Fabricação de Scaffolds de PCL Reforçados com β-tcp Mediante Impressão 3D por Rosca de Extrusão para Aplicações em Engenharia Tecidual

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1 JOSÉ LUIS DÁVILA SÁNCHEZ Fabricação de Scaffolds de PCL Reforçados com β-tcp Mediante Impressão 3D por Rosca de Extrusão para Aplicações em Engenharia Tecidual 105/2014 CAMPINAS 2014 i

2 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA MECÂNICA JOSÉ LUIS DÁVILA SÁNCHEZ Fabricação de Scaffolds de PCL Reforçados com β-tcp Mediante Impressão 3D por Rosca de Extrusão para Aplicações em Engenharia Tecidual Orientador: Prof. Dr. Marcos Akira d Ávila Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Engenharia Mecânica da Universidade Estadual de Campinas para obtenção do título de Mestre em Engenharia Mecânica, na Área de Materiais e Processos de Fabricação. ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO JOSÉ LUIS DÁVILA SÁNCHEZ, E ORIENTADA PELO PROF. DR. MARCOS AKIRA d ÁVILA ASSINATURA DO ORIENTADOR CAMPINAS 2014 iii

3 Powered by TCPDF ( Ficha catalográfica Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Área de Engenharia e Arquitetura Rose Meire da Silva - CRB 8/5974 D289f Dávila Sánchez, José Luis, D_aFabricação de scaffolds de PCL reforçados com ß-TCP mediante impressão 3D por rosca de extrusão para aplicações em engenharia tecidual / José Luis Dávila Sánchez. Campinas, SP : [s.n.], D_aOrientador: Marcos Akira D'Ávila. D_aDissertação (mestrado) Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Mecânica. D_a1. Engenharia tecidual. 2. Matriz extracelular. 3. Poli (caprolactona). 4. Compósitos. 5. Biomateriais. I. D'Ávila, Marcos Akira, II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia Mecânica. III. Título. Informações para Biblioteca Digital Título em outro idioma: Fabrication of PCL scaffolds with ß-TCP reinforcement by 3D miniscrew extrusion printing for tissue engineering applications Palavras-chave em inglês: Tissue engineering Extracellular matrix Poly (caprolactone) Composites Biomaterials Área de concentração: Materiais e Processos de Fabricação Titulação: Mestre em Engenharia Mecânica Banca examinadora: Marcos Akira D'Ávila [Orientador] Cecília Amélia de Carvalho Zavaglia Jorge Vicente Lopes da Silva Data de defesa: Programa de Pós-Graduação: Engenharia Mecânica iv

4 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA MECÂNICA COMISSÃO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA MECÂNICA DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE MANUFATURA E MATERIAIS DISSERTAÇÃO DE MESTRADO ACADÊMICO Fabricação de Scaffolds de PCL Reforçados com β-tcp Mediante Impressão 3D por Rosca de Extrusão para Aplicações em Engenharia Tecidual Autor: José Luis Dávila Sánchez Orientador: Prof. Dr. Marcos Akira d Ávila A Banca Examinadora composta pelos membros abaixo aprovou esta Dissertação: Prof. Dr. Marcos Akira d Ávila Universidade Estadual de Campinas FEM/DEMM Prof a. Dr a. Cecília Amélia de Carvalho Zavaglia Universidade Estadual de Campinas FEM/DEMM Prof. Dr. Jorge Vicente Lopes da Silva Centro de Tecnologia da Informação Renato Archer CTI/DT3D v Campinas, 11 de dezembro de 2014.

5 Aos meus pais Miguel Ángel e María Elena pelo amor e apoio em todo momento. Sem dúvida eles me ensinaram que tudo é possível. Às minhas irmãs Marthy e Silvi por serem sempre um exemplo para mim. Aos meus sobrinhos Gabrielito e Dany, que cresceram durante minha ausência. Não pude ver seus primeiros sorrisos nem seus primeiros passos, mas sei que vale a pena, porque algum dia eles saberão de tudo o que eu fiz e chegarão ainda mais longe. José Luis vii

6 Agradecimentos Aos meus pais e às minhas irmãs, que sempre me apoiaram e incentivaram para crescer como pessoa e como profissional. Obrigado por confiar sempre em mim. Ao o meu orientador, o Prof. Dr. Marcos Akira d Ávila, pelos conhecimentos transmitidos e o completo apoio prestado para a realização deste trabalho. Agradeço também a ajuda proporcionada desde o momento que iniciei o processo seletivo da FEM. Ao Prof. Dr. Víctor Hugo Guerrero pela amizade e por ter me incentivado para continuar os estudos na pós-graduação. Ao Prof. Dr. Jorge Vicente Lopes da Silva, por ter aberto as portas da Divisão de Tecnologias Tridimensionais (DT3D) do CTI, pelas valiosas sugestões, os conhecimentos transmitidos e o completo apoio durante o desenvolvimento deste trabalho. Ao pessoal da DT3D do CTI, especialmente ao Paulo Inforçatti Neto, Matheus Stoshy de Freitas, Frederico Pereira, Paulo Amorim e Thiago Franco de Moraes, que contribuíram e ajudaram em várias fases desta pesquisa. À Profa. Dra. Cecília Amélia de Carvalho Zavaglia, pelas valiosas sugestões e conhecimentos transmitidos na sala de aula e em várias fases do desenvolvimento deste trabalho. Aos meus amigos Carlos, Nicolao, João, Taís, Ana Flávia, Geraldine, Rosemeire e Josias. Obrigado pela ajuda prestada, o trabalho em equipe, as conversas e o apoio em todo momento. tricálcico. Ao colega e amigo Felipe de Carvalho Zavaglia, por ter sintetizado e cedido o beta fosfato ix

7 Ao pessoal do Laboratório de Polímeros da Universidade Federal de São Carlos pelas caracterizações reológicas. Ao Anderson Maia e à Márcia Melo pelas caracterizações realizadas no Laboratório de Desenvolvimento da Cromex. Ao pessoal do Laboratório Multiusuário de Caracterização de Materiais da FEM: Claudinete Vieira Leal, José Luis Lisboa e Márcia de Oliveira Taipina, pela ajuda prestada durante as caracterizações morfológicas, mecânicas e térmicas. Ao Prof. Dr. Rubens Caram por ter disponibilizado o equipamento de difração de raios X do Laboratório de Metalurgia Física e Solidificação da FEM e ao Fernando Henrique da Costa pela ajuda prestada durante a realização das caracterizações. Ao Prof. Dr. Oswaldo Luiz Alves por ter disponibilizado o microtomógrafo de raios X do Laboratório de Química do Estado Sólido do IQ. Ao Prof. Dr. Guilherme Mariz De Oliveira Barra e a Claudia Merlini pelas caracterizações FTIR realizadas no Laboratório de Pesquisa em Polímeros e Compósitos da Universidade Federal de Santa Catarina. Ao. Prof. Dr. David Mendes Soares e ao técnico Luiz Orivado Bonugli, pela disponibilização do equipamento de medição do ângulo de contato do Laboratório de Nanoestruturas e Interfaces do Instituto de Física Gleb Wataghin. À Prof. Dra. Maria Helena Fernandes e ao Prof. Dr. Pedro de Sousa Gomes pela realização da avaliação biológica in vitro no Laboratório de Metabolismo e Regeneração Óssea da Universidade do Porto. x

8 Ao pessoal administrativo do Programa de Pós-graduação em Engenharia Mecânica pela disponibilidade e ajuda prestada sempre que foi necessário. À SENESCYT e ao povo equatoriano por terem fornecido a bolsa de estudos. Ao Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Biofabricação BIOFABRIS pelo apoio e financiamento. xi

9 "Nunca deixe que alguém te diga que não pode fazer algo. Nem mesmo eu. Se você tem um sonho, tem que protegê-lo. As pessoas que não podem fazer por si mesmas, dirão que você não consegue. Se quer alguma coisa, vá e lute por ela. Ponto final. (Christopher Gardner) xiii

10 Resumo A engenharia tecidual é uma linha de pesquisa que emerge como a sinergia entre diferentes ramos da ciência. É orientada à obtenção de estruturas com características semelhantes à matriz extracelular (ECM) de diferentes órgãos e tecidos, com o objetivo de reparar, regenerar ou restaurar tecido danificado. Surge como uma solução viável para diferentes problemas de saúde, que com tratamentos convencionais têm limitações, principalmente devido à pequena quantidade de doadores. As estruturas que imitam as características da ECM são chamadas de scaffolds. A manufatura aditiva permite fabricar scaffolds com geometria controlada e 100% de interconectividade, mediante a aplicação progressiva de camadas de material. Neste trabalho foram fabricados scaffolds de policaprolactona (PCL) e scaffolds de compósitos de matriz PCL reforçados com β fosfato tricálcico (β TCP) para aplicações em tecido ósseo. Foram utilizadas composições de 10, 20 e 30% em peso de reforço. Primeiramente foram definidos os parâmetros de processamento, além disso, foi realizada a caracterização reológica do PCL mediante reometria capilar. Em seguida foram fabricados scaffolds utilizando o processo de impressão 3D por rosca de extrusão, desenvolvido no Centro de Tecnologia da Informação Renato Archer (CTI). Para a fabricação dos scaffolds foi desenvolvido um software que permite gerar trajetórias de impressão contínuas em curtos tempos. Posteriormente, foram caracterizadas as propriedades térmicas mediante a análise termogravimétrica (TGA) e calorimetria exploratória diferencial (DSC), a morfologia dos scaffolds utilizando microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microtomografia computadorizada (Micro-CT), a presença do reforço mediante difração de raios- X (XRD) e a estrutura química mediante espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR). A caracterização mecânica foi realizada mediante o ensaio de compressão e a caracterização das propriedades hidrofílicas mediante a medição do ângulo de contato. Finalmente foi feita a avaliação biológica in vitro. Os scaffolds fabricados apresentaram boas características morfológicas e propriedades. A avaliação biológica in vitro mostrou que os scaffolds fabricados têm potencial para serem utilizados em aplicações em tecido ósseo. Palavras Chave: Engenharia tecidual; Matriz extracelular; Scaffolds; Manufatura aditiva. xv

11 Abstract Tissue engineering emerges as the synergy between different scientific fields. Its main objective is to repair, regenerate or restore damaged tissues or organs through the fabrication of structures with similar characteristics to the extracellular matrix (ECM). It is a viable solution to health problems, because conventional treatments have limitations, mainly due to the small number of donors. Structures that mimic the ECM characteristics are known as scaffolds. Additive manufacturing enables the fabrication of scaffolds with controlled geometry and 100% of interconnectivity through the progressive application of material layers. In this work, polycaprolactone (PCL) and PCL composites reinforced with β tricalcium phosphate (β-tcp) were manufactured for bone tissue applications. Compositions of 10, 20 and 30% by weight of β- TCP were used. Initially, processing parameters were determined. Furthermore, rheological properties of PCL were obtained by capillary rheometry. Then scaffolds were fabricated by 3D mini-screw extrusion printing, which was developed at the Renato Archer Information Technology Center (CTI). To fabricate scaffolds in short times and with continuous path, generator software was developed. Subsequently, thermal properties were obtained by thermal gravimetric analysis (TGA) and differential scanning calorimetry (DSC), scaffolds morphology using computed microtomography (Micro-CT) and scanning electron microscopy (SEM), the reinforcement presence by X-ray diffraction (XRD) and chemical structure by Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). Mechanical characterization was performed by compression test and hydrophilic properties were studied by measuring the contact angle of water drops. Finally, biological in vitro evaluation was performed. The fabricated scaffolds have good characteristics and suitable properties. The biological in vitro evaluation showed that the scaffolds have potential for bone tissue applications. Key Words: Tissue engineering; Extracellular matrix; Scaffolds; Additive manufacturing. xvii

12 Lista de Ilustrações Figura 2.1. Abordagem da engenharia tecidual mediante a utilização de scaffolds Figura 2.2. Elementos chave da engenharia tecidual... 9 Figura 2.3. Principais requisitos dos scaffolds Figura 2.4. Monômero ε-caprolactona e unidade de repetição do PCL Figura 2.5. Esquema da estrutura do tecido ósseo Figura 2.6. Esquema do processo de estereolitografia Figura 2.7. Esquema do processo SLS Figura 2.8. Esquema do processo 3DP Figura 2.9. Esquema do processo FDM com dois filamentos Figura Esquema do processo PED Figura Esquema do processo de impressão 3D por rosca de extrusão Figura Esquema do processo de extrusão monorosca Figura Esquema do inchamento do extrudado em uma matriz circular Figura 3.1. (a) Distribuição de tamanho de partícula do β TCP e (b) difratograma (XRD) do β TCP Figura 3.2. Etapas desenvolvidas para a fabricação e caracterização de scaffolds Figura 3.3. Impressora 3D Fab@CTI: a) equipamento utilizado e b) cabeçote de impressão 3D por rosca de extrusão Figura 3.4. Superfície lateral de scaffolds de PCL com altura de camada: (a) PH=0,30 mm e (b) PH=0,38 mm Figura 3.5. Escolha de parâmetros de processamento Figura 3.6. Variáveis que definem a morfologia dos scaffolds: (a) vista superior, (b) vista frontal e (c) perspectiva do scaffold Figura 3.7. Trajetórias de impressão: (a) número ímpar de fios extrudados e (b) número par de fios extrudados Figura 3.8. Trajetórias de impressão: (a) trajetória utilizada para a fabricação de scaffolds com o hidrogel Mebiol Gel (IWAMI e UMEDA, 2011) e (b) exemplo da trajetória utilizada neste trabalho xix

13 Figura 3.9. Interface gráfica do software desenvolvido Figura Trajetórias de impressão e projeções no plano xy: (a) 9 fios extrudados e 4 camadas e (b) 10 fios extrudados e 4 camadas Figura Trajetórias geradas exportadas ao software Fab@Home: (a) 2 camadas, (b) 10 camadas e (c) 100 camadas Figura Scaffolds de PCL: (a) Defeitos na morfologia causados pelas instabilidades do processo de extrusão e (b) Morfologia bem sucedida obtida com impressão continua Figura 4.1. Curvas reológicas do PCL CAPA Figura 4.2. Curvas TGA e DTG para os scaffolds P100C Figura 4.3. Curvas TGA e DTG para os scaffolds P90C Figura 4.4. Curvas TGA e DTG para os scaffolds P80C Figura 4.5. Curvas TGA e DTG para os scaffolds P70C Figura 4.6. Curvas TGA dos scaffolds de PCL puro e compósitos Figura 4.7. Curvas DSC para o segundo aquecimento Figura 4.8. Curvas DSC obtidas durante o resfriamento Figura 4.9. Morfologia dos scaffolds P100C0 (v m =12 mm/s): (a) Arquitetura 0 /90 40X, (b) 0 /90 120X, (c) seção transversal do fio extrudado 450X e (d) superfície do fio extrudado 500X Figura Morfologia dos scaffolds P100C0 (v m =11,5 mm/s): (a) Arquitetura 0 /90 40X, (b) 0 /90 120X, (c) seção transversal do fio extrudado 450X e (d) superfície do fio extrudado 500X Figura Morfologia dos scaffolds com composição P90C10 (v m =12 mm/s): (a) Arquitetura 0 /90 40X, (b) arquitetura 0 /90 120X, (c) seção transversal do fio extrudado 450X e (d) superfície do fio extrudado 500X Figura Morfologia dos scaffolds com composição P80C20 (v m =12 mm/s): (a) Arquitetura 0 /90 40X, (b) arquitetura 0 /90 120X, (c) seção transversal do fio extrudado 450X e (d) superfície do fio extrudado 500X Figura Morfologia dos scaffolds com composição P70C30 (v m =12 mm/s): (a) Arquitetura 0 /90 40X, (b) arquitetura 0 /90 120X, (c) seção transversal do fio extrudado 450X e (d) superfície do fio extrudado 500X xx

14 Figura Seção transversal dos scaffolds: (a) P100C0 (v m =12 mm/s), (b) P100C0 (v m =11,5 mm/s), (c) P90C10 (v m =12 mm/s), (d) P80C20 (v m =12 mm/s) e (e) P70C30 (v m =12 mm/s) Figura Porosidade dos scaffolds obtida mediante a análise Micro-CT Figura Reconstrução 3D para os scaffolds P100C0 (v m =12 mm/s): (a) Vista frontal e (b) imagens 3D Figura Reconstrução 3D para os scaffolds P100C0 (v m =11,5 mm/s): (a) Vista frontal e (b) imagens 3D Figura Reconstrução 3D para os scaffolds P90C10: (a) Vista frontal, (b) imagens 3D Figura Reconstrução 3D para os scaffolds P80C20: (a) Vista frontal, (b) imagem 3D e (c) partículas aglomeradas de β-tcp Figura Reconstrução 3D para os scaffolds P70C30: (a) Vista frontal, (b) imagem 3D e (c) partículas aglomeradas de β-tcp Figura Resultados obtidos com a análise XRD para o PCL CAPA 6505 e os scaffolds P100C Figura Resultados obtidos com a análise XRD para o β TCP e os scaffolds compósitos Figura Espectros FTIR do pó de PCL CAPA 6505, do pó de β TCP e dos scaffolds de PCL e PCL/ β TCP Figura Curvas tensão versus deformação para os scaffolds: (a) P100C0, (b) P90C10, (c) P80C20 e (d) P70C Figura Curvas médias de tensão versus deformação para os scaffolds de PCL e PCL/ β TCP Figura Módulo de elasticidade médio para os scaffolds de PCL e PCL/ β TCP Figura Resultados obtidos na medição do ângulo de contato das amostras não porosas de PCL e PCL/ β TCP Figura (a) Equipamento utilizado para a medição do ângulo de contato, (b) scaffold de PCL e (c) amostra não porosa de PCL utilizada nas medições do ângulo de contato xxi

15 Lista de Tabelas Tabela 2.1. Critérios no projeto de scaffolds Tabela 2.2. Biomateriais comumente utilizados em engenharia tecidual Tabela 2.3. Propriedades mecânicas dos ossos trabecular e cortical para o ensaio de compressão Tabela 2.4. Processos de MA utilizados para a fabricação de scaffolds; classificação ASTM segundo o processo Tabela 3.1. Especificações do PCL CAPA Tabela 3.2. Fração em peso e fração volumétrica dos scaffolds Tabela 3.3. Resultados do teste de continuidade do fluxo de material na extrusora Tabela 3.4. Influência da rotação da rosca de extrusão na morfologia dos scaffolds analisada mediante MEV Tabela 3.5. Imagens MEV da superfície lateral e transversal de scaffolds de PCL fabricados com diferentes alturas de camada (PH) Tabela 3.6. Variáveis do software Tabela 3.7. Equações utilizadas na caracterização reológica Tabela 4.1. Resultados do ajuste linear dos dados reológicos experimentais Tabela 4.2. Resultados obtidos com a caracterização reológica do PCL CAPA Tabela 4.3. Resultados obtidos com a análise TGA Tabela 4.4. Resultados obtidos durante a caracterização térmica dos scaffolds Tabela 4.5. Resultados obtidos durante a caracterização da morfologia dos scaffolds Tabela 4.6. Porosidade real e teórica dos scaffolds obtida mediante a análise Micro-CT Tabela 4.7. Bandas características do PCL e bandas obtidas para o material puro e os scaffolds na análise FTIR Tabela 4.8. Gotas de água deionizada (5 μl) na superfície das amostras não porosas de PCL e PCL// β TCP Tabela 4.9. Imagens MEV da cultura celular para os dias 1 e xxiii

16 Lista de Abreviaturas e Siglas Abreviações α' TCP α TCP β TCP 3D 3DP ANOVA CAD CAM CT XRD DSC DTG ECM FDM FTIR HA IE MA MEV Micro-CT MRI PBS PCL PED ph α' Fosfato tricálcico α Fosfato tricálcico β Fosfato tricálcico Tridimensional Processo de impressão 3D Análise de variância Desenho assistido por computador Manufatura assistida por computador Tomografia computadorizada Difração de raios-x Calorimetria exploratória diferencial Termogravimetria derivada Matriz extracelular Modelagem por fusão e deposição Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier Hidroxiapatita Inchamento do extrudado Manufatura aditiva Microscopia eletrônica de varredura Microtomografia computadorizada Imagem por ressonância magnética Tampão fosfato salino (Phosphate Buffered Saline) Policaprolactona Deposição por extrusão de precisão Potencial hidrogeniônico xxv

17 PLA SBF SL SLS TCP TGA u.a. UV Poli (ácido láctico) Soro bovino fetal Estereolitografia Sinterização seletiva a Laser Fosfato tricálcico Termogravimetria Unidades arbitrárias Ultravioleta Siglas ASTM CTI DT3D ESB FDA ITRI MIT NSF American Society for Testing and Materials Centro de Tecnologia da Informação Renato Archer Divisão de Tecnologias Tridimensionais European Society for Biomaterials Food and Drug Administration International Technology Research Institute Massachusetts Institute of Technology National Science Foundation Letras Latinas AG Tamanho do poro (mm); (μm) D Diâmetro da rosca (mm) d Diâmetro (mm) D b Diâmetro do barril (mm) D c Diâmetro do capilar (mm) D e Diâmetro do extrudado (mm) e Espaçamento (mm) H Profundidade do canal da rosca (mm) xxvi

18 L c Comprimento do capilar (mm) m Consistência do material (Pa s n ) M w Massa molecular ponderal média (g mol) n Índice de potência N Rotação da rosca (rpm) NE NL Número de espaços Número de camadas P Porosidade (%) P r Porosidade real (%) P t Porosidade teórica (%) PH Altura de camada (mm) R 2 Coeficiente de determinação T c Temperatura de cristalização ( C) T g Temperatura de transição vítrea ( C) T i Temperatura do início da degradação térmica ( C) T m Temperatura de fusão ( C) T o Temperatura do fim da degradação térmica ( C) T p Temperatura pico da degradação térmica ( C) T pr Temperatura de processamento ( C) v b Velocidade de descida do êmbolo (mm s) v m Velocidade de movimentação do cabeçote (mm s) W Largura do scaffold (mm) Letras Gregas γ Taxa de cisalhamento (s 1 ) γ C Taxa de cisalhamento corrigida (s 1 ) H c Entalpia de cristalização (J g) H m Entalpia de fusão (J g) xxvii

19 0 ΔH m Entalpia de fusão para 100% de cristalinidade (J g) ρ Densidade (g cm 3 ) ρ m Densidade da matriz (g cm 3 ) ρ r Densidade do reforço (g cm 3 ) φ c Fração volumétrica χ c (%) Grau de cristalinidade (%) ω ω p Fração em peso da matriz Fração em peso do reforço η Viscosidade (Pa s) κ Razão entre as densidades do reforço e da matriz λ Comprimento de onda (Å) θ Ângulo de incidência ( ) π Pi τ Tensão (Pa) xxviii

20 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO Considerações Gerais Motivação do trabalho Objetivos Objetivo geral Objetivos específicos REVISÃO DA LITERATURA Engenharia tecidual Scaffolds para engenharia tecidual Requisitos dos scaffolds Critérios para projetar scaffolds Biomateriais utilizados na fabricação de scaffolds Poli(caprolactona) PCL β Fosfato tricálcico Tecido ósseo Manufatura aditiva (MA) aplicada à fabricação de scaffolds Estereolitografia (SL) Sinterização seletiva a laser (SLS) Impressão 3D (3DP) Modelagem por fusão e deposição (FDM) Deposição por extrusão de precisão (PED) Impressão 3D por rosca de extrusão Conceitos básicos da extrusão monorosca xxix

21 3. MATERIAIS E MÉTODOS Materiais Poli(caprolactona) PCL CAPA β Fosfato tricálcico Métodos Equipamento Fab@CTI e cabeçote de impressão 3D por rosca de extrusão Fabricação de scaffolds Parâmetros de processamento Software gerador de trajetórias para fabricação de scaffolds 0 / Técnicas de caracterização Reometria capilar Análise termogravimétrica (TGA) Calorimetria exploratória diferencial (DSC) Microscopia eletrônica de varredura (MEV) Microtomografia computadorizada (Micro-CT) Difração de raios-x (XRD) Infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) Ensaio de compressão Ângulo de contato Avaliação biológica in vitro RESULTADOS E DISCUSSÕES Reometria capilar Análise termogravimétrica (TGA) Calorimetria exploratória diferencial (DSC) Microscopia eletrônica de varredura (MEV) Microtomografia computadorizada (Micro-CT) Difração de raios-x (XRD) xxx

22 4.7 Infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) Ensaio de compressão Ângulo de contato Avaliação biológica in vitro CONCLUSÕES E SUGESTÕES PARA PRÓXIMOS TRABALHOS Conclusões Sugestões para próximos trabalhos REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS xxxi

23 1. INTRODUÇÃO No capítulo introdutório são apresentadas as considerações gerais afins ao tema, enfocando principalmente a engenheira tecidual e a sua relação com a manufatura aditiva e os biomateriais. Além disso, são mostrados alguns detalhes fundamentais do trabalho e a motivação para desenvolvê-lo. O capítulo conclui expondo os objetivos definidos para a realização desta pesquisa. 1.1 Considerações Gerais A engenharia tecidual é definida como: A aplicação dos princípios e métodos de engenharia e ciências da vida na direção do entendimento fundamental das relações estruturafunção em tecidos normais e patológicos de mamíferos, e o desenvolvimento de substitutos biológicos para restaurar, manter ou incrementar a função do tecido. Esta definição foi realizada por Skalak e Fox em 1988, posteriormente aceita pelo ITRI (International Technology Research Institute) e a NSF (National Science Foundation) (MCINTIRE et al., 2002). A engenharia tecidual é uma área de pesquisa emergente. Atualmente, as pesquisas estão focalizadas em diferentes subáreas, com a finalidade de obter estruturas semelhantes às de cartilagens, ossos, válvulas do coração, nervos, bexiga, fígado, etc., além de testar o seu desempenho em ensaios in vitro e in vivo (HUTMACHER, 2001; SHOUFENG et al., 2002). Para a regeneração de tecido danificado é necessário desenvolver estruturas análogas às dos diferentes tecidos. Na engenharia tecidual essas estruturas são chamadas de scaffolds. Segundo a norma ASTM F , um scaffold é uma estrutura de suporte ou uma matriz que facilita a migração, crescimento ou transporte de células ou moléculas bioativas. Além disso, pode desempenhar a função de um veículo para liberação controlada de fármacos, sendo seu principal objetivo substituir, restaurar ou regenerar tecidos (ASTM, 2013). Características como 1 ASTM F : Standard Guide for Characterization and Testing of Biomaterial Scaffolds Used in Tissue- Engineered Medical Products. 1

24 biocompatibilidade, resistência mecânica, porosidade controlada, interconectividade entre poros, etc., são de grande importância no desenvolvimento de scaffolds (SHOUFENG et al., 2002; LIN et al., 2008). A partir dessas características, principalmente a porosidade, permitirá migração de células, transferência de nutrientes e vascularização (ABDELAAL e DARWISH, 2011; YEO et al. 2010). As limitações de alguns tratamentos cirúrgicos levaram ao desenvolvimento da engenharia tecidual na procura de obter tratamentos alternativos (YEONG et al., 2004), considerando que muitos pacientes morrem na espera de doadores de tecidos e órgãos (SHOUFENG et al., 2002). Sendo assim, as tecnologias de manufatura aditiva são muito importantes para a engenharia tecidual. Essa tecnologia não é recente, antigamente era utilizada em grandes empresas (devido ao seu alto custo) para a elaboração de protótipos de produtos. Na década de 80, a indústria de impressão 3D era de acesso limitado devido ao custo elevado das máquinas (CANESSA et al., 2013). Na última década, a manufatura aditiva tem evoluído e está disponível para aplicações em diferentes ramos. A bioengenharia tem sido beneficiada pelos diferentes processos de manufatura aditiva, devido à possibilidade de fabricar estruturas tridimensionais com características semelhantes às de órgãos e tecidos reais, além de próteses personalizadas. Então, a fabricação de scaffolds poderá ser realizada através da combinação das tecnologias 3D, CAD e CAM (OLIVEIRA et al., 2007). Os biomateriais são parte fundamental da engenharia tecidual. Pesquisas na área da ciência e engenharia dos materiais têm permitido obter diferentes biomateriais metálicos, cerâmicos, poliméricos e compósitos. Esses materiais podem ser utilizados conjuntamente com a manufatura aditiva para fabricar scaffolds. No caso dos biomateriais poliméricos e compósitos de matriz polimérica, a manufatura aditiva é muito utilizada, principalmente devido à relativa facilidade de obter estruturas porosas com arquitetura controlada mediante software CAD, sendo que a complexidade da arquitetura depende diretamente do processo utilizado (WENYONG et al., 2013). 2

25 Neste trabalho foi investigada a fabricação de scaffolds de policaprolactona (PCL) reforçada com β fosfato tricálcico (β TCP). Aproveitando as características do PCL, foi possível utilizá-lo como matriz, e juntamente com o processo de manufatura aditiva baseado em um cabeçote de impressão 3D por rosca de extrusão, o reforço cerâmico foi adicionado para obter um material com melhor desempenho para aplicações em engenharia tecidual. O PCL tem sido muito utilizado na engenharia tecidual devido às suas propriedades mecânicas, mas a principal desvantagem que possui é a hidrofobia (RODRIGUEZ et al., 2013; WU et al., 2012). O processo de manufatura utilizado é baseado no projeto Fab@Home 2 da Universidade de Cornell. No Centro de Tecnologia da Informação Renato Archer (CTI) situado em Campinas, foram desenvolvidos diferentes projetos de cabeçotes de impressão sob o projeto Fab@CTI. O CTI está integrado à rede de desenvolvimento mundial Fab@Home (INFORÇATTI NETO, 2007). O mais recente desenvolvimento da Divisão de Pesquisa em Tecnologias Tridimensionais (DT3D), em cooperação com a Escola de Engenharia de São Carlos USP, foi um cabeçote de impressão 3D por rosca de extrusão que trabalha com material em forma de pó. Então, a principal vantagem desse equipamento é a possibilidade de imprimir materiais poliméricos e compósitos, sem a necessidade de processamentos prévios como a obtenção de fios extrudados ou pellets, que são comumente utilizados em equipamentos semelhantes (SILVEIRA et al., 2014). Em muitos dos trabalhos desenvolvidos na área de scaffolds compósitos para aplicações em engenharia tecidual, a hidroxiapatita (HA) tem sido comumente utilizada para reforçar ao PCL. Do mesmo jeito, existem trabalhos desenvolvidos com a utilização de vidros bioativos e fosfatos de cálcio α e β. Estes materiais apresentam boas propriedades biológicas para a regeneração dos tecidos. Na literatura é citado que o β TCP apresenta maior biorreabsorção e osteocondutividade do que o TCP. Embora os cerâmicos sejam muito frágeis, ao desenvolver compósitos de matriz polimérica o desempenho mecânico pode ser melhorado; sendo assim, compósitos de PCL reforçados com β TCP podem ser aplicados para a regeneração de tecido ósseo (YEO et al., 2010)

26 Compilando os aspectos relatados nos parágrafos precedentes, nesta pesquisa foram desenvolvidos scaffolds de compósitos de PCL reforçados com β TCP utilizando três composições diferentes: 10, 20 e 30% em peso de reforço. A composição máxima de 30% em peso é baseada no fato de que o processo utilizado trabalha com extrusão monorosca sem elementos de mistura. Então, decidiu-se trabalhar com menores quantidades de reforço que as utilizadas em pesquisas da literatura. Com processos de extrusão pneumáticos são reportados trabalhos com até 40% em peso de reforço de β TCP, no entanto os métodos utilizados reportam a necessidade de moagem criogênica para um segundo processamento do material para melhorar a dispersão do reforço na matriz polimérica (LEE e KIM, 2011). Inicialmente foram avaliadas as propriedades reológicas do PCL utilizando reometria capilar, isto foi um passo prévio ao processamento. Em seguida foram definidos os parâmetros de processamento com a finalidade de obter a reprodutibilidade. Posteriormente foram avaliadas a propriedades térmicas mediante termogravimetria (TGA) e calorimetria exploratória diferencial (DSC), a morfologia dos scaffolds utilizando microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microtomografia computadorizada (Micro-CT), a presença do β TCP mediante difração de raios-x (XRD) e a estrutura química mediante espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR). As propriedades mecânicas foram determinadas utilizando o ensaio de compressão. As propriedades hidrofílicas foram avaliadas mediante a medição do ângulo de contato. Além disso, foi realizada a avaliação biológica in vitro para determinar se é factível utilizar os scaffolds em aplicações em engenharia tecidual. 1.2 Motivação do trabalho A principal motivação deste trabalho é aportar soluções à área da saúde a partir da área da engenharia. Os processos de manufatura aditiva apresentam um grande potencial para desenvolver estruturas tridimensionais, então, a engenharia tecidual pode ser estudada de forma mais profunda aplicando processos que atualmente podem ser desenvolvidos com equipamentos de baixo custo. A impressora Fab@CTI apresenta características adequadas para pesquisas em engenharia tecidual; software e hardware abertos, baixos custos de produção, baixas quantidades 4

27 de material para o processamento e a possibilidade de trabalhar com diferentes materiais. Isso gera inúmeras opções para a fabricação de scaffolds. Além do mais, o contínuo desenvolvimento e melhoramentos dos elementos que compõem a Fab@CTI, têm permitido realizar diferentes avanços nas condições de processamento. O cabeçote de impressão 3D por rosca de extrusão é um claro exemplo do trabalho que vem sendo desenvolvido no CTI com a impressora Fab@CTI. Então, estudar uma aplicação específica da engenharia tecidual nesta plataforma é de grande utilidade, para além da área da saúde aportar à validação do cabeçote neste tipo de aplicação. 1.3 Objetivos Objetivo geral Fabricar scaffolds de PCL reforçados com β TCP mediante impressão 3D por rosca de extrusão para potenciais aplicações em engenharia tecidual Objetivos específicos Determinar os parâmetros de processamento adequados para a obtenção de scaffolds com arquitetura 0 /90. Analisar a influência de três composições diferentes de β TCP nos scaffolds, nas propriedades térmicas, mecânicas, físicas e na estrutura química. Verificar se a dispersão da biocerâmica na matriz polimérica foi homogênea. Avaliar a morfologia e a porosidade dos scaffolds, de forma que as dimensões obtidas sejam apropriadas para a regeneração de tecido ósseo. Analisar a influência da concentração de β TCP na hidrofilicidade dos scaffolds. Determinar se os scaffolds têm potencial de uso em engenharia tecidual mediante a avaliação biológica in vitro. 5

28 2. REVISÃO DA LITERATURA Na parte inicial do segundo capítulo é exposta a abordagem da engenharia tecidual, para em seguida definir as principais características, requisitos e critérios fundamentais na hora de projetar scaffolds. Logo após, são apresentadas as características e propriedades dos biomateriais utilizados nesta pesquisa, além do tecido ósseo. Finalmente são descritos os processos de fabricação de scaffolds, com ênfase no processo de impressão 3D por rosca de extrusão. 2.1 Engenharia tecidual Ao redor do mundo inteiro, os maiores problemas de saúde estão relacionados à falha de órgãos e tecidos. Os transplantes e enxertos têm sido as principais soluções utilizadas para substituir órgãos e tecidos danificados, no entanto, há grandes limitações devido à pequena quantidade de doadores, à dificuldade de encontrar doadores compatíveis, o risco de infecção e de rejeição do implante, entre outros (GUALANDI, 2011). A engenharia tecidual se apresenta como uma solução viável para os problemas anteriormente expostos. A engenharia tecidual abarca principalmente a obtenção de pequenas quantidades de tecido e isolamento e crescimento das células. Essas células são incorporadas a biomateriais ou scaffolds mediante implantação. Assim, o tecido projetado pode ser implantado no corpo para iniciar o processo de regeneração. A engenharia tecidual já provou ser viável em humanos, especialmente nos tecidos da pele, cartilagem, bexigas, e vasos sanguíneos (KHADEMHOSSEINI et al., 2006). Por outro lado, a utilização de scaffolds é parte fundamental nesta área de pesquisa, porque estas estruturas fornecem um ambiente adequado para a regeneração de tecidos. A elaboração de scaffolds com a utilização de biomateriais é de grande importância, porque durante a regeneração do tecido, o material utilizado como estrutura será biorreabsorvido progressivamente e finalmente eliminado do corpo (ZILBERMAN, 2011). Na Figura 2.1 é apresentada a abordagem da engenharia tecidual mediante o cultivo de células em scaffolds tridimensionais. 7

29 Figura 2.1. Abordagem da engenharia tecidual mediante a utilização de scaffolds. Fonte: Autoria própria. Fundamentalmente, o transplante de células pode ser autólogo ou alogênico. No primeiro caso, as células são obtidas do próprio paciente, o que elimina o risco de rejeição do implante e transmissão de doenças (GONSALVES et al., 2008). Por outro lado, no transplante alogênico, as células transplantadas vêm de um doador. Neste caso, do mesmo jeito que no transplante de órgãos, o doador deve ter genética similar com o paciente, procurando assim compatibilidade para evitar a rejeição do implante (RATNER et al., 2004). O doador não necessariamente deve ser da família do paciente, só deve ser geneticamente semelhante. No entanto, neste último caso a probabilidade de se encontrar um doador compatível diminui consideravelmente. O transplante de células autólogo é frequentemente visto como o caminho mais óbvio e conveniente em aplicações em engenharia tecidual. Isto é devido às reduzidas exigências regulatórias e de segurança em comparação ao transplante alogênico. O uso de células autólogas implica máxima segurança para o paciente (MCINTIRE et al., 2002). 8

30 Para construir um novo tecido a engenharia tecidual é baseada em três componentes: (i) células, (ii) biomateriais e (iii) mecanismos de sinalização. As células são obtidas de tecido em bom estado; incluindo tecidos de nervos, fígado, pâncreas, cartilagem e osso, além de células troco adultas ou embrionárias e células precursoras. Os biomateriais são utilizados para fabricar scaffolds com o objetivo de criar uma estrutura para cultivar as células. Essa construção celular vai imitar a função da matriz extracelular (ECM) do tecido. Os mecanismos de sinalização promovem e/ou impedem a adesão, proliferação, migração e diferenciação celular. Além disso, regulam positiva ou negativamente a síntese de proteínas, fatores de crescimento e receptores (KHANG et al., 2007; ATTAF, 2011). Na Figura 2.2 são mostrados os elementos chave da engenharia tecidual. Figura 2.2. Elementos chave da engenharia tecidual. Fonte: Adaptado de (KHANG et al., 2007). 9

31 2.2 Scaffolds para engenharia tecidual Na engenharia tecidual é necessário projetar e fabricar estruturas com as características da matriz extracelular. Neste contexto, os scaffolds são definidos especificamente como uma matriz temporária para o tecido em crescimento. Esta matriz é uma estrutura porosa que suporta o tecido em regeneração, idealmente, a sua taxa de degradação é igual à taxa de cura ou regeneração total (SEYEDNEJAD et al., 2012). Enquanto o scaffold é degradado, as células formam uma nova matriz extracelular, com uma arquitetura cada vez mais próxima ao tecido hospedeiro (KHADEMHOSSEINI et al., 2006). As células de tecidos danificados não têm a capacidade de formar tecidos 3D com características anatômicas. A proliferação celular sem a utilização de scaffolds faz com que as células formem um conjunto de camadas 2D (GONSALVES et al., 2008) Requisitos dos scaffolds Os scaffolds precisam de certas características básicas para terem um bom desempenho para atender os objetivos da engenharia tecidual: biocompatibilidade e bioatividade, biodegradabilidade e biorreabsorção, compatibilidade mecânica, porosidade interligada e natureza não tóxica dos produtos de degradação, são as principais características Biocompatibilidade e bioatividade A biocompatibilidade é a habilidade de um material para induzir uma resposta adequada do hospedeiro em uma aplicação específica. Isto é, envolve a aceitação de um implante artificial pelos tecidos circundantes e pelo organismo (WILLIAMS, 1999). Os materiais biocompatíveis não irritam as estruturas circundantes, não provocam uma resposta inflamatória anormal, não incitam reações alérgicas ou imunológicas e não causam câncer nem nenhum outro tipo de doença (PARK e BRONZINO, 2003). A biocompatibilidade é um fator crítico na hora de projetar scaffolds, então, deve ser biocompatível tanto o material, quanto os produtos da degradação, para não induzir respostas prejudiciais nos sistemas biológicos (BIDANDA e BÁRTOLO, 2008). 10

32 A bioatividade é a capacidade de um material estabelecer ligações de natureza química com o tecido ósseo, o que é conhecido como osteointegracão. Então, em engenharia tecidual, especificamente em aplicações de tecido ósseo, essa propriedade é desejável para que o colágeno e o mineral do osso sejam depositados diretamente sobre a superfície do scaffold (WILLIAMS, 1999) Biodegradabilidade e biorreabsorção A biodegradabilidade é a capacidade do ambiente fisiológico para quebrar ou degradar o material implantado. A biodegradação é uma característica crítica dos materiais utilizados na regeneração de tecidos. Os materiais utilizados são muitas vezes chamados de "biomateriais inteligentes", porque ao iniciar o processo de regeneração também inicia o processo de degradação. Ao término da regeneração, idealmente não deve existir nenhuma evidência do implante, sem que seja necessário realizar intervenções cirúrgicas para removê-lo do corpo. A biorreabsorção permite eliminar o material degradado após a metabolização (ATTAF, 2011) Propriedades mecânicas A estrutura do scaffold deve proporcionar uma resistência mecânica adequada para ter um bom desempenho durante o processo de implantação e manipulação cirúrgica. Além do mais, a integridade mecânica deve ser suficiente para resistir às condições de carga fisiológica normal no local de implante (ATTAF, 2011). Características como a porosidade, permeabilidade, conectividade de poros, entre outras, são necessárias para o desenvolvimento de scaffolds, porém as propriedades mecânicas geralmente são afetadas quando se procura aperfeiçoar essas características. Na atualidade, o projeto de scaffolds leva em consideração biomateriais compósitos, tentando manter um equilíbrio, para não afetar as propriedades mecânicas nem as características fundamentais para a proliferação de células (ATTAF, 2011; SCHUURMAN et al., 2011). Se as propriedades mecânicas como a resistência à compressão são baixas, o scaffold será deformado ou esmagado. Assim, o tecido em crescimento também ficará deformado ou não crescerá. Por 11

33 outro lado, se a resistência do scaffold é muito alta, as células não estarão sujeitas as condições apropriadas in vivo. Para o crescimento das células é necessária certa flexibilidade no scaffold (EBNESAJJAD, 2013). É extremamente importante que as propriedades mecânicas do scaffold sejam muito próximas às do tecido a regenerar. A formação da nova ECM não está limitada pela falha mecânica do scaffold, no entanto, uma boa compatibilidade entre as propriedades mecânicas vai gerar estímulos para garantir um crescimento adequado do tecido (GUALANDI, 2011) Porosidade, tamanho do poro e interconectividade Segundo a norma ASTM F , os poros são definidos como uma rede inerente ou induzida de canais e espaços abertos dentro de uma estrutura que de outro modo seria sólida. A sua vez, a porosidade é definida como uma propriedade de um sólido que contém uma rede de poros. A porosidade pode ser medida pela relação entre o volume poroso e o volume aparente (total) de um material e é comumente expressa como uma porcentagem (ASTM, 2013). No caso dos scaffolds, a porosidade é muito importante para permitir a proliferação das células na sua estrutura. Além disso, é necessária uma grande relação área superficial/volume para ter uma boa interação entre o material e as células, além de minimizar a quantidade de restrições na difusão durante o processo de cultivo e proliferação celular. Em muitas pesquisas têm-se utilizado porosidades de 55% até 74% para regeneração de tecido ósseo. Seria ideal trabalhar com porosidades de 90%, no entanto, neste caso as propriedades mecânicas são afetadas (ANG et al., 2006). O tamanho do poro vai depender do tipo de tecido a regenerar. No caso do tecido ósseo o tamanho de poro sugerido está entre 50 e 710 μm. Em alguns estudos foram obtidos bons resultados com tamanhos entre 150 e 300 μm (EBNESAJJAD, 2013) Critérios para projetar scaffolds Para projetar scaffolds é necessário levar em consideração os requisitos anteriormente apresentados. Estes requisitos devem estar equilibrados de maneira que a atividade celular seja promovida. Isto é, deve ser considerada uma combinação de requisitos biológicos e de 3 ASTM F : Standard Guide for Characterization and Testing of Biomaterial Scaffolds Used in Tissue- Engineered Medical Products. 12

34 engenharia. Na Tabela 2.1 são apresentados os critérios fundamentais a ser levados em consideração no projeto de scaffolds e na Figura 2.3 são mostrados os requisitos dos scaffolds. Tabela 2.1. Critérios no projeto de scaffolds. Critério Função/característica resultante Não toxicidade / Resposta inflamatória mínima. Biocompatibilidade Interação positiva com o tecido hospedeiro. Arquitetura 3D Ambiente fisiologicamente relevante para a função celular. Porosidade: Eficiência da cultura de células. Área superficial. Migração e proliferação celular. Vascularização. Crescimento de novo tecido. Adesão/migração das células. Tamanho de poro: Espaços vazios Macroporos (>50 μm): Funcionalidade do tecido. Microporos (<50 μm): Funcionalidade das células e adesão celular. Nanoporosidade (1 100 nm): Adesão celular; arquitetura a nível nano e texturas da superfície. Interconectividade: Viabilidade celular e regeneração do tecido. Difusão e intercambio de nutrientes. Eliminação de produtos residuais. Química da superfície e topografia Adesão celular e interações célula-matriz. Integração total com tecido(s) circundante(s). Capacidade de suportar as forças in vivo e evitar a osteopenia*. Manter propriedades mecânicas para preservar o espaço para o Comportamento mecânico crescimento das células e a formação da ECM. Inicialmente, o scaffold deve suportar as cargas no ambiente do tecido hospedeiro. Essas cargas devem ser transferidas gradativamente para o tecido regenerado. O scaffold conduz à formação da matriz funcionalizada. Taxa de degradação A cinética de degradação deve garantir estabilidade mecânica do scaffold. Comportamento mecânico anisotrópico. Anisotropia estrutural Influência na orientação das células e na deposição na ECM. * No caso de scaffolds para regeneração de tecido ósseo. A osteopenia é a redução da densidade do osso. Fonte: Adaptado de: (ZILBERMAN, 2011; BÁRTOLO et al., 2012). 13

35 Figura 2.3. Principais requisitos dos scaffolds. Fonte: Autoria própria. 2.3 Biomateriais utilizados na fabricação de scaffolds De acordo a 2 a Conferência de Consenso sobre Definições de Biomateriais, realizada pela ESB (European Society for Biomaterials) em 1991, os biomateriais são definidos como: materiais destinados a interagir com sistemas biológicos para avaliar, tratar, aumentar ou substituir um tecido ou órgão ou alguma função no corpo (WILLIAMS, 1999). Os biomateriais são substâncias naturais ou sintéticas (que não sejam drogas). Estes materiais são tolerados de forma transitória ou permanente, pelos diversos tecidos que constituem o organismo humano. Existem diferentes tipos de biomateriais, que basicamente podem ser: (i) biomateriais metálicos, (ii) biomateriais cerâmicos, (iii) biomateriais poliméricos e (iv) biomateriais compósitos (RATNER et al., 2004). 14

36 Na engenharia tecidual comumente são utilizados polímeros naturais, sintéticos e biocerâmicas. Estes materiais estão em conformidade com os requisitos necessários para a fabricação de scaffolds, sendo as características fundamentais a biocompatibilidade e a biodegradação (ZILBERMAN, 2011). Uma grande variedade de materiais biodegradáveis tem sido utilizada na engenharia tecidual. Em muitas pesquisas além de trabalhar com biomateriais poliméricos ou com biocerâmicas de jeito independente, têm se trabalhado com blendas ou com compósitos de polímero reforçados com biocerâmica, tanto para melhorar as propriedades mecânicas quanto para melhorar propriedades como as hidrofílicas e a microporosidade (PATRÍCIO et al., 2013; NARAYAN et al., 2010). A utilização de polímeros apresenta algumas vantagens, no entanto, existe a preocupação de que seus produtos de degradação possam levar a uma queda no ph local, criando um ambiente ácido que pode danificar as células e tecidos (SINGH et al., 2013). Além disso, a queda no ph local acelera o processo de degradação, o que pode resultar em uma rápida diminuição da estabilidade mecânica (PALLUA e SUSCHEK, 2011). No entanto, a processabilidade e outras características são importantes fatores para que os polímeros sejam muito utilizados. Os biomateriais poliméricos têm sido empregados na forma de malhas fibrosas, esponjas porosas, ou hidrogéis. Estes materiais apresentam maior variedade quanto ao tempo de degradação, tendo desde curtos períodos de degradação, muitas vezes da ordem de dias ou meses, até períodos de vários anos (VAN DE VELDE e KIEKENS, 2002). As biocerâmicas são empregadas frequentemente para a regeneração do tecido ósseo. Isso é devido ao fato de que muitas delas possuem os elementos constituintes do osso, o que é ideal para a osteointegracão com o tecido. Na Tabela 2.2 são apresentados alguns materiais comumente utilizados para a fabricação de scaffolds. 15

37 Tabela 2.2. Biomateriais comumente utilizados em engenharia tecidual. Naturais Alginato Colágeno Quitosana Biomateriais poliméricos Sintéticos Poli (ácido glicólico) PGA, poli (ácido lático) PLA e seus copolímeros Poli(caprolactona) Poli(dioxanona) Ácido hialurônico Poli(óxido de etileno) PEO, copolímeros do Poli(butileno tereftalato) / Poli (propileno fumarato) Polianídrido Biocerâmicas Hidroxiapatita e outros tipos de fosfato de cálcio, como fluorapatita ou fosfato tricálcico Hidroxiapatita bifásica / Cerâmicas de fosfato tricálcico Vidros bioativos Fonte: (BIDANDA e BÁRTOLO, 2008) Poli(caprolactona) PCL O PCL é um poliéster alifático biodegradável e biorreabsorvível. É um polímero semicristalino que possui alta solubilidade. Além disso, as suas propriedades térmicas fazem com que seja possível trabalhar com diferentes processos de fabricação utilizados comumente no processamento de termoplásticos. O seu ponto de fusão (T m ) é baixo, está entre 59 e 64 C. A temperatura de transição vítrea (T g ) está ao redor de -60 C e a temperatura de degradação geralmente está perto dos 350 C (MARK, 2009; JIANG et al., 2011). Este material tem uma excepcional habilidade para formar blendas, o que é de grande interesse na pesquisa de biomateriais (LENDLEIN e SISSON, 2011). Por outro lado, levando em consideração que o grau de cristalinidade diminui quando aumenta a massa molar, com 5000 g/mol a cristalinidade é de 80%, e no caso de uma massa molar de g/mol a cristalinidade cai até 45% (DUMITRIU e POPA, 2013). 16

38 O PCL é obtido mediante polimerização por abertura do anel de ε-caprolactona a 170 C em uma atmosfera de nitrogênio, para isso, é utilizado óxido de dibutil-estanho (CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 ) 2 SnO como catalisador, no entanto, podem-se utilizar outros tipos de catalisadores. Há uma ampla variedade de iniciadores, tais como catalisadores organometálicos e alcanolamina (MARK, 2009). Na Figura 2.4 é apresentada a estrutura do PCL e o monômero de onde é obtido. Figura 2.4. Monômero ε-caprolactona e unidade de repetição do PCL. Fonte: Adaptado de: (RATNER et al., 2004; LABET e THIELEMANS, 2009) Em geral, o processo de degradação do PCL é mais lento em comparação ao poli(ácido láctico) (PLA), portanto, pode ser utilizado para liberação controlada de fármacos, porque permanece ativo por mais de um ano no corpo (SULTANA, 2013). A degradação acontece em duas fases. Na primeira fase, ocorre uma cisão aleatória da cadeia hidrolítica, o que resulta em uma redução da massa molar do polímero. Na segunda fase, os fragmentos de baixa massa molar e as pequenas partículas de polímero são levadas longe do local de implantação por solubilização nos fluidos corporais ou por fagocitose, o que resulta numa perda de massa molar. A degradação e eliminação completa do PCL pelo organismo podem durar entre dois e quatro anos (DUMITRIU e POPA, 2013). Na Europa o PCL tem sido utilizado para a fabricação de grampos biodegradáveis e fios de sutura para fechar feridas. Após uma grande quantidade de testes, é considerado como um material não tóxico e biocompatível (RATNER et al., 2004). O PCL foi aprovado pela FDA 17

39 (Food and Drug Administration) para a utilização na liberação controlada de fármacos e em dispositivos médicos (KYRIAKIDOU et al., 2008). No caso de scaffolds, ainda é utilizado em pesquisas para regeneração de tecidos da pele, ossos, cartilagem e fígado (WILLIAMS et al., 2005) β Fosfato tricálcico As cerâmicas biorreabsorvíveis dissolvem com o tempo e gradualmente são substituídas por tecidos naturais. A sua maior desvantagem é que a sua resistência mecânica diminui durante o processo de biorreabsorção. Estes materiais são frequentemente utilizados na fabricação de scaffolds ou para preencher espaços que permitam a infiltração de tecidos. Todas as cerâmicas biorreabsorvíveis são baseadas nos fosfatos de cálcio com exceção do gesso. A degradabilidade varia da seguinte maneira: α TCP > β TCP >>>> HA O fosfato tricálcico (TCP) é biodegradável por excelência. A sua fórmula química é Ca 3 (PO 4 ) 2. O TCP apresenta polimorfismo, sendo conhecidas três fases: (i) β, (ii) α e (iii) α, ordenadas de menor a maior temperatura de estabilidade. A fase β cristaliza no sistema hexagonal, a fase α no sistema ortorrômbico e a fase α no sistema monoclínico. A transição de fase α α ocorre a uma temperatura de 1475 ± 5. Essa transição de fase é completamente reversível nos dois sentidos, o que também acontece com a transição de fase β α a 1150 ± 10. Abaixo desta temperatura deve ocorrer a transição inversa; α β, no entanto, se a taxa de resfriamento é muito alta, a fase α metaestável é preservada à temperatura ambiente (CARUTA, 2006). Os fosfatos de cálcio são comumente utilizados em aplicações em que é necessário substituir ou regenerar o tecido ósseo. A interação entre a biocerâmica e o tecido ósseo é favorecida formando uma ligação entre o biomaterial e o tecido, o que é conhecido como osteointegracão. Os fosfatos de cálcio são classificados com base na razão molar Ca P. Para o 18

40 β TCP, a razão molar Ca P = 1,5. Este fosfato de cálcio pode ser sintetizado por precipitação a partir de soluções contendo íons cálcio e fósforo, sob condições alcalinas ou ácidas. Em geral, para razões molares Ca P entre 0,5 e 2,0, os fosfatos de cálcio podem ser sintetizados sob as condições antes mencionadas (ORÉFICE et al., 2006). Do mesmo jeito que a síntese de hidroxiapatita (HA), a síntese de β TCP em solução aquosa é afetada por inúmeros parâmetros físicos e químicos, o que origina grande dificuldade para obter produtos 100% puros. No entanto, o β TCP puro pode ser facilmente obtido com uma reação em estado sólido de compostos de cálcio e fósforo (CARUTA, 2006). Biocerâmicas como os vidros bioativos e fosfatos de cálcio como a HA e o β TCP têm sido amplamente estudados devido às propriedades biológicas que possuem. O β TCP apresenta alta capacidade de biorreabsorção e osteocondutividade, no entanto, a principal limitação é a fragilidade, característica comum dos cerâmicos (YEO et al., 2010). O β TCP é biodegradável e biocompatível. Os implantes deste material demoram entre seis e 15 semanas em ser parcialmente biorreabsorvidos, tempo que depende principalmente da porosidade do implante (ORÉFICE et al., 2006). 2.4 Tecido ósseo O tecido ósseo é capaz de se regenerar, mas complicações como perda óssea excessiva, fraturas traumáticas e fraturas osteoporóticas, fazem com que seja necessário utilizar enxertos ósseos. Os enxertos ósseos autólogos são comumente utilizados para reparação óssea, no entanto, em casos que envolvem grandes perdas de tecido, são necessários doadores que em geral são limitados, sendo a engenharia tecidual um método alternativo potencial para suprir essas limitações. O tecido ósseo consiste de osso trabecular e osso cortical. O osso trabecular é comumente chamado de osso esponjoso devido à sua maior porosidade. Este osso fornece suporte estrutural e organização à medula óssea. Por outro lado, o osso cortical é o osso compacto que envolve o espaço da medula e confere resistência mecânica ao tecido ósseo. A camada externa de tecido 19

41 mole que cobre a superfície do osso cortical é o periósteo (BAO et al., 2013). A porosidade do osso cortical humano varia de 5 a 30% e a sua densidade aparente de 1,8 a 2,0 g cm 3. No caso do osso trabecular a porosidade está em uma faixa de 30 a 90%, com uma densidade aparente que assume valores na faixa de 0,1 a 0,9 g cm 3 (BONUCCI, 2000; FONTES, 2010). Na Figura 2.5 é mostrado um esquema da estrutura do tecido ósseo. Figura 2.5. Esquema da estrutura do tecido ósseo 4. Fonte: Adaptado de: (BAO et al., 2013) O ósteon é a unidade funcional básica do osso cortical. É formado por lamelas concêntricas que rodeiam o canal de Havers, contendo as células e a matriz extracelular (ECM). No canal de Havers estão localizados os nervos e os vasos sanguíneos. No ósteon estão localizados os osteoblastos e os osteócitos, os que sintetizam os componentes orgânicos da matriz óssea, contribuindo na geração e manutenção da ECM, a que dá ao osso a resistência estrutural. Os osteoblastos e osteócitos são derivados das células osteoprogenitoras, as que residem na medula óssea e no periósteo. No ósteon também estão presentes os osteoclastos, que são células de reabsorção que dissolvem os minerais e digerem a matriz óssea. A ECM está altamente 4 Imagens obtidas do banco de imagens Servier Medical Art: 20

42 mineralizada para conferir resistência mecânica. Fosfatos de cálcio como a hidroxiapatita (HA) estão presentes na ECM. A HA é intercalada com colágeno do tipo I, isso fornece ao osso a resistência mecânica e a tenacidade para resistir tensões de impacto (BAO et al., 2013; HOLLINGER et al., 2005). A resistência à compressão está associada à HA e a resistência à tração às fibras de colágeno (GONÇALVES, 2012). As propriedades mecânicas do tecido ósseo variam de acordo com a localização no corpo. Os ossos são extremamente anisotrópicos, assim, as propriedades variam em uma ampla faixa. A tensão de compressão do osso trabecular está em uma faixa de 2 a 12 MPa e o módulo de elasticidade sob compressão possui valores de 0,02 até 0,50 GPa. Por outro lado, a tensão de compressão do osso cortical varia de 100 até 230 MPa e o módulo de elasticidade sob compressão varia de 8,7 a 14,1 GPa (WHITE et al., 2007; FONTES, 2010). Na Tabela 2.3 são mostradas algumas propriedades mecânicas comuns dos ossos trabecular e cortical localizado em diferentes regiões do corpo humano. Tabela 2.3. Propriedades mecânicas dos ossos trabecular e cortical para o ensaio de compressão. Resistência à compressão (MPa) Modulo de elasticidade (MPa) Osso 2, Cabeça femoral superior 0,56 51 Cabeça femoral inferior Osso trabecular Trabéculas do fêmur 126 ± 96,9 Primeira e segunda vértebras lombares 6-81,3 Calcâneo 2,22 ± 1, Tíbia proximal Osso cortical ,7 19,7 (GPa) Fêmur ,5 34, 3 (GPa) Tíbia Fonte: Adaptado de: (HOLLINGER et al., 2005; NJEH et al., 2003). Para a fabricação de scaffolds é importante levar em conta a porosidade do tecido ósseo. Como foi descrito nos parágrafos precedentes, a principal diferença entre o tecido ósseo 21

43 trabecular e compacto é a porosidade. A estrutura porosa do osso trabecular é devida aos espaços vazios, onde estão localizados os canais vasculares e a medula óssea. Por outro lado, a porosidade do osso cortical é devida aos espaços vazios onde se localizam os canais dos ósteons, os canais de Volkmann e de Havers, os osteócitos e seus canalículos e os canais de reabsorção (BONUCCI, 2000; COWIN e DOTY, 2007). No osso cortical, as lacunas onde estão localizados os osteócitos têm tamanhos desde 10 até 20 μm. Os canais vasculares Haversiano e de Volkmann têm diâmetros de 20 até 50 μm. As cavidades de reabsorção estão em uma faixa de 50 até 300 μm, entanto que os canalículos são pequenas tubulações de aproximadamente 100 nm de diâmetro. No osso trabecular, os poros variam da ordem de 100 μm até alguns milímetros (EVDOKIMENKO, 2012). 2.5 Manufatura aditiva (MA) aplicada à fabricação de scaffolds Muitos dos processos convencionais para fabricação de scaffolds estão limitados à fabricação de estruturas de geometrias simples ou aleatórias. Em processos como: evaporação de solvente, separação de fases, eletrofiação, liofilização, formação de espumas, etc., a geometria pode variar muito de uma região para outra (SENEDESE, 2010). Para fabricar scaffolds com geometria uniforme ou com maior complexidade, é utilizada a manufatura aditiva. Os scaffolds fabricados utilizando MA têm 100% de interconectividade e a porosidade pode ser controlada. Além disso, extraindo informação anatômica do paciente utilizando tomografia computadorizada (CT) ou imagens por ressonância magnética (MRI), as técnicas CAD permitem obter scaffolds personalizados de acordo a necessidade do paciente (NARAYAN et al., 2010). O papel da MA na medicina e na engenharia tecidual para o desenvolvimento de scaffolds tem ganhado muita importância. Existem vários processos de fabricação que possibilitam a obtenção de scaffolds com geometrias complexas e com uma boa precisão, assim é possível imitar a matriz extracelular e as suas características anatômicas. É preciso salientar que muitos dos processos de MA, além de serem usados para fabricar scaffolds, são comumente empregados para fazer próteses (IWAMI e UMEDA, 2011) Na Tabela 2.4 são apresentados os principais processos de MA utilizados para a fabricação de scaffolds. Esses processos são classificados de 22

44 acordo a norma ASTM F a 5, que define as categorias para os processos de MA de acordo ao princípio fundamental de funcionamento (ASTM, 2012). Tabela 2.4. Processos de MA utilizados para a fabricação de scaffolds; classificação ASTM segundo o processo. Processo Estereolitografia Sinterização seletiva a laser Impressão 3D Modelagem por fusão e deposição Deposição por extrusão de precisão Impressão 3D por rosca de extrusão Fonte: Adaptado de: (ASTM, 2012). Categoria do processo (ASTM) Fotopolimerização em cuba Fusão em leito de pó Jateamento de aglutinante Extrusão de material Descrição Uma resina líquida fotocurável contida em uma cuba é seletivamente curada por ativação por luz de polimerização. A energia térmica funde seletivamente regiões de um leito de pó. Um líquido aglutinante é seletivamente depositado para ligar materiais em pó. O material é seletivamente depositado através de um bico ou um orifício Estereolitografia (SL) A estereolitografia é um método empregado para fabricar estruturas 3D, utilizando resinas fotocuráveis na faixa do espectro ultravioleta (UV). O objetivo do método é fabricar peças camada por camada. Os materiais que podem ser utilizados com este processo, além das resinas, são compósitos onde a matriz deve ser uma resina. Neste caso, as partículas de reforço podem ser utilizadas após serem dispersas na matriz. Este processo geralmente emprega dois métodos distintos de irradiação UV. No primeiro método, uma imagem é transferida para um polímero no 5 ASTM F a: Standard Terminology for Additive Manufacturing Technologies. 23

45 estado líquido por irradiação através de uma máscara padronizada. Desse jeito, o polímero é solidificado. No segundo, o feixe de UV irradia diretamente ao polímero (BIDANDA e BÁRTOLO, 2008). A porosidade obtida neste processo geralmente é menor que 90% e o tamanho de poro assume valores na faixa de μm. A principal vantagem do processo é a precisão no controle do tamanho de poro e a interconectividade. Além disso, é possível obter estruturas de grande complexidade e em muitos casos com características próximas as anatômicas reais. Entre as desvantagens está o alto custo do equipamento e a limitação a polímeros curáveis na faixa do espectro UV (PALLUA e SUSCHEK, 2011). Na Figura 2.6 é mostrado um esquema do processo de estereolitografia. Figura 2.6. Esquema do processo de estereolitografia. Fonte: Autoria própria Sinterização seletiva a laser (SLS) O processo SLS trabalha a partir de pó como matéria prima. Esta tecnologia foi desenvolvida na Universidade de Texas em Austin, inicialmente para trabalhar com polímeros, para depois adequar o processo para trabalhar com materiais metálicos e cerâmicos. O pó é espalhado em uma plataforma de construção mediante um rolo. A fina camada depositada é sinterizada com um feixe laser. O processo ocorre dentro de uma câmara aquecida a uma temperatura que está abaixo da temperatura de fusão do pó. A câmara aquecida além de facilitar o 24

46 processo de fusão, evita a distorção térmica das peças construídas. Essa câmara tem atmosfera controlada, sendo que para polímeros é normalmente utilizada uma atmosfera de nitrogênio. Após a fabricação de cada camada, a plataforma de construção desce para colocar outra camada de pó para ser sinterizada. O material sinterizado faz parte da peça e o pó não sinterizado serve como suporte; esse material pode ser retirado no final do processamento e reutilizado após um processo de peneiramento, no entanto, a geometria é restringida devido à retirada de pó. (BIDANDA e BÁRTOLO, 2008). Com o processo SLS a porosidade obtida geralmente é menor que 40%, sendo que o tamanho de poro está entre μm. Além disso, pode ser gerada microporosidade intrínseca. O processo tem boa precisão e as principais desvantagens são o alto custo do equipamento e a baixa porosidade dos scaffolds. (PALLUA e SUSCHEK, 2011). O esquema do processo é apresentado na Figura 2.7. Figura 2.7. Esquema do processo SLS. Fonte: Autoria própria Impressão 3D (3DP) O processo de impressão 3DP utiliza um jato de aglutinante, que é expelido acima de material em pó por uma cabeça de impressão de líquidos, com a finalidade de ligar finas camadas de partículas para formar peças sólidas (YEONG et al., 2004; ASTM, 2012). Este processo foi desenvolvido no Instituto de Tecnologia de Massachusetts (MIT). O princípio de funcionamento 25

47 é semelhante ao processo SLS, mas neste caso, é substituído o laser, sendo que o aglutinante é depositado seletivamente. A porosidade obtida com este processo é geralmente menor que 60% e o tamanho de poro está entre 45 e 1600 μm (PALLUA e SUSCHEK, 2011). Na Figura 2.8 é apresentado o esquema do processo 3DP. Figura 2.8. Esquema do processo 3DP. Fonte: Autoria própria Modelagem por fusão e deposição (FDM) O processo de modelagem por fusão e deposição é baseado na extrusão de um filamento através de um bico. O material é fundido e extrudado e imediatamente depositado em uma base ou plataforma de construção no plano xy. Assim, o material vai sendo depositado camada por camada na base que tem mobilidade na direção z. Na engenharia tecidual, este método é comumente utilizado com biomateriais poliméricos e materiais compósitos de matriz polimérica e reforços que usualmente são biocerâmicas. Os filamentos utilizados geralmente são fabricados em uma extrusora com matriz circular. Quando as peças são muito complexas, além do material utilizado para a fabricação, é utilizado material de suporte. Quando finaliza o processo, o material de suporte pode ser extraído (YEON et al., 2004; BIDANDA e BÁRTOLO, 2008). A 26

48 porosidade obtida neste processo comumente é menor que 80% e o tamanho de poro está em uma faixa de μm. Este processo permite trabalhar com uma boa precisão. A principal desvantagem é que é limitado aos polímeros termoplásticos (PALLUA e SUSCHEK, 2011). Na Figura 2.9 é apresentado um esquema do processo. Figura 2.9. Esquema do processo FDM com dois filamentos. Fonte: Autoria própria Deposição por extrusão de precisão (PED) A deposição por extrusão de precisão é um método que trabalha com materiais em forma de grãos ou pellets. O material é extrudado através de um bico e em seguida é depositado camada por camada numa plataforma de construção. Cabe salientar que a extrusão é por rosca. Isto é, o processo consiste basicamente em uma extrusora monorosca montada em um sistema 3D, onde cada camada é depositada no plano xy e a altura de camada é definida com a movimentação da plataforma no eixo z. O cilindro da extrusora é aquecido com faixas de aquecimento. Este sistema foi desenvolvido na Universidade de Drexel para fabricar scaffolds de PCL e compósitos de matriz PCL reforçados com HA. Na literatura produzida pelo grupo de pesquisa são reportados scaffolds de PCL com um tamanho de poro de 350 μm e 65% de porosidade. Também são 27

49 reportados resultados para scaffolds de PCL e PCL/HA com porosidades de 60 e 70% e tamanhos de poro de 450 e 750 μm respectivamente. O diâmetro dos fios extrudados foi de 450 μm e o diâmetro do bico utilizado 245 μm. Em todos os casos os resultados apresentaram boas características e propriedades para aplicações em engenharia tecidual (NARAYAN et al., 2010; SHOR et al., 2009). Na Figura 2.10 é mostrado um esquema do processo. Figura Esquema do processo PED. Fonte: Adaptado de: (NARAYAN et al., 2010) Impressão 3D por rosca de extrusão A impressão 3D por rosca de extrusão é o processo utilizado nesta pesquisa. Este método de manufatura aditiva foi desenvolvido no CTI. A impressora Fab@CTI é uma impressora 3D portátil, de baixo custo e interface aberta (INFORÇATTI NETO, 2007). O cabeçote de extrusão é intercambiável e pode ser facilmente instalado na impressora. Então, o equipamento consiste basicamente em uma miniextrusora monorosca montada em um sistema de movimentação 3D (SILVEIRA et al., 2014). A principal diferença deste processo com o processo PED é o tamanho do material alimentado, neste caso é utilizado pó. A grande vantagem do processo é que permite misturar pós para obter compósitos ou blendas, sem a necessidade de fabricar pellets ou 28

50 filamentos, os que precisam de um processo de extrusão prévio. Além disso, o sistema trabalha com pequenas quantidades de material, o que o diferencia de equipamentos comerciais. Na Figura 2.11 é apresentado um esquema do processo. Figura Esquema do processo de impressão 3D por rosca de extrusão. Fonte: Autoria própria. Sendo um processo de manufatura aditiva, a fabricação é desenvolvida camada por camada. Após a deposição de cada camada, a plataforma desce para depositar a próxima. A plataforma onde o material é depositado pode trabalhar com aquecimento, o que é útil em alguns materiais para evitar o empenamento durante o processamento. O material em pó é transportado dentro do barril da extrusora devido à rotação da rosca de seção variável. Isto é, a profundidade do canal vai diminuindo e simultaneamente também diminui a folga entre os filetes da rosca e o barril. Levando em conta que o barril é estacionário, a rotação da rosca vai gerar forças de atrito no material. Essas forças tornam possível o transporte 29

51 do material até o bico para depositá-lo formando camadas na base. O projeto do cabeçote foi baseado no funcionamento de extrusoras monorosca de grande capacidade, sendo que o material é transportado e completamente processado em três zonas: (i) alimentação, (ii) compressão e (iii) dosagem (SILVEIRA et al., 2014). Em seguida, na seção 2.6, são mostrados os conceitos básicos da extrusão monorosca. 2.6 Conceitos básicos da extrusão monorosca A extrusão é um processo em que um material é transportado e empurrado através de uma matriz com a finalidade de obter peças de seção transversal constante. É um dos métodos mais importantes para a produção de materiais termoplásticos. A extrusora monorosca é a máquina mais empregada na indústria de transformação de polímeros (GUERRERO et al., 2011). Basicamente, uma extrusora monorosca consiste de uma rosca de Arquimedes que gira dentro de um cilindro aquecido mediante resistências elétricas, sendo que e o material é colocado em um funil de alimentação. Comumente o material pode ser alimentado em forma de grãos ou pellets de até 5 mm. Nesta pesquisa foi utilizado pó, no entanto, a lógica do processo é a mesma. Na Figura 2.12 é mostrado um esquema do processo de extrusão monorosca. Figura Esquema do processo de extrusão monorosca. Fonte: Autoria própria. Na zona de alimentação da extrusora geralmente existe um sistema de refrigeração para evitar a fusão prematura do material no interior do cilindro. Na zona de compressão a 30

52 profundidade do canal vai diminuindo, o que permite a compactação do leito de sólidos, isso evita que o ar seja carregado para frente junto com o material polimérico. Conforme o material avança, é formada uma película de polímero na parede interna do cilindro da extrusora. Na zona de dosagem o material entra quase completamente fundido. Nesta região a profundidade do canal é menor, então, a alta taxa de cisalhamento permite fundir ao material por completo. A taxa de cisalhamento é calculada com a Equação 1 (RAUWENDAAL, 2013). γ = πdn H Equação 1 Onde: γ : Taxa de cisalhamento (s 1 ) D: Diâmetro da rosca (mm) N: Rotação da rosca (rpm) H: Profundidade do canal da rosca (mm) Devido à pressão, o material é forçado a sair pela matriz da extrusora. Geralmente, cada zona da extrusora pode ser aquecida independentemente, sendo que é muito comum que a menor temperatura seja configurada na primeira zona e a maior na zona de dosagem. Em suma, a rosca da extrusora é a encarregada de transportar o material desde o funil, com a finalidade de homogeneizar e plastificar o polímero por aquecimento devido ao atrito e as resistências elétricas colocadas no cilindro. Assim, quando o polímero atingir um estado maleável pode ser conformado na matriz. A temperatura de processamento vai influir diretamente na qualidade do extrudado. Quando a temperatura é demasiadamente alta, a viscosidade do polímero cai até o ponto de afetar a estabilidade geométrica da peça moldada na matriz. Por outro lado, baixas 31

53 temperaturas de processamento dificultam a mistura e compactação do material polimérico (MANRICH, 2005). A relação entre o comprimento e o diâmetro da rosca de uma extrusora (L/D) está em uma faixa de 20 a 30. Sendo que L/D= 20 é utilizada para polímeros amorfos e L/D entre 25 e 30 é utilizada para polímeros semicristalinos, considerando que é necessária uma maior quantidade de energia para fundir a fase cristalina. A folga entre o filete da rosca e o cilindro da extrusora é comumente 0,001D. A profundidade no canal da rosca vai diminuindo desde a zona de alimentação até a zona de dosagem. Geralmente, uma rosca comum tem uma profundidade de canal constante na zona de alimentação, depois, na zona de compressão vai diminuindo até a zona de dosagem, onde a profundidade é mantida constante novamente (LOKENSGARD, 2014; MANRICH, 2005). Os polímeros são materiais viscoelásticos, isto é, têm um comportamento intermediário entre um material viscoso e um material elástico. Um material viscoso dissipa todo o trabalho externo aplicado, entanto que um material elástico armazena todo o trabalho externo aplicado. Então, um material viscoelástico tem a capacidade de armazenar uma parte do trabalho externo aplicado e de dissipar outra. A viscoelasticidade é uma característica que vai influenciar no processamento dos polímeros. No caso da extrusão de termoplásticos, o inchamento do extrudado é um fenômeno gerado devido à viscoelasticidade, isso deve ser levado em conta no projeto de matrizes e ao momento de configurar os parâmetros de processamento (BRETAS e D'ÁVILA, 2005). O inchamento do extrudado consiste no aumento das dimensões do perfil extrudado devido à recuperação elástica do material ao sair da matriz. Na extrusora, as cadeias poliméricas estão enoveladas. Logo após sair da extrusora, as cadeias têm a tendência de se alinhar nas paredes da matriz na direção do fluxo do material. Ao sair da matriz as cadeias voltam a se enovelar, o que aumenta as dimensões do perfil extrudado (MANRICH, 2005; BRETAS e D'ÁVILA, 2005). Na Figura 2.13 é mostrado um esquema do inchamento do extrudado para uma matriz circular. 32

54 Figura Esquema do inchamento do extrudado em uma matriz circular. Fonte: Adaptado de: (BRETAS e D'ÁVILA, 2005). O inchamento do extrudado (IE) em uma matriz circular é quantificado dividindo o diâmetro do extrudado (D e ) pelo o diâmetro da matriz ou do capilar (D c ). É preciso salientar que o material tenta recuperar a deformação elástica ainda dentro da matriz, no entanto, existe um desequilíbrio entre a deformação e a recuperação. Por isso, uma parte da deformação sempre será recuperada fora da matriz. Quanto maior o comprimento da matriz, o material recuperará uma maior quantidade da deformação elástica antes de sair (MANRICH, 2005). 33

55 3. MATERIAIS E MÉTODOS No terceiro capítulo são apresentadas as características e principais propriedades dos materiais utilizados nesta pesquisa. Além disso, são definidos os métodos empregados e os parâmetros definidos para o processamento de scaffolds. Neste ponto, é apresentado um software gerador de trajetórias para fabricar scaffolds com arquitetura 0 /90, cujo código foi desenvolvido para otimizar o tempo requerido na atividade de projetar scaffolds. Finalmente, são apresentadas as técnicas de caracterização utilizadas. 3.1 Materiais Poli(caprolactona) PCL CAPA 6505 O biomaterial polimérico utilizado nesta pesquisa foi o PCL CAPA 6505, fornecido pela Rhodia e cedido pelo CTI. É um poliéster de alta massa molecular (M w = g/mol) derivado do monômero ε-caprolactona. Este polímero é fornecido em pó, sendo que o 97,5% das partículas têm um tamanho menor que 500 μm. Na Tabela 3.1 são apresentadas as especificações deste material. Tabela 3.1. Especificações do PCL CAPA Massa molecular média (M w ) g/mol Temperatura de fusão (T m ) C Teor de água < 1% 15% 106 μm Distribuição de tamanho de partícula 106 µm < 82,5% 500 μm 2,5% > 500 μm Toxicidade Biologicamente inerte 35

56 3.1.2 β Fosfato tricálcico O β TCP foi produzido e cedido pelo Laboratório de Cerâmicas do Labiomec (Laboratório de Biomecânica) da Unicamp. Esse material foi preparado por um processo de reação em estado sólido a partir de difosfato de cálcio ou monetita comercial (CaHPO 4 ) e carbonato de cálcio comercial (CaCO 3 ), com massas moleculares de 136,058 g mol e 100,091 g mol respectivamente. A calcinação foi realizada a uma temperatura de 1050 C durante 6 horas. A taxa de aquecimento foi de 5 C/min. Após isso, o material foi moído em moinho de bolas por 5 horas utilizando bolas de alumina. A moagem foi realizada a seco (ZAVAGLIA, 2011). Na Figura 3.1a é mostrado o gráfico com a distribuição bimodal de tamanho de partícula após o processo de moagem. O tamanho de partícula está na faixa de 0,05 μm a 50 μm com um tamanho médio de 7,4 μm. Na Figura 3.1b é apresentado o difratograma da biocerâmica, onde ficou comprovado que o material é β TCP. As especificações do material, a distribuição de tamanhos de partícula e o difratograma de raios X foram fornecidos junto com o material. (a) (b) Figura 3.1. (a) Distribuição de tamanho de partícula do β TCP e (b) difratograma (XRD) do β TCP. Fonte: Dados fornecidos pelo Labiomec 36

57 3.2 Métodos Na Figura 3.2 são apresentados os procedimentos experimentais definidos para a fabricação e caracterização dos scaffolds. O trabalho foi dividido em quatro etapas, iniciando com a definição dos parâmetros de processamento através de testes preliminares. Em seguida foram verificados os parâmetros de impressão definidos. Logo após, foi feita a fabricação de scaffolds e finalmente as caracterizações. Figura 3.2. Etapas desenvolvidas para a fabricação e caracterização de scaffolds. 37

58 3.2.1 Equipamento e cabeçote de impressão 3D por rosca de extrusão Os scaffolds foram fabricados utilizando a impressora Fab@CTI acoplada com um cabeçote de impressão 3D por rosca de extrusão, ambos mostrados na Figura 3.3. O software utilizado para o controle da impressora foi o Fab@Home Model 1:V.0.24 RC6. Além disso, para gerar a trajetória de impressão foi desenvolvido e utilizado um software que é detalhado posteriormente neste capítulo. PC Software CAD/CAM Controlador de temperatura Base Funil Cilindro Bico Resistência elétrica (a) (b) Figura 3.3. Impressora 3D Fab@CTI: a) equipamento utilizado e b) cabeçote de impressão 3D por rosca de extrusão Fabricação de scaffolds Para a fabricação dos scaffolds de PCL, a policaprolactona em pó foi colocada diretamente no funil. No caso dos scaffolds compósitos, os materiais polimérico e cerâmico foram pesados em uma balança analítica com frações em peso de 10%, 20% e 30%. Após feita a mistura em almofariz, cada composição foi colocada no funil para executar o processo de manufatura. É necessário salientar que a matéria prima e os scaffolds foram armazenados em dessecador sob vácuo durante todo o tempo. Por outro lado, levando em conta a densidade do polímero e do 38

59 cerâmico, foi feito o cálculo da fração volumétrica utilizando a Equação 2 (YEO et al., 2010). Sendo que a densidade do PCL é ρ m = 1,135 (g cm 3 ) e a densidade do β TCP é ρ r = 3,14 (g cm 3 ). φ c = ω p ω p (1 κ) + κ Equação 2 Onde: φ c : Fração volumétrica do compósito ω p : Fração em peso do reforço κ = ρ r ρ m ρ r : Densidade do reforço (g cm 3 ) ρ m : Densidade da matriz (g cm 3 ) Na Tabela 3.2 são mostradas a fração em peso e a fração volumétrica dos scaffolds. Além disso, é apresentada a denominação das amostras utilizada para o processo de caracterização. Para a denominação das amostras foi considerada a fração em peso. Tabela 3.2. Fração em peso e fração volumétrica dos scaffolds. Denominação das amostras Fração em peso (%) Fração volumétrica (%) PCL β TCP PCL β TCP P100C P90C P80C P70C P: Polímero/C: Cerâmico 39

60 3.2.3 Parâmetros de processamento Para o processamento dos scaffolds é necessário considerar tanto os parâmetros do processo de extrusão quanto os parâmetros geométricos. Os parâmetros ligados ao processo de extrusão são: (i) rotação da rosca (N), (ii) velocidade de movimentação do cabeçote (v m ) e (iii) temperatura de processamento (T pr ). Esses parâmetros podem ser controlados por meio do computador e o controlador de temperatura. Por outro lado, os parâmetros referentes à geometria do scaffold são vários, no entanto, os que vão influir consideravelmente são a altura da camada impressa (PH) e o tamanho do poro, sendo que o tamanho do poro vai depender do espaçamento (e) entre os fios extrudados e do seu diâmetro. Para a determinação dos parâmetros de processamento foram realizados vários testes preliminares com um bico de 0,4 mm de diâmetro e L c D c = 6,25 mm. Inicialmente foi avaliada a continuidade do fluxo de material saindo da extrusora. Para isso, foram definidas quatro temperaturas de processamento e três velocidades de rotação da rosca. Neste caso, o teste foi realizado sem movimentação do cabeçote durante 120 s. Na Tabela 3.3 são apresentados os resultados obtidos durante a realização dos testes. Tabela 3.3. Resultados do teste de continuidade do fluxo de material na extrusora. N (rpm) P100C0 P90C C 105 C 110 C 115 C 100 C 105 C 110 C 115 C 7, , N (rpm) P80C20 P70C C 105 C 110 C 115 C 100 C 105 C 110 C 115 C 7, , Fluxo contínuo - Fluxo descontínuo 40

61 Em concordância com os resultados obtidos nos testes preliminares para a determinação de parâmetros de processamento, foi possível definir uma temperatura de processamento de 105 C, que é a menor temperatura que permite uma vazão contínua para todos os casos, isto é, para o PCL puro e o PCL reforçado com β TCP. Além disso, foi realizada a reometria capilar para o PCL, resultado que é apresentado no inicio do quarto capítulo e que ratifica a validade da temperatura escolhida para o processamento. A velocidade de movimentação do cabeçote (v m ) foi definida com um valor de 12 mm/s. Essa é a máxima velocidade disponível na Fab@CTI quando utilizado o cabeçote de impressão 3D por rosca de extrusão. Patrício et al. utilizaram uma velocidade de 17 mm/s para a fabricação de scaffolds de PCL e blendas de PCL/PLA com o processo BioCell Printing, obtendo uma morfologia adequada (PATRÍCIO et al., 2013). Então, a v m de 12 mm/s foi testada junto com velocidades de rotação de 7,5, 10 e 12,5 rpm para imprimir scaffolds. Por outro lado, a altura de camada (PH) foi definida com um valor de 0,3 mm, que é um valor menor que o diâmetro do bico de extrusão, assim é garantida uma boa adesão entre camadas, além disso, o espaçamento (e) foi definido com um valor de 0,9 mm, o que permite obter poros com um tamanho dentro da faixa para regeneração de tecido ósseo. Quanto maior a velocidade de rotação da rosca de extrusão, maior a vazão do material, maior o aquecimento viscoso e a probabilidade de degradação do material. A maior vazão gerou um aumento significativo da quantidade de material depositado, isto foi verificado utilizando microscopia eletrônica de varredura (MEV). Então, foi possível definir uma velocidade de rotação da rosca com um valor de 7,5 rpm para a fabricação dos scaffolds. Para esse valor de rotação é observada uma maior uniformidade dos fios extrudados. Por outro lado, com rotações de 12,5 rpm é possível observar que a porosidade dos scaffolds é afetada consideravelmente devido ao excesso de material. Além disso, o β TCP gerou um aumento no valor do diâmetro dos filamentos. Na Tabela 3.4 são apresentados os resultados obtidos mediante microscopia eletrônica de varredura para os testes preliminares. Na Tabela 3.5 são mostradas imagens MEV para diferentes alturas de camada. 41

62 Tabela 3.4. Influência da rotação da rosca de extrusão na morfologia dos scaffolds analisada mediante MEV. P100C0 7,5 rpm 10 rpm 12,5 rpm P90C10 7,5 rpm 10 rpm 12,5 rpm P80C20 7,5 rpm 10 rpm 12,5 rpm P70C30 7,5 rpm 10 rpm 12,5 rpm 42

63 Tabela 3.5. Imagens MEV da superfície lateral e transversal de scaffolds de PCL fabricados com diferentes alturas de camada (PH). PH=0,28 mm PH=0,30 mm PH=0,32 mm PH=0,28 mm PH=0,30 mm PH=0,32 mm PH=0,34 mm PH=0,36 mm PH=0,38 mm PH=0,34 mm PH=0,36 mm PH=0,38 mm Como observado nas microscopias mostradas na tabela anterior, é logico dizer que com uma maior altura de camada a adesão vai diminuir. Na Figura 3.4 são mostradas microscopias com uma menor ampliação para uma altura de camada de 0,30 mm e 0,38 mm. Na Figura 3.4(a) é possível observar uma morfologia do scaffold sem defeitos e com uma boa adesão entre camadas. Com PH=0,38 mm apareceram defeitos devido à insuficiente adesão durante o processamento. 43

64 (a) Figura 3.4. Superfície lateral de scaffolds de PCL com altura de camada: (a) PH=0,30 mm e (b) PH=0,38 mm. (b) Em seguida, na Figura 3.5 são apresentados os parâmetros definidos para o processamento. Esses parâmetros permitem obter scaffolds com boas características morfológicas, além da reprodutibilidade do processo. Para o PCL foi definida uma menor velocidade de movimentação do cabeçote para obter valores próximos de porosidade entre os grupos de scaffolds estudados. No quarto capítulo, especificamente na caracterização morfológica é detalhada a justificativa para a escolha de uma menor velocidade para o PCL. Figura 3.5. Escolha de parâmetros de processamento. 44

65 3.2.4 Software gerador de trajetórias para fabricação de scaffolds 0 /90 Para fabricar scaffolds, a impressora Fab@Home apresenta três opções de arquivo: (i) *.stl, (ii) G-Code.txt e (iii) Points.txt. A primeira opção consiste em utilizar software CAD para desenhar um sólido. Então, para obter um scaffold, é necessário inserir o sólido no software Fab@Home e definir o diâmetro do extrudado, o espaçamento, o ângulo de preenchimento e a altura de camada. No entanto, o software da impressora coloca material nas bordas do sólido, permitindo fabricar uma estrutura porosa só internamente, isto é, o exterior é fechado com camadas de material. Na segunda opção, o código G pode ser obtido utilizando software CAD e CAM. Na terceira opção é possível obter a trajetória de pontos x, y, z, utilizando software CAD. Neste caso, existe maior complexidade para desenhar o scaffold e precisa-se de maior tempo, porque todas as variáveis geométricas devem ser definidas diretamente no software CAD, no entanto, podem ser controladas de melhor maneira. Para projetar os scaffolds, as três opções utilizam software CAD. Então, para diminuir o tempo necessário nesta atividade, foi desenvolvido um software nomeado BioScaffolds PG, que permite escolher rapidamente as variáveis geométricas do scaffold e gerar um arquivo Points.txt que contém a trajetória de impressão 0 /90. O software foi desenvolvido na linguagem Visual Basic, levando em conta as dimensões comumente utilizadas na regeneração de tecido ósseo. O programa permite definir variáveis como a largura, o espaçamento, a altura de camada e o número de camadas a serem impressas. Além disso, inserindo o diâmetro do extrudado é possível fazer automaticamente uma estimativa da porosidade (P), cálculo que é realizado utilizando a Equação 3: P = (1 V p V s ) 100% Equação 3 Onde V p é o volume poroso (cm 3 ) e V s é o volume aparente do sólido (cm 3 ). Estes volumes são calculados com base no comprimento da trajetória impressa e as dimensões fornecidas como variáveis de entrada. 45

66 Para o desenvolvimento do software, inicialmente foram definidas as variáveis dentro do código de programação. Na Tabela 3.6 são mostradas as variáveis que definem a geometria do scaffold. As variáveis de entrada são mostradas junto com as faixas de valores que o usuário pode escolher na interface gráfica do software. Também são apresentadas as variáveis de saída junto com a equação utilizada nos cálculos. As variáveis que definem a morfologia dos scaffolds são mostradas na Figura 3.6. Tabela 3.6. Variáveis do software. Variável Descrição Faixa e (mm) Espaçamento entre fios extrudados 0,5 a 1,5 Variáveis de entrada Variáveis de saída NE Número de espaços 2 a 30 NL Número de camadas 2 a 100 PH (mm) Altura de camada 0,2 a 1,5 d (mm) Diâmetro extrudado 0,2 a d AG * AG (mm) Tamanho do poro AG = e d W (mm) Largura do scaffold W = NE e * d AG: Diâmetro em que AG=0 (a) (b) (c) Figura 3.6. Variáveis que definem a morfologia dos scaffolds: (a) vista superior, (b) vista frontal e (c) perspectiva do scaffold. Fonte: Autoria própria. 46

67 Com as variáveis principais definidas, a lógica do software foi planejada para calcular os pontos x, y, z das trajetórias mostradas na Figura 3.7. Primeiro são calculados os pontos (x, y). Em seguida, com o número de camadas (NL) e a altura de camada (PH), é definida a variável z. Na arquitetura 0 /90, para que a impressão seja continua devem ser considerados dois casos para o cálculo das variáveis x e y : (i) número ímpar de fios extrudados e (ii) número par de fios extrudados. No primeiro caso, mostrado na Figura 3.7a, o cálculo é feito com base nas duas posições apresentadas. Isto é, a trajetória completa será formada pelas trajetórias 0 alternadas com 90. No segundo caso, apresentado na Figura 3.7b, o cálculo é feito baseado nas quatro posições mostradas. Então, a trajetória completa estará formada pela alternância dessas quatro trajetórias, mantendo a continuidade durante o processo de impressão. Figura 3.7. Trajetórias de impressão: (a) número ímpar de fios extrudados e (b) número par de fios extrudados. Fonte: Autoria própria. Utilizando a interface gráfica as trajetórias são plotadas no software. Além disso, o código permite gerar um arquivo *.txt, com três colunas separadas por um espaço em branco. Cada 47

68 coluna contém as coordenadas dos pontos x, y, z que fazem parte da trajetória. O arquivo *.txt garante uma impressão continua, evitando afetar a morfologia dos scaffolds devido às instabilidades que aparecem no início do processo de extrusão em cada camada. Além disso, na primeira camada foi adicionada uma linha de impressão para eliminar as instabilidades no inicio do processo. Na Figura 3.8 são apresentadas duas trajetórias; uma comumente utilizada para fabricação de scaffolds e a trajetória utilizada neste trabalho, esta última tem vantagens como uma morfologia mais uniforme e um melhor aproveitamento do material. (a) (b) Figura 3.8. Trajetórias de impressão: (a) trajetória utilizada para a fabricação de scaffolds com o hidrogel Mebiol Gel (IWAMI e UMEDA, 2011) e (b) exemplo da trajetória utilizada neste trabalho. Na Figura 3.9 é apresentada a interface do software após ser feito o cálculo de uma trajetória de impressão. Posteriormente foram gerados arquivos *.txt e os dados foram plotados. Na Figura 3.10 são mostradas duas trajetórias de impressão e suas projeções no plano xy, para 9 e 10 fios extrudados e 4 camadas. Nos gráficos é possível observar que as coordenadas foram calculadas corretamente, o que permite que o passo seguinte seja exportar os arquivos gerados para a impressora 3D. 48

69 Figura 3.9. Interface gráfica do software desenvolvido. (a) (b) Figura Trajetórias de impressão e projeções no plano xy: (a) 9 fios extrudados e 4 camadas e (b) 10 fios extrudados e 4 camadas. 49

70 No software foram colocados scaffolds com diferentes números de camada. Na Figura 3.11 são mostrados os resultados obtidos ao exportar os dados gerados com o software BioScaffolds PG. Em todos os casos os resultados foram positivos, o que garante a compatibilidade entre os dois programas. Finalmente, os arquivos *.txt foram utilizados para a fabricação dos scaffolds desta pesquisa, resultados que são apresentados no próximo capítulo. (a) (b) (c) Figura Trajetórias geradas exportadas ao software Fab@Home: (a) 2 camadas, (b) 10 camadas e (c) 100 camadas. Na Figura 3.12 são mostradas imagens obtidas com MEV. A Figura 3.12a mostra um scaffold de PCL com defeitos na morfologia devido às instabilidades do processo de extrusão. A Figura 3.12b mostra um scaffold de PCL fabricado com o processo de impressão contínuo utilizando o código desenvolvido. Neste caso não é necessário controlar o tempo de avanço (PushOut) ou retroação (SuckBack) do fluxo de material no software da impressora. O parâmetro 50

71 PushOut define o tempo de avanço da rotação rosca para iniciar a deposição do material. Por outro lado, o parâmetro SuckBack define o tempo de retroação da rotação da rosca para parar o fluxo de material (INFORÇATTI NETO, 2013). Excesso de material Defeito Excesso de material Defeitos (a) (b) Figura Scaffolds de PCL: (a) Defeitos na morfologia causados pelas instabilidades do processo de extrusão e (b) Morfologia bem sucedida obtida com impressão continua. 3.3 Técnicas de caracterização Nesta seção são descritas as técnicas de caracterização, os procedimentos, parâmetros e equipamentos utilizados para determinar as propriedades tanto dos materiais utilizados quanto dos scaffolds Reometria capilar A análise de reometria capilar foi realizada para o PCL CAPA 6505 no reômetro Instron Foram utilizadas duas temperaturas: (i) 105 C e (ii) 115 C. O capilar utilizado tem uma 51

72 razão L c D c = 33 e diâmetro D c = 0,762 mm. O diâmetro do barril é D b = 9,523 mm. Na Tabela 3.7 são apresentadas as equações com que foram realizados os cálculos. Utilizou-se a correção de Rabinowitsch, mostrada na Equação 4, para ajustar o desvio do comportamento Newtoniano. A taxa de cisalhamento foi calculada utilizando a Equação 5 e o índice de potência foi determinado utilizando a Lei das Potências mostrada na Equação 6 (MORRISON, 2001; (BRETAS e D'ÁVILA, 2005). Esta análise faz parte dos ensaios preliminares para determinar as condições de processamento. Os ensaios foram realizados no Laboratório de Polímeros da Universidade Federal de São Carlos. Na Tabela 3.7 são mostradas as equações utilizadas. Tabela 3.7. Equações utilizadas na caracterização reológica. Equação Parâmetros γ C = ( 3n + 1 4n ) γ γ : Taxa de cisalhamento corrigida (s 1 ) n: Índice de potência γ : Taxa de cisalhamento (s 1 ) Equação 4 γ = 2 15 v D 2 b b D c 3 v b : Velocidade de descida do êmbolo (mm s) D b : Diâmetro do barril (mm) D c : Diâmetro do capilar (mm) Equação 5 η = m(γ) n 1 η: Viscosidade (Pa s) τ = ηγ τ: Tensão (Pa) m: Consistência do material (Pa s n ) Equação Análise termogravimétrica (TGA) As análises foram realizadas em equipamento TGA da marca Mettler Toledo. A taxa de aquecimento utilizada foi 10 C/min. A faixa de temperatura dos ensaios foi de 25 C até 700 C em atmosfera de nitrogênio, com um fluxo de 50 ml/min. A quantidade de amostra utilizada para os testes foi de aproximadamente 10 mg. Com está análise é possível determinar a temperatura do 52

73 início da degradação térmica (T i ), a temperatura pico da degradação térmica (T p ), a temperatura do fim da degradação térmica (T o ) e a porcentagem de perda de massa durante o aquecimento. O objetivo desta análise foi caracterizar a estabilidade térmica dos scaffolds. Além disso, no caso dos scaffolds compósitos o objetivo foi determinar a quantidade real de reforço. As análises foram realizadas no Laboratório de Desenvolvimento da empresa Cromex Calorimetria exploratória diferencial (DSC) As análises DSC foram realizadas em concordância com a norma ASTM D , orientada à determinação das temperaturas de transição e as entalpias de fusão e cristalização de materiais poliméricos (ASTM, 2012). Foi empregado o equipamento DSC 200 F3 Maia - Netzsch. Utilizaram-se amostras de aproximadamente 10 mg. O primeiro aquecimento foi realizado entre 20 C e 200 C. Em seguida, as amostras foram resfriadas até -100 C e mantidas nesta temperatura por 2 min. Finalmente, foi realizado um segundo aquecimento até 200 C. A taxa de aquecimento e resfriamento utilizada foi 10 C/min. Todos os ensaios foram realizados em atmosfera de nitrogênio com fluxo de 50 ml/min em cadinho de alumínio com tampa furada. A análise dos resultados foi realizada utilizando o software Netzsch Proteus Thermal Analysis As análises foram realizadas no Laboratório Multiusuário de Caracterização de Materiais da Faculdade de Engenharia Mecânica da Unicamp Microscopia eletrônica de varredura (MEV) Para analisar a morfologia dos scaffolds utilizou-se o microscópio eletrônico de varredura Zeiss Evo MA 15. Foi observada a superfície dos scaffolds e a seção transversal. Neste último caso, as amostras foram fraturadas utilizando nitrogênio líquido. Todas as amostras foram revestidas com uma camada de ouro utilizando o equipamento Bal-Tec Sputter Coater SCD 050. A medição dos fios extrudados e dos poros dos scaffolds foi feita utilizando o software ImageJ 1.47v. As médias foram determinadas realizando 100 medições aleatórias para cada amostra. As 6 ASTM D : Standard Test Method for Transition Temperatures and Enthalpies of Fusion and Crystallization of Polymers by Differential Scanning Calorimetry. 53

74 microscopias foram realizadas no Laboratório Multiusuário de Caracterização de Materiais da Faculdade de Engenharia Mecânica da Unicamp Microtomografia computadorizada (Micro-CT) A porosidade dos scaffolds e morfologia foram avaliadas mediante a análise Micro-CT. Para isso foi utilizado o microtomógrafo de raios-x Skyscan 1074, disponível no Laboratório de Química do Estado Sólido do Instituto de Química da Unicamp. Foram utilizadas amostras de aproximadamente 8 8 mm com oito camadas. O tempo de exposição definido para os ensaios foi de 600 ms. A voltagem e a corrente utilizadas foram 40 kv e 1000 μa respectivamente. Foram realizadas 400 varreduras com um passo de 0,9 para uma reconstrução de 360. O software de captação de imagem foi o Skycan 1074 v2.1. A análise da porosidade foi realizada utilizando o software CT Analyser v A reconstrução 3D foi feita com o software InVesalius 3.0 Beta 5, que é um software de livre acesso para análise de imagens médicas desenvolvido no Centro de Tecnologia da Informação Renato Archer (AMORIM et al., 2011) Difração de raios-x (XRD) As análises de difração de raios-x foram realizadas utilizando o difratômetro da marca PANalitycal modelo X'Pert PRO PW3040/60. Esse equipamento conta com um detector PIXcel e tubo de raios-x com alvo de Cu Kα com filtro de Ni e radiação com comprimento de onda λ = 1,5405 Å. Para as analises utilizou-se uma tensão de 40 kv e uma corrente de 20 ma na faixa de 20 2θ 40. Com esta análise foi avaliada a presença do β TCP na matriz PCL. As análises XRD foram realizadas no Laboratório de Metalurgia Física e Solidificação da Faculdade de Engenharia Mecânica da Unicamp Infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) As análises FTIR foram realizadas utilizando o espectrômetro da marca Bruker, modelo Tensor 27, com o objetivo de determinar se houve alterações estruturais tanto nos scaffolds de 54

75 PCL puro quanto nos scaffolds compósitos. A transmitância foi avaliada na faixa de comprimento de onda de 4000 até 600 cm -1. Os testes foram feitos com 32 varreduras para cada amostra, utilizando-se o modo de reflexão total atenuada (ATR). As análises foram feitas no Laboratório de Pesquisa em Polímeros e Compósitos da Universidade Federal de Santa Catarina Ensaio de compressão O ensaio de compressão foi realizado conforme a norma ASTM D Utilizou-se a máquina universal de ensaios MTS Modelo 810-FlexTest 40, com uma célula de carga de 1,5 kn e uma velocidade de ensaio de 1,3 mm/min. Foram testadas 5 amostras para cada grupo de scaffolds. As amostras foram extraídas com dimensões de mm (ASTM, 2009). Para a caracterização mecânica foi necessário fabricar scaffolds com 35 camadas. Os ensaios foram realizados no Laboratório Multiusuário de Caracterização de Materiais da Faculdade de Engenharia Mecânica da Unicamp Ângulo de contato A análise do ângulo de contato foi realizada utilizando o microscópio da marca Hitachi com o software AxioVs40 V Para este ensaio foram fabricadas amostras sem porosidade com a finalidade de avaliar as propriedades hidrofílicas da superfície do PCL e dos compósitos de PCL/ β TCP. Utilizou-se gotas de 5 μl de água deionizada. As gotas foram colocadas na superfície das amostras com pipeta da marca Brand Transferpette. Todas as análises foram realizadas com uma temperatura ambiental de 26 ± 2 C e uma umidade relativa de 46 ± 2%. Para cada grupo de amostras foram realizadas cinco análises (cinco gotas). Foi capturada uma imagem depois de colocada a gota e outra após 300 s, com a finalidade de avaliar a variação do ângulo. As medições do ângulo de contato foram realizadas utilizando o software ImageJ 1.47v com o complemento Drop Analysis - LB-ADSA. Esta análise foi realizada no Laboratório de Nanoestruturas e Interfaces do Instituto de Física Gleb Wataghin da Unicamp. 7 ASTM D : Standard Test Methods for Tensile, Compressive, and Flexural Creep and Creep-Rupture of Plastics. 55

76 Avaliação biológica in vitro A caracterização biológica foi realizada de maneira preliminar mediante o teste de cultura celular. As amostras foram extraídas com dimensões de 8 8 mm a partir de scaffolds de oito camadas. Os reagentes para o teste foram fornecidos pela empresa Sigma-Aldrich, salvo as exceções devidamente mencionadas. As placas de cultura utilizadas foram adquiridas na empresa Corning. As células da linha MG63 (células osteoblásticas humanas) foram cultivadas no meio de cultura α-minimal Essential Medium (α-mem) (GIBCO Invitrogen), suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF) (GIBCO Invitrogen), 50 mg/ml de ácido ascórbico, 2,5 μg/ml de fungizona (GIBCO Invitrogen), 100 IU/ml de penicilina e 10 mg/ml de estreptomicina (GIBCO Invitrogen). As culturas foram mantidas em estufa à temperatura constante de 37 ºC, em atmosfera úmida de 95% de ar e 5% de CO 2 durante todo o tempo; só foram retiradas da estufa para mudar o meio de cultura. Inicialmente, as culturas foram mantidas até próximo da confluência (70-80% de confluência), altura em que foi efetuada a subcultura. Esta foi realizada através da libertação enzimática da camada celular aderida (tratamento com uma solução de 0,04% de tripsina e 0,025% de colagenase tipo I). Em seguida, a suspensão celular obtida foi utilizada para efetuar a subcultura celular na superfície das amostras, as que previamente foram esterilizadas em álcool. As células foram cultivadas com uma densidade de 106 células/cm 2, tendo sido mantidas as condições de cultura referenciadas, em termos de composição do meio de cultura e do microambiente de incubação. Os materiais colonizados foram mantidos em cultura durante 5 dias, sendo o meio de cultura mudado após 2 dias. O comportamento das culturas estabelecidas foi caracterizado relativamente à adesão, morfologia e proliferação celular através da observação dos materiais colonizados por microscopia eletrónica de varredura (MEV). Assim, as amostras com 1 e 5 dias de cultura dos materiais colonizados foram lavadas com PBS, e fixadas numa solução de glutaraldeído a 1,5%, em tampão de cacodilato de sódio a 0,14 M, durante dez minutos. Os materiais foram em seguida desidratados em álcool etílico (70, 80, 90 e 100%), e submetidos à 56

77 secagem por ponto crítico. Previamente à observação no MEV, as superfícies das amostras colonizadas foram revestidas com um filme de ouro/paládio durante 70 segundos, com uma corrente de 15 ma. Este revestimento foi efetuado por pulverização catódica, com o equipamento SPI Module Sputter Coater, SPI, West-Chester, USA. Em seguida, as amostras foram observadas no MEV FEI Quanta 400 FEG ESEM, Hillsboro, USA. As análises foram realizadas em parceria com o Laboratório de Metabolismo e Regeneração Óssea da Universidade do Porto-Portugal. 57

78 4. RESULTADOS E DISCUSSÕES Neste capítulo são analisados e discutidos os resultados obtidos para as diferentes caracterizações, as que foram realizadas com o objetivo de verificar se o processo de fabricação permitiu obter scaffolds com potencial para serem utilizados em aplicações em tecido ósseo. Inicialmente são apresentados os resultados correspondentes à reometria capilar do PCL CAPA Em seguida, são apresentados os resultados das caracterizações realizadas para a matéria prima, os scaffolds de PCL e os scaffolds compósitos de PCL/ β TCP. 4.1 Reometria capilar Na Figura 4.1 são apresentados os resultados obtidos com o ensaio de reometria capilar para o PCL CAPA Os dados foram ajustados com a correção de Rabinowitsch. Na Tabela 4.1 são mostrados os dados correspondentes ao ajuste linear dos resultados experimentais. Na Tabela 4.2 são apresentados os valores da viscosidade para as duas temperaturas utilizadas e diferentes taxas de cisalhamento, as que foram calculadas com três velocidades de rotação da rosca da extrusora na região de dosagem. Figura 4.1. Curvas reológicas do PCL CAPA

79 Tabela 4.1. Resultados do ajuste linear dos dados reológicos experimentais. Temperatura ( C) Ajuste linear log(η) = log(m) + (n 1)log(γ ) m (Pa s n ) n R 2 * 105 log(η) = 4,50 0,53log(γ ) 31622,7 0,47 0, log(η) = 4,37 0,49log(γ ) 23442,3 0,51 0,988 *Coeficiente de determinação Tabela 4.2. Resultados obtidos com a caracterização reológica do PCL CAPA N (rpm) γ (s -1 ) η (Pa.s) T= 105 C T= 115 C 7, , Na seção 3.2.3, após a realização dos ensaios preliminares foi definida uma temperatura (T pr ) de 105 C para o processamento. O comportamento reológico do PCL corrobora o valor definido para a T pr. Com as curvas reológicas foi possível observar que enquanto aumenta a taxa de cisalhamento, a viscosidade assume valores próximos entre si para as duas temperaturas avaliadas. Então, com uma temperatura de 105 C vai existir uma menor possibilidade de que a degradação do material seja significativa durante o processamento. Além disso, uma rotação da rosca de extrusão de 7,5 rpm gera uma menor taxa de cisalhamento, o que está associado a um menor aquecimento viscoso (MANRICH, 2005). Por outro lado, o valor de n < 1 mostra que o comportamento do PCL é pseudoplástico, o que é típico dos materiais poliméricos (KALAMBUR e RIZVI, 2006). 4.2 Análise termogravimétrica (TGA) Da Figura 4.2 até a Figura 4.5 são apresentadas as curvas de degradação térmica (TGA) e as curvas de termogravimetria derivada (DTG) para os scaffolds. Em seguida, na Figura 4.6 são mostradas as curvas TGA num mesmo gráfico para efeitos comparativos dos resultados obtidos. 60

80 Figura 4.2. Curvas TGA e DTG para os scaffolds P100C0. Figura 4.3. Curvas TGA e DTG para os scaffolds P90C10. 61

81 Figura 4.4. Curvas TGA e DTG para os scaffolds P80C20. Figura 4.5. Curvas TGA e DTG para os scaffolds P70C30. 62

82 Figura 4.6. Curvas TGA dos scaffolds de PCL puro e compósitos. Quando a análise TGA do PCL é realizada em atmosfera de nitrogênio é liberado ácido 5- hexanóico, CO 2, CO e ε-caprolactona. Neste caso, a curva de degradação térmica apresenta um estágio de degradação, sendo que inicialmente é liberado o ácido 5-hexanóico e o CO 2. Acima dos 430 C é liberado ε-caprolactona e vestígios de CO (VOGEL e SIESLER, 2008). Por outro lado, a temperatura de calcinação do β TCP ocorre acima dos 1000 C (SOLOMÃO, 2011). Então, como observado dentro da faixa de temperatura definida para os ensaios (25 e 700 C), os scaffolds de PCL apresentaram uma perda de massa praticamente total. Para os scaffolds compósitos foi possível verificar a quantidade real de reforço cerâmico, levando em consideração que o β TCP não apresenta perda de massa na faixa de temperatura do ensaio, o que é reportado na literatura (YEO et al., 2012). Todas as curvas TGA apresentaram um estágio de degradação, que neste caso corresponde ao PCL. Nos scaffolds compósitos foi observado um valor de composição em peso próximo ao 63

83 definido teoricamente. Nos scaffolds P70C30 houve uma menor proximidade entre o valor teórico e o real para o conteúdo de reforço, isto pode ser associado à presença de aglomerados de β TCP, o que foi observado nos resultados das análises micro-ct. Na Tabela 4.3 são mostrados os resultados obtidos para as temperaturas de degradação térmica e a perda de massa da matéria prima e dos scaffolds. Tabela 4.3. Resultados obtidos com a análise TGA. Amostra T i ( ) T f ( ) T p ( ) Perda de massa (%) P100C ,2 P90C ,9 P80C ,3 P70C ,0 A tabela anterior mostra uma diminuição das temperaturas inicial e final de degradação térmica com o aumento do teor de β TCP. Por outro lado, a temperatura pico de degradação térmica não apresentou uma variação significativa. O comportamento observado com a adição do β TCP é semelhante ao comportamento de um retardante de chama; abaixou a temperatura de inicio da degradação térmica e diminuiu a perda de massa (CANEVAROLO, 2003). Não obstante, o foco principal da caracterização TGA foi a perda de massa para determinar a quantidade real de reforço, levando em consideração que as aplicações dos scaffolds estão restritas a uma temperatura de aproximadamente 37 C (temperatura corporal do organismo humano) (ESPOSITO, 2010). 4.3 Calorimetria exploratória diferencial (DSC) Na Figura 4.7 são apresentadas as curvas DSC correspondentes ao segundo aquecimento. Com estas curvas foram determinadas as temperaturas de transição vítrea (T g ), de fusão (T m ) e 64

84 as entalpias de fusão ( H m ) do PCL CAPA 6505 e dos scaffolds. Na Figura 4.8 são apresentadas as curvas correspondentes ao resfriamento, com as que foram determinadas a entalpias de cristalização ( H c ) e as temperaturas de cristalização (T c ). Na Tabela 4.4 são apresentados os resultados obtidos durante a caracterização térmica. O grau de cristalinidade foi calculado com a Equação 7 (LÖNNBERG et al., 2008). A entalpia de fusão para o PCL com cristalinidade ideal (100% de cristalinidade) é: ΔH m 0 GUPTA et al., 2011). Além disso, ω é a fração em peso do polímero. = 139,5 (J g) (GUARINO et al., 2010; χ c (%) = H m ΔH Equação 7 m ω Figura 4.7. Curvas DSC para o segundo aquecimento. 65

85 Figura 4.8. Curvas DSC obtidas durante o resfriamento. Tabela 4.4. Resultados obtidos durante a caracterização térmica dos scaffolds. Amostra T g ( ) T m ( ) T c ( ) H m (J g) H c (J g) χ c (%)* PCL CAPA ,8 57,6 24,8 62,9 55,4 45,1 P100C0-61,0 58,5 30,4 70,1 64,3 50,3 P90C10-61,3 59,2 31,3 68,8 59,6 54,7 P80C20-61,7 58,2 32,0 57,5 47,2 51,5 P70C30-61,5 58,4 33,0 53,7 46,9 54,9 * Grau de cristalinidade da matriz polimérica. Observando os resultados obtidos com a análise DSC pode-se verificar que as temperaturas T g e T m não sofreram uma variação significativa. A T c dos quatro grupos de scaffolds teve um aumento com relação à T c do PCL CAPA No caso dos scaffolds compósitos, além da 66

86 temperatura de processamento, o β TCP influenciou na cristalização. Na literatura Patlolla et al. reportaram um comportamento semelhante em compósitos PCL/HA. Então, o aumento da T c dos scaffolds compósitos estaria associado à presença do β TCP e ao seu efeito nucleante (PATLOLLA et al., 2010). No caso dos scaffolds P100C0, o aumento da T c pode ser associado ao fato de que a temperatura de processamento é consideravelmente maior que a temperatura de fusão do PCL (SENEDESE et al., 2011). Nos valores das entalpias de fusão e cristalização dos scaffolds compósitos houve uma diminuição com o aumento do teor de β TCP, isto em relação aos scaffolds P100C0. O grau de cristalinidade da matriz polimérica dos scaffolds aumentou em comparação ao PCL CAPA 6505, sendo que os scaffolds compósitos apresentaram maior cristalinidade do que os scaffolds P100C0, o que pode ser associado ao reforço cerâmico atuar como nucleante. Além do mais, o efeito nucleante pode ser influenciado pela presença de aglomerados. O grau de cristalinidade dos scaffolds P80C20, apresentou uma leve diminuição em comparação aos scaffolds P90C10 e P70C30 o que estaria relacionado com a possível presença de aglomerados. Além disso, na literatura é reportado que com o aumento da quantidade de biocerâmica pode diminuir levemente o efeito nucleante (PATLOLLA et al., 2010). 4.4 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) Nas microscopias mostradas na Figura 4.9 é possível observar que a fabricação dos scaffolds de PCL com uma velocidade de movimentação do cabeçote de 12 mm/s foi bem sucedida. Na Figura 4.9(d), é observada a formação de microporos na superfície do scaffold. A microporosidade gera rugosidade na superfície, o que é um fator positivo para a adesão das células (SOBRAL et al., 2011). O processo de adesão celular é influenciado por inúmeras variáveis, principalmente a natureza do biomaterial e características da superfície tais como: rugosidade, topografia, composição química, propriedades hidrofílicas, tratamentos superficiais, entre outras (MARCOTTE e TABRIZIAN, 2008). Na literatura, Senedese et al. obtiveram scaffolds de PCL utilizando o processo FDM na Fab@CTI, a superfície também apresentou microporosidade, a que foi associada ao processo de manufatura (SENEDESE et al., 2011). A 67

87 microporosidade pode afetar a estabilidade mecânica dos scaffolds; com a aplicação de carga, a falha pode começar pelos microporos. Em processos de extrusão, os microporos são formados devido ao ar que pode ser carregado dentro do cilindro da extrusora. Extrusoras industriais comumente têm um sistema de vácuo acoplado para extrair o ar (RAUWENDAAL, 2013). Por outro lado, na Figura 4.9(b) é observado o achatamento dos fios extrudados nos pontos de união das camadas. Isto é devido ao fato de que a altura de camada utilizada no processamento é menor que o diâmetro do fio extrudado, o que permite gerar uma boa adesão entre camadas. Achatamento (a) (b) Microporos (c) Figura 4.9. Morfologia dos scaffolds P100C0 (v m =12 mm/s): (a) Arquitetura 0 /90 40X, (b) 0 /90 120X, (c) seção transversal do fio extrudado 450X e (d) superfície do fio extrudado 500X. (d) Na Figura 4.10 são mostradas as microscopias correspondentes a os scaffolds de PCL fabricados com uma velocidade de movimentação do cabeçote de 11,5 mm/s. Neste caso também 68

88 é observada uma morfologia bem sucedida, achatamento nos pontos de adesão entre camadas e microporos na superfície. A menor velocidade de movimentação do cabeçote de impressão aumentou o diâmetro dos fios extrudados. A Figura 4.10(c) mostra uma seção transversal com maior área, levando em consideração que o ponto de fratura está perto da região achatada. Achatamento (a) (b) Microporos (c) Figura Morfologia dos scaffolds P100C0 (v m =11,5 mm/s): (a) Arquitetura 0 /90 40X, (b) 0 /90 120X, (c) seção transversal do fio extrudado 450X e (d) superfície do fio extrudado 500X. (d) Nas microscopias mostradas na Figura 4.11 é possível observar uma morfologia bem sucedida durante o processamento para os scaffolds com 10% de reforço. Também é observada a presença da biocerâmica, principalmente na superfície dos scaffolds. Segundo Yeo et al., as partículas podem se localizar preferentemente na superfície do fio extrudado. Isto pode ser 69

89 associado à tensão de cisalhamento na parede do bico de extrusão (YEO et al., 2010). Neste caso não é observada a microporosidade na superfície, o que estaria associado à tendência do β TCP a se posicionar perto dessa região. Na Figura 4.11(b) é observado o achatamento dos fios extrudados nos pontos de adesão entre camadas. Na Figura 4.11(c) e na Figura 4.11(d) são observadas as partículas de β TCP no scaffold. Achatamento (a) (b) β-tcp β-tcp (c) (d) Figura Morfologia dos scaffolds com composição P90C10 (v m =12 mm/s): (a) Arquitetura 0 /90 40X, (b) arquitetura 0 /90 120X, (c) seção transversal do fio extrudado 450X e (d) superfície do fio extrudado 500X. Na Figura 4.12 se observa que a morfologia foi bem sucedida durante o processamento para os scaffolds com 20% de reforço. É detectável a maior presença do β TCP. A biocerâmica está bem dispersa na superfície do scaffold e também está presente na seção transversal. Existe uma 70

90 boa dispersão, porém, a distribuição uniforme das partículas biocerâmicas pode ser comprometida, levando em consideração que o processamento utiliza uma rosca simples sem elementos de mistura. Na Figura 4.12(b) é observado o achatamento dos fios extrudados nos pontos de adesão entre camadas. Achatamento (a) (b) β-tcp β-tcp (c) (d) Figura Morfologia dos scaffolds com composição P80C20 (v m =12 mm/s): (a) Arquitetura 0 /90 40X, (b) arquitetura 0 /90 120X, (c) seção transversal do fio extrudado 450X e (d) superfície do fio extrudado 500X. Nas microscopias mostradas na Figura 4.13 é possível observar uma maior quantidade de β TCP; para os scaffolds com 30% de reforço a morfologia também foi bem sucedida. Na Figura 4.13(b) é observado o achatamento dos fios devido à adesão entre camadas. Na seção transversal mostrada na Figura 4.13(c) e na superfície do fio mostrado na Figura 4.13(d) é 71

91 observada a presença da biocerâmica. Neste caso também existe uma boa dispersão das partículas de β TCP. A distribuição uniforme do reforço na matriz polimérica é limitada, o que está associado ao processamento de extrusão por rosca simples. Achatamento (a) (b) β-tcp β-tcp (c) (d) Figura Morfologia dos scaffolds com composição P70C30 (v m =12 mm/s): (a) Arquitetura 0 /90 40X, (b) arquitetura 0 /90 120X, (c) seção transversal do fio extrudado 450X e (d) superfície do fio extrudado 500X. Na Figura 4.14 são apresentadas as secções transversais dos scaffolds. A fratura foi realizada utilizando nitrogênio líquido. Nestas imagens é possível observar a adesão entre camadas, os microporos na superfície dos scaffolds de PCL e a presença da biocerâmica nos scaffolds compósitos. 72

92 (a) (b) (c) (d) (e) Figura Seção transversal dos scaffolds: (a) P100C0 (v m =12 mm/s), (b) P100C0 (v m =11,5 mm/s), (c) P90C10 (v m =12 mm/s), (d) P80C20 (v m =12 mm/s) e (e) P70C30 (v m =12 mm/s). 73