Ana Lívia Rocha Monteiro MÉTODOS NÃO INVASIVOS DE MONITORAMENTO DE FAUNA. Botucatu-SP

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1 Ana Lívia Rocha Monteiro MÉTODOS NÃO INVASIVOS DE MONITORAMENTO DE FAUNA Botucatu-SP 2006

2 Ana Lívia Rocha Monteiro MÉTODOS NÃO INVASIVOS DE MONITORAMENTO DE FAUNA Seminário apresentado à Disciplina de Seminários I, do Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária, nível Mestrado, Área de Reprodução Animal, da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia FMVZ / UNESP Campus de Botucatu Aluna: Ana Lívia Rocha Monteiro Orientador: Prof. Ass. Dr. João Carlos Pinheiro Ferreira Professores Responsáveis: Prof ª Dr ª Maria Denise Lopes Prof Dr Sony Dimas Bicudo Botucatu-SP 2006

3 RESUMO Há hoje uma preocupação global com a conservação dos animais, por outro lado se observa um grande número destes em extinção, situação provocada pela expansão urbana desordenada, degradações ambientais e principalmente o tráfico de silvestres, no qual atinge principalmente as aves, sendo 82% dos animais apreendidos no Brasil. Dentro de todo esse contexto vê-se a real necessidade de programas de conservação desta espécie. A neuroendocrinologia comportamental é o elo entre a função neuroendócrina e o comportamento em animais, sendo, portanto uma importante ferramenta no auxílio à conservação, pois auxilia na avaliação da saúde de uma população ou de um indivíduo. Esses hormônios podem ser avaliados a partir do plasma sangüíneo (métodos invasivos) ou a partir de metabólitos nas fezes (métodos não-invasivos), por RIA (radioimunoensaio), EIA (ensaio imunoensimático) e HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Performance). PALAVRAS CHAVE Monitoramento não-invasivos, hormônios, reprodução, estresse, bem-estar

4 Sumário 1. Introdução 5 2. Revisão de literatura Animais em extinção Hormônios do estresse Corticosteróides Prolactina Hormônios da Reprodução Testosterona Progesterona e Estrógeno Avaliação dos Hormônios Métodos invasivos Métodos não-invasivos Corticosteróides Testosterona Progesterona e Estradiol Interação entre os Métodos Análise dos Hormônios Extração dos Hormônios Cromatógrafo Líquido de Alta Performance ( HPLC) Radioimunoensaio (RIA) Considerações Finais Referências Bibliográficas 19

5 5 1. INTRODUÇÃO Há hoje uma preocupação global com a conservação dos animais, por outro lado se observa um grande número destes em extinção. Esta crise de extinção é predominantemente causada por atividades humanas, incluindo habitat, destruição, introdução de novas espécies e predação direta. As últimas pesquisas apontam que milhares de espécies animais foram extintas nos últimos cem anos. Muitas destas espécies jamais serão conhecidas por gerações futuras. Sabemos que, muitas delas, poderiam revelar ao homem informações importantes sobre o meio ambiente e até mesmo a cura para determinados tipos de doenças. Estratégias para aliviar esta crise devem ser desenvolvidas pelo homem, como o controle da população humana, preservação do habitat e uma gestão mais eficiente de populações nativas e exóticas. Dentro deste contexto percebe-se a real necessidade de programas de conservação para animais ameaçados de extinção e conseqüentemente para a sobrevivência das espécies, promovendo a procriação, criando condições para a sobrevivência de populações de vida livre em suas regiões de origem. A neuroendocrinologia comportamental é o elo entre a função neuroendócrina e o comportamento em animais, sendo, portanto uma importante ferramenta no auxílio à conservação, pois auxilia na avaliação da saúde de uma população ou de um indivíduo. Esses hormônios podem ser avaliados a partir do plasma sangüíneo (métodos invasivos) ou a partir de metabólitos nas fezes e na urina (métodos não-invasivos), por RIA (radioimunoensaio), EIA (ensaio imunoensimático) e HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Performance). Há necessidade de validação destes métodos para cada espécie estudada, visto que são técnicas espécie-específicas. A mensuração dos esteróides fecais tem provido gradativamente uma importante técnica para avaliação da reprodução, do estresse ambiental e agressão em populações de animais e indivíduos de vida livre e de cativeiro. Esta revisão objetiva caracterizar técnicas não invasivas para avaliar os hormônios ligados ao estresse e à reprodução de animais de vida livre e de cativeiro, pois esta metodologia tem permitido o monitoramento a longo prazo dos

6 6 hormônios avaliados, refletida de maneira mais fisiológica, uma vez que dispensa os estressantes da colheita de sangue. 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Animais em extinção Os cientistas estimam que hajam em torno de 10 a 15 milhões de espécies da fauna, flora e microorganismos, desse total 60 mil seriam vertebrados (5 mil mamíferos e 10 mil aves) e o outro restante seria de insetos e plantas ( 18/03/2006). O relatório do Planeta Vivo 2004 mostra que em 30 anos houve uma redução de 40% da fauna ( 18/03/2006)Outra importante pesquisa publicada em relatório da União para Conservação da Natureza (UICN) mostrou que um quarto das espécies conhecidas pelo homem estão ameaçadas de extinção ( 18/03/2006). Não se tem certeza do número exato de animais estão extinção em no mundo, mas os especialistas mencionam que são mais de a cada ano, que são quase dois a cada hora. Se este rítmo continuar é estimado que no início do século seguinte haverão apenas15 e 25 % de todas as espécies habitantes do planeta, o que levará a um grande prejuízo futuro. São diversas as causas que levam a extinção de animais no mundo, dentre elas, segundo Lopes (2002), a expansão urbana descontrolada, degradações ambientais e tráfico de animais, tendo o último, papel fundamental neste processo. O tráfico traz sérios e substanciais riscos para as espécies comercializadas, para a saúde e subsistência do homem, ampliando o risco de doenças para humanos, animais domésticos e silvestres (EUWB, 2005). De acordo com Lopes (2002), o tráfico de animais silvestres é considerado um dos maiores negócios do mundo, ocupando o 3º lugar no ranking da ilegalidade. O Brasil participa com cerca de 5-15% do total mundial (LOPES, 2000 apud RENCTAS, 2005) e envolve todas as regiões do país (LOPES, 2002). É estimado

7 7 que a cada ano esta atividade movimente entre dois a cinco milhões de aves vivas, representando 82% do total de animais apreendidos (RENCTAS, 2005) Hormônios do estresse Um adequado balanço entre o processo de catabolismo (mobilização de energia) induzido pelos hormônios do estresse como a epinefrina, norepinefrina e cortisol e processos anabólicos (reparação, cicatrização e crescimento) provocados por esteróides sexuais e hormônios de crescimento são necessários para a sobrevivência e saúde do animal (LUNDBERG, 2005). Porém com o aumento da pressão antropogênica e dos distúrbios ambientais, este equilíbrio pode ser quebrado (ROMERO, 2004), induzindo ao estresse psicológico crônico. As respostas ao estresse por longo período de tempo afetam negativamente a sobrevivência, a reprodução e a resistência às doenças, devido à queda da imunidade de uma grande variedade de aves e mamíferos (HOFER and EAST, 1998 apud DEHNHARD et al., 2003). A elevação dos níveis de glicocorticóides circulantes resulta em uma alteração no metabolismo dos carboidratos e uma alteração na via energética em atividades não essenciais (McKENZIE e DEANE, 2005). Contudo, se o estresse tornar-se crônico ou freqüente, muitos efeitos deletérios podem ocorrer incluindo inibição da reprodução e supressão da função imune (SAPOLSKY, 1992 apud McKENZIE e DEANE, 2005). O cortisol influencia no metabolismo das células, na distribuição da gordura e no sistema imune, seus níveis são controlados pelo sistema de feedback no hipotálamo e a formação hipocampal (LUNDBERG, 2005). Os animais respondem a um estressor com uma série de respostas endócrinas que aumentam imediatamente a energia disponível em parte por inibição de processos biológicos que não são requeridos para sobrevivência imediata (Wingfield, 1994). Uma das respostas primárias ao estresse é um aumento da atividade do eixo hipotalâmica-pituitária-adrenocortical causando um aumento da concentração de glicocorticóides na circulação sanguínea. Em pouco tempo (horas ou dias), os glicocorticóides se elevam redirecionando os recursos para mobilizar a energia que pode ser usada para resolver a situação de estresse (Sapolsky, 1992). Caso o estressor não for eliminado e os níveis de

8 8 glicocorticóides continuarem altos por mais que alguns dias, resultaram conseqüências prejudiciais, incluindo supressão do sistema imune, diminuição de massa muscular e supressão reprodutiva (Pottinger, 1999). Lundberg (2005) descreve ainda que algumas implicações na saúde do animal devido ao elevado nível de cortisol circulante podem promover o acúmulo de gordura na região abdominal, infarto do miocárdio, problemas cardiovasculares, diabetes Tipo 2, redução da função do sistema imune, prejuízos de cognição entre outros. Portanto, para avaliar a saúde de uma população, estudos sobre mensuração de resposta ao estresse têm aumentado nas áreas de ecologia, biologia e medicina da conservação (eg. WASSER et al., 2002) Corticosteróides A concentração plasmática de glicocorticosteróides é um indicador de estresse confiável, acurado e preciso (BEUVING & VONDER, 1986 apud DEHNHARD et al., 2003), porém em animais silvestres, os níveis plasmáticos de corticosterona em aves, anfíbios, répteis e muitos roedores e cortisol em peixes e mamíferos (ROMERO, 2004) elevam-se rapidamente, em aproximadamente 3 a 5 minutos após contenção e manipulação (WINGFIELD & ROMERO, 2001 apud ROMERO, 2004), além de a avaliação plasmática ser pontual, não representando os níveis hormonais ao longo do tempo (HARPER & AUSTAD, 2000) Prolactina: A prolactina plasmática eleva rapidamente seus níveis durante o estresse em mamíferos, este aumento é freqüentemente considerado como parte da resposta clássica ao estresse (De VLAMING, 1979 apud CHASTEL et al., 2005). Porém, segundo Chastel (2005), em aves, há várias indicações que os níveis de prolactina plasmática podem decrescer em eventos de estresse Hormônios da Reprodução Entender os processos básicos de reprodução é crucial para determinar porque alguns animais se reproduzem e outros não. Diversas espécies de

9 9 felídeos não domésticos se reproduzem fracamente em cativeiro, e há poucas informações fisiológicas disponíveis para ajudar a identificar as causas desta reprodução falha em certas espécies, sejam em populações ou indivíduos. Portanto a meta é desenvolver uma base de dados das inter-relações de regulação das atividades hormonais. Desse modo, monitorar padrões hormonais, mas utilizar métodos por coleta de sangue não é prático para estas espécies. Em substituição, deve-se fazer o uso de técnicas não invasivas para avaliar a função reprodutiva precisam ser desenvolvidas (Brown et al, 1993) Testosterona A testosterona é um hormônio esteróide do testículo, o qual é responsável pela maturação sexual do macho humano, incluindo o crescimento dos testículos e do pênis e facilita a espermatogênese (Griffin & Wilson, 1992). Em um grande número de espécies sinais de agressão são testosterona dependente (Wingfield et al., 1994). Morais et al. (1997) em seus estudos com três espécies de pequenos felídeos, machos, comparou a atividade adrenal com características reprodutivas, concluiu que apesar do estudo não ter estabelecido especificamente causa-efeito entre esta relação, houve uma modesta relação entre as altas concentrações de corticóide fecal e a função espermática prejudicada Progesterona e estrógeno O estabelecimento do comportamento sexual depene da exposição, ou falta de exposição, do hipotálamo à testosterona durante o início do período neonatal. Verdadeiramente a testosterona (convertida em estrogênio por aromatização) promove a masculinização dos centros sexuais no hipotálamo; na ausência da testosterona o hipotálamo torna-se feminino (CUNNINGHAM, 1999). Existem vários princípios com relação aos efeitos dos hormônios sobre o comportamento sexual dos animais domésticos. Primeiramente, a magnitude da variação na concentração hormonal que afeta o comportamento sexual é pequena: na gata, por exemplo, um aumento na concentração de 17β-estradiol de 10 a 20 pg/ml de plasma resulta em sinais de proestro. Em segundo lugar, o

10 10 sinergismo entre hormônios costuma ser importante para a receptividade sexual: por exemplo, na cadela é importante a elevação do estrogênio seguida pela progesterona. Em terceiro a seqüência de exposição ao hormônio pode ser importante; por exemplo: na ovelha é requerida a exposição a progesterona antes da exposição ao estrogênio para que haja manifestação do estro. O estrogênio, originado no desenvolvimento do folículo antral, é o hormônio necessário à receptividade sexual em todos os animais domésticos. A progesterona derivada da granulosa do folículo pré-ovulatório, ou do corpo lúteo também é importante para o estro em alguns animais (CUNNINGHAM, 1999) Avaliação dos hormônios Métodos invasivos De acordo com Good (2003), a mensuração de esteróides no plasma reflete a situação de um indivíduo em um momento pontual, portanto mudanças rápidas e em curto prazo nas concentrações de glicocorticóides, como aquelas provocadas por um novo ambiente ou situação, são mais bem determinadas utilizando amostras de plasma. Para Brown & Wildt (1997) uma única coleta de sangue pode produzir valores que representam apenas um único momento, o pico ou o ponto médio de uma secreção pulsátil. No passado, glicocorticóides eram tipicamente quantificados do sangue. Ensaios baseados no sangue (soro ou plasma) mensuram o nível destes hormônios avaliados em resposta biológica imediata do animal (WINGFIELD et al., 1994). Portanto o uso de avaliação sangüínea é restrito a algumas espécies, pois normalmente o animal precisa primeiro ser capturado, conseqüentemente comprometendo a avaliação do estresse agudo (COOK et al., 2000). Porém estes estudos não são possíveis em animais selvagens. Em adição, a amostra pontual provida da mensuração do sangue pode não ser representativa para análises de níveis hormonais para um longo tempo, devido a padrões de secreção pulsátil dos glicocorticóides no sangue (HARPER & AUSTAD, 2000). Estudos com avaliação de hormônios em felídeos selvagens não progrediram tão rápido quanto os de felídeos domésticos, principalmente por

11 11 causa de tecnologias inadequadas. O primeiro estudo sério para investigar o sistema endócrino do gato doméstico foi para fundamentar a atividade hormonal em fêmeas, portanto estas foram mantidas sob condições extremamente controladas e contidas, um pequeno volume de sangue foi coletado por várias vezes para estabelecer a dinâmica da gonadotrofina pituitária e a secreção do esteróide ovariano envolvido na regulação da reprodução. Foram estabelecidos então valores normais para o gato doméstico, mas por causa da dificuldade de coleta de sangue para deduzir o dado hormonal e a impossibilidade de estabelecer padrão semelhante para outras espécies, não há como identificar estes valores para os felídeos selvagens (BROWN & WILDT, 1997), com este tipo de abordagem. Para haver uma coleta sangüínea em animais selvagens é necessário anestesiá-los e apesar de anestesias ocasionais para este fim não afetar desfavoravelmente o potencial reprodutivo, a dinâmica da secreção hormonal (amplitude do pulso e freqüência) pode ser interrompida temporariamente por drogas anestésicas específicas (JOHNSON & GAY, 1981). De acordo com Brown & Wildt (1997) o uso de anestesia no intervalo periovulatório para coleta sangüínea em felídeos selvagens é contra-indicado porque os dados subseqüentes do hormônio podem está comprometidos Métodos não-invasivos Métodos não invasivos para quantificar o estresse estão sendo desenvolvidos e aplicados em estudos de vertebrados, o qual oferece diversas vantagens sobre os métodos invasivos. Os ensaios feitos com metabólitos fecais de hormônios estão sendo agora utilizados em uma variedade de áreas (ciência animal, ecologia comportamental, biologia conservacionista, ornitologia e primatologia) para examinar o estatus reprodutivo e adrenocortical (Dehnhard et al., 2001). Estes métodos não invasivos são em particular usados porque amostras podem ser facilmente obtidas sem incômodo ao animal e sem colocá-lo em perigo durante a captura (Wasser et al., 2000). Conseqüentemente, amostras podem ser coletadas em intervalos regulares ao longo do tempo. Por não causar incômodo ao animal, técnicas não invasivas podem suprir uma avaliação acurada do

12 12 estresse sem a influência do aumento nos glicocorticóides induzidos pela captura. Portanto os ensaios feitos com metabólitos fecais de glicocorticóides refletem um nível médio destes hormônios circulantes por um período de tempo, melhor que uma amostra pontual, e por isso pode prover uma avaliação mais acurada de um longo tempo de seus níveis (HARPER & AUSTAD, 2000). Métodos não-invasivos de análise de hormônios ligado ao estresse e a reprodução, realizada através das fezes, urina e saliva, têm demonstrado uma importante ferramenta para o monitoramento do bem-estar dos animais (WASSER et al. 2002; DEHNHARD et al., 2003; LUNDBERG, 2005; McKENZIE e DEANE, 2005). Nas fezes há uma grande quantidade de hormônios esteróides como os andrógenos, estrógenos e progestágenos; glicocorticóides como os corticosteróides, cortisol e dehidroepiandrosterona e mineralocorticóides. Os hormônios proteicos, de alto peso molecular, como os luteinizantes e o hormônio do crescimento são destruídos no intestino e vão para a urina, não podendo ser avaliados nas fezes. Em adição, hormônios de baixo peso molecular, como os tireóideos e prostaglandinas, são grupos pouco estudados e apresentam-se nas fezes (WASSER et al., 2002). A variação da excreção dos hormônios esteróides pela urina e fezes varia conforme a espécie e o hormônio a ser avaliado (PALME et al., 1996 apud WASSER et al., 2002), devendo levar em conta possíveis contaminações ao avaliar as amostras (WASSER et al., 2002). Shille et al (1984, 1990) determinou que o estrógeno no gato doméstico foi excretado nas fezes e não na urina, e em pesquisas subseqüentes afirmou que o metabólito da progesterona foi quantificado nas fezes em felídeos selvagens. Brown & Wildt (1997) afirmaram que o monitoramento dos hormônios por métodos não invasivos proporcionou o entendimento da biologia reprodutiva de animais e que esta é uma das mais poderosas ferramentas de avaliação em zoológicos atualmente. A amostra fecal, ao contrário da amostra sangüínea representa níveis de metabólitos hormonais de períodos longos, conseqüentemente refletindo o mínimo de oscilações, a confusão entre a dinâmica secretória normal e uma resposta fisiológica é improvável. Outra vantagem desta técnica é a de que os

13 13 cientistas não têm um número limitado de amostras, as amostras podem ser coletadas por diversas vezes e por tempo indeterminado (BROWN & WILDT, 1997). Khan et al (2002) apud Whitten et al. (1998) afirmou que amostras fecais são mais fisiológicas, mais estáveis por um tempo maior quando armazenadas em temperaturas abaixo de zero. Brown & Wildt (1997) afirmaram que o monitoramento por metabólitos esteróides nas fezes habilita a avaliação do estado de puberdade, pois o início da atividade gonadal esteroidogênica é associada com o estabelecimento e manutenção da gametogênese; determinação da incidência de ovulação espontânea versus induzida; previsão de parição, identificação de prenhez e caracterização de período pós-parto; identificação de causas de inatividade reprodutiva (senescência reprodutiva) ou hiperatividade, incluindo várias patologias como cistos foliculares e retenção de corpo lúteo; melhora de tratamentos com gonadotrofina exógena usada na reprodução assistida, por exemplo, determinando se o tratamento em particular resultou em uma resposta ovariana normal ou anormal; avaliação do nível do estresse fisiológico como uma ferramenta para avaliar e melhorando o habitat para aumentar o bem-estar e também o potencial reprodutivo; e comparações entre espécies para estudo da conservação e evolução de mecanismos reprodutivos Corticosteróides: Dehnhard et al. (2003) revisaram que em patos (Anas platyrhynchos) e galinhas (Gallus domesticus) os corticosteróides circulantes são metabolizados pelo fígado apresentando meia-vida de 10 a 15 minutos, sendo excretados pelas fezes e urina. Porém observaram que em galinhas os níveis de corticosterona fecal, relacionados ao estresse, são detectados 4 horas após estimulação; os mesmos autores revisaram que há variações conforme a espécie de ave estudada. Hormônios esteróides são excretados via intestinal através da bile, após clearance do sangue pelo fígado. Mudanças na dieta do animal alteram a excreção biliar, podendo incorrer em erros na avaliação. Em um estudo com babuínos, esta alteração fora eliminada através do método de congelamento a

14 14 seco das amostras. (WASSER et al., 1993 apud WASSER et al., 2002). Assim é interessante um exame separado para cada pool de amostra fecal, de acordo com a dieta oferecida. A longevidade dos hormônios excretada pode ser afetada pelo local de trabalho (temperatura/ umidade), pela forma de armazenagem de curto prazo (material utilizado durante o transporte da amostra p.ex. sílica ou etanol) e pela forma de armazenagem de longo prazo (modo de conservação da amostra até a sua análise p.ex. congelamento, secagem ou congelamento a seco). O melhor método de armazenagem varia conforme a espécie e o hormônio analisado (WASSER et al., 2002) Testosterona Brown et al (1996, I) em pesquisas com gatos domésticos determinou o tempo do curso e a rota primária de excreção da injeção de testosterona C 14 marcada em gatos domésticos, validou o radioimunoensaio para quantificar metabólito fecal do andrógeno e demonstrou a relevância fisiológica do andrógeno fecal imunoreativo no gato doméstico e em felídeos não domésticos. Concluiu que os metabólitos da testosterona são excretados quase exclusivamente nas fezes no gato doméstico macho; que a mensuração dos metabólitos andrógenos permite ser monitorar a atividade esteroidogênica testicular no gato doméstico; e que este procedimento também tem um potencial para ser uma valiosa ferramenta para acessar o status androgênico de espécies de felídeos ameaçadas de extinção. Morais et al (1996) utilizando três espécies de felídeos selvagens avaliou pelo monitoramento não invasivo, analisou metabólitos fecais de esteróides para gerar uma base de dados reprodutivos destas espécies, foram pesquisados então: a ciclicidade do estro das fêmeas; a função testicular (esteroidogênica e espermática) em machos e a influência da estação do ano na atividade reprodutiva em machos e fêmeas, concluiu que as análises feitas com o monitoramento não invasivo, por meio dos metabólitos fecais do ovário e do testículo demonstrou utilidade; em cada espécie houve influência da estação do ano na atividade reprodutiva, apesar de muitos parâmetros terem efeitos modestos; estas informações são importantes para definir o processo reprodutivo

15 15 normal, o qual fortemente prova a ajuda valiosa para melhorar as estratégias de auxílio à conservação de espécies Progesterona e Estradiol Diversos estudos foram feitos usando análises de metabólitos fecais de progesterona e estradiol para examinar a atividade ovariana, estas informações foram utilizadas para avaliar as possíveis causas de performance reprodutiva fraca em animais de cativeiro (BROWN et al, 1996, II). Brown et al (1996, II) em estudos com fêmeas de chitas (Acinonyx jubatus), esteróides fecais foram utilizados para avaliar eventos reprodutivos nesta espécie, para confirmar e explicar a aparente falta de ciclicidade ovariana. Em adição, um novo dado foi produzido na regularidade da resposta ovariana ao hormônio exógeno de indução, e ao protocolo de inseminação artificial em comparação ao perfil traçado pelo esteróide fecal na prenhez versus não prenhez dos animais após o acasalamento. Czekala et al (1994) analisaram metabólitos fecais do estradiol e progesterona para monitorar a atividade esteroidogênica de felídeos. Para Brown et al (1996, I) estes dados servem para auxiliar na reprodução assistida, pois com eles sabe-se o momento correto de fazer uma inseminação artificial, por exemplo, havendo assim menos chances de falha neste tipo de reprodução. Brown et al (1993) pesquisando taxas de excreção e o metabolismo da progesterona no gato doméstico e então desenvolver e validar o radioimunoensaio para avaliação de progesterona fecal, monitorando assim a função ovariana no gato doméstico Interação entre os métodos: Nos estudos de Dehnhard et al. (2003) com galinhas, corvo-marinho e falcão, a dinâmica das concentrações dos metabólitos fecal refletiu o curso da atividade biológica do hormônio no plasma.o pico do metabólito fecal acompanhou o do plasma sangüíneo com um atraso de 3,5 + 1,1 h Análise dos hormônios:

16 16 É de fundamental importância o anticorpo escolhido para a análise das amostras, para evitar falsos positivos/negativos. Além da validação dos níveis de cortisol fecal devido a grande variabilidade de excreção com relação às espécies (WASSER et al., 2002). Hormônios adrenais e gonadal nas fezes podem ser avaliados por técnicas de EIA (Ensaio Imunoenzimático), RIA (Radioimunoensaio), HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Performance) (DEHNHARD et al., 2003) Extração dos hormônios Segundo Brown e Wildt (1997), o método de extração dos metabólitos esteróides das fezes conta com a combinação de solventes orgânicos e aquosos. Amostras são liofilizadas, pulverizadas e 0,1 0,2 g do pó é fervido em 5mL de etanol a 90%:água destilada por 20 minutos. Posteriormente centrifugado em 500 g por 10 minutos, o supernadante é recuperado e o pellet ressuspendido em 5 ml de etanol a 90%, homogeneizado por 1 minuto e recentrifugado. Os supernadantes do etanol são combinados, secos completamente e então redissolvido em 1 ml de metanol. Os extratos são homogeneizados (1 minuto), colocados em um recipiente ultrasônico, limpo por 30 segundos e livres de partículas aderidas em sua parede, e então homogeneizado brevemente (15 segundos). O extrato depois é diluído (1:20 1:80 para o estradiol; 1:800 1: para progesterona) em fosfato (0,01 M PO 4, 0,14 M NaCl, 0,5% albumina sérica bovina (BSA), 0,01% sódio, ph 7,4) antes da análise. Este método resulta em alta recuperação de esteróides endógenos das amostras nos estudos rádio marcados, como também esteróides marcados (Wasser et al, 1991, 1993) Cromatógrafo Líquido de Alta Performance (HPLC) Brown et al. (1996), em seus ensaios com felídeos utilizou HPLC para determinar o número e a proporção relativa de metabólitos da testosterona nas fezes de gatos e na sua urina, e foram determinados por estágio reverso HPLC. Antes da HPLC, amostras são reconstituídas em 0,5 ml, passadas através de uma coluna matriz C-18 e diluída com 5mL de 80% de metanol para remover os

17 17 contaminantes. O filtrado de extratos fecal e urinário forma evaporados, reconstituído em 60µL de metanol, e diluído usando um gradiente de % metanol: água após minutos respectivamente. Uma fração de ml foi coletada após um período de 120 minutos (1 ml/ minuto taxa de escoamento). O perfil co-diluição de 3 H-testosterona, 3 H-androsterona e 3 H- androstenediol também foram determinados. Frações HPLC de diluição foram levados para secar, reconstituídos em fosfato-protegido salino e metabólito imunoreativo de testosterona quantificado por RIA Radioimunoensaio (RIA) Testosterona imunorreativa em extratos fecais e frações HPLC foram mensuradas usando anticorpo duplo. 125 I- testosterona RIA. O anti-soro foi seguido à reação cruzada: 100% testosterona, 34% dihidrotestosterona, 3,8% 5βandrostan-3α, 17β-diol, 3,3% 11-hidroxitestosterona, 2,9% 5α-androstan-3α, 17βdiol, 2,7% 5α-androstan-3β.17β-diol, 2,1% androsterona, e <1% com drostenediol, DHEA, 5β-dihidrosterona, aldosterona, cortisol, cortisona, corticosterona, estradiol, pregnanediol, progesterona e 17α-hidroxiprogesterona. A testosterona ensaiada foi validada por extratos fecais no gato doméstico por demonstração: paralelismo entre diluições de extratos e curva padrão; e recuperação significante de testosterona exógena (2,5-200 ng/ml), adicionada de extratos fecais. 3. CONSIDERAÇÕES FINAIS Por causa do potencial efeito deletério do estresse crônico há um grande interesse entre os diversos campos de estudo em mensurar o estresse animal. Biólogos conservacionistas estão freqüentemente interessados com o alívio dos efeitos das condições ambientais e distúrbios induzidos pelo homem na vida selvagem. Estes estudos auxiliam também na avaliação de manejos desenvolvidos para animais que vivem em cativeiro. Após o desenvolvimento de técnicas de avaliações não invasivas é hoje possível descobrir porque indivíduos ou populações não estão reproduzindo ou mesmo reproduzindo de forma insatisfatória, podendo facilitar em gestões para a

18 18 proliferação e em conseqüência conservações de diversas espécies ameaçadas de extinção, além de evitar que outras espécies tornem-se ameaçadas. 4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Assessoria de Comunicação Social WWF Brasil. <Disponível em: Acesso em: 18/03/2006. Animais em extinção.<disponível em: Acesso em: 18/06/2006. Animals in extinction. <Disponível em: idpag=128. Acesso em: 18/03/2006. BROWN, J.L.; WASSER, S.K.; HOWARD, J.; ELLS,.; LANG, K.;COLLINS, L. Development and utility of fecal progesterone analysis to asses reproductive status en felids. Proceedings American Association of Zoo Veterinarians, p , BROWN, J.L.; WILDT, D. E.; WIELBNOWSKI, N.; GOODROWE, K.L.; GRAHAM, L.H.; WELLS, S.; HOWARD, J.G. Reproductive activity in captive female cheetahs (Acinonyx jubatus) assessed by faecal steroids. Journal of Reproduction and Fertility, v. 106, p , 1996(I).

19 19 BROWN, J.L.; TERIO, K.A.; GRAHAM, L. H. Fecal androgen metabolite analysis for noninvasive monitoring of testicular steroidogenic activity in felids. Zoo Biology, v. 15, p , 1996 (II). BROWN, J.L.; WILDT, D. Assessing reproductive status in wild felids by non-invasive faecal steroid monitoring. Int Zoo, v.35, p , CZEKALA, N.M., DURRANT, B.S., CALLISON, L., WILLIAMS, M., MILLARD, S. Fecal steroid hormone analysis as an indicator of reproductive function in the cheetahs. Zoo Biology, v. 13, p , CHASTEL, O.; LACROIX, A.; WEIMERSKIRCH, H; GABRIELSEN, G.W. Modulation of prolactin but not corticosterone responses to stress in relation to parental effort in a longlived bird. Hormones and Behavior, v.47, p CUNNINGHAM, J. Tratado de fisiologia Veterinária. 2. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1999, 528p. DEHNHARD, M., SCHREER, A., KRONE, O., JEWGENOW, K., KRAUSE, M. and GROSSMANN, R., Measurement of plasma corticosterone and fecal glucocorticoid metabolites in the chicken (Gallus domesticus), the great cormorant (Phalacrocorax carbo), and the goshawk (Accipiter gentilis). General and Comparative Endocrinology, v.131, p , GOOD, T.; KHAN, M.Z.; LYNCH, J.W. Biochemical and physiological validation of a corticosteroid radioimmunoassay for plasma and fecal samples in oldfield mice (Peromycus polionotus). Physiology & Behavior, v.80, p , GRIFFIN, J.E.; WILSON, J.D. Disorders of the testes and the male reproductive tract. In: Wilson JD, Foster DW, Kronenberg HM, Larsen PR (Ed.) Williams Textbook of Endocrinology, ed. 9. Philadelphia Saunders, p HARPER, J.M.; AUSTAD, S. N. Fecal Glucocorticoids: A Noninvasive Method of Measuring Adrenal Activity in Wild and Captive Rodents. Physiological and Biochemical Zoology, v. 73, p , 2000

20 20 IUCN <Disponível em: em: 18/03/2006. JOHNSON, L.M.; GAY, V. L. Luteinizing hormone in the cat. II. Mating-induced secretion. Endocrinology, v. 109 (1), p , LUNDBERG, U. Stress hormones in health and illness: The roles of work and gender. Psychoneuroendocrinology, v. 30, p , LOPES, J.C.A. Operações de fiscalização da fauna: análise, procedimentos e resultados. In: RENCTAS (Ed.) Animais silvestres vida à venda, Brasília: Dupligráfica, p McKENZIE, S., DEANE, E.M. Faecal corticosteroid levels as an indicator of well-being in the tammar wallaby, Macropus eugenii. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A, v.140, p.81 87, MORAIS, R.N.; MUCCIOLO, R. G.; GOMES, M.L.F. ;LACERDA, O.; MORAES, W.de; MOREIRA, N.; SWANSON, W.F., BROWN, J.L. Adrenal activity by fecal corticoids and male reproductive traits en three south American felid species. Proceedings American Association of Zoo Veterinarians, p , ROMERO, L.M. Physiological stress in ecology: lessons from biomedical research. TRENDS in Ecology and Evolution, v.19, n.5, SAPOLSKY, R.M. Neuroendocrinology of the stress response. In: BECKER, J.B. et al., (Ed.) Behavioral Endocrinology, Massachusetts: Institute of Technology Press, p SHILE, V.M.; WING, A.E.; LASLEY, B.L.; BANKS, J.A. Excretion of radiolabel estradiol in the cat (Felis catus) a preliminary report. Zoo Biology, v. 3, p , SHILE, V.M.; HAGGERS, M.A.; SHAGNHON, C.; LASSEY, B. I. Metabolites of estradiol in serum bile intestine and feces of the domestic cat Felis catus. Theriogenology, v.3, p , 1990.

21 21 WASSER, S. K., HUNT, K. E., BROWN, J. L., COOPER, K., CROCKETT, C. M., BECHERT, U., MILLSPAUGH, J. J., LARSON, S. and MONFORT, S. L. A generalized fecal glucocorticoid assay for use in a diverse array of nondomestic mammalian and avian species. Gen. Comp. Endocrinol., n.120, p , WASSER, S.K., HUNT, K.E., CLARKE, C.M. Assessing Stress and Population Genetics Through Noninvasive Means. In: Conservation Medicine - Ecological Health in Practice Oxford University Press. 2002, Cap 11, p WINGFIELD, J. C., VLECK, C. M., and MOORE, M. C. Seasonal changes of the adrenocortical response to stress in birds of the Sonoran desert. J. Exp. Zool, v.264, p , WINGFIELD, J.C. Modulation of the adrenocortical response to stress in birds. In: DAVEY, K.G. et al. (Ed.) Perspectives in Comparative Endocrinology, National Research Council, p WHITTEN, P.L.; BROCKMAN, D.K.; STAVISKY, R.C. Recent advances in noninvasive techniques to monitor hormone-behavior interactions. American Journal of Physical Anthropology, v. 107, p. 1-23, 1998.