EFEITO DA LIPOPROTEÍNA DE BAIXA DENSIDADE SOBRE A VIABILIDADE DE ESPERMATOZÓIDES OVINOS RESFRIADOS.

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1 EFEITO DA LIPOPROTEÍNA DE BAIXA DENSIDADE SOBRE A VIABILIDADE DE ESPERMATOZÓIDES OVINOS RESFRIADOS. Effect of low density lipoprotein on the viility of cooling sheep spermtozo SILVA, M.C 1 ; SNOECK, P.P.N 1.;SILVA, S.C.B 1 ; ÁLVARES, C.T.G 1, FUJII, J.B. 2, NEVES, M.M 2 ; HENRY, M 2 RESUMO O ojetivo deste experimento foi vlir o efeito d lipoproteín de ix densidde (LBD) em diferentes concentrções em sustituição gem de ovo integrl sore viilidde espermátic no processo de resfrimento de sêmen ovino. As mostrs de sêmen form vlids qunto às crcterístics físics mcro e microscópics ntes e pós-resfrimento. Após determinção d concentrção espermátic, form frcionds e diluíds em meio contendo gem de ovo e LBD ns proporções de 5, 1 e 2%. Após vlição do sêmen diluído, s mostrs form envsds e sumetids os tempos de equilírio de minutos, 3 minutos, 1 hor e 2 hors pré-resfrimento. As plhets form resfrids à tempertur de 5ºC num período de dus hors. O sêmen foi sumetido o teste de termorresistênci lento (TTR) pósresfrimento e o teste hiposmótico (HO) com frutose-citrto pós-resfrimento. As vlições de motilidde espermátic demonstrrm que o diluidor contendo gem de ovo foi superior (P<,5) o demis diluidores pósresfrimento e em todos os tempos de TTR. Não houve diferenç significtiv (P>,5) entre os trtmentos ns vlições de integridde funcionl de memrn plsmátic. Os resultdos demonstrrm que LBD purificd não deve sustituir gem de ovo integrl n composição dos diluidores pr resfrimento de sêmen ovino qundo d vlição d motilidde, no entnto, preservm integridde de memrn de form semelhnte gem de ovo. PALAVRAS-CHAVE: diluidor, gem de ovo, crneiro, Snt Inês. SUMMARY The purpose of this experiment ws to evlute the effect of low density lipoprotein (LDL) in different concentrtions in plce the egg yolk in the extender for cooling of sheep semen. Smples of semen were evluted fter cooling. After determining the sperm concentrtion the semen ws diluted in medi contining egg yolk or LDL in the proportions of 5, 1 nd 2%. After evluting the diluted semen, smples were divided nd different equilirium time ws tested: minutes, 3 minutes, 1 hour nd 2 hours efore cooling. The semen ws cooled to temperture of 5 C over period of two hours fter envse into,25 ml strws. The sperm ws sumitted to the thermo-resistnce slow test (TTR) nd hypoosmotic swelling test (HOS) fter cooling. Evlutions of sperm motility showed tht the extender contining egg yolk ws etter thn the others extenders with LDL (P <.5). There ws no significnt difference etween tretments in the evlutions of the sperm integrity of plsm memrne (P >.5). The results showed tht the purified LDL should not replce the egg yolk in full composition of semen extenders for cooling of sheep. KEYWORDS: extender, egg yolk, sheep, Snt Inês. 1 Curso de Medicin Veterinári d Universidde Estdul de Snt Cruz (UESC) 2 Escol de Veterinári d Universidde Federl de Mins Geris (UFMG)

2 INTRODUÇÃO A gem de ovo é freqüentemente utilizd n composição de diluidores pr criopreservção de espermtozóides dos mmíferos (ENGLAND, 1993), visndo à proteção ds céluls contr o choque térmico. Este mecnismo de proteção é triuído à frção lipoprotéic de ix densidde (LBD) que interge com s proteíns presentes no plsm seminl, impedindo o efeito deletério desss proteíns n memrn espermátic (MANJUNATH et l., 28). Apesr dos seus efeitos protetores, o uso d gem de ovo integrl present desvntgens, como possiilidde de trnsportr microrgnismos ptogênicos (SILVA et l., 22), lém de conter sustâncis que iniem respirção dos espermtozóides e promovem diminuição d motilidde espermátic (PACE; GRAHAM, 1974). Estudos recentes demonstrrm ser possível purificção d LBD, permitindo su utilizção em sustituição à gem de ovo integrl n formulção dos diluidores utilizdos n criopreservção de espermtozóides (MOUSSA et l., 22). A ção crioprotetor d LBD já foi demonstrd ns espécies ovin (AMIRAT et l, 24), eqüin (JULIANI et l, 24), cnin (VARELA JR, 24) e suín (DEMANIOWICZ; STRZEZEK 1996). Dest form, o presente trlho teve como ojetivo vlir o efeito d LBD em diferentes concentrções em sustituição gem de ovo integrl sore viilidde espermátic no processo de resfrimento de sêmen ovino. MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi relizdo no Hospitl Veterinário d Universidde Estdul de Snt Cruz (UESC) no período de jneiro julho de 28. Form utilizdos nove crneiros d rç Snt Inês dultos, os quis form coletdos por meio de vgin rtificil (um ejculdo/niml) com uxílio de um fême no estro induzido. Os ejculdos form vlidos qunto às crcterístics físics mcroscópics (volume, cor, odor e specto) e microscópics (motilidde totl, motilidde progressiv, vigor e turilhonmento). O cálculo de concentrção espermátic foi relizdo com uxílio d câmr de Neuuer, com sêmen diluído n proporção de 1µl pr 399µl (1:4) de solução tmpond de formol-slin (CBRA, 1998). As mostrs form frcionds e diluíds em diferentes meios, que constituírm os grupos experimentis: D1) composto de tris, glicose, gem e 5% de glicerol 1221 mosmol/l (SALAMON; VISSER, 1972); D2) tris, glicose, 5% de LBD e 5% de glicerol 172 mosmol/l; D3) tris, glicose, 1% de LBD e 5% de glicerol 1138 mosmol/l e D4) tris, glicose, 2% de LBD e 5% de glicerol 1182 mosmol/l. Após diluição, s mostrs form novmente vlids no intuito de verificr possíveis lterções ns crcterístics seminis durnte o processo de diluição. O juste finl d diluição foi relizdo de form oter 15x1 6 sptz/plhet,25 ml. O sêmen envsdo foi sumetido o tempo de equilírio em tempertur miente (2-25ºC) pr permitir interção do meio diluidor com os espermtozóides. Form testdos os seguintes tempos de equilírio: minutos, 3 minutos, 1 hor e 2 hors pré-resfrimento. Após o equilírio s plhets form colocds em geldeir com tempertur intern estilizd entre 2 e 5ºC de modo permitir qued grdtiv de tempertur miente à 5ºC num período de dus hors. Ao finl d curv de resfrimento, o sêmen foi

3 vlido qunto à motilidde totl (MT), motilidde progressiv (MP) e vigor espermático (V), fim de verificr possíveis lterções ns crcterístics seminis durnte o processo de resfrimento. O sêmen resfrido foi vlido qunto à integridde funcionl de memrn plsmátic por meio do teste HO utilizndo solução de frutose-citrto com osmolridde proximd de 1 mosmol/l. As mostrs que otiverm os vlores mínimos de 3% de motilidde e vigor = 2 pós-resfrimento form sumetids o TTR pr sêmen ovino, sendo relizds vlições de motilidde espermátic e vigor pós um, dus e três hors de incução. O delinemento experimentl foi em esquem ftoril qutro x qutro (qutro diluidores versus qutro tempos de equilírio pré-resfrimento) e o ejculdo de cd reprodutor foi considerdo um repetição. RESULTADOS E DISCUSSÃO O sêmen fresco dos nimis utilizdos no experimento presentou colorção rnco mrfim, odor suis generis, specto leitoso e volume médio de 1,2 ±,3 ml. O vlor médio de turilhonmento foi 3,7 ±,6. A concentrção espermátic vriou de 1,7 x 1 9 7,1 x 1 9 espermtozóides/ml, tendo como médi 3,6 x 1 9 espermtozóides/ml. Vle ressltr que tods esss crcterístics estvm dentro dos pdrões requeridos pr o resfrimento e criopreservção de sêmen ovino, conforme estelecido pelo CBRA (1998). As médis de motilidde espermátic e vigor do sêmen fresco e pós-diluição estão dispostos n tel 1. Tel 1. Vlores médios e desvio pdrão de motilidde totl, motilidde progressiv e vigor dos espermtozóides ovinos pr cd trtmento ntes d refrigerção Trtmento Vriáveis Sêmen fresco D1 D2 D3 D4 Motilidde Totl (%) Motilidde Progressiv (%) Vigor (-5) 81,9 ± 8,1% 75,3± 9,9% 3,6 ±,5 76,9±7,7 68,6±9,4 3,3±,5 74,3±6,7 64,3±9,7 3,4±,5 74,5±1,2 54,7±23,6 3,6±,5 Não houve diferenç entre os trtmentos (P>,5). D1= gem de ovo (SALAMON & VISSER, 1972); D2=LBD5%; D3=LBD1%; D4=LBD2%. 65,2±29,7 56,9±27,2 3,1±1,5 Verificou-se neste estudo que os qutro diluidores testdos preservrm de mneir similr s crcterístics físics do sêmen pós-diluição, não hvendo diferenç significtiv (P>,5) entre os trtmentos, demonstrndo que o uso de LBD purificd ns proporções de 5, 1 e 2% é cpz de grntir proteção os espermtozóides ovinos de form semelhnte à gem de ovo, durnte este processo. MANJUNATH et l. (27) verificrm que o plsm seminl de ovinos contém proteíns vinculds lipídios chmds de BSP. Ests proteíns são produzids ns vesículs seminis e tum n memrn espermátic trvés d remoção de colesterol e fosfolipídios, fetndo negtivmente cpcidde dos espermtozóides de se mnterem viáveis. Dest form, LBD purificd ns proporções estudd é cpz de permitir ocorrênci destes mecnismos de proteção, com mesm eficiênci d gem de ovo integrl, durnte o processo de diluição de sêmen ovino. Os resultdos de motilidde espermátic progressiv e vigor pr cd trtmento pós o resfrimento estão demonstrdos n figur 1. As médis de motilidde progressiv pós o resfrimento de sêmen form diferentes entre os

4 diluidores testdos (P<,5), demonstrndo que o uso de LBD em proporções vrids, em sustituição gem de ovo, não confere mior proteção o choque térmico durnte o processo de refrigerção pr sêmen ovino. É possível que o efeito protetor d LBD pr sêmen ovino sej mis evidente pós descongelção, um vez que no resfrimento o diluidor se de gem de ovo foi mis eficz pr proteger motilidde espermátic. No entnto, é importnte ressltr que todos os diluidores preservrm de form semelhnte o vigor espermático (P>,5). 1 5 MP (%) Vigor Sêmen Fresco Tempo de equilírio (min.) Sêmen Fresco Tempo de equilírio (min.) Figur 1. Vlores médios de motilidde progressiv (%) e vigor espermático (-5) do sêmen ovino fresco e pós o resfrimento utilizndo diferentes meios diluidores Os resultdos de motilidde progressiv e vigor espermático pós três hors de TTR são mostrdos n figur MP (%) Vigor Tempo de equilírio (min.) Tempo de equilírio (min.) Figur 2. Vlores médios de motilidde progressiv (%) e vigor espermático (-5) do sêmen ovino sumetido três hor de incução 38ºC utilizndo diferentes meios diluidores Not-se que o D1 mnteve-se superior os demis diluidores em preservr motilidde progressiv (P<,5). Não houve diferenç significtiv ns vlições de vigor espermático pós s três hors de incução. Estes resultdos indicm que LBD, ns proporções estudds, em sustituição gem de ovo, não confere mior longevidde os espermtozóides ovinos resfridos, contrrindo Mouss et l. (22) que encontrrm melhores resultdos com o uso d LBD n su form purificd comprd o uso de

5 gem de ovo integrl n composição de diluidores pr criopreservção de sêmen. Os resultdos dos espermtozóides retivos o teste hiposmótico são presentdos n tel 2. Os diluidores preservrm de form semelhnte integridde funcionl de memrn plsmátic (P>,5), independente do tempo de equilí rio pré-resfrimento utilizdo. Tel 2. Porcentgem de espermtozóides ovinos retivos o teste hiposmótico, pós o resfrimento utilizndo-se diferentes diluidores e tempos de equilírio. Tempo de Equilírio Diluidor min. 3 min. 6 min. 12 min. D1 (gem) D2 (5% LBD) D3 (1% LBD) D4 (2% LBD) 57,2±18,1 51,6±25, 58,4±19,7 62,3±18,6 59,3±25,3 45,4±21,2 51,7±19,8 52,±17,8 66,3±17,8 62,4±19,8 63,4±2,9 56,6±21,3 57,8±21,7 55,4±19,9 57,7±23,3 52,6±2,4 HO%= % de lterções n região d cud pós o teste HO- % de lterções n região d cud ntes do teste HO (MELO & HENRY, 1999). HO sêmen fresco: 72,2±17,7. Os diluidores formuldos com LBD presentrm potencil semelhnte pr preservr integridde de memrn espermátic que diluidores formuldos com gem de ovo. É importnte slientr que integridde funcionl d memrn é um requisito essencil pr o processo de fertilizção, portnto, o sêmen resfrido com os diluidores testdos possivelmente present potencil pr ser utilizdo n inseminção rtificil. REFERÊNCIAS AMIRAT, L.; TAINTURIER, D.; JEANNEAU, L.; THORIN, C.; GERARD, O.; COURTENS, J.L., ANTON, M. Bull semen in vitro fertility fter cryopreservtion using egg yolk LBD: comprison with Optidyl, commercil egg yolk extender. Theriogenology, v.61, p , 24. CBRA. Colégio Brsileiro de Reprodução Animl. Mnul pr exme ndrológico e vlição de sêmen niml, p , DEMANIOWICZ, W.; STRZEZEK, J. The effect of lipoprotein frction from egg yolk on some of the iologicl properties of or spermtozo during storge of the semen in liquid stte. Reproduction in Domestic Animls, v31, p , ENGLAND, G. C. Cryopreservtion of dog semen. Journl of Reproduction nd Fertility Supplement v.47, p , JULIANI, G.; HENRY, M.; MELO, V.I. Freezing of equine semen in extenders with low density lipoproteins. In: INTERNACIONAL CONGRESS ON ANIMAL REPRODUTION, 15, 24, Porto Seguro. Anis...Belo Horizonte: Colégio Brsileiro de Reprodução Animl, 24. p.498. MANJUNATH, P.; BERGERON, A.; LEFEBVRE, J.; FAN, J. Seminl Plsm Proteins: Functions nd Interction With Protective Agents During Semen

6 Preservtion. Society of Reproduction nd Fertility Supplement, v.65, p , 27. MANJUNATH, P.; LUSIGNAN, M. F.; BERGERO, A. Sperm Protection y Extender Components. In: BIANNUAL MEETING, 6, 28, Budpeste. Anis Budpeste: Assocition for Applied Animl Andrology, 28. MOUSSA, M.; MARTINET, V.; TRIMECHE, A.; TAINTURIER, D.; ANTON, M. Low density lipoproteins extrcted from hem egg yolk y n esy method: crioprotective effect on frozen-thwed ull semen. Theriogenology, v.57, p , 22. PACE, M.M.; GRAHAM, E.F. Components in egg yolk which protect ovine spermtozo during freezing. Journl of Animl Science, v.39, p , SALAMON, S.; VISSER, D. Effect of composition of tris-sed diluent nd of thwing solution on survivl of rm spermtozo frozen y the pellet method. Aust. J. Biol. Sci. v. 25, p , SILVA, A.R.; CARDOSO, R.C.S.; UCHOA, D.C.; SILVA, L.D.M. Effect of Trisuffer, egg yolk nd glycerol on cnine semen freezing. The Veterinry Journl, v. 164, p , 22. VARELLA JR., A.S.; Efeito d Lipoprotein de ix densidde sore qulidde do sêmen cnino sumetido criopreservção. Dissertção de Mestrdo UFPEL Pelots-RS, 24.