ANÁLISE MORFOMÉTRICA APLICADA AO DIAGNÓSTICO CITOPATOLÓGICO E/OU À DETECÇÃO MOLECULAR DO HPV

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISE MORFOMÉTRICA APLICADA AO DIAGNÓSTICO CITOPATOLÓGICO E/OU À DETECÇÃO MOLECULAR DO HPV ALESSANDRA HERMÓGENES GOMES OURO PRETO 2012

2 ALESSANDRA HERMÓGENES GOMES ANÁLISE MORFOMÉTRICA APLICADA AO DIAGNÓSTICO CITOPATOLÓGICO E/OU À DETECÇÃO MOLECULAR DO HPV Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Biológicas do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas. Orientadora: Prof a. Cláudia Martins Carneiro OURO PRETO 2012

3 Dedico este trabalho... Aos meus avós Lina e Milton tão queridos; Aos meus pais, Creuza e Félix, por me apoiarem até aqui; A minha irmã Fernanda, e aos meus sobrinhos Víctor e Eduardo pelo carinho; Ao Wellington por todo amor e cumplicidade; A todos os amigos e familiares que oraram e sempre torceram por mais esta vitória.

4 . Agradecimentos A Deus, acima de tudo, por ser meu salvador, meu sustento, por me guiar em seu caminho, por me dar sempre a certeza de Sua presença em minha vida! Em especial, a Professora Cláudia Martins Carneiro, por ter me recebido desde o primeiro instante com carinho, por ter confiado em mim, e pelo exemplo de uma profissional excepcional e dedicada. Agradeço-lhe imensamente pelos ensinamentos, por me orientar durante esses anos e por compartilhar comigo mais essa conquista. Ao Wendel Coura Vital, pela colaboração na realização das análises estatísticas e sugestões valiosas para elaboração desta dissertação. À Professora Angélica Alves Lima, pela colaboração na realização das PCRs. À Aline pelo auxílio na captura das lâminas, e aos amigos do Laboratório Piloto de Análises Clínicas, Renata, Diego e Roney pela cooperação e agradável convivência. Aos funcionários da Escola de Farmácia, em especial ao Maurício José Guimarães, por sempre estar presente e pela disponibilidade em ajudar. Ao Wellington, pelo amor, companheirismo e incentivo, e por sempre me proporcionar momentos de alegria. À Conceição e à Isliê, pelo carinho. À Danielle, que compreende bem esse duro caminho, pela amizade. Aos meus pais pelo amor, e por sempre se esforçarem para que eu tivesse uma boa educação. A todos meus queridos amigos da Igreja Cristã Maranata, por sempre estarem presentes, pelo carinho e acolhimento. Às mulheres que aceitaram participar deste projeto, sem as quais ele não existiria. Enfim, a todos os amigos e familiares que contribuíram para que mais esse sonho se tornasse realidade. Muito Obrigada! iv

5 Resumo O câncer de colo do útero é o segundo tipo de câncer mais comum em mulheres no Brasil, sendo a infecção pelo Papilomavírus Humano (HPV) um dos principais fatores associados ao desenvolvimento de lesões cervicais. O objetivo deste trabalho foi verificar se a análise morfométrica associada ou não à PCR aumenta a sensibilidade do exame citopatológico. Durante dois anos foram coletadas 198 amostras cervicais, sendo realizada coleta de 99 amostras a cada ano, as quais foram submetidas à avaliação citopatológica através do exame citopatológico e à avaliação molecular por meio da PCR para verificar a presença e o tipo de HPV eventualmente presente na amostra. Para a análise morfométrica, foram capturados 60 campos de cada lâmina, em uma ampliação de 40x e ocular de 10x com auxílio instrumental de uma câmera digital Leica DFC340FX acoplada ao micriscópio Leica DM5000B. Foram mensurados os parâmetros área nuclear (AN), área citoplasmática (AC) por meio do software de morfometria Image J 1.43, e determinado a razão núcleo/citoplasma (N/C). Citologia, PCR, razão N/C, AN e AC foram avaliadas utilizando o modelo longitudinal de Cox com variável tempo-dependente a partir dos quatro modelos construídos com base nestas variáveis. O teste de Wilcoxon foi aplicado para análise pareada destas variáveis através do programa GraphPad Prism 5 com intervalo de confiança de 95%. A razão N/C mostrou aumento significativo da primeira para a segunda coleta em três dos modelos construídos. Verificou-se que o aumento de uma unidade da razão N/C(x100) aumenta em 2,1 vezes o risco da PCR negativa na primeira coleta, positivar na segunda. Nos demais modelos a razão N/C também apresentou razão de risco significativa, demonstrando ser o parâmetro mais expressivo na avaliação dos esfregaços citológicos. A morfometria associada ao teste molecular e ao exame morfológico convencional aumentou a sensibilidade do diagnóstico citológico, além da morfometria acrescentar parâmetros ao exame citopatológico que podem ser utilizados como fatores prognósticos na análise de esfregaços cervicais. v

6 GOMES,A.H Abstract Cervical cancer is the second most common type of cancer in women in Brazil, where infection with Human Papillomavirus (HPV) is one of the main factors associated with the development of cervical lesions. The objective of this study was to determine whether the morphometric analysis with or without PCR increases the sensitivity of the Pap smear. For two years was collected 198 cervical samples, being made collecting of 99 samples each year, which were submitted to cytological test of Pap smear and molecular evaluation by the polymerase chain reaction (PCR) for the presence and type of HPV eventually present in the sample. For the morphometric analysis, 60 fields were captured from each slide, at a magnification of 40x and eyepiece 10x with the instrumental help of a digital camera Leica DFC340FX attached to the microscope Leica DM5000B. The parameters measured were nuclear area (NA), cytoplasmic area (CA) through morphometry software Image J 1.43, and determined the nuclear/cytoplasm ratio (N/C). Cytology, PCR, N/C ratio, NA and CA were evaluated using the longitudinal model of Cox with timedependent variable from the four models built based on these variables. The Wilcoxon test was used for paired analysis of these variables using the GraphPad Prism 5 with a confidence interval of 95%. The N/C ratio increased significantly from the first to the second collect in three models constructed. It was found that an increase of one unit of the N/C (x100) ratio increases 2,1 times the risk of PCR negative in the first test becomes positive on second. In the other models the N/C ratio also showed significant ratio, proving to be the most expressive parameter in the assessment of cytological smears. Morphometry associated with molecular testing and conventional morphological examination increased the sensitivity of cytological diagnosis, and morphometric parameters when adding Pap smear that can be used as prognostic factors in the analysis of cervical smears. vi

7 GOMES,A.H Lista de Figuras Figura 1- Mudanças na estrutura do tecido associadas à progressão da NIC no epitélio escamoso cervical. Piersma, (adaptado) Figura 2 - Análise morfométrica de células escamosas utilizando o software Image J Figura 3 - Representação dos quatro modelos construídos com base nos diferentes grupos de mulheres e eventos avaliados Figura 4 - HPVs identificados na primeira coleta, conforme tipo e risco oncogênico Figura 5 - Diagnósticos citológicos positivos na primeira coleta, de acordo com o tipo de alteração encontrada Figura 6 - Diagnósticos citológicos positivos na segunda coleta, de acordo com o tipo de alteração encontrada Figura 7 - Presença ou não do DNA-HPV conforme resultado citológico positivo da primeira coleta Figura 8 - Presença ou não do DNA-HPV conforme resultado citológico positivo da segunda coleta Figura 9 - Presença ou não do DNA-HPV conforme resultado citológico negativo da primeira coleta Figura 10 - Presença ou não do DNA-HPV conforme resultado citológico negativo da segunda coleta Figura 11 - Análise morfométrica da razão N/C, AN e AC observadas em células escamosas coletadas com auxílio da escova e da espátula, na primeira e segunda coleta Figura 12 - Análise morfométrica da razão N/C, AN e AC observadas em células escamosas coletadas com a escova e com a espátula de pacientes PCR negativa na primeira coleta, porém positiva na segunda Figura 13 - Análise morfométrica da razão N/C, AN e AC observadas em células escamosas coletadas com a escova e com a espátula de pacientes com citologia negativa na primeira coleta, porém positiva na segunda Figura 14 - Análise morfométrica da razão N/C (x100), AN e AC observadas em células escamosas coletadas com a escova e com a espátula de pacientes PCR e citologia negativa na primeira coleta, porém citologia positiva na segunda Figura 15 - Análise morfométrica da razão N/C (x100), AN e AC observadas em células escamosas coletadas com a escova e com a espátula de pacientes PCR e citologia negativa na primeira coleta, porém PCR positiva na segunda vii

8 SANA, D.E.M Lista de Tabelas Tabela 1 - Resultado da PCR de acordo com a coleta Tabela 2 - Variação da PCR de acordo com a coleta Tabela 3 - Resultado do exame citológico de acordo com a coleta Tabela 4 - Resultado citológico da segunda coleta de acordo com amostras citológicas positivas da primeira coleta Tabela 5 - Resultados citológicos positivos da segunda coleta de amostras previamente classificadas como negativas na primeira coleta Tabela 6 - Análise univariada do modelo 1, avaliando os fatores de risco para infecção por HPV detectada por teste molecular (PCR) Tabela 7 - Modelo final dos fatores de risco para infecção por HPV detectado por diagnóstico molecular (PCR) em mulheres com exame citológico e molecular negativos Tabela 8 - Análise univariada do modelo 2 avaliando os fatores de risco para a mulher apresentar citologia positiva, partindo de mulheres citologia negativa Tabela 9 - Análise univariada dos fatores de risco associados a positividade de HPV através da técnica de PCR em mulheres com PCR e citologia negativa Tabela 10 - Fatores de risco associados ao teste citopatológico positivo, partindo de mulheres com PCR e citologia negativa para HPV viii

9 Lista de Abreviaturas AC: Área citoplasmática AGC: Células glandulares atípicas AGC-NEO: Células glandulares atípicas possivelmente neoplásicas AGC-SOE: Células glandulares atípicas sem outras especificações AIS: Adenocarcinoma in situ AN: Área nuclear N/C: Núcleo/citoplasma ASC: Células escamosas atípicas ASCUS: Células escamosas atípicas de significado indeterminado ASC-US: Células escamosas atípicas de significado indeterminado, possivelmente não neoplásicas ASC-H: Células escamosas atípicas em que não se pode excluir lesão de alto grau DNA: Ácido desoxirribonucleico E: Early region HPV: Papiloma vírus humano HSIL: Lesão intra-epitelial escamosa de alto grau JEC: Junção escamo-colunar L: Late region LAPAC: Laboratório piloto de análises clínicas LCR: Long control region LSIL: Lesão intraepitelial escamosa de baixo grau LSIL-H: Lesão intraepitelial escamosa de baixo grau, não podendo excluir lesão de alto grau NIC: Neoplasia intraepitelial cervical NIC 1: Neoplasia intraepitelial cervical grau 1 NIC 2: Neoplasia intraepitelial cervical grau 2 NIC 3: Neoplasia intraepitelial cervical grau 3 NUPEB: Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas PV: Papilomavírus PCR: Reação em cadeia da polimerase SIL: Lesão intra-epitelial escamosa SUS: Sistema Único de Saúde UNIFESP: Universidade Federal de São Paulo UFOP: Universidade Federal de Ouro Preto ix

10 Sumário 1 - Introdução Revisão da Literatura Características gerais do Papiloma Vírus Humano (HPV) Associação do HPV com a Carcinogênese Cervical Epidemiologia da Infecção pelo HPV e do Câncer de Colo do Útero Métodos de Detecção do DNA/HPV Exame Citopatológico Métodos de Coleta Nomenclatura para exames citopatológicos Exame citopatológico e Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) Detecção do HPV e Atipias Citológicas Exame citopatológico e Morfometria Celular Objetivos Objetivo Geral Objetivos Específicos Material e Métodos Período e População Estudada Coleta e Processamento das Amostras Análise Morfométrica Análise Estatística Resultados Caracterização das Amostras Tipos de HPV Identificados Diagnósticos Citológicos Presença do HPV Conforme Diagnóstico Citológico Análise Morfométrica Análise dos Fatores de Risco Discussão Conclusões Referências Bibliográficas Anexos x

11 1 - Introdução

12 Introdução O câncer do colo do útero é o terceiro tipo de câncer mais freqüente entre as mulheres no mundo, com aproximadamente 530 mil novos casos em 2008, com maior freqüência em países em desenvolvimento (WHO, 2008). No Brasil, esse é o segundo tipo de câncer mais incidente entre as mulheres, excetuando-se os casos de câncer de pele não-melanoma. As estimativas para o ano de 2012 apontam para ocorrência de novos casos de câncer de colo do útero, com um risco aproximado de 17 casos a cada 100 mil mulheres (INCA, 2012). Segundo a Organização Mundial de Saúde (2002), para haver redução da incidência de câncer cervical de 60 a 90%, é necessário o mínimo de 80% de cobertura populacional da população-alvo, que no caso do câncer cervical compreende mulheres entre 25 a 64 anos. Adicionalmente também é necessária a garantia do diagnóstico precoce, seguimento e tratamento adequado dos casos alterados. Para isso, a realização periódica do exame citopatológico do colo do útero continua sendo a estratégia mais adotada para o rastreamento do câncer cervical (WHO, 2012). O exame citopatológico é um teste de rastreamento amplamente aceito em todo mundo, por ser eficaz, de baixo custo, e por muitas vezes mostrar características citológicas associadas à infecção pelo Papiloma Vírus Humano (HPV) (Rachmadi et al., 2012). Por outro lado, apesar da utilidade inquestionável deste exame, sabe-se que ele possui algumas limitações em termos de sensibilidade, especificidade e valores preditivos, o que por vezes reflete em uma elevada taxa de resultados falso-negativos (Gupta & Sodhanj, 2004). Essa ocorrência é atribuída principalmente a erros de amostragem e de interpretação onde a subestimação de resultados geralmente ocorre devido à presença de alterações morfológicas sutis ou em pequena quantidade, que não chamam atenção do citologista (Gupta et al., 2012). A análise computadorizada de imagem é um instrumento promissor na classificação de diferenças citológicas sutis ao observador, uma vez que o olho humano é sensível a inúmeras variáveis como intensidade de luz, mensurar áreas semelhantes, o que por vezes dificulta na classificação exata das atipias citológicas encontradas nos esfregaços cervicais (Eldar et al., 1999). A morfometria nuclear avalia parâmetros do núcleo como tamanho, forma e padrão cromatínico, características estas que se apresentam de maneira distinta nos processos benignos e malignos, sendo um dos principais objetivos da morfometria a eliminação da subjetividade permitindo assim a reprodutibilidade interobservador. Desta forma, vários autores têm lançado mão da morfometria nuclear para aprimorar parâmetros diagnósticos e reunir fatores prognósticos confiáveis (Andrea et al., 2008). Da mesma forma, outra alternativa levantada nos últimos anos para melhorar o desempenho do rastreio do câncer cervical é o uso da biologia molecular. A realização do teste de triagem para o 2

13 Introdução HPV, principalmente os de alto risco oncogênico, abriu novas possibilidades para detecção de mulheres com risco de desenvolver o câncer cervical, mesmo aquelas que apresentam o exame citológico negativo. O teste para detecção de HPV de alto risco é consideravelmente mais sensível do que o exame citopatológico, porém menos específico, e uma combinação dos dois testes pode ser usada para selecionar mulheres com baixo risco de desenvolver a neoplasia cervical e que não precisam de um rastreio anual, e da mesma forma identificar aquelas que necessitam de um acompanhamento mais minucioso (Thrall et al., 2010). Uma das grandes limitações dos métodos citológicos convencionais é a subjetividade inerente às avaliações microscópicas. Com a evolução da informática foi possível captar imagens microscópicas, no entanto, para avaliações mais precisas é necessária a realização de análises morfométricas das estruturas celulares. Neste sentido diversas informações importantes com implicações diagnósticas e prognósticas podem ser obtidas pela análise morfométrica, que é um método objetivo e, portanto altamente reprodutível. A incorporação de métodos automatizados no rastreio do câncer do colo do útero pode ser um grande aliado para redução significativa de resultados falso-negativos, melhorando o prognóstico e reduzindo custos, o que vem em contrapartida aos testes moleculares que possuem alto custo unitário. Além disso os métodos automatizados permitem a avaliação de um grande volume de lâminas por dia, onde aquelas com alguma suspeita de alteração seria selecionada para revisão detalhada pelo citologista. 3

14 2 - Revisão da Literatura

15 2.1 - Características gerais do Papiloma Vírus Humano (HPV) Revisão da Literatura Os papilomavírus (PV) pertencem à família Papillomaviridae, e são capazes de infectar o epitélio de vertebrados e causar neoplasias ou persistir de forma assintomática (Bernard, et al., 2010). Até o momento, 29 gêneros de papilomavírus foram descritos, dos quais 5 gêneros (Alpha, Beta, Gamma, Mu e Nupapillomavirus ) têm capacidade de infectar os seres humanos, e por isso são denominados Papilomavírus Humano (HPV) (Kovanda et al., 2011). Os HPVs possuem mais de 130 genótipos, podendo ser divididos em tipos cutâneos ou de mucosa. Estes vírus são do tipo não envelopados compostos por dupla fita de DNA circular, com genoma composto por aproximadamente pares de bases que codificam 8 genes (Paavonen, 2007). Seu genoma pode ser organizado em região precoce (E: early), que codifica diversas proteínas, incluindo E1, E2, E6 e E7, que são importantes para replicação viral; região tardia (L: late), onde são codificadas as proteínas L1 e L2 para formação do capsídeo viral; e região reguladora LCR (long control region), que controla a replicação viral e a expressão gênica (Munger et al., 2004; Freitas et al., 2012). Mais de 200 tipos de HPVs já foram identificados (Alhamany et al., 2010), contudo somente 40 genotipos estão associados a infecções do trato anogenital, e pelo menos 12 são classificados como de alto risco oncogênico e estão associados a neoplasia cervical (Sjoeborg et al., 2010). Um novo tipo de HPV é reconhecido quando a seqüência nucleotídica de L1 difere em mais de 10% dos outros tipos. Quando há diferença na homologia entre 2 e 10% define-se um subtipo, e diferenças menores que 2% caracterizam uma variante (de Villers et al., 2004). HPVs do grupo Beta são comumente associados a infecções cutâneas inaparentes, contudo podem induzir lesões em pacientes imunosuprimidos. Já os HPVs do grupo Alpha tem maior tropismo por mucosa, embora raros vírus deste grupo possuam tropismo cutâneo, como o HPV 2 (Doobar, 2006). Os tipos genitais de HPV são classificados de acordo com o risco de malignidade em alto risco oncogênico (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73), risco provável alto (26, 53, 66) e baixo risco (6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61,70, 72, 81) (Lurchachaiwong et al., 2011) Associação do HPV com a Carcinogênese Cervical O câncer de colo uterino é uma doença cuja evolução é lenta, apresentando fases préinvasivas, e, portanto, benignas, que são detectáveis e curáveis mesmo em mulheres assintomáticas. 5

16 Revisão da Literatura O período de evolução de uma lesão cervical inicial para a forma invasiva e, por conseguinte, maligna, pode durar anos e até décadas (Medeiros, 2005). Desta forma, este pode ser considerado o tipo de câncer que apresenta um dos mais altos potenciais de prevenção e cura, chegando perto de 100% quando diagnosticado precocemente (Rama et al., 2008). Aproximadamente metade das infecções recentes pelo HPV são indetectáveis entre os primeiros 6 a 12 meses, e mais de 90% são eliminadas pelo próprio organismo dentro de poucos anos, e observa-se que a taxa de liberação do vírus é alta nos primeiros meses após a infecção, mas diminui ao longo do tempo (Schiffman et al., 2011). Lesões verrucosas características de infecções do epitélio mucoso e cutâneo têm sido descritas desde tempos remotos, contudo elas foram relacionadas à doença causada por um agente infeccioso no início do século XX. Koss, em 1956, descreveu os primeiros aspectos morfológicos das células retiradas de lesões verrucosas do colo do útero usando o termo de atipia coilocitótica, isso antes de se relacionar o coilócito com a infecção pelo HPV. As principais características morfológicas do coilócito, incluindo halo perinuclear irregular, condensação periférica de filamentos citoplasmáticos, alargamento nuclear e hipercromasia, já têm sido utilizadas como patognomônico para o efeito viral do HPV, demonstrando a replicação do genoma viral na célula hospedeira. Mais de 95% dos casos de neoplasia cervical tem sido relacionada à presença do DNA do HPV (Thomison III et al., 2008). Para o HPV completar todo seu ciclo celular, ou seja, na infecção produtiva que resulta nas lesões de baixo grau, há infecção das células basais da epiderme ou mucosa que têm o potencial para proliferar e se diferenciar (Miura et al., 2010). O vírus consegue acesso a essas células basais através de micro traumas no epitélio ou infectando a zona de transformação, local onde há uma transição abrupta entre o epitélio colunar e escamoso. As células infectadas expressam ativamente os genes E1, E2, E4 e E5. As oncoproteínas E6 e E7 são expressas em quantidades limitadas, devido à repressão transcricional exercida pela E2. As células basais infectadas amadurecem e migram para a parte superior do epitélio, onde se diferenciam. Essas células já diferenciadas expressam as proteínas L1 e L2 para formação do capsídio viral, onde ocorre então empacotamento do genoma viral em partículas infectantes que serão liberadas ao alcançar a superfície do epitélio, podendo infectar novas células ou até mesmo ser transmitido sexualmente (Perez-Plasencia et al., 2008; Piersma, 2011). O principal determinante para desenvolvimento da infecção não produtiva, quando há integração do DNA do HPV à célula hospedeira, é a expressão desregulada de proteínas precoces E6 e E7 de HPVs de alto risco, que resulta na interrupção da regulação do ciclo celular, na anulação 6

17 Revisão da Literatura dos mecanismos de apoptose e na instabilidade genética, resultando nas lesões de alto grau (Wright Jr, 2006). A proteína E6 se liga a p53 impedindo o mecanismo de apoptose de células com dano no DNA, enquanto E7 se liga a proteínas do retinoblastoma impedindo que exerçam suas funções, que são de controlar a progressão e diferenciação do ciclo celular (Doobar, 2006). Por outro lado as proteínas E6 e E7 de HPVs de baixo risco como 6 e 11 também interagem com proteínas do retinoblastoma, contudo com menor afinidade e somente induzem a degradação proteolítica de p130 (Muench et al., 2009). Praticamente 100% dos casos de câncer cervical apresentam positividade para HPV de alto risco (Stanley, 2010). O câncer cervical é um evento tipicamente monoclonal, relativo a somente um tipo de HPV, no entanto, o epitélio cervical circundante pode ainda ser afetado com outros tipos virais (Moscicki et al., 2006). O câncer de colo do útero é precedido por lesões pré-neoplásicas, denominadas de neoplasia intraepitelial cervical (NIC), que são categorizadas em grau 1, 2 e 3 dependendo da espessura do epitélio já acometido por células diferenciadas. As NIC 1 correspondem a lesões intraepiteliais escamosas de baixo grau (LSIL), que podem ou não apresentar efeito citopático pelo HPV, os coilócitos. Essas lesões acometem células maduras, na porção superior do epitélio, que na maioria dos casos, regridem naturalmente em períodos de 12 a 24 meses, sendo então desconsideradas como lesão precursora. Por outro lado as NIC 2 e 3, que são as lesões intraepiteliais escamosas de alto grau (HSIL) são as verdadeiras precursoras do câncer cervical, uma vez que acometem células jovens da porção inferior do epitélio, células essas indiferenciadas, que podem tomar toda espessura do epitélio cervical, e que se não tratada pode evoluir para o câncer (Brasil, 2011). A realização de análise mais detalhada em esfregaços com diagnóstico de ASC-US e ASC-H é necessária para avaliar se essa paciente tem mais susceptibilidade ou não de desenvolver uma lesão de alto grau. Atualmente já é bem conhecido o fato de que a infecção pelo HPV de alto risco é uma condição necessária, mas não suficiente para o desenvolvimento da neoplasia cervical. Sendo assim, a triagem para o HPV tem sido realizada em muitas pacientes com ASC (Lorenzato et al., 2008). A progressão das lesões pré-neoplásicas para o carcinoma invasivo parece estar relacionada, em parte, com o tipo do HPV oncogênico envolvido na infecção. Lesões induzidas pelos HPVs 16 e 18 parecem apresentar progressão substancialmente mais rápida do que lesões induzidas por HPVs 31 e 33 (Vinkurova et al., 2008). 7

18 2.3 - Epidemiologia da Infecção pelo HPV e do Câncer de Colo do Útero Revisão da Literatura A infecção por HPV é uma das doenças sexualmente transmissíveis mais comum em todo o mundo (Bruni et al., 2010). O HPV está associado com aproximadamente 99,7% dos casos de câncer cervical, mas também tem participação na patogênese de outras doenças malignas como câncer anal, vulvar, de pênis, cabeça e pescoço (Crawford et al., 2011), sendo que somente os HPVs 16 e 18 estão relacionados com 70% dos casos de câncer de colo do útero (Durham et al., 2012; Konno et al., 2011; Rositch et al., 2012). Estudos de base populacional sugerem que cerca de 80% de mulheres sexualmente ativas podem ter contato com pelo menos um tipo de HPV genital em sua vida (Garland & Smith, 2010). Uma meta-análise mostrou que aproximadamente 10% das mulheres em todo o mundo com achados citológicos normais podem apresentar níveis detectáveis de infecção cervical por HPV, e que a prevalência mundial de HPV gira em torno de 10,4%, e para a América Latina em torno de 12,9% (de Sanjosé et al., 2007). A infecção pelo HPV é transmitida preferencialmente por via sexual, sendo que a maioria é transitória e regride espontaneamente, contudo, em alguns casos essa infecção pode persistir, levando a progressão para o câncer cervical (Jones et al., 2011). A transmissão do HPV também pode ocorrer por contaminação da região ano-genital, por via congênita, onde o recém-nascido adquire a infecção no momento do parto, e sugere-se possibilidade de transmissão através de fômites (Gavillon et al., 2010). A principal causa do câncer de colo do útero é a infecção persistente pelo HPV, onde aproximadamente 15 tipos do vírus são responsáveis por praticamente todos os cânceres cervicais e suas lesões precursoras em todo o mundo (Piras et al., 2011). O câncer de colo do útero é evitável quando as lesões pré-neoplásicas são detectadas precocemente. Neste sentido, a análise citológica é fundamental para detectar e classificar as alterações celulares encontradas no esfregaço cervical que são fortemente associadas com a persistência de HPV oncogênico (Konno et al., 2011). Muito embora a infecção pelo HPV tenha maior ocorrência em mulheres jovens sexualmente ativas, tem-se observado o aumento da prevalência de HPV em mulheres na pósmenopausa, o que em parte pode estar ocorrendo devido à reativação de infecções adquiridas anteriormente, ou mesmo por novas infecções adquiridas ao longo da vida (Trottier & Franco, 2006). O HPV desempenha papel fundamental na patogênese do câncer do colo do útero, sendo que a infecção por este vírus é considerada uma condição necessária, mas nem sempre suficiente para o desenvolvimento desta neoplasia. Por outro lado o desenvolvimento do câncer cervical sem o envolvimento do HPV é raro. Konno et al. (2011) mostram que das mulheres positivas para a 8

19 Revisão da Literatura presença do DNA do HPV, 60,6% estavam infectadas por um único tipo de HPV e 39,4% apresentavam infecções múltiplas por este vírus. Em outro estudo feito por Piras et al. (2011), 88% das amostras positivas correspondiam a infecção pelo HPV de alto risco, e 40,1% das infecções apresentaram mais de um tipo de HPV. Em uma meta-análise realizada recentemente que avaliou a prevalência e distribuição do HPV em mulheres com citologia normal, encontrou-se que a estimativa de prevalência do HPV mundial foi de 11,7%, com 16,1% de prevalência na América, sendo que o HPV 16 foi o tipo predominante em todo o mundo (Bruni et al., 2010). Em outra meta-análise realizada com dados globais foi verificado presença de HPV em 97% dos casos de câncer cervical (Moscicki et al., 2006). Crawford et al. (2011) avaliaram a prevalência do HPV 16 em amostras cervicais e de mucosa oral de 100 pacientes, e verificaram a presença de um ou mais genótipos de HPV de alto risco em 95,1% dessas mulheres. Há uma grande variação na prevalência entre os diferentes tipos de HPV. O HPV 18 predomina no sudoeste da Ásia, o HPV 45 é mais freqüente na África Ocidental, já os HPVs 39 e 59 estão mais limitados a América Central e do Sul. O HPV mais freqüente em todo o mundo é o tipo 16, que ocorre em cerca de 53% dos casos de câncer cervical, seguido do tipo 18 (15%), 45 (9%), 31 (6%) e 33 (3%) (Muñoz et al., 2000). Não há estudo em larga escala a respeito da prevalência do HPV no Brasil, mas um trabalho isolado usando técnicas de biologia molecular mostrou prevalência de 62-80% de HPV em amostras cervicais com atipias citológicas no exame citopatológico (Paesi et al., 2009). Ayres & Silva (2010) conduziram uma revisão sistemática da literatura para avaliar a prevalência de HPV em mulheres no Brasil, onde encontraram prevalência global de infecção pelo HPV variando de 13,7 a 54,3%, e nos casos de mulheres com citologia normal a prevalência variou entre 10,4 e 24.5%. No município de Ouro Preto, segundo trabalho realizado por Miranda (2010), onde foram avaliadas 569 mulheres, a prevalência de HPV está em torno de 23,4% e 60% das mulheres apresentaram infecção por HPVs de alto risco, sendo o mais prevalente o HPV 16. O aumento da carga viral do HPV tem sido correlacionado com a progressão do câncer cervical, e da mesma forma, a carga viral elevada de HPV 16 tem sido associada a carcinoma da orofaringe. Essas informações destacam a importância de detectar, distinguir e quantificar infecções pelo HPV para monitoramento do tratamento e da progressão da doença (Seaman et al., 2010). O uso da vacina como profilaxia a infecção pelo HPV tem mostrado resultados promissores, contudo o desenvolvimento de vacinas eficazes exigiria estudos exaustivos quanto aos diferentes genótipos do vírus espalhados pelo mundo (Alhamany et al., 2010). 9

20 Revisão da Literatura Atualmente estão disponíveis duas vacinas contra o HPV, uma quadrivalente (HPV 6, 11, 16 e 18) e uma bivalente (HPV 16 e 18), ambas eficazes na prevenção de lesão de alto grau ou adenocarcinoma in situ em mulheres que não tiveram infecção por HPVs de alto risco antes da vacinação. A vacina quadrivalente também demonstrou ser profilática ao aparecimento de verrugas genitais em mulheres e lesões anais em homens, por outro lado a vacina não reduz a progressão das lesões cervicais pré-neoplásicas em mulheres infectadas antes da aplicação da vacina (Joura et al., 2012). Uma vez que a infecção pelo HPV pode ocorrer durante todo o tempo em que uma mulher se mantém sexualmente ativa, a vacina deve induzir uma forte resposta de anticorpos que seja sustentada por um longo prazo para garantir a sua proteção (Schwarz & Leo, 2008). Além disso, o grau de imunidade cruzada entre os tipos de HPV é fundamental tanto para a epidemiologia do vírus quanto para o impacto das vacinas contra o HPV na saúde pública (Durham et al., 2012) Métodos de Detecção do DNA/HPV Existem várias técnicas de detecção de DNA viral, dentre as quais se destacam a imunohistoquímica, captura de híbridos e reação em cadeia da polimerase (PCR). A captura híbrida permite a detecção dos tipos de HPV mais freqüentes e avaliação da carga viral, todavia, não é possível especificar o tipo viral e não detecta tipos que possam estar presentes na amostra e que não tenham homologia com as sondas testadas (Lõrincz et al., 2003). Contudo, esta técnica detecta a presença de qualquer um dos 13 tipos de HPVs de alto risco mais freqüentes, e é atualmente um dos métodos mais utilizados na prática clínica, apresentando alta sensibilidade (95-97%) (Pino et al., 2011). A reação em cadeia da polimerase, também conhecida como PCR, é uma técnica de síntese de ácidos nucléicos em que um segmento específico de DNA é replicado (Castle et al., 2002), e representa um método sensível para detecção do DNA do HPV (Seaman et al., 2010). A técnica de hibridização in situ pode demonstrar a presença do DNA-HPV em coilócitos (Wright Jr, 2006). O ensaio APTIMA HPV detecta o mrna de 14 tipos de HPV de alto risco em amostras de citologia em meio líquido, contudo os estudos clínicos quanto ao desempenho desta técnica ainda são limitados, sendo necessários mais dados para elucidar a aplicação clínica deste teste. Recentemente num estudo realizado com mulheres que apresentavam 30 anos ou mais com diagnóstico de ASCUS, onde foi realizado esse teste, observou-se que ele é promissor, pois 10

21 Revisão da Literatura apresentou alta sensibilidade no seguimento para detecção de lesões de alto grau ou mais grave (Waldstrom & Ornskov, 2011) Exame Citopatológico O exame citopatológico (ou Papanicolaou) foi desenvolvido a partir da iniciativa do Dr. George Papanicolaou de classificar as células que observava as quais acreditava serem representativas de lesões neoplásicas. Diversas modificações ocorreram desde então de acordo com o conhecimento adquirido a respeito da evolução natural dessas lesões. Vale ressaltar, porém, que o objetivo deste exame continua o mesmo, que é identificar alterações sugestivas de anormalidade, e da mesma maneira indicar ações que permitam o diagnóstico preciso e tratamento adequado para as pacientes (Brasil, 2012). O exame citopatológico é uma das estratégias mais bem sucedidas para a prevenção do câncer e tem sido amplamente utilizado na prática clínica com o intuito de reduzir a incidência de câncer e mortalidade. Para realização dos testes citológicos é necessária a coleta de células esfoliadas do colo do útero e exame microscópico destas células após coloração. Este procedimento permite detectar células anormais e assim avaliar se existe risco de lesão precursora não detectável clinicamente, para que então, caso necessário, essa mulher possa ser encaminhada para uma investigação complementar. É por isso, que este exame ainda é o escolhido para o screening ou triagem, e prevenção do câncer do colo uterino (Derchain, Longatto Filho & Syrjanen, 2005). Apesar de o exame citopatológico apresentar em média 50% de sensibilidade para detecção da neoplasia cervical, os modelos de rastreio disponíveis sugerem que até 85% dos casos de câncer do colo do útero podem ser impedidos se o exame citopatológico for realizado a cada três anos (Austin & Zhao, 2012). O sucesso dos programas de rastreio para o câncer cervical baseia-se principalmente na longa fase pré-clínica característica da carcinogênese do colo do útero, o que permite a detecção de lesões pré-neoplásicas antes de se tornarem o câncer invasivo, e por isso o benefício do rastreio para essa neoplasia excede o custo envolvido (Bal et al., 2012). O principal objetivo do exame citopatológico é identificar mulheres com lesões cervicais que as conferem risco aumentado de desenvolver o câncer cervical (Arbyn et al., 2004). Segundo o Ministério da Saúde o exame citopatológico deve ser realizado com intervalo de três anos, após dois exames negativos com intervalo anual. O início da coleta deve ser aos 25 anos de idade para mulheres que já iniciaram atividade sexual e deve prosseguir até os 64 anos, e só deve 11

22 Revisão da Literatura ser interrompido quando após essa idade as mulheres apresentarem dois exames negativos consecutivos nos últimos cinco anos (Brasil, 2011). O rastreio em mulheres jovens ainda é alvo de discussão em todo mundo, uma vez que estudos têm indicado que o câncer cervical nessas mulheres são significativamente menos susceptíveis de serem prevenidos com o rastreio citológico de rotina. Contudo dados da Islândia sugerem que a triagem de mulheres com idade entre 20 e 29 anos podem resultar no aumento de detecção de carcinomas cervicais em fase inicial, ou até mesmo diminuir o diagnóstico do câncer em estágios mais avançados (Sigurdsson, 2010). Por outro lado, o rastreio em mulheres idosas leva a uma redução substancial na incidência e mortalidade do câncer cervical (Sasieni et al., 2009). Juntamente com o exame citopatológico novas tecnologias têm sido acrescentadas ao arsenal diagnóstico disponível para a detecção precoce deste tipo de neoplasia, como a citologia em meio líquido e os testes para detecção do HPV por captura híbrida. Estas tecnologias de rastreamento apresentam sensibilidade, especificidade e custos bastante variados e, atualmente, somente o exame citopatológico faz parte do conjunto de procedimentos cobertos pelo Sistema Único de Saúde (SUS) (Tavares et al., 2007) Métodos de Coleta O exame citopatológico é um procedimento simples, rápido e indolor (Bukhari et al., 2010). Os métodos de coleta mais utilizados na citologia oncótica cérvico-vaginal são a coleta convencional (dupla ou tríplice) e em meio líquido. A coleta convencional dupla, que é a atualmente recomendada pelo Ministério da Saúde, consiste na coleta de células do colo do útero utilizando a espátula de Ayre, para coleta de células da ectocérvice, e a escova endocervical, para coleta de células da endocérvice, sendo o esfregaço confeccionado em uma lâmina de vidro de extremidade fosca, onde consta identificação da paciente (Arbyn et al., 2008). É recomendado iniciar a coleta com a espátula e posteriormente com a escova, pois isso minimiza contaminação por sangue que eventualmente pode acompanhar o uso da escova endocervical. Em mulheres na pós-menopausa ou em tratamento cervical excisional prévio, a junção escamocolunar (JEC) geralmente está localizada no interior do canal endocervical, e o orifício cervical pode ser estreito, sendo recomendado nestes casos o uso da espátula. Amostras coletadas com o uso em conjunto da espátula de Ayre e da escova endocervical mostraram qualidade melhor 12

23 Revisão da Literatura do que as que foram coletadas com somente um dos dispositivos acima citados, tanto com relação a adequação da amostra, quanto a presença de células endocervicais (Davey et al., 2008). Existem várias métodos de preparo de citologia em meio líquido tais como DNA-Citoliq (Digene-Brasil), Thin Prep (Cytyc Corp., USA) e Aytocyte (Tripath, USA). As amostras coletadas em meio líquido são dispersas em uma suspensão líquida e em seguida centrifugadas e filtradas. A amostra a ser avaliada é obtida então de um preparado em monocamada, onde a morfologia celular é bem preservada, sem aglomerados e sobreposição, nem fatores obscurecedores (Abulafia et al., 2003). O método de coleta da citologia em meio líquido consiste no uso de uma única escova de forma cônica, no caso da DNA-citoliq, que possui extremidade descartável e desenho anatômico que se encaixa no orifício cervical externo permitindo a esfoliação de células da ectocérvice, da junção escamo-colunar e da endocérvice. Após a coleta do material a haste desta escova é destacada de maneira que essa escova é colocada em um tubo contendo líquido preservante e/ou fixador, permitindo a posterior preparação de uma ou mais lâminas de citologia, além de testes moleculares (Velasco, 2001). Estudos comparativos entre a citologia em meio líquido (ThinPrep) e a convencional tem mostrado que a citologia em meio líquido apresenta melhor adequação da amostra, melhorando o diagnóstico de LSIL e HSIL, mas não há diferença quanto ao diagnóstico de atipias escamosas e glandulares (Bonfin et al., 2007). Estudos têm indicado que a citologia em meio líquido não é nem mais sensível nem mais específica do que a citologia convencional, além de requerer mais investimento de capital, gerar mais custos operacionais e demandar maior quantidade de materiais descartáveis do que a citologia convencional (Arbyn et al., 2008) Nomenclatura para exames citopatológicos A primeira nomenclatura em citologia foi criada e introduzida por George N. Papanicolaou no início dos anos 40 e expressava se as células eram normais ou não lhes atribuindo a seguinte classificação: Classe I: ausência de células atípicas ou anormais, Classe II, citologia atípica, mas sem evidência de malignidade, Classe III: citologia sugestiva de malignidade, Classe IV: citologia fortemente sugestiva de malignidade e Classe V, citologia conclusiva de malignidade (Papanicolaou & Traut, 1997). Reagan introduziu em 1953 a classificação de displasia leve, moderada, severa e carcinoma in situ como lesões precursoras do carcinoma invasor, em amostras citológicas e histológicas, 13

24 Revisão da Literatura baseando-se na espessura do epitélio comprometido pela presença de células alteradas (Reagan & Hicks, 1953). Posteriormente Richard propõe o uso do termo neoplasia intraepitelial cervical (NIC), dividida histologicamente em três graus: 1, 2 e 3, que correspondem a atipias celulares que compreendem parte ou toda a espessura do epitélio cervical. Nessa terminologia, NIC 1, 2 e 3 correspondem, respectivamente, a displasia leve, moderada e displasia severa/carcinoma in situ (Richard, 1967) (Figura 1). Após considerar o HPV como agente causal do câncer cervical, Richard sugeriu uma nova classificação para as lesões precursoras: NIC de baixo grau para alterações associadas ao HPV e NIC de alto grau para alterações com características morfológicas de lesões precursoras de câncer (Richard, 1990). Em 1988 foi desenvolvido o Sistema de Bethesda no intuito de uniformizar a terminologia para os laudos citopatológicos. O principal objetivo deste sistema foi estabelecer normas de classificação citológica para reduzir dúvidas diagnósticas entre alterações celulares benignas e realmente atípicas. Esse sistema categoriza as amostras em dentro dos limites da normalidade ou apresentando anormalidades epiteliais, separando dessa forma, alterações celulares secundárias associadas a processos inflamatórios e de reparo, daquelas relacionadas às lesões precursoras de câncer. Para classificar lesões pré-neoplásicas são utilizados os termos lesão intraepitelial escamosa de baixo grau (LSIL) ou de alto grau (HSIL). A LSIL corresponde àquelas alterações sugestivas da presença do HPV, incluindo as Neoplasias Intraepiteliais Cervicais 1 - NIC 1. Já a HSIL, compreende o NIC 2/3. Antes desses dois grupos, foi inserido um referente a células escamosas atípicas (ASCUS), que posteriormente foi subdividido em células escamosas atípicas de significado indeterminado possivelmente não neoplásico (ASC-US), e células escamosas atípicas de significado indeterminado não sendo possível excluir HSIL (ASC-H). O ASC-US está relacionado às alterações de células maduras, tendo uma tendência a uma regressão espontânea ou de ser uma LSIL. Semelhantemente, as células glandulares quando atípicas, são categorizadas em células glandulares atípicas sem outras especificações (AGC-SOE), células glandulares atípicas possivelmente neoplásicas (AGC-NEO). No caso de suspeita de invasão a categoria usada é adenocarcinoma endocervival in situ (AIS), e nos casos de invasão adenocarcinoma endocervical (Solomon et al., 2002). A classificação de Bethesda além de fornecer uma terminologia padronizada e orientações para gestão clínica reflete as diferenças biológicas entre os diferentes graus de lesões, diferenças essas que afetam diretamente a conduta clínica das pacientes. Por um lado as HSIL têm tendência de persistir e progredir para o câncer cervical, enquanto que a maioria das LSIL regride espontaneamente. É por isso que as HSIL geralmente são tratadas com cirurgia de alta freqüência 14

25 Revisão da Literatura (CAF), enquanto que as LSIL são acompanhadas com repetições do exame citopatológico (Ince et al., 2011). O Ministério da Saúde também dispõe da nomenclatura brasileira para laudos citopatológicos baseada no Sistema de Bethesda, que foi elaborada a fim de padronizar o laudo citopatológico com as respectivas condutas clínicas e manter o controle de qualidade deste exame principalmente nos laboratórios que prestam serviço para o Sistema Único de Saúde (SUS). Foi lançada no ano de 2012 a versão mais atualizada deste manual, visando à introdução de novos conceitos estruturais e morfológicos que iriam contribuir tanto para o desempenho do laboratório quanto para a relação entre a citologia e a clínica (Brasil, 2012). Recentemente uma categoria intermediária, a LSIL-H, que separa diagnósticos limítrofes entre LSIL e HSIL, tem sido apontada como uma categoria distinta de diagnóstico que remete a uma avaliação clínica adicional. Apesar de não haver critérios citomorfológicos específicos para essa categoria, tem-se sugerido que ela facilitaria a cooperação entre citopatologista e ginecologistas para o tratamento adequado das pacientes (Ince et al., 2011). Epitélio normal Lesão intraepitelial escamosa Câncer invasor Baixo Grau Alto Grau Partículas virais infectantes Figura 1- Mudanças na estrutura do tecido associadas à progressão da NIC no epitélio escamoso cervical. Piersma, (adaptado) 15

26 2.6 - Exame citopatológico e Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) Revisão da Literatura A implementação do exame citológico para rastreio do câncer do colo do útero reduziu consideravelmente a incidência dessa doença em todo o mundo. No entanto, a sensibilidade da citologia cervical para lesões intraepiteliais escamosas de alto grau é moderada, por isso há necessidade de repetir o exame em intervalos regulares. A presença de infecção pelo HPV de alto risco oncogênico é causa fundamental para estabelecimento do câncer de colo do útero, sendo assim o uso de testes para detecção do DNA HPV podem ser utilizados como ferramenta de triagem de neoplasias cervicais, uma vez que a positividade de HPV de alto risco é um preditor de displasia cervical em mulheres sem anormalidade citológica. Diante do aumento da sensibilidade proporcionada pelos testes de DNA HPV, tem sido sugerido o uso combinado de citologia e testes para detecção do vírus (Bulkmans et al., 2007). O teste para detecção de HPV de alto risco oncogênico tem se tornado ferramenta padrão na triagem de mulheres com diagnóstico de ASCUS no exame citológico e no manejo clínico de pacientes tratadas, e está sendo cada vez mais utilizada como método para rastreio primário de neoplasias cervicais (Pino et al., 2011). O uso combinado de teste para detecção de DNA HPV com a citologia para triagem do câncer cervical é mais sensível do que a triagem convencional só com a citologia, de acordo com resultado obtido em estudos feitos por Leinonem et al. (2009). Citologia e teste de HPV foram métodos precisos na triagem de mulheres suspeitas de ter lesões intraepiteliais cervicais na inspeção visual, especialmente para aquelas com lesões intraepiteliais escamosas grau 3 (Pimple et al., 2010). Mulheres com um teste HPV positivo e citologia negativa apresentaram maior risco de alterações futuras. Da mesma forma, em mulheres com um teste HPV positivo, mas que não havia componente da Junção escamo-colunar (JEC) presente no esfregaço citológico, o risco de resultado citológico falso-negativo é maior (Davey et al., 2008). Em um estudo realizado por Naucler et al. (2007) foi constatado que a adição de um teste de DNA HPV ao exame citopatológico para mulheres acima de 30 anos reduz a incidência de lesões intraepiteliais escamosas de alto grau e também de câncer, que são detectados em exames citológicos subseqüentes, pois o teste de DNA HPV melhora a sensibilidade do exame citológico tanto em identificar lesões que não existiam, quanto em rastrear lesões que não regrediram. O interesse no uso de testes para detecção do HPV como teste de triagem é baseado no fato de que o HPV está presente em quase todos os cânceres cervicais e por serem testes de fácil execução, além de demonstrarem maior sensibilidade para detecção de lesões de alto grau do que o obtido na citologia convencional (Cuzick et al., 2006). 16

27 Revisão da Literatura Com o uso crescente do teste para HPV a qualidade deste método tem sido alvo de muitos questionamentos. Poucos estudos têm publicado dados a respeito da definição de uma amostra adequada para o teste de HPV. A celularidade tem sido apontada como um fator que influencia a confiabilidade do teste, uma vez que foi encontrada maior detecção de carga viral de HPV oncogênico em amostras cervicais com maior número de células. Amostras com poucas células alteradas e até mesmo anatomia do colo do útero têm sido apontados como fatores que podem interferir no teste gerando falso-negativos, mostrando a importância da implantação de métodos de controle de qualidade interno para esse teste (Davey et al., 2008) Detecção do HPV e Atipias Citológicas Em todos os sistemas de classificação há uma categoria de alterações celulares de natureza incerta, ou seja, uma categoria limítrofe. O termo ASCUS é utilizado para anormalidades celulares mais acentuados do que aqueles atribuídos a alterações reativas, mas que quantitativamente e qualitativamente são aquém de um diagnóstico definitivo de lesão intraepitelial escamosa (SIL) (Edwards et al., 2002). O manejo clínico e a importância das células escamosas atípicas do colo do útero ainda geram muita controvérsia, e muitas tentativas tem sido feitas a fim de distinguir células atípicas com reais chances de progressão para lesões cervicais, daquelas com reações benignas e inflamatórias. Neste sentido a realização do teste para HPV tem sido sugerido com uma ferramenta para acompanhamento destas mulheres, principalmente nos casos de ASC-H (Alli & Ali, 2003). Na maioria das populações rastreadas pelo exame citopatológico em média 4 a 5% dos resultados são de ASC, e embora o acompanhamento da maioria destes casos seja negativo, uma taxa média de 20% poderão desenvolver alguma SIL no seguimento, sendo que uma fração significativa dessas lesões é representada por NIC 2 ou 3 (Schmidt et al., 2006). Atualmente muitos programas de rastreamento aceitam e concordam que o uso do teste do HPV como acompanhamento de amostras citológicas alteradas é eficaz. Mulheres com HPV positivo que tem real risco de desenvolver lesão intraepitelial grave podem ser selecionadas e acompanhadas separadamente daquelas com HPV negativo, que podem com segurança voltar pra o rastreio normal (Waldstrom & Ornskov, 2011). Mulheres diagnosticadas com ASC-US mostraram um risco relativo de 15 a 30 vezes de desenvolverem o carcinoma invasor ou lesão intraepitelial escamosa de alto grau nos primeiros dois anos de acompanhamento, se comparadas com mulheres com um esfregaço normal. Além disso, 17