). Após internalização, o vírus sofre desnudamento, expondo o genoma viral, para assim iniciar a replicação. A atividade de RNA-polimerase RNA - dependente (transcriptase) gera uma fita de RNA, de polaridade negativa, complementar ao RNA viral, que serve também de molde para que haja a síntese de novas fitas de RNA de polaridade positiva que servirão para a formação de novos vírus (Figura 1.4) (Pawlotsky 2004; Penin et al. 2004). O RNA de polaridade positiva, sintetizado a partir das fitas RNA negativas interage com inúmeras proteínas do capsídeo para formar o nucleocapsídeo viral, o qual adquire o envelope no RE (retículo endoplasmático). A partícula viral montada é transportada, via complexo de golgi (CG), para ser exocitada da célula hospedeira (Pawlotsky 2004). O RNA viral serve como RNA mensageiro (RNAm) e depois da tradução, uma poliproteína é produzida e clivada em proteínas estruturais e nãoestruturais (Santos et al. 2002; Szabó et al. 2003). As regiões terminais não codificantes (NC) são essenciais no processo de replicação viral. A região 5 NC, (sequência mais conservada do genoma do HCV), contém um sítio interno de entrada de ribossomo (IRES) essencial para a tradução independente do RNA viral (Honda et al. 1996; Hellen et al. 1999). A região 3 NC por sua vez, é constituída de uma estrutura em forma de trevo, consistindo de uma 9

25 região variável pequena de aproximadamente 40 nucleotídeos, uma cauda poli-u e uma região altamente conservada de 98 nucleotídeos (Tanaka et al. 1995; Kolykhalov et al. 1996). Figura 1.4. Ciclo de replicação do HCV. Partículas de HCV se ligam à célula hospedeira via interação específica entre as glicoproteínas do envelope e receptores celulares. As partículas ligadas são então internalizadas, provavelmente por meio de endocitose mediada por receptor. Após a liberação do genoma viral no citoplasma (desnudamento) ocorre a tradução, no retículo endoplasmático rugoso (RER) em uma poliproteína que é clivada nas proteínas estruturais e não-estruturais. As proteínas nãoestruturais participam da replicação viral e as estruturais fazem parte da estrutura do capsídeo e glicoproteínas do envelope. O local de montagem das partículas virais ainda não foi identificado, mas acredita-se que seja em membranas intracelulares derivadas do retículo endoplasmático ou do compartimento de Golgi. Os vírions recém montados são então liberados da célula hospedeira, possivelmente por meio da via secretória. Adaptado de: [Acesso em 5 mai 2012)]. 1.6 Epidemiologia A ferramenta mais utilizada para estimar a prevalência da hepatite C são estudos de soroprevalência realizados em doadores de sangue (Gonçales et al. 1993; Parolin et al. 1999), usuários de drogas (Oliveira et al. 1999) e pacientes submetidos à hemodiálise (Yoshida et al. 1992). No entanto, por se tratar de populações com características específicas (grupos de risco para hepatite C), estes 10

26 estudos podem não representar a prevalência real da infecção pelo HCV (Martins et al. 2010). Em estudos realizados na população norte-americana que apresentava na década de 1990 prevalência estimada de infecção pelo HCV de 0,6% em estudos com doadores de sangue e de 1,8% na população geral, demonstram a falha neste mecanismo de avaliação (Alter et al.1999). Apesar de estudos populacionais com amostras representativas de múltiplas comunidades serem mais adequados, esse tipo de estudo possui maior complexidade, custo elevado e não pode ser executado na maior parte das regiões do mundo (Martins et al. 2010). Mesmo com essas ponderações, as estimativas da OMS apontam para valores absolutos de indivíduos infectados variando de 130 a 170 milhões o que significa uma prevalência de 2,2 a 3% sobre a população mundial (Wasley & Alter 2000; Armstrong et al. 2002; Shepard et al. 2005; Alter 2007; Lavanchy et al. 2009). Além disso, todos os anos, 3-4 milhões de pessoas são infectadas com o HCV e aproximadamente 150 milhões de pessoas estão cronicamente infectados e em risco de desenvolver cirrose hepática e/ou câncer de fígado. A cada ano, mais de pessoas morrem de doenças no fígado relacionadas com a hepatite C (WHO, 2012). Embora o HCV tenha distribuição mundial, existe um elevado grau de variação geográfica em sua prevalência (Figura 1.5)(Wasley & Alter 2000; Shepard et al. 2005; Alter 2007). 11

27 Figura 1.5. Prevalência global da infecção pelo vírus da Hepatite C. Em muitos países não existem dados sobre a infecção e as estimativas são baseadas em médias ponderadas para as regiões. Adaptado de Perz et al A prevalência da hepatite C é baixa no Reino Unido, Escandinávia (0,01% a 0,1%), Américas, Europa Ocidental, Austrália e África do Sul (0,2% a 0,5%). Prevalências intermediárias são encontradas no Leste Europeu, Mediterrâneo, Oriente Médio e Índia. Outros países com prevalência intermediária incluem Brasil, Europa Oriental, partes da África e Ásia (Perz et al. 2004). Os países com as taxas mais altas de infecção crônica são: Egito (22%), Paquistão (4,8%) e China (3,2%) sendo o principal modo de transmissão nesses países atribuído às injeções usando seringas contaminadas (Wasley & Alter 2000; Yen et al. 2003; WHO 2012). Em alguns estudos isolados na população em geral foi possível observar uma prevalência de anti-hcv de 24,6% na Itália (Castellana), 10,4% no Camboja e 0,87% na Índia (Osella et al. 1999; Chowdhury et al. 2003). Outros trabalhos realizados com população em risco de infecção por HCV como doadores de sangue e hemodialisados foi encontrada uma prevalência de 16% na Mongólia (Takahashi et al. 2004) principalmente em indivíduos da faixa etária de 50 a 86 anos e em pacientes de diálise na Grécia (22,5%), sendo este valor muito maior do que a relatada na população em geral, sugerindo que a transmissão de um paciente para o outro pode ser uma importante via de transmissão (Katsoulidou et al. 1999). 12

28 No Brasil, aproximadamente 70 mil casos de hepatite C crônica foram confirmados de (MS, 2010). Em 2010 a taxa média de número de casos foi de 4,5 casos por 100 mil habitantes. As maiores taxas foram identificadas nas regiões Sul (7,2 casos/100 mil hab) e Sudeste (6,8 casos/100 mil hab) onde as maiorias dos casos ocorreram em indivíduos com idade superior a 35 anos (80,7%). A prevalência de anti-hcv na população brasileira entre 10 e 69 anos foi de 2,10% na região Norte, 1,32% na região Centro-Oeste, 1,27% na região sudeste, 1,19% na região sul e 0,68% na região Nordeste. Neste levantamento soroepidemiológico realizado em indivíduos saudáveis também foi possível observar uma prevalência de 0,75% em indivíduos com idade entre 10 a 19 anos e 1,56% em indivíduos com 20 a 69 anos (MS, 2010). A mortalidade encontra-se decrescente desde 2000, alcançando um óbito a cada 100 mil habitantes em 2007 e assim permanecendo até 2010 (MS, 2010). Por ser um país de dimensões continentais e com grandes variações demográficas, sociais e culturais entre as diferentes regiões, os estudos de prevalência no Brasil são poucos e imprecisos, englobando no geral populações específicas (Ferreira & Silveira 2004). De acordo com o inquérito realizado pela Sociedade Brasileira de Hepatologia (SBH, 1999), dos doadores de sangue avaliados, (1,23%) foram reativos para o anti-hcv. A Figura 1.6 mostra a distribuição da prevalência de anti-hcv no Brasil em estudo realizado em doadores de sangue onde é possível observar que nas mesmas regiões podem ser encontradas prevalências altas e baixas (SBH, 1999). 13

29 Figura 1.6. Distribuição geográfica da prevalência de anti-hcv segundo os Estados brasileiros (SBH, 1999). Os valores mais elevados de prevalência foram observados nos Estados da região Norte (2,12%). A região Sul, por sua vez, mostrou baixa prevalência de anti- HCV (0,65%) enquanto as regiões Centro-Oeste, Nordeste e Sudeste apresentaram taxas intermediárias (1,04%, 1,19% e 1,43%, respectivamente) (SBH, 1999). Em estudo de base populacional realizado em 1049 indivíduos moradores de São Paulo, a prevalência de anti-hcv foi de 1,42%. Os maiores valores de prevalência foram observados nos indivíduos acima de 30 anos, com pico de 3,8% observado na faixa etária entre 50 e 59 anos (Focaccia et al.1998). 1.7 Aspectos Clínicos Apesar de o HCV possuir baixa infectividade e lenta taxa de replicação, 80 a 85% dos pacientes irão desenvolver uma persistente infecção assintomática, que pode progredir para cirrose em aproximadamente 20% dos pacientes e em carcinoma hepatocelular em parte desses casos (Seef et al. 1992; Takahashi et al. 1992). Dessa forma, a hepatite C pode ser classificada clinicamente como forma aguda ou crônica. É estabelecido que a forma aguda equivale à presença de sinais clínicos, alterações enzimáticas ou sintomas da hepatite C até um período de 6 14

30 meses após o a exposição ao HCV (Blackard et al. 2008). Entretanto, a forma aguda é observada em apenas 20-30% dos indivíduos infectados (Augusto & Lobato 2003). Apenas 5% dos indivíduos portadores da hepatite C apresentam doença sintomática (Multimer et al.1995). Nos demais indivíduos infectados a infecção é subclínica ou assintomática sendo este um dos maiores problemas de saúde pública pois, podem transmitir o vírus sem conhecimento (Ferreira & Gameiro 2002; Blackard et al. 2008). Em somente 20% dos casos ocorrem resolução espontânea da viremia, sendo a maioria ocorre em indivíduos jovens, do gênero feminino, caucasianos e com baixa viremia (Thomas et al. 2000; Lauer & Walker 2001; Chen & Morgan 2006; Blackard et al. 2008). Clinicamente, os sintomas da hepatite C são semelhantes aqueles observados nos outros casos de hepatites virais, onde o paciente pode apresentar icterícia, fadiga, anorexia, náusea e outros sintomas inespecíficos (Kohara 2000). É possível detectar o HCV pela reação em cadeia da polimerase (PCR) nos primeiros estágios da hepatite aguda (a região utilizada para a PCR é a região 5 NC do vírus), surgindo, concomitantemente, os níveis anormais de transaminases. Diferente destes, a soroconversão para anti-hcv pode demorar meses ou semanas para ocorrer (Pawlotsky et al. 1999)(Figura 1.7). Nos indivíduos com infecção aguda não resolvida, 70-80%, evoluem para a forma crônica, onde o vírus replica-se persistentemente e é possível detectar o RNA viral no soro ou tecido hepático, na presença de resposta imune (Figura 1.7) (Blackard et al. 2008). Com o estabelecimento da infecção crônica, não ocorrerá resolução espontânea da viremia (Lemon et al. 2007). Dos indivíduos cronicamente infectados, aproximadamente 15 a 20% desenvolvem cirrose num período de 10 a 30 anos e, por ano, 1-5% destes doentes desenvolve hepatocarcinoma (HCC) (Bruijne et al. 2009). 15

31 Figura 1.7. Representação esquemática da infecção pelo HCV. Níveis de RNA do HCV (linha preta) e início da produção de anticorpos anti-hcv (seta azul) ao longo da infecção. No eixo dos X encontram-se representados o tempo (meses) após a infecção por HCV e no eixo Y a carga viral (log10 cópias/ml). PJ Período Janela (Adaptada de Blackard et al. 2008). 1.8 Transmissão e Prevenção Até o momento não existe uma vacina disponível contra a hepatite C. Desta forma, a eliminação dos comportamentos de risco é fundamental para que as taxas de incidência da infecção sejam reduzidas e, consequentemente, diminuição dos casos de doença hepática. A grande maioria das infecções por HCV está associada à utilização de drogas injetáveis e, por isso, a prevenção deste comportamento de risco irá eliminar grande parte das infecções. O uso de drogas intravenosas (DIV) é uma das principais formas de transmissão do HCV nos últimos 40 anos em países como os Estados Unidos e a Austrália, e atualmente este é o principal fator de risco em países desenvolvidos (Alter 2002; Dore et al. 2003). Nesses países, o uso de DIV responde por cerca de 70% a 80% das contaminações pelo HCV ocorridas nos últimos 30 anos (Alter 2002; Dore et al. 2003). Outras formas de infecção pelo HCV incluem os procedimentos médicos e exposição nosocomial, transplante de órgãos, exposição ocupacional, transmissão vertical e sexual. Procedimentos com equipamentos ou seringas contaminadas se apresentam como uma forma possível de transmissão. Estima-se que aproximadamente 2 16

32 milhões de indivíduos se infectem por esta via. Em países subdesenvolvidos, muitas vezes ocorre reutilização de material ou falta de cuidado com a esterilização. Além disso, muitas terapias são realizadas em ambiente doméstico por indivíduos não habilitados o que aumenta significativamente o risco de infecção pelo HCV (Hauri et al. 2004). Acredita-se que entre os anos de 1960 e 1991, antes da introdução dos testes sorológicos nos bancos de sangue, 5% a 15% dos receptores de hemoderivados infectaram-se com HCV e, atualmente, após a adoção dos testes de rastreamento, o risco de infecção por transfusão sanguínea está em torno de 0,001% por unidade de sangue transfundida. A prevalência do anti-hcv em doadores de órgãos, varia de 4,2% a 5,1% dependendo do teste realizado. Receptores de órgãos sólidos de doadores anti-hcv positivos apresentam elevadas taxas de soroconversão. Em estudo realizado com transplantados renais, 35% dos receptores de doadores com anti-hcv reagente desenvolveram doença hepática no pós-transplante, e 74% apresentaram evidências de viremia. Apesar desses dados, as evidências ainda são limitadas e são necessários novos estudos para avaliar o impacto do transplante de órgãos na prevalência do HCV (Martins et al. 2011). Quanto aos acidentes ocupacionais, os acidentes perfurocortantes são uma forma bem documentada de transmissão do HCV, apresenta taxas de soroconversão após uma única exposição percutânea com objeto sabidamente contaminado variando entre 3% e 10% (Mitsui et al. 1992; Lahphear et al. 1994, Martins et al. 2011) A transmissão vertical apresenta taxas variando entre 0% a 20%, com média em torno de 5% na maioria dos estudos (Taler et al,1991, Martins et al. 2011). Por fim, o papel da transmissão sexual ainda não foi bem estabelecido (Sy & Jamal 2006), constituindo este um fato controverso na epidemiologia da hepatite C devido à divergência entre resultados (Alter et al.1982; Alter et al.1989). A maioria dos trabalhos afirma que as chances de transmissão são baixas ou quase nulas e as porcentagens oscilam entre 0% e 3% (Cavalheiro 2007). 17

33 1.9 Diagnóstico Diagnóstico Sorológico O diagnóstico da infecção pelo HCV é realizado através de testes de detecção de anticorpos, antígenos e do genoma viral em amostras de soro ou plasma. Para a detecção de anticorpos anti-hcv no plasma ou soro são utilizados ensaios imunoenzimáticos de terceira geração que detectam anticorpos contra vários epítopos do HCV e apresentam especificidade maior que 99% (Uyttendaele et al. 1994; Barrera et al. 1995). Um dos problemas desta técnica é a possibilidade de resultados falsos negativos devido ao período de janela imunológica necessária para o surgimento de anticorpos. Além disso, indivíduos imunocomprometidos têm uma maior possibilidade de obterem resultados falsos negativos (Pawlotsky 1999). Um novo ensaio imunoenzimático foi desenvolvido para diagnóstico de infecção pelo HCV, baseado na detecção de antígeno e anticorpo. Este teste detecta o antígeno do HCV antes que uma resposta com anticorpos tenha sido gerada e dessa forma diminui o período de janela para diagnóstico e são denominados ensaios de quarta geração (Nick & Scheiblauer 2007). Os testes sorológicos se baseiam na detecção de anticorpos anti-hcv no soro de pacientes infectados, através de técnica imunoenzimática (Enzyme linked immunosorbent assay ou ELISA) (Pawlotsky 2002). O antígeno de captura dos testes imunoenzimáticos de primeira geração era a proteína NS4 do HCV, enquanto que o nos testes de segunda geração eram compostos pela proteína core, NS3 e NS4 do vírus. Já os testes de terceira geração utilizam uma mistura de antígenos virais (três ou quatro) de regiões estruturais e não-estruturais do HCV (core, NS3, NS4 e/ou NS5) (Cossart 1999). Atualmente já estão disponíveis os testes de quarta geração para detecção simultânea de antígenos do HCV e anticorpos anti-hcv em amostras de soro ou plasma (Lambert 2007). O teste apresenta eficiência comparada à detecção qualitativa do vírus e tem sido muito utilizado para acompanhamento de pacientes, onde permite correlacionar os níveis de antígeno core com a carga viral no soro dos pacientes infectados podendo ser utilizado com marcadores de replicação do HCV (Buti et al. 2004). Além dos ensaios imunoenzimáticos convencionais, o ensaio imunoblot recombinante (RIBA) é um teste suplementar empregado naquelas amostras com resultados positivos no ELISA e pode ser útil na diferenciação de indivíduos com 18

34 testes imunoenzimáticos falso-positivos daqueles que necessitarão de investigação clínica. O RIBA utiliza antígenos recombinantes do HCV que são imobilizados como bandas individuais na tira de reação. O mais utilizado é o imunoblot (RIBA) de 2ª ou 3ª geração, que detecta reação do soro do indivíduo contra proteínas de até 4 regiões diferentes do genoma do HCV. Quando não há reação a qualquer desses antígenos o teste é considerado negativo. Quando há reação a apenas uma proteína, indeterminado. No caso de reação a duas bandas do RIBA ou mais, a positividade do ELISA anti-vhc é confirmada. (Munoz Espinosa 2002; Souto et al. 2002). Além do diagnóstico sorológico convencional, atualmente os testes rápidos para detecção de anticorpos anti-hcv vem sendo introduzidos como uma ferramenta alternativa e prática para o diagnóstico da hepatite C. O teste baseia-se no princípio da reação antígeno-anticorpo onde o antígeno encontra-se fixado na linha T do teste e os anticorpos anti-hcv na amostra do paciente (em casos de infecção por HCV). A linha T dos testes apresenta uma combinação de antígenos (core, NS3, NS4 e NS5) que pode variar de acordo com o fabricante (Shivkumar et al. 2012). Após a adição da amostra do paciente, na presença de anticorpos anti- HCV, este reage com o conjugado (proteína A) e migra até a linha T do teste onde se liga aos antígenos lá fixados produzindo cor rosa. Alguns estudos realizados até o momento encontraram resultados de sensibilidade e especificidade superiores a 95% (Lee et al. 2010, 2011; Smith et al. 2011, Drobnik et al. 2011). Além da praticidade do teste rápido, alguns ainda podem ser utilizados em amostras de fluido oral apresentando sensibilidade e especificidade, em ambientes de campo e laboratorial, superior a 90% (Lee et al. 2010,2011; Smith et al. 2011, Drobnik et al. 2011) Diagnóstico Molecular Para a detecção do HCV-RNA, testes qualitativos e quantitativos podem ser empregados. Estes testes são baseados na amplificação, através de métodos de biologia molecular, de regiões específicas do genoma do vírus. A detecção do RNA viral pode ser qualitativa ou quantitativa e, geralmente, a detecção é feita em amostras de soro ou plasma. 19

35 Os testes qualitativos permitem determinar a presença do HCV na fase inicial da infecção (1-2 semanas após exposição), antes mesmo da produção de anticorpos (Ozaras & Tahan 2009). São exemplos de testes qualitativos a reação em cadeia de polimerase (PCR) ou testes de amplificação mediada pela transcrição (TMA). Ambos ensaios utilizam o produto da transcrição reversa (RT) (Chevaliez & Pawlotsky 2006) Os testes quantitativos incluem a RT-PCR competitiva, PCR-ELISA quantitativa, PCR em tempo real e amplificação de sinal [ensaio por DNA ramificado (bdna)]. Estes testes devem apresentar elevada sensibilidade para determinação da carga viral antes e durante o tratamento antiviral, uma vez que são utilizados tanto no diagnóstico quanto no monitoramento da eficácia terapêutica (Strauss 2001; Portaria n 221, de 13 de julho de 2011, Brasil). Os testes de detecção de anticorpos são utilizados para triagem sorológica, sendo apropriados para rastreamento em populações de risco e recomendado como teste inicial para pacientes com hepatopatia (Seeff & Hoofnagle 2002). Já os testes moleculares são importantes para determinação da carga viral presente no soro de pacientes infectados (carga viral), o que é utilizado para avaliação do prognóstico e monitoramento da terapia antiviral (Ballardini et al.1997; Strauss 2001; Seeff & Hoofnagle 2002) Tratamento O tratamento padrão da infecção crônica pelo HCV, atualmente, consiste na administração da combinação de interferon peguilado alfa-2a ou alfa-2b (IFN) e ribavirina (Fried et al. 2002). O interferon peguilado e a ribavirina são utilizados para o tratamento em pacientes monoinfectados com HCV e em pacientes co-infectados HCV/HIV. A resposta virológica sustentada é determinada pela ausência de RNA viral no período de seis meses após o tratamento (Pawlotsky 2009). A duração do tratamento para indivíduos monoinfectados HCV é baseado no genótipo infectante onde, é recomendado 24 a 48 semanas de tratamento para os genótipos 2 ou 3 e 48 a 72 semanas para os genótipos 1 e 4. A taxa de resposta depende do genótipo infectante, o que sugere que as diferenças de seqüência entre genótipos influenciam a susceptibilidade a esses medicamentos (Van den Eynde et al. 2009; Portaria n 221, de 13 de julho de 2011, Brasil). O tratamento é eficaz em aproximadamente 80% dos doentes infectados com o genótipo 2 ou 3 e menos de 50% dos doentes com o genótipo 1 (Pawlotsky 2009). Assim, doentes com o genótipo 1 necessitam de 20

36 uma maior dose de RBV e tratamento mais prolongado (1,0-1,2 g/dia, 48 a 72 semanas) do que doentes infectados com o genótipo 2 ou 3 (0,8 g/dia, 24 a 48 semanas). Para os genótipos 4, 5 e 6 existem ainda poucos ensaios clínicos, aplicando-se o protocolo terapêutico utilizado para o genótipo 1 (Pawlotsky 2009; Portaria n 221, de 13 de julho de 2011, Brasil). Atualmente, terapias utilizando antivirais de ação direta contra o HCV (inibidores de protease) podem ser uma estratégia eficaz para o tratamento do genótipo 1. As drogas Boceprevir e Telaprevir foram os primeiros inibidores de protease para o tratamento da hepatite C e recentemente obtiveram registro na Anvisa, entrando dessa forma no esquema terapêutico nacional (MS, 2012). As novas drogas serão utilizadas em terapia tripla com interferon-α e ribavirina. Estas drogas demonstraram taxas de RVS de 67%- 75% em estudos de fase III com pacientes infectados pelo HCV genótipo 1 (Poordad et al. 2011; Jacobson et al. 2011). Em relação aos efeitos adversos, foram observados para Boceprevir, anemia, pele seca e disgeusia e para o Telaprevir, anemia, náuseas, rash, diarreia, prurido e sintomas anorretais (MS, 2012). Quanto os efeitos adversos do tratamento convencional para hepatite C, os principais eventos associados aos fármacos são: interferon (alterações hematológicas, sintomas semelhantes a gripe, dor de cabeça, fadiga, febre e mialgia) e ribavirina (anemia hemolítica, tosse, dispinéia, gota, náuseas, erupções cutâneas e teratogenicidade) (MS, 2011). 21

37 2. RACIONAL E JUSTIFICATIVA O Brasil é um país composto por uma população heterogênea principalmente quanto ao nível cultural e socioeconômico. Sua geografia variada e grande área territorial tornam o país ainda mais complexo do ponto de vista epidemiológico. Esta grande diversidade dificulta e até mesmo impossibilita uma estratégia única de atuação frente aos problemas de saúde da população. Dessa forma, novas metodologias de detecção de marcadores sorológicos para hepatite C têm sido estudadas para permitir o acesso ao diagnóstico em populações situadas em áreas remotas, longe dos centros urbanos. Uma metodologia que pode ser bastante útil em áreas remotas são os testes rápidos que superam a limitação comum da realização dos testes sorológicos que em média duram 4 horas, além de diminuírem os custos de realização dos testes. Os testes rápidos de diagnóstico já são utilizados para o diagnóstico da infecção pelo HIV de acordo com a Portaria 151 do Ministério da Saúde. Os testes rápidos constituem testes de triagem que produzem resultados em um curto intervalo de tempo, em geral de 10 minutos a 2 horas, sem necessidade de grandes equipamentos. No mercado, existem testes rápidos para a detecção de diferentes patógenos [HCV (Lee et al. 2010; Drobnik et al. 2011; Smith et al. 2011; Lee et al. 2011), dengue (Lima et al. 2010; Lima et al.2011; Tontulawat et al. 2011), rotavirus (Park et al. 2012; Bruggink et al. 2011), HIV (Stevinsona et al. 2011; Delaneya et al. 2011), HBV (Soeung et al. 2009; Lin et al. 2008), sífilis (Lien et al. 2000), HEV (Chen et al. 2005), HAV (Lee et al. 2010)] os quais se baseiam em diferentes princípios: aglutinação de partículas, imunocromatografia e immunodot. Em sua maioria, os testes podem ser estocados à temperatura ambiente e são embalados em embalagens individuais. Estes testes constituem uma ferramenta de grande utilidade em situações como os estudos de campo, laboratórios que processam um pequeno número de amostras dispensando o investimento e subutilização de equipamentos, casos de exposição ocupacional, situações de emergência e diagnóstico de infecções em populações de risco, onde nem sempre ocorre o retorno pós-teste dos indivíduos para a decisão terapêutica. Além da utilização de testes rápidos, o estudo de fluidos alternativos ao soro tal como o fluido oral, faz-se necessário para reduzir o custo e o processo invasivo tradicionalmente utilizado para obtenção do espécime biológico para o diagnóstico da infecção pelo HCV (coleta de sangue). O uso da saliva também aumenta a 22

38 segurança do profissional de saúde, pois diminui o risco de acidentes com perfuro cortantes e podem garantir acesso às populações distantes do laboratório e com acesso venoso dificultado (ex. usuários de drogas endovenosas, hemodialisados, idosos e obesos). Dessa forma, a avaliação de testes rápidos associados à utilização de fluido oral como amostra biológica é necessária para determinar métodos mais eficientes para o diagnóstico da hepatite C. Logo, neste estudo esperamos contribuir para o desenvolvimento de estratégias efetivas voltadas ao diagnóstico da infecção pelo HCV. 23

39 3. Objetivo Geral Avaliar a utilização de testes rápidos para detecção de anticorpos anti-hcv para fins de diagnóstico e estudos epidemiológicos. 3.1 Objetivos Específicos Estabelecer os padrões necessários para a avaliação do desempenho dos testes rápidos, mediante a confecção de painéis de referência composta por amostras positivas e negativas para o HCV, caracterizadas frente a testes de diagnóstico disponíveis comercialmente; Avaliar parâmetros relacionados com a acurácia do teste como a sensibilidade, especificidade, bem como os valores preditivos positivo e negativo de testes rápidos de diferentes fabricantes; Avaliar o desempenho dos testes rápidos para detecção do anti-hcv em populações com diferentes perfis de endemicidade para a infecção pelo HCV; Avaliar o uso de fluido oral em testes rápidos de diagnóstico para hepatite C; Avaliar os parâmetros relacionados com a precisão intra e interensaio dos testes; Avaliar a reação cruzada dos testes rápidos para hepatite C em amostras de soro com outras infecções presentes (sífilis, malária, dengue, HIV). 24

40 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. Aspectos éticos O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da FIOCRUZ (Parecer 063/09) (ANEXO 1). Todos os pacientes que aceitaram participar do presente estudo foram informados sobre o mesmo e assinaram o termo de consentimento pós-informação, conforme resolução nº 01, de 13 de junho de 1988 do Conselho Nacional de Saúde Ministério da Saúde. Neste estudo o fluxo de trabalho pode ser observado na Figura 4.1. O estudo foi composto por amostras de soro avaliadas em um painel de referência que foram testadas nos testes rápidos Wama Imuno Rápido HCV e Bioeasy HCV Rapid Test. Além disso, todas as amostras foram testadas em dois ELISAs de fabricantes distintos: HCV Ab (Radim, Itália) e ETI-AB-HCVK4 (Diasorin, Itália). As amostras reagentes no Elisa foram retestadas em duplicata e submetidas à detecção de HCV RNA e genotipagem quando o volume de amostra foi suficiente. Figura 4.1. Fluxograma do estudo realizado com as amostras presentes no painel de referência e estudo de campo. 25