Qualidade dos alimentos: novas desafios. Braganc;:a, Setembro ISBN

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1 Qualidade dos alimentos: novas desafios Braganc;:a, Setembro ISBN

2 Ação antimicrobiana de extratos fenólicos de cogumelos silvestres contra Neisseria gonorrhoeae Maria José Alves, Azucena Marques, Isabel C.F.R. Ferreira*, Anabela Martins, Manuela Pintado a CBQF-Escola Superior de Biotecnologia - Universidade Católica Portuguesa Porto b Centro Hospitalar de Trás-os-Montes e Alto Douro- Unidade de Chaves c CIMO-Escola Superior Agrária, Instituto Politécnico MANUELA PINTADO a de Bragança *iferreira@ipb.pt) Palavras chave: Cogumelos silvestres; Atividade antimicrobiana; Neisseria gonorrhoeae RESUMO Infeções pelo gonococo e por clamídia estão entre as doenças sexualmente transmissíveis mais comuns causadas por bactérias no mundo. Por outro lado, tem-se verificado um aumento de resistência da Neisseria gonorrhoeae aos diferentes antimicrobianos usados no mercado, sendo desta forma urgente a descoberta de novas soluções antimicrobianas no combate a esta infeção. Assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade antimicrobiana de extratos e respetivos compostos fenólicos puros de nove espécies de cogumelos silvestres, provenientes do Nordeste de Portugal, contra Neisseria gonorrhoeae obtida de exsudados da uretra no CHTMAD Centro Hospitalar de Trás-os-Montes e Alto Douro. Para a determinação das concentrações mínimas inibitórias (CMI) de crescimento recorreu-se ao método da microdiluição e ao ensaio colorimétrico com cloreto de p-iodonitrotetrazólio (INT). De um modo geral, todos os extratos apresentaram atividade antimicrobiana sobre a Neisseria gonorrhoeae, e alguns compostos parecem apresentar boa atividade antimicrobiana para esta bactéria, tornando-se pertinente estudar o mecanismo de ação destes compostos na inibição da bactéria bem como a sua toxicidade celular no sentido de avaliar possíveis aplicações clínicas na terapêutica e mesmo na prevenção da gonorreia. 1. INTRODUÇÃO A vigilância e controlo dos resultados terapêuticos na última década chamou a atenção para o flagelo da crescente resistência aos antibióticos [1]. O relatório da OMS publicado em 2001 faz referência à estimativa de que mais de seis milhões de casos de gonorreia (infeção causada pela Neisseria gonorrhoeae) ocorrem a cada ano e com índices crescentes, principalmente nos países em desenvolvimento. Por outro lado, tem-se vindo a verificar uma resistência emergente deste microrganismo aos agentes antimicrobianos comuns no seu tratamento, sendo um grande obstáculo no controle de gonorreia [2,3]. Em simultâneo, a fonte que anteriormente era abundante em compostos antimicrobianos novos e inovadores tem-se esgotado, tornando a sua produção muito exigente e pouco lucrativa. Assim, é urgente a descoberta de novas soluções antimicrobianas no combate a esta infeção. Os cogumelos têm sido reconhecidos como alimentos funcionais e como uma fonte para o desenvolvimento de medicamentos e nutracêuticos podendo ser uma fonte de antibióticos naturais [4,5]. Por outro

3 lado, estudos in vitro bem como estudos epidemiológicos sugerem que o consumo de compostos fenólicos extraídos de cogumelos podem diminuir significativamente o risco de problemas graves de saúde através da sua atividade antimutagénica, anti-inflamatória e antibacteriana [6,7]. Tendo por base o referido anteriormente, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade antimicrobiana de extratos e respetivos compostos fenólicos puros de nove espécies de cogumelos silvestres, provenientes do Nordeste de Portugal, contra Neisseria gonorrhoeae obtida de exsudados da uretra no CHTMAD Centro Hospitalar de Trás-os-Montes e Alto Douro. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Preparação dos extratos Cada amostra de cogumelo liofilizada (ca. 3 g) foi extraída usando uma mistura de metanol: água (80:20; 30 ml) a -20 C durante 6 h. Depois de 15 min em banho ultrassónico, o extrato foi centrifugado a 4000g por 10 min e filtrado através de papel Whatman n º 4. O resíduo foi então extraído com duas porções adicionais de 30 ml da mistura metanol: água. Os extratos combinados foram evaporados, sob pressão reduzida, para remover o metanol e, posteriormente, liofilizados, dissolvidos em água numa concentração de 200 mg/ml e armazenados a - 20 C para uso posterior Preparação de compostos fenólicos Os compostos foram identificados e quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a deteção de díodos (HPLC-DAD). Estes foram submetidos à avaliação da atividade antimicrobiana contra Neisseria gonorrhoeae. Os compostos foram dissolvidos em água, numa concentração de 10 mg/ml e armazenados a -20 C para uso Ensaios para avaliação da atividade antimicrobiana Para a determinação das concentrações mínimas inibitórias (CMI) de crescimento recorreu-se ao método da microdiluição e ao ensaio colorimétrico com cloreto de p-iodonitrotetrazólio (INT), seguindo a metodologia sugerida por Kuete e seus colaboradores [8] com algumas modificações. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados da Tabela 1 demostraram que os nove extratos estudados, na gama de concentrações testadas (10,0-20,0 mg/ml), conseguiram inibir completamente o crescimento de Neisseria gonorrhoeae. De todos as espécies testadas, os extratos de Agaricus bisporus, Lactarius deliciosus, Russula delica e Sarcodon imbricatus foram aqueles que apresentaram maior atividade em concentrações de extrato muito reduzidas (CMI= 1,25 mg/ml). O extrato de Leucopaxillus giganteus apresentou uma CMI = 2,5 mg/ml e o de Ramaria botrytis e Agaricus arvenses apresentaram uma CMI de 10 mg/ml. O extrato de Tricholoma

4 portentosum demonstrou ser o de menor atividade contra Neisseria gonorrhoeae, com uma CMI elevada (20 mg/ml). Tabela 1. Valores de CMI de extratos de cogumelos contra Neisseria gonorrhoeae. Extratos fenólicos CMI (mg/ml) Agaricus arvensis 10 Agaricus bisporus 1,25 Lactarius deliciosus 1,25 Lepista nuda 5 Leucopaxillus giganteus 2,5 Ramaria botrytis 10 Russula delica 1,25 Sarcodon imbricatus 1,25 Tricholoma portentosum 20 Composto de referência Ceftriaxon 1 Dos principais compostos fenólicos derivados do ácido benzoico presentes em extratos de cogumelos, verificou-se que os ácidos protocatéquico, vanílico, 2,4-di-hidroxibenzoico e gálico inibiram a Neisseria gonorrhoeae para uma concentração de 1mg/ml, não se verificando qualquer atividade antimicrobiana para o ácido p-hidroxibenzoico. Relativamente aos derivados do ácido cinâmico, os ácidos p-cumárico, ferúlico e o próprio ácido cinâmico apresentam atividade antimicrobiana para uma concentração de 1 mg/ml (Tabela 2). Tabela 2. Valores de CMI de compostos fenólicos de cogumelos com Neisseria gonorrhoeae. Compostos fenólicos Derivados do ácido benzoico CMI (mg/ml) Ácido p-hidroxibenzoico > 1 Ácido 2,4-di-hidroxibenzoico 1 Ácido protocatéquico 1 Ácido gálico 1 Ácido vanílico 1 Ácido siríngico > 1 Derivados do ácido cinâmico Ácido cinâmico 1 Ácido p-cumárico 1 Ácido o-cumárico > 1 Ácido cafeico > 1 Ácido ferúlico 1 Ácido clorogénico >1 Composto de referência Ceftriaxon 1

5 De um modo geral, todos os extratos apresentaram atividade antimicrobiana sobre a Neisseria gonorrhoeae, e alguns compostos parecem apresentar boa atividade antimicrobiana para esta bactéria, sendo pertinente estudar no futuro o mecanismo de ação destes compostos na inibição da bactéria bem como a sua toxicidade celular no sentido de avaliar possíveis aplicações clínicas na terapêutica e mesmo na prevenção da gonorreia. Agradecimentos: Fundos Nacionais através da FCT Fundação para a Ciência e COMPETE/QREN/EU- projeto de investigação PTDC/AGR-ALI/110062/2009 e projetos estratégicos PEst-OE/AGR/UI0690/2011 e PEst-OE/EQB/LA0016/2011. Referências: [1] M. Ramellkamp. Resistance of Staphycococcus aureus to the action of penicillin - Proc Soc Exp Biol Med. (1942) 51:386-9 [2] WHO. Global Prevalence and Incidence of Selected Curable Sexually Transmitted Diseases: Overview and Estimates [3] CA Ison, J Pepin, NS Roope, E Dimba, O Seaka, CSF Easmon - Genitourin Med (1992) 68: [4] Lindequist, U., Niedermeyer, T.H.J., Julich, W.D. The pharmacological potential of mushrooms - ecam (2005) 2: [5] Poucheret, P., Fons, F., Rapior, S. Biological and pharmacological activity of higher fungi: 20- Year retrospective analysis - Mycologie (2006) 27: [6] Albayrak, S., Aksoy, A., Sagdic, O., Hamzaoglu, E. Compositions, antioxidant and antimicrobial activities of Helichrysum (Asteraceae) species collected from Turkey- Food Chem (2010) 119: [7] Surh, Y.J.. Anti-tumor promoting potential of selected spice ingredients with antioxidative and anti-inflammatory activities: a short review - Food Chem. Toxicol. (2002) 40: [8] Kuete, V., Ango, P.Y., Fotso, G.W., Kapche, G.D., Dzoyem, J.P., Wouking, A.G., Ngadjui, B.T., Abegaz, B.M. Antimicrobial activities of the methanol extract and compounds from Artocarpus communis (Moraceae). - BMC Complement. Altern. Med. (2011) 25: 11-42